Summary
Præsenteret her er en protokol for en standardiseret in vitro hæmodynamisk loop model. Denne model gør det muligt at teste hæmokompatibilitet af perfusion rør eller vaskulære stents at være i overensstemmelse med ISO (International Organization for Standardisering) standard 10993-4.
Abstract
I denne undersøgelse blev hæmokompatibiliteten af rør med en indre diameter på 5 mm lavet af polyvinylchlorid (PVC) og belagt med forskellige bioaktive konjugater sammenlignet med ubestrøget PVC-rør, latexrør og en stent til intravaskulær anvendelse, der blev placeret inde i PVC-rørene. Evaluering af hæmokompatibilitet blev udført ved hjælp af en in vitro hæmodynamisk loop model, der anbefales af ISO-standard 10993-4. Rørene blev skåret i segmenter af samme længde og lukket for at danne sløjfer undgå ethvert hul på splejsning, derefter fyldt med menneskeblod og roteret i et vandbad ved 37 °C i 3 timer. Derefter blev blodet inde i rørene indsamlet til analyse af fuldblodscelletal, hæmolyse (gratis plasma hæmoglobin), komplementsystem (sC5b-9), koagulationssystem (fibrinopeptid A) og leukocytaktivering (polymoronuclear elastase, tumornekrosefaktor og interleukin-6). Aktivering af værtscelle blev bestemt for kopladeaktivering, leukocyt integrinstatus og monocytplade aggregater ved hjælp af flowcytometri. Effekten af unøjagtig løkke lukning blev undersøgt med x-ray mikrotomografi og scanning elektron mikroskopi, der viste trombe dannelse på splejsning. Latex rør viste den stærkeste aktivering af både plasma og cellulære komponenter i blodet, hvilket indikerer en dårlig hæmokompatibilitet, efterfulgt af stent gruppe og ubestrøget PVC rør. De belagte PVC-rør viste ikke et signifikant fald i blodpladeaktiveringsstatus, men viste en stigning i komplement- og koagulationkaskade sammenlignet med ubestrøget PVC-rør. Sløjfemodellen i sig selv førte ikke til aktivering af celler eller opløselige faktorer, og hæmolyseniveauet var lavt. Derfor undgår den præsenterede in vitro hæmodynamiske loop model overdreven aktivering af blodkomponenter ved mekaniske kræfter og tjener som en metode til at undersøge in vitro interaktioner mellem donorblod og vaskulær medicinsk udstyr.
Introduction
Hæmokompatibilitet test af medicinsk udstyr er et afgørende skridt i udviklingen af nye enheder såsom vaskulære stents eller perfusion rør til ekstrakorporal membran iltning. Indtil i dag, dyremodeller betragtes som standard værktøjer til at færdiggøre proceduren for test af medicinsk udstyr forud for dens gennemførelse hos mennesker. Fremover er det nødvendigt at finde alternative in vitro-modeller, der yderligere støtte til at minimere undersøgelser af dyr. I denne undersøgelse har vi derfor udforsket en miniature in vitro hæmodynamisk loop model. Målet med denne præsenterede metode er at teste in vitro blod kompatibilitet af medicinsk udstyr i overensstemmelse med ISO 10993-4 standard.
ISO 10993-4-standarden beskriver standardiserede sæt kliniske parametre, der skal undersøges på prøve 1 af1. Kort sagt er der tale om trombose (trombosesammenlægning og -antal), koagulation (fibrinopeptid A, FPA), hæmatologisk analyse (antallet af blodceller), hæmolyseindeks (frit plasmahæmoglobin) og komplementsystemet (terminal complement kompleks, sC5b9). Men yderligere markører, såsom neutrofil polymorfe elastase (PMN), interleukin 6 (IL-6) og tumor nekrose faktor - alpha (TNF) afspejler aktivering status leukocytter kan også tages i betragtning til målinger. For at bestemme og kvantificere de cirkulerende cellefrie proteiner, der findes i blodplasma, repræsenterer sandwichenzymatisk forbundet immunosorbentanalyse (ELISA) en konventionel og mest pålidelig metode2,3. Ligeledes kan værtscellernes fænotype- og aktiveringsstatus (f.eks. leukocytter) kvantificeres ved at detektere celleoverfladeudtryk af molekyler ved flowcytometri (FACS), der giver enkelt celleaffjedringsbaserede udlæsninger, hvor fluorescerende mærkede specifikke antistoffer binder sig til de målrettede celleoverflademolekyler4. Scanning elektronmikroskopi (SEM) anbefales også at bestemme trombedannelse på det testede materiale ved HJÆLP AF ISO 10993-4 standard1. Denne metode kan suppleres med røntgenmikrotomografi (μCT), til at udføre strukturel analyse af trombe f.eks dens tykkelse, størrelse og lokalisering i en 3D gengivet billede5.
Begrundelsen bag ved hjælp af denne in vitro hæmodynamiske model er at screene for de bedst præsterende og kompatible medicinsk udstyr ved at forstå de grundlæggende fysiologiske dynamik af blodkomponenter såsom blodplader, der er involveret i den primære hæmostase eller leukocytter og deres interaktion med forskellige typer af vaskulære enheder. Sådanne in vitro-systemer er stærkt efterspurgte, da de reducerer behovet for dyreforsøg.
Den her præsenterede loop model opfylder disse krav. Denne model blev først beskrevet af A.B. Chandler i 1958 til produktion af blod trombi og er derfor også kaldet Chandler Loop model6. Indtil nu har denne model været anvendt i en række eksperimenter og ændringer for at undersøge blodets biokompatibilitet af medicinsk udstyr7,8,9,10,11,12,13,14. Den består af polymerrør, som delvist er fyldt med blod og formet til genoprængelige sløjfer. Disse sløjfer roterer i et temperaturstyret vandbad for at simulere vaskulære strømningsforhold med sine hæmoriologiske virkninger. Alternative metoder såsom pumpedrevne modeller eller modeller , der bruger mekaniske kugleventiler inde i løkkerne til at fremkalde en blodgennemstrømning inde i polymerrør er allerede blevetbeskrevet 15,16. Men den samlede fordel ved den her præsenterede metode er, at den mekaniske kraft, der anvendes på blodceller og proteiner er lav, undgå hæmolyse, og der er ingen kontakt mellem blod og stik, der muligvis kan føre til flow turbulens og aktivering af blodkomponenter. De vigtigste aktiverende faktorer inde i løkken er selve testmaterialet og den luft, der er fanget inde. Dette hjælper med at minimere kilder til måling af fejl og til at levere en høj reproducerbarhed, selv om blod-luft interface kan føre til protein denaturering17. Det er også muligt at undersøge sorter af slangematerialer og stentdiametre uden længde- eller størrelsesbegrænsninger, hvilket gør det muligt at anvende rør af forskellig længde og indvendig diameter. Desuden er det også muligt at undersøge værtsømokompatibiliteter på unøjagtig sløjfelukning og eksponering for den ubestrøget røroverflade. Andre lignende medicinske anvendelser af denne in vitro hæmodynamiske loop model er, at det også kunne bruges til at studere samspillet mellem immunterapeutikika (narkotika) og blodkomponenter under enten præklinisk udvikling eller individuelle lægemiddelsikkerhed screening forud for første-i-mand fase I kliniske forsøg, eller til generering af trombusmateriale, der kan anvendes i yderligere eksperimenter18,19,20.
Denne undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til test af hæmokompatibiliteter af perfusionsrør og/eller stents. Her sammenligningen mellem ubestrøget og belagt PVC rør (hepPVC: heparin belægning, polyPVC: belægning med en bioaktiv polymer). Sænket aktivering af blodplader, men en højere aktivering af koagulationssystemet (FPA) blev fundet for begge belagte rør i forhold til de ubestrøget rør. De hepPVC rør, der anvendes her, er modificeret med kovale bundet heparin at gøre dem tromboresistant21 og har allerede været ansat i en løkke model til at optimere og karakterisere forskellige parametre22. De polyPVC rør, der anvendes i denne undersøgelse er kommercielt tilgængelige rør, der anvendes i kliniske indstillinger af ekstrakorporal blod perfusion og er belagt med en heparin polymer til at reducere deres tromicity23. Nogle gange, i kliniske applikationer selv ubestrøget PVC-rør anvendes. Derfor inkluderede vi latexrør som en positiv kontrolgruppe, der viste overdreven aktivering af blodplader, koagulationssystem og opløselige faktorer som IL-6, TNF og PMN elastase. Trombedannelse blev bemærket, da der blev simuleret løkkelukning. Dette førte til aktivering af koagulation og komplementsystem samt leukocytter og blodplader i forhold til baselinebetingelserne. Desuden førte blodkontakt til det her anvendte stentmateriale (bar metalnittolstent, dækket med kulstofimprægneret ekspanderet polytetrafluorethylen) til højere trombocyt- og leukocytaktivering i form af PMN elastase. Samlet set fremskåede den præsenterede model ikke hæmolyse i nogen af de testede vaskulære anordninger, da de kunne sammenlignes med de baseline eller statiske tilstande, bortset fra latexrørene, hvor hemolyse af røde blodlegemer (RBC) var indlysende. Desuden kan disse perfusionsrør undersøges enten ved billeddannelse eller ved histologi. Selvom histologiske evalueringer kan være mulige, fokuserede vi primært på ELISA og flowcytometri for at udføre disse eksperimenter og dermed muliggøre feasibilities af at udføre eksperimenter baseret på den her præsenterede model for mange laboratorier. Denne metode repræsenterer således en mulig metode til at teste blodbiokompatibiliteten af vaskulært medicinsk udstyr i overensstemmelse med anbefalingerne i ISO 10993-4-standarden. Desuden kan denne metode anvendes, når et samspil mellem blod og materialer bør testes under strømningsforhold, efterligne in vivo betingelser.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet på Universitetshospitalet Magdeburg (ansøgningsnummer 88/18), og de emner, der blev givet skriftligt informeret samtykke forud for blodprøvetegningsproceduren.
1. Forberedelse af heparinbestand og blodprøvetagning
- Beregn den mængde blod, der er nødvendig for hele eksperimenterne.
BEMÆRK: Næsten, 5 ml hepariniseret blod er påkrævet for hver vaskulær enhed i dubletter (sløjfer). Ligeledes kræves der 5 ml blod for hver baseline og statisk tilstand, som holdes til side ved stuetemperatur. - Der forbered en heparinbestandopløsning ved koncentrationen af 100 IE/ml ved at fortynde den ufraksevne heparin (f.eks. Brug 150 μL af denne opløsning til heparinisering af 10 ml frisk blod.
- Beregn mængden af blod samt plasma, der er nødvendige for fuldblodscelletal, ELISA og FACS-analyser.
BEMÆRK: De målinger, der er repræsenteret i denne undersøgelse, er opnået fra to sløjfer, der kører parallelt (en som dublet) med et samlet blodvolumen på 10 ml. - Baseret på den nødvendige mængde blod fyldes der 10 ml sprøjter med 150 μL heparin stock opløsning for at forhindre blodkoagulering med en endelig heparinkoncentration på 1,5 IE/ml blod.
- Tegn blod ved hjælp af en sommerfugl (størrelse: 21 G). Fyld sprøjterne meget forsigtigt for at undgå hæmolyse eller celleaktivering på grund af overdreven vakuum.
BEMÆRK: Der bør indhentes tilladelse fra det lokale etiske udvalg, inden forsøgene påbegyndes. Indhente informeret samtykke fra hver human bloddonor. Sørg for, at bloddonoren er sund og ikke tager nogen medicin, især ingen antiplatelet agenter eller ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler i mindst 10 dage før forsøgene. Bemærk, at samme donor foretrækkes, når man sammenligner forskellige typer af vaskulære enheder for første gang som præsenteret i dette manuskript. For yderligere at vurdere de inter-individuelle forskelle, kan protokollen gentages med forskellige donorer. - Opsaml blod i et glasbæger, undgå overdreven omrøring.
2. In vitro hæmodynamisk loop samling
- Fyld vandbadet, indtil vandstanden når op til midten af rotationsenheden. Vandtemperaturen indstilles til 37 °C.
- Loop samling til afprøvning af forskellige slangematerialer (polyPVC, hepVC, PVC og latex)
- Skær to 50 cm lange stykker af hvert rør materiale (indre diameter 5 mm) med rørskæreren. Sørg for, at skærefladen er flad, da dette er særligt vigtigt for perfekt lukning for løkkerne med små diametre, så blodet flyder uden forvrængning på monteringskanten.
BEMÆRK: Hele denne protokol udnytter rørene med en indre diameter på 5 mm. - For at lette håndteringen og undgå forsinkelser efter prøven efter rotation skal du kun køre fire sløjfer (2 materialer i dubletter) parallelt.
- For at generere en løkke form, sæt de åbne endelser af rørene i et kort stykke silicium rør montering den ydre diameter af efterforskningsrøret.
- Brug polycarbonatspændingsbåndene til at sikre korrekt lukning af løkkerne. Når det bruges første gang, justeres længden af båndene, så de passer til løkkens ydre diameter, ved at skære spændingsbåndet med en saks i de ønskede længder og fastgøres med en 3 mm drejningsmometer.
- Stram forsigtigt låseskruen på spændingsbåndsstikket under inspektion af rørenderne. Juster lukkekraften, så der ikke er mellemrum mellem rørenderne. Hvis låseskruen er helt strammet, og spændingen i polycarbonatbåndet virker for lav til at lukke afstanden mellem rørenderne, skal du åbne låsesystemet og skære et par mm af spændingsbåndet. Gentag dette, indtil nøjagtig sløjfelukning er opnået( Figur 1A).
- Hvis slangematerialet er meget blødt og har tendens til at glide inde i spændingsbåndene, fastgør løkken med elektrisk tape til spændingsbåndet (Figur 1B,C).
- Forbered en ekstra løkke af PVC til temperaturkontrol med de samme dimensioner som testløkkerne.
- Fastgør løkkerne i rotationsholderens løkkeholder uden for vandbadet. Derefter fastgøres løkkeholderen til rotationsenheden inde i vandbadet (Figur 1E).
- Demonter spændingsbåndet delvist fra løkkerne, og tag den ene ende af hvert rør ud for at åbne løkken.
- Fyld forsigtigt hver sløjfe med 5 ml blod med en 5 ml serologisk pipette. Bland blodet forsigtigt to gange i glasbægeret ved langsomt at pipettere op og ned, før det indlæses i løkkerne.
- Tag engangstermometeret og placer det inde i temperaturkontrolløkken. Hvis termometeret er for stort, skæres det med en saks, så det passer til mindre rør. Fyld løkken med 5 ml deioniseret vand ved stuetemperatur.
- Luk løkkerne og sørg for, om løkkerne, spændingsbåndene og rack'et er korrekt monteret.
- Indstil rotationshastigheden til 30 runder i minuttet (omdr./min.) og roter i 3 timer.
- Skær to 50 cm lange stykker af hvert rør materiale (indre diameter 5 mm) med rørskæreren. Sørg for, at skærefladen er flad, da dette er særligt vigtigt for perfekt lukning for løkkerne med små diametre, så blodet flyder uden forvrængning på monteringskanten.
- Loop samling til test af virkningen af forkert loop lukning (hul)
- Forbered fire sløjfer (polyPVC) som beskrevet i 2.2.
- Luk to af løkkerne korrekt med spændingsbåndene, og undgå mellemrum mellem rørenderne.
- For de to andre sløjfer sættes de åbne ender i det større rør som beskrevet i 2.2.3, men efterlad et mellemrum på 1-2 mm mellem løkkeenderne. Brug ikke spændingsbåndene til disse sløjfer (Figur 1D).
- Der klargør en temperaturreguleringsløkke som beskrevet i 2.2.7 og 2.2.11.
- Fyld alle løkker med blod som beskrevet i 2.2.10.
- Indstil rotationshastigheden til 30 omdrejninger i minuttet, og roter i 3 timer.
- Loop samling til stent test
- Forbered fire sløjfer som beskrevet i 2.2 og følgende.
BEMÆRK: For at vurdere stenternes biokompatibilitet i blodet skal selve slangematerialet testes for at være biokompæleligt for at forhindre maskering af celleaktivering. Hvis der ikke foreligger data, kan selve rørmaterialet testes som beskrevet i 2.2. Desuden kan diameterområdet inden for stenten anvendes (se producentens anvisninger) og skal passe til rørmaterialets indre diameter. - Åbn to af løkkerne og tag røret ud af spændingsbåndsystemet.
- Sæt stenten ind i midten af røret i henhold til producentens anvisninger.
- Brug de to andre sløjfer uden stent som kontrol. Fyld alle løkker med blod som beskrevet i 2.2.10.
- Indstil rotationshastigheden til 30 omdrejninger i minuttet, og roter i 3 timer.
- Forbered fire sløjfer som beskrevet i 2.2 og følgende.
- Temperaturkontrol
- På et hvilket som helst tidspunkt under varighed, og når rotationen er stoppet, angives blodets temperatur inde i løkkerne med termometeret inde i temperaturreguleringsløkken. For at aflæse temperaturen skal rotationen stoppes og straks aflæse den temperatur, der er angivet af termometeret.
3. Behandling af blodprøver
- Efter rotation, lad løkkerne stå i rack i 2 min i en opadgående position for at lade blodet ophobes i bunden af løkkerne, så du undgår spild, mens du åbner løkkerne.
- Undersøg blodet tilbage for statiske forhold: Hvis dette blod er koaguleret, en forkert heparinisering er i sidste ende mistænkt. I dette tilfælde gentages forsøget helst også med en anden bloddonor.
- Tag forsigtigt løkkerne ud af stativet. Åbn stikkene og lad blodet flyde ind i et 10 ml glasbæger.
- Pool blodet fra rørene, der køres i dubletter.
- Der trækkes frisk blod til baselineanalyse fra samme donor som beskrevet i 1,5 og 1,6.
- Indsamling af natriumcitratblod
- Til opsamling af natriumcitratblod fyldes der fire 1,5 ml-rør, hver med 111 μL natriumcitratopløsning indsamlet fra natriumcitratrør, for at generere en endelig koncentration på 3,2 % natriumcitrat.
- Hvert rør fyldes med 1 ml blod fra glasbægeret som beskrevet i 1.6 og 3.3.
- Hold blodet ved stuetemperatur og brug dette blod til FACS-analyser som beskrevet i 12.
BEMÆRK: For at ændre længden af løkkerne for forskellige eksperimentelle opsætninger, planlægges aliquots korrekt baseret på mængden af målinger, der skal foretages. Det kan være nødvendigt at fastsætte alle nødvendige målinger med frisk blod forud for de virkelige eksperimenter for at sikre, at mængden af blod i løkkerne er nok til alle målinger.
- Indsamling af ethylenediamintetraacetic syre (EDTA) blod- og plasmaprøver.
- Fra hvert glasbæger med blod (se 1.6 og 3.3) overføres 4,5 ml blod til et 5 ml EDTA-rør. Fyld to EDTA-rør fra hvert 10 ml glasbæger med blod.
- Bland forsigtigt blodet og hold det på is.
- Overfør 2 ml blod i et 2 ml låsecentrifugeringsrør, og dette blod anvendes til blodcelletal og fri hæmoglobinmåling som beskrevet i 5. Og 6.
- Centrifuge det resterende blod ved 3.500 x g i 20 min.
- Plasmaet opsamles forsigtigt i supernatanten i 500 μL aliquots, og fastfrysning straks ved -80 °C.
4. Scanning af elektronmikroskopi og μCT-billeder
- Efter behandling af blodprøver skylles de tømmede sløjfer, der er fremstillet som beskrevet i 2.3, med 10 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) hver.
- Skær forsigtigt en 1 cm lang prøve fra hver ende af hvert rør med en skalpel.
- Der inkuberes prøve natten over ved 4 °C i en 2% glutaraldehydopløsning.
FORSIGTIG: Indånding af aldehyder kan forårsage nasale symptomer såsom en løbende næsemåm vedvarende stuffiness og luftvejsirritation, og kontakt med huden forårsager dermatitis. Aldehyder skal håndteres i en røghætte, mens de bærer handsker, en beskyttende kjole og sikkerhedsbriller. - Skyl prøven (3 gange) med PBS.
- Der klargøres en 1% opløsning af osmium tetroxid (OsO4) i deioniseret vand og inkubere prøven i 15 minutter ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: OsO4 er et stærkt oxiderende middel, det kan reduceres ved udsættelse for lys. For at undgå reduktion under tilberedningen opbevares OsO4 i en brun glasflaske. OsO4 er ekstremt flygtig, dens dampe er giftige for øjne, næse og hals. Arbejd altid under en røghætte og brug handsker og beskyttelse af tøj, der sikrer, at ingen del af kroppen udsættes for OsO4. Kontakt din institutions retningslinjer for håndtering af bortskaffelse og opbevaring af affald. Generelt kan OsO4 opbevares i flere måneder, men har brug for særlige glasflasker med Teflon liner og en ekssiccator, fordi OsO4 kan misfarve indvendige overflader og indholdet af køleskabet i nærvær af utætte dampe. - Udtagning prøver, overfør dem i nye 15 ml centrifugerør, og skyl prøverne 3 gange med PBS.
- Forbered en række ethanol med varierende koncentrationer (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Dehydrer prøver i ethanol: inkuberes i 20 min hver i 25%, 50%, 75% og 90% og 30 min i 100%.
- Tag prøver ud af 100% ethanol og lad det lufttørre natten over ved stuetemperatur.
- Der undersøges prøver i scanningselelektromikroskopet ved en accelerationsspænding på 5 kV og med røntgen-μCT-scanneren.
5. Antal blodlegemer
- Tag 2 ml EDTA-blod opnået som beskrevet i 3.7.3
- Sæt røret i den automatiserede hæmatologi analysator og følg producentens anvisninger.
6. Måling af frit hæmoglobin (fHb) i plasma
- Optø en plasmaprøve fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5. Opbevares på is efter optøning.
BEMÆRK: Tø altid frosne plasmaprøver op i et vandbad ved 37 °C, og overfør straks til is, der indeholder noget vand, for at sænke temperaturen. Dette er vigtigt for at undgå aktivering af blodkomponenter under optøning. - Brug fHb reagens og følg producentens anvisninger. Undgå forurening efter åbning, og beskyt reagenset mod direkte lys (sol, UV-lys).
- Brug en pipetteringsordning (se producentens anvisninger) med 1:5 fortynding.
- Der tilsættes 1000 μL af hæmoglobin reagenset i en 1,6 ml semi-mikro cuvette. Brug denne kuvette til at bestemme den tomme værdi.
- Der tilsættes 1000 μL hæmoglobinrealer og 250 μL af plasmaprøven i en anden semimikrok cuvette.
- Indholdet blandes i begge kuvetter ved at skylle pipetten grundigt ved gentagne gange at fylde med reaktionsblanding og inkuberes mindst 3 min ved stuetemperatur.
- Prøvens udryddelse (E) bestemmes mod fHb reagens som blindgenser. Prøvens fHb-koncentration (mmol/l) beregnes: E540-E680 x 0,452.
7. Måling af FPA
- Tø en plasmaprøve op fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5, og opbevares på is efter optøning.
- Brug FPA Elisa-sættet, og følg producentens anvisninger.
8. Måling af sC5b9
- Tø en plasmaprøve op fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5, og opbevares på is efter optøning.
- Brug sC5b-9 ELISA-sættet, og følg producentens anvisninger.
9. Måling af PMN
- Tø en plasmaprøve op fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5, og opbevares på is efter optøning.
- Brug PMN-Elastase ELISA-sættet, og følg producentens anvisninger.
10. Måling af TNF
- Mikroplader skal belægges én dag, før ELISA'en køres. Til belægning tilsættes 100 μL indfangningsantistofopløsning til alle brønde, tætningsplade og inkuberes natten over ved 2 °C-8 °C.
- Optø en plasmaprøve fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5. Opbevares på is efter optøning.
- Brug TNF ELISA-sættet, og følg producentens anvisninger.
11. Måling af IL-6
- Mikroplader skal belægges med indfangningsantistoffer en dag før forsøget. Til belægning tilsættes 100 μL indfangningsantistofopløsning til alle brønde af den mikroplade, der er forsynet med sættet, tætningspladen og inkubering natten over ved 4 °C
- Tø en plasmaprøve op fra hver tilstand, der er opnået som beskrevet i 3.7.5. og opbevares på is efter optøning.
- Brug IL-6 ELISA-sættet, og følg producentens anvisninger.
12. FACS-analyser
- Der klargøres 500 ml FACS-buffer ved at tilsætte 10 ml føtalt kalveserum og 2 ml EDTA-opløsning (0,5 M) til 488 ml 1x PBS. FACS-bufferen kan opbevares i 4 uger ved 4°C.
- Brug 100 μL af natriumcitratblodet (se 3.6.3) for hver farvningsprocedure (monocytplade aggregater (MPA), blodpladeaktivering (PA), leukocyt integriner (LI)).
- Pipette 100 μL blod fra hver prøve i et 5 ml FACS-rør. Fra hver prøve, forberede 3 rør til antistof farvning og etiket med MPA (monocyt blodplade aggregater) panel, PA (trombocyt aggregater) panel og LI (leukocyt integrin) panel.
- Bland resten af de 4 prøver i et 5 ml FACS-rør. Brug denne blanding til uhæmmet og fluorescens minus en (FMO) kontrol.
- Der tilbereds 6 FACS-rør ved at pipettere 100 μL af det blandede prøveblod ind i hvert rør. Mærke 3 rør som uhæmmede og 3 rør som FMO-CD41, FMO-CD62P og FMO-CD162.
- Der tilsættes 100 μL 4% paraformaldehydopløsning og inkuberes i 15 min. i mørke ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: Paraformaldehyd er giftigt for hud og øjne. Det kan forårsage alvorlig lungeirritation ved indånding og kan føre til lungeskader efter længere tids eksponering. Desuden er det klassificeret som et kræftfremkaldende stof og et reproduktivt toksin. Bær altid handsker og sikkerhedsbriller og arbejd under røghætten. - Der tilsættes 1 ml vaskebuffer til hvert rør og centrifugeres ved 287 x g i 5 min. Kassér supernatanten, og gentag vasketrinnet to gange.
- For røde blodlegemer (RBC) lysis tilsættes 1 ml RBC-bufferenC lysis buffer (fortyndet 10x RBC lysis buffer i deioniseret vand), blandes ved langsomt at pipettere op og ned og inkuberes i 5 min ved RT i mørke.
- Forbered kompensation perler for enkelt pletter. Til 1 ml FACS buffer tilsættes 4 dråber af hver positiv og negativ perler. Vortex grundig og tilsæt 100 μL perler opløsning til en 5 ml FACS rør.
- Forbered 4 rør med perler og etiket som CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC og CD62P-PE. Der tilsættes 1 ml FACS-buffer til hvert rør og centrifugeres ved 287 x g i 5 min. Kassér supernatant og holde på is.
- Efter RBC lysis tilsættes 1 ml FACS-buffer til hvert rør og vaskes som beskrevet i 12.7. Kassér supernatant.
- Forbered antistof cocktails:
- MPA-panel: Der tilsættes 4 μL CD45-APC, 4 μL CD14-FITC og 4 μL CD41-BV421 til 388 μL FACS-buffer.
- PA-panel: Der tilsættes 1,6 μL CD41-BV421 og 12 μL CD62P-PE til 386,4 μL FACS-buffer.
- LI-panel: Der tilsættes 4 μL CD45-APC og 8 μL CD162-BV421 til 388 μL FACS-buffer. Hold på is.
- Forbered enkelte pletter: Tilsæt 0,5 μL til 499,5 μL FACS-buffer hver for CD14-FITC, CD41-BV421 og CD45-APC. For CD62P-PE tilsættes 0,3 μL til 499,7 μL FACS-buffer. Hold på is.
- Forbered FMO-betjeningsanvende: i) MPA-panel (FMO-CD41): Tilsæt 1 μL CD14-FITC-antistof og 1 μL CD45-APC-antistof til 98 μL FACS-buffer. ii) PA-panel (FMO-CD62P): Tilsæt 0,4 μL CD41-BV421 til 99,6 μL FACS-buffer. iii) LI-panel (FMO-CD162): Tilsæt 1 μL CD45-APC til 99 μL FACS-buffer. Hold FMO kontrol på is.
- Vortex antistof cocktails og tilsæt 100 μL af hver antistof cocktail som forberedt i 12,12 til hver af de respektive mærkede rør (MPA, PA og LI panel) som beskrevet i 12,3 og bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Hold på RT i mørke.
- Vortex enkelt plet antistof fortyndinger og tilsæt 100 μL af enkelt plet antistof fortyndinger som fremstillet i 12.13. til hvert af de respektive mærkede rør med perler som beskrevet i 12.7 og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Hold på RT i mørke.
- Vortex FMO antistof cocktails og tilsæt 100 μL af hver FMO-1 antistof cocktail som udarbejdet i 12.14. til hvert af de respektive mærkede rør (FMO-betjeningskontrol) som beskrevet i 12.5. og bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Hold på RT i mørke.
- Inkuber alle rør med antistoffarvning i 30 min. ved RT i mørke.
- Tag de tre rør til uhæmmet kontrol (se 12.4) og resuspend pellet i 250 μL FACS buffer. Hold på is.
- Efter inkubationstid vaskes alle rør undtagen uindgroede betjeningsindstillede ler med FACS-buffer som beskrevet i 12.7. Opslæmmet pellet i 250 μL FACS-buffer og anskaffe data om flowcytometeret.
- Brug uhæmmede celler til negative indstillinger og kompensation mus perler for positive indstillinger i FACS software. Brug desuden FMO til at styre gating-strategien, hvor FMO-CD41 bruges i MPA-panelet, FMO-CD62P bruges i PA-panelet, og FMO-CD162 bruges i LI-panelet.
- Erhverve næsten 0,5 x 106 - 0,25 x 106 begivenheder pr rør til FACS. Gem data og analysér med en analysesoftware (version 9.9.6).
Representative Results
Alle præsenterede data, undtagen FACS plots, blev analyseret med en statistik software. FACS-plots blev analyseret ved hjælp af flowcytometrisoftware.
Analysen af antallet af fuldblodsceller viste ingen signifikante forskelle med hensyn til erythrocytter mellem alle testede tilstande (figur 2). Men, blodplader og leukocytter blev drastisk reduceret i latex gruppen, hvilket indikerer en meget dårlig biokompatibilitet af latex. Dette understreges yderligere af forhøjede niveauer af frit hæmoglobin i latexgruppen, hvilket indikerer, at bortset fra latexgruppen førte ingen af de andre vaskulære anordninger eller tilstande til omfattende hæmolyse (Figur 2). Desuden førte de belagte PVC-rør, polyPVC og hepPVC samt den testede stent ikke til trombose ved hjælp af blodplade- og leukocyttab, mens latex udviste det højeste tab af blodplader og leukocyt, efterfulgt af ubestrøget PVC-rør, der viste en nedsat tendens.
Mens alle de testede vaskulære enheder førte til øget aktivering af koagulationssystemet (FPA) og komplementkomponent (sC5b-9), udviste hepPVC-sløjferne en tendens til nedsat niveau af FPA og sC5b-9 sammenlignet specifikt med polyPVC sløjfer (Figur 3). Interessant, ubestrøget PVC og Gap sløjfer viste lavere niveauer af FPA i forhold til polyPVC, men ikke nå niveauet for statistisk signifikans. Ikke desto mindre udviste latexsløjfe signifikant forhøjede niveauer af FPA sammenlignet med baseline og statiske forhold.
I overensstemmelse med antallet af blodceller udviste latexsløjfehøjeste niveauer af TNF, IL-6 og PMN elastase (figur 4), der nåede niveauet for statistisk signifikans sammenlignet med resten af grupperne med hensyn til TNF og IL-6 (figur 4A,B), mens statiske og baselinebetingelser i form af PMN elastase (figur 4C). Disse resultater indikerer den potente aktivering af leukocytter ved latex. De grundlæggende niveauer af aktiveringsmarkører var altid sammenlignelige med statiske forhold, hvilket indikerer en ordentlig heparinisering af blodet.
Interessant, det blev vist, at blodplader og leukocyt tæller for hul induceret sløjfer var kun lidt reduceret med moderat aktivering af koagulatoriske system (FPA) og leukocytter (PMN elastase), men forkert loop lukning med deraf følgende flow turbulens og blod kontakt til ubestrøget, ru skæreflade førte til makroskopisk synlige blodpropper på splejset (Figur 1F). Blodpropperne og dens fordeling over hele splejsningsoverfladen var tydelige med μCT- og SEM-billeder, mens der ikke blev fundet nogen blodprop, da løkkerne blev lukket med den eksterne lukkeanordning, der ikke efterlader mellemrum mellem sløjfeenderne (Figur 5).
Flow cytometrisk analyse af værtsblodceller, der var plettet med blodplade specifikke markører, CD41 og blodplade aktivering markør CD62P, er vist i figur 6A, B. Her udstillede latexrørene overordentlig høj median fluorescensintensitet (MFI) for CD62P på blodplader, efterfulgt af stent, mens heparinbelagte polyPVC-rør udviste minimal aktivering af blodplader, der skildrer polyPVC-rørs antitrombogen. Desuden blev leukocytter klassificeret på grundlag af CD45 og SSC (side scatter) baseret granularitet i i) granulocytter; ii) monocytter og (iii) lymfocytter (figur 7) og ekspressionen af CD162+ integrin blev påvist på hver delpopulation af leukocytter, der vides at interagere med CD62P på blodplader24. Det blev bemærket, at integrin udtryk blev drastisk reduceret på granulocytter og lymfocytter i latex sløjfer. Dette resultat var på linje med sænkede niveauer af de samlede frekvenser af leukocytter i latexsløjferne (Figur 2). Generelt var integrin-niveauerne højere blandt monocytter sammenlignet med granulocytter og lymfocytter, hvilket indikerer sandsynligheden for monocytinteraktion med aktiverede blodplader. I den forbindelse blev monocytpladeplade aggregats også evalueret ved farvning af blodcellerne med CD14 (som monocytmarkør) og CD41 (som trombocytmarkør) og i sidste ende at identificere dobbelt positive celler, dvs CD14+CD41+MPA (Figur 8). Her bemærkede vi, at stentgruppen udviste de højeste niveauer af CD41-udtryk på MPA, efterfulgt af latexgruppen, hvilket indikerer en øget tendens til at danne MPA, på trods af den reducerede frekvens af monocyt (<1 %) i latexløkkerne.
Figur 1: Oversigt over in vitro hæmodynamisk loop model og dens ændringer. -Løkkefor gap-eksperimentet med eksternt sløjfelukningssystem, så der ikke er hul i splejsningssystemet. (B)Loop lavet af polyPVC belagt PVC rør og stent indeni (pil). (C) Loop lavet af latex rør. (D)Loop for mellemrum eksperimentet uden den eksterne loop lukning system efterlader et mellemrum mellem røret ender (pil). (E) Loops placeret i løkken vugge inde i vandbad og fyldt med blod. (F)Trombus resulterer i et hul på splejsning (pil) efter rotation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Resultater for antallet af blodlegemer og plasma hæmoglobin. (A) Erythrocytter tæller. (B) Blodplader tæller. (F) Leukocytter tæller. D) Gratis plasma hæmoglobin. Resultaterne indikerer den dårlige biokompatibilitet af latex, hvilket fører til overdreven hæmolyse. Data præsenteres som middelværdi. fejllinjer angiver SEM. n=1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Resultater for aktivering af koagulations- og komplementsystemet. (A) Koagulationssystem aktivering, målt ved niveauer af FibrinopeptidE A (FPA) (B) Komplement systemaktivering, målt ved niveauer af sC5b-9. Mens latex rør fremkaldte betydelige forhøjede niveauer af FPA, komplement aktivering var stærk for alle testede materialer. Data præsenteres som middelværdi, fejllinjer angiver SEM. *p<0,05, n=1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Leukocyt aktiveringsmarkører. (A)Tumor nekrose faktor alpha (TNF). b) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Resultaterne indikerer øget aktivering af leukocytter på grund af forhøjede niveauer af de analyserede markører, efterfulgt af stentløkker, der kun førte til forhøjede niveauer for PMN Elastase, men ikke TNF eller IL-6. Data præsenteres som middelværdi, fejllinjer angiver SEM. *p<0.5; **p<0.01, n=1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeddannelse af løkkernes splejsning. a) μ-computer tomografi (μCT) af løkker med forkert lukning (hul). De røde områder indikerer trombemateriale. b) Gengivelse af rørets lysside. Den rektangulære markering angiver området til scanning af elektronmikroskopi (SEM) (C). d) μCT af sløjfer med ekstern sløjfelukningsanordning og ingen mellemrum ved splejsning og(E) gengivelse og visning af lysfladen. Der blev ikke fundet noget trombemateriale. (F) SEM billede af den rektangulære udvælgelse i (E). Der blev ikke fundet noget trombemateriale på skærefladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: FACS-plot til aktivering af blodplader (CD62P). a) Repræsentativt FACS-plot (grundlæggende tilstand), der viser blod-CD41+ blodpladerne. b)Graf, der viser trombocytaktiveringsstatus, der afspejles af den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af de forskellige typer vaskulære anordninger i forhold til de statiske RT- og baselineforhold. Datalinjerne præsenterer data fra enkelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: FACS-plot for leukocyt integrin (CD162). a )RepræsentativtFACS-plot (grundlæggende tilstand), der viser blodets CD45+ leukocytter og undergrupper (B) Graf, der viser leukocyt CD162+ integrin gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) af de forskellige typer vaskulære anordninger i forhold til de statiske og baseline betingelser. Datalinjerne præsenterer data fra enkelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: FACS-plot for monocytagggggregater til trombocyt (CD41/CD14). a )RepræsentativtFACS-plot (grundlæggende tilstand), der viser gatingen for blodmoncytter (CD45+/CD14+), blodplader (CD41+) og monocytpladekotelets aggregater (CD41+/CD14+)Graf,der viser CD41+ gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) på monocytplade aggregats for de forskellige vaskulære anordninger sammenlignet med statiske og baseline betingelser. Datalinjerne præsenterer data fra enkelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne undersøgelse har vist, at den præsenterede in vitro hæmodynamiske loop model tilbyder en pålidelig metode til at teste in vitro blod kompatibilitet af medicinsk udstyr i overensstemmelse med ISO 10993-4 standard.
Kritiske trin i protokollen omfatter tegning af blod og påfyldning af rørene med blod, hvor overdreven vakuum eller omrøring bør undgås for at forhindre, at blodkomponenterne aktiveres ved håndteringsproceduren. Desuden er det meget vigtigt straks at fryse plasmaprøverne og holde dem på is efter optøning, da komplement- og koagulationssystemets aktivering kan ændres ved at holde prøverne på stuetemperatur i længere tid.
Da denne model har både fordele og ulemper i forhold til andre in vitro-modeller, skal der tages hensyn til flere faktorer under udformningen af forsøgene.
For det første kan løkkerne varieres i længde og diameter, så de passer til forskellige eksperimentelle opsætninger. Hvis opsætningen omfatter kontrasterende rør med varierende indvendige diametre, skal det være for øje, at forskellene i diameter vil resultere i forskellige forskydningskræfter, hvilket påvirker koagulationen og supplerer kaskade7. For det andet blev rotationshastigheden sat til 30 omdr./min. i dette eksperiment. Dette vil resultere i en blodgennemstrømning på ca 25 cm / s, hvilket kan sammenlignes med blodgennemstrømningen hastighed i human koronararterie bypass grafts25. Stammen sats, genereret af rotation af løkkerne, er den vigtigste parameter, der vil indlede biokemiske kaskader af blodkomponenter, herunder celler og celle-fri proteiner. Men da blod er en ikke-newtonsk væske, vil stammen sats også blive påvirket af røret krumning, henholdsvis længden af de rør, der er lukket for sløjfer10. Når rotationshastigheden eller løkkens størrelse ændres, er det vigtigt at tage i betragtning, at sammenhængen mellem belastningshastighed og rotationshastighed ikke er lineær. Sammenhængen mellem rotationshastigheden og belastningshastigheden undersøges først tilstrækkeligt i dag , og der kræves yderligere undersøgelser for at undersøgedisse særligeparametre10,26,27. Men baseret på en model for laminar grænselag, den givne rørdiameter på 5 mm og rotationshastigheden på 25 cm/s, et groft skøn over vægforskydningsbelastningen (WSS ) angiver værdier mellem 2,20-22,00 pascal for en afstand på 1,00-0,01 mm til rørets væg, når blodtætheden skønnes at være 1060 kg*m-3, og den kinetiske viskositet er sat til 0,0025 pascal*s28,29. Interessant, også en mere detaljeret beregningsmæssige analyse af flow dynamik i krumning af menneskelige kranspulsårer viste WSS værdier spænder fra 11,33 til 16,77 pascal på nogenlunde sammenlignelige parametre for hastighed, tæthed og viskositet af blodet30.
Ved siden af denne begrænsning, den præsenterede loop model er et tryk mindre system, der ikke efterligner de intravaskulære blodtryksforhold af det menneskelige vaskulære system.
Næste vigtige begrænsning er, at blodet er i kontakt med luft inde i løkkerne, hvilket bringer yderligere forstyrrelser. En sådan blodluftkontakt påvirkes af to parametre, som omfatter rørrørenes gaspermeabilitet og fastholdelse af luft inde i løkkerne, mens de fyldes med blod. Hvert rørmateriale har en vis gaspermeabilitet, der kan føre til betydelige ændringer i gaskoncentrationer inde i rørene. Mens nogle forfattere, at den deraf følgende virkning af gasgennemtrængelighed på aktivering af blodkomponenter fortsater uklar 31, er det kendt, at funktionen af blodkoagulatorer er meget følsom over for en pH-skift, der kan være forårsaget af CO2 diffusion32,33,34. Her har vi testet biokompatibiliteten af blodperfusionsrør under indendørs luftforhold, der kan sammenlignes med kliniske scenarier for ekstrakorporal blodperfusion. For fremtidige forbedringer af den præsenterede model, inkubation af hele modellen i en CO2 inkubator og udfører blod pH validering før og efter inkubation kan være nyttigt at yderligere standardisere denne model.
Også, blod-luft interface inde i sløjfer kan føre til aktivering af plasma proteiner og celle fraktioner af blodet35,36. Rullepumpen drevne enheder uden luft inde i rørene kan undgå spørgsmålet om blod-luft interface, men de helt sikkert fremkalde skader på blodlegemer med betydelige forhøjede niveauer af hæmoglobin i forhold til her præsenterede loop model, og hæmoglobin i plasma kan forstyrre følsomheden af testede analyster i ELISA16. I denne undersøgelse har vi vist, at den hæmolytiske effekt af sløjfemodellen i sig selv forbliver minimal, mens du bruger biokompælelige materialer som heparinbelagte PVC-rør. Således er modellen på den ene side ikke forårsager overdreven celleskade i forhold til pumpedrevne modeller, men på den anden side inducerende plasmaproteiner på grund af blodluftkontakt. Bemærk, van Oeveren et al. udviklet en kugle-ventil baseret loop model undgå luft inde isløjferne 16. Dette lovende alternativ til den her præsenterede loop model kan løse problemet med blod-luft interface, men i forhold til den model, der præsenteres her, blodplade vedhæftning er stadig højere for bolden-ventil baseret loop model.
Med hensyn til den statiske kontrol er det en note, at glas i sig selv har vist sig at være en potent aktivator i koagulatorsystemet37. I den præsenterede opsætning førte inkubation i et glasbæger (statisk kontrol) imidlertid ikke til overdreven aktivering eller aktivering af koagulatorsystemet sammenlignet med basisniveauerne direkte efter tegning af blodet. Afslutningsvis kan det være nyttigt at bruge for eksempel polypropylenrør, hvis den statiske kontrol viser høje niveauer af aktivering.
Uanset om det er en løkke baseret eller en pumpe-drevet model, disse in vitro modeller helt mangler den autentiske biologiske interaktioner, der hovedsagelig er bidraget med en intakt endotel, som er en ideel blod kontaktflade. Rationalet bag dette spørgsmål er mere tydeligt, når et medicinsk udstyr som en stent bliver testet, hvilket kan give forskellige resultater, i form af aktivering og plasma proteiner, under sin interaktion med blodkomponenter i overværelse af endotel. Dette erklærer at være en stor ulempe ved alle diskuterede in vitro-systemer efterligne kredsløbssygdomme. Derfor, for at løse dette problem, nye mikrofluidiske systemer, der er helt dækket med endotel vinder enorm interesse, men ikke desto mindre i forhold til loop model præsenteres her, er de stadig begrænset til at rumme mindre blodmængder og minimale strømningshastigheder38,39
Således konkluderer vi, at Chandler Loop model er fortsat at være en robust model for gennemførelse af standardiserede tests på blodets biokompatibilitet af vaskulære medicinsk udstyr inden for hjerte-kar-forskning.
Disclosures
Bidragyderen [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Tyskland] ydede finansiel støtte i form af hjælpematerialer og publikationsgebyrer til forfatteren af dette manuskript [Max Wacker]. Finansieringskilderne havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsens udformning, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Ms Elena Denks for hendes tekniske bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
