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वैस्कुलर मेडिकल डिवाइसेज की हेमोसिटोकम्पेबिलिटी और होस्ट सेल एक्टिवेशन की जांच करने के लिए एक इन विट्रो हेमोडायनामिक लूप मॉडल

Published: August 21, 2020 doi: 10.3791/61570
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 4, 1, 1
1Department of Cardiothoracic Surgery, Otto-von-Guericke-University, 2Department of Mechanical Engineering, Institute for Materials and Joining Technology, Otto-von-Guericke-University, 3Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry, Otto-von-Guericke-University, 4Division of Cardiology and Angiology, Department of Internal Medicine, Otto-von-Guericke-University

Summary

यहां प्रस्तुत एक मानकीकृत इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह मॉडल आईएसओ (मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन) मानक 10993-4 के अनुसार होने के लिए परफ्यूजन ट्यूब या संवहनी स्टेंट की हीमोकंप्लाटि का परीक्षण करने की अनुमति देता है।

Abstract

इस अध्ययन में, पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) से बने 5 मिमी के भीतरी व्यास वाले ट्यूबों की हीमोक्वता और विभिन्न बायोएक्टिव संजूगेट्स के साथ लेपित अनकोटेड पीवीसी ट्यूब, लेटेक्स ट्यूब, और पीवीसी ट्यूबों के अंदर रखे गए इंट्रावैस्कुलर एप्लिकेशन के लिए एक स्टेंट की तुलना में की गई थी। हीमोकंपनि का मूल्यांकन एक इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल का उपयोग करके किया गया था जिसे आईएसओ मानक 10993-4 द्वारा अनुशंसित किया गया है। ट्यूबों को समान लंबाई के खंडों में काटा गया था और स्प्लिस में किसी भी अंतर से बचने के लिए लूप बनाने के लिए बंद कर दिया गया था, फिर मानव रक्त से भरा हुआ था और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में घुमाया गया था। इसके बाद, ट्यूबों के अंदर रक्त पूरे रक्त कोशिका गिनती, हीमोलिसिस (मुक्त प्लाज्मा हीमोग्लोबिन), पूरक प्रणाली (एससी5बी-9), जमाव प्रणाली (फाइब्रिनोपेप्टाइड ए), और ल्यूकोसिटे सक्रियण (पॉलीमॉर्फोक््यूक्लियर इलास्टेज, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर और इंटरल्यूकिन-6) के विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया। मेजबान सेल सक्रियण प्लेटलेट सक्रियण, ल्यूकोसाइट तीक्ष्ण स्थिति और मोनोसाइट प्लेटलेट के लिए निर्धारित किया गया था जो प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एकत्रित होते हैं। गलत लूप क्लोजर के प्रभाव की जांच एक्स-रे माइक्रोटोमोग्राफी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ की गई थी, जिसने स्प्लिस में थ्रोम्बस फॉर्मेशन दिखाया था । लेटेक्स ट्यूबों ने रक्त के प्लाज्मा और सेलुलर घटकों दोनों की सबसे मजबूत सक्रियता दिखाई, जो एक खराब हीमोकंप्मेंटेबिलिटी का संकेत है, जिसके बाद स्टेंट समूह और अनकोटेड पीवीसी ट्यूब्स हैं। लेपित पीवीसी ट्यूबों प्लेटलेट सक्रियण स्थिति में एक महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखा था, लेकिन अनकोटेड पीवीसी ट्यूबों की तुलना में पूरक और जमावट झरना में वृद्धि हुई दिखाया । लूप मॉडल में ही कोशिकाओं या घुलनशील कारकों की सक्रियता नहीं हुई, और हीमोलिसिस का स्तर कम था। इसलिए, प्रस्तुत इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल यांत्रिक बलों द्वारा रक्त घटकों की अत्यधिक सक्रियता से बचा जाता है और दाता रक्त और संवहनी चिकित्सा उपकरणों के बीच इन विट्रो इंटरैक्शन की जांच करने की विधि के रूप में कार्य करता है।

Introduction

चिकित्सा उपकरणों का हेमोकंप्मेंटेबिलिटी परीक्षण नए उपकरणों जैसे वैस्कुलर स्टेंट या एक्सट्राकॉर्पोरल झिल्ली ऑक्सीजन के लिए परफ्यूजन ट्यूब के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है। आज तक, पशु मॉडल को मनुष्यों में इसके कार्यान्वयन से पहले चिकित्सा उपकरणों के परीक्षण की प्रक्रिया को अंतिम रूप देने के लिए मानक उपकरण के रूप में माना जाता है। अब से, यह इन विट्रो मॉडल है कि आगे जानवरों पर जांच को कम करने में सहायता में वैकल्पिक खोजने के लिए आवश्यक है । इस अध्ययन में, हमने, विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल में एक लघु का पता लगाया है। इस प्रस्तुत विधि का लक्ष्य आईएसओ 10993-4 मानक के अनुसार चिकित्सा उपकरणों की इन विट्रो रक्त अनुकूलता का परीक्षण करना है।

आईएसओ 10993-4 मानक रक्त नमूना1पर जांच की जाने वाली नैदानिक मापदंडों के मानकीकृत सेटों का वर्णन करता है। संक्षेप में, ये थ्रोम्बोसिस (प्लेटलेट एकत्रीकरण और गिनती), जमाव (फाइब्रिनोपेप्टाइड ए, एफपीए), हेमेटोलॉजिकल विश्लेषण (पूरे रक्त कोशिका गिनती), हीमोलिसिस सूचकांक (मुक्त प्लाज्मा हीमोग्लोबिन) और पूरक प्रणाली (टर्मिनल पूरक परिसर, sC5b9) हैं। हालांकि, अतिरिक्त मार्कर, जैसे न्यूट्रोफिल पॉलीमॉर्फोक्लियर इलास्टेज (पीएमएन), इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर - अल्फा (टीएनएफ) ल्यूकोसाइट्स की सक्रियण स्थिति को दर्शाते हुए भी माप के लिए हिसाब लगाया जा सकता है। रक्त प्लाज्मा में मौजूद परिसंचारी सेल मुक्त प्रोटीन को निर्धारित करने और निर्धारित करने के लिए, सैंडविच एंजाइमेटिक लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) एक पारंपरिक और सबसे विश्वसनीय विधि का प्रतिनिधित्व करता है2,3। इसी तरह, मेजबान कोशिकाओं (जैसे, ल्यूकोसाइट्स) की फेनोटाइप और सक्रियण स्थिति को प्रवाह साइटोमेट्री (एफएएफएस) द्वारा अणुओं की कोशिका सतह अभिव्यक्ति का पता लगाकर निर्धारित किया जा सकता है जो एकल कोशिका निलंबन आधारित रीडआउट प्रदान करता है, जहां फ्लोरोसेंट लेबल विशिष्ट एंटीबॉडी लक्षित कोशिका सतह अणुओं से बांधते हैं4। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) को आईएसओ 10993-4 मानक 1 द्वारा परीक्षण सामग्री पर थ्रोम्बस गठन निर्धारित करने की भी सिफारिश कीजातीहै। इस विधि को एक्स-रे माइक्रोटोमोग्राफी (μCT) के साथ पूरित किया जा सकता है, जैसे कि थ्रोम्बस का संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए, इसकी मोटाई, आकार और स्थानीयकरण 3 डी प्रदान की गई छवि5में।

इस इन विट्रो हीमोडायनामिक मॉडल का उपयोग करने के पीछे तर्क प्लेटलेट्स जैसे रक्त घटकों की बुनियादी शारीरिक गतिशीलता को समझकर सर्वोत्तम प्रदर्शन और संगत चिकित्सा उपकरणों के लिए स्क्रीन करना है, जो प्राथमिक हीमोलासिस या ल्यूकोसाइट्स में शामिल हैं और विभिन्न प्रकार के संवहनी उपकरणों के साथ उनकी बातचीत। इस तरह के इन विट्रो सिस्टम की अत्यधिक मांग की जाती है क्योंकि वे पशु अध्ययन की आवश्यकता को कम करते हैं।

यहां प्रस्तुत लूप मॉडल इन मांगों को पूरा करता है । इस मॉडल को पहली बार 1958 में ए.B चांडलर ने रक्त थ्रोम्बी के उत्पादन के लिए वर्णित किया था और इसलिए इसे चांडलर लूप मॉडल 6 भी कहाजाताहै। अब तक, इस मॉडल का उपयोग चिकित्सा उपकरणों 7 ,8, 8, 9,10, 11 , 12,13,14की रक्त जैव अनुकूलता की जांच करने के लिए प्रयोगों और संशोधनों की एक श्रृंखला में किया गया है। इसमें पॉलीमर ट्यूब होते हैं, जो आंशिक रूप से रक्त से भरे होते हैं और फिर से क्लोबल लूप में आकार लेते हैं। ये छोरों अपने रक्तस्रावी प्रभाव के साथ संवहनी प्रवाह की स्थिति अनुकरण करने के लिए एक तापमान नियंत्रित पानी स्नान में घुमाते हैं । पॉलीमर ट्यूबों के अंदर रक्त प्रवाह को प्रेरित करने के लिए छोरों के अंदर यांत्रिक बॉल वाल्व का उपयोग करने वाले पंप चालित मॉडल या मॉडल जैसे वैकल्पिक तरीकों को पहले ही15,16वर्णित किया गया है । हालांकि, यहां प्रस्तुत विधि का समग्र लाभ यह है कि रक्त कोशिकाओं और प्रोटीन पर लागू यांत्रिक बल कम है, हीमोलिसिस से परहेज करता है, और रक्त और कनेक्टर के बीच कोई संपर्क नहीं है, जो संभवतः प्रवाह अशांति और रक्त घटकों की सक्रियता का कारण बन सकता है। लूप के अंदर मुख्य सक्रिय कारक परीक्षण सामग्री ही और हवा है कि अंदर फंस गया है । यह त्रुटि को मापने के स्रोतों को कम करने और उच्च प्रजनन क्षमता प्रदान करने में मदद करता है, भले ही रक्त-वायु इंटरफेस प्रोटीन डेनैचेशन17का कारण बन सकता है। लंबाई या आकार प्रतिबंधों के बिना टयूबिंग सामग्री और स्टेंट व्यास की किस्मों की जांच करना भी संभव है जिससे विभिन्न लंबाई और आंतरिक व्यास की ट्यूबों के उपयोग की अनुमति मिल सके। इसके अलावा, गलत लूप बंद करने और अनकोटेड ट्यूब सतह के संपर्क में आने पर होस्ट हीमोकोबिलिटी भी जांच संभव है। इस इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल के अन्य समान चिकित्सा अनुप्रयोग यह है कि इसका उपयोग पहले-मानव चरण I नैदानिक परीक्षण से पहले प्रीक्लिनिकल विकास या व्यक्तिगत दवा सुरक्षा स्क्रीनिंग के दौरान इम्यूनोथेरपीटिक्स (दवाओं) और रक्त घटकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, या थ्रोम्बस सामग्री की पीढ़ी के लिए जिसका उपयोग आगे के प्रयोगों में किया जा सकता है18,19,20।

यह अध्ययन परफ्यूजन ट्यूबों और/या स्टेंट की हीमोकोबिलिटी के परीक्षण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । यहां, अनकोटेड और कोटेड पीवीसी ट्यूबों (हेपपीवीसी: हेपरिन कोटिंग, पॉलीपीवीसी: बायोएक्टिव बहुलक के साथ कोटिंग) के बीच तुलना। प्लेटलेट्स की सक्रियता कम हो गई, लेकिन अनकोटेड ट्यूबों की तुलना में दोनों कोटेड ट्यूबों के लिए जमावट प्रणाली (एफपीए) की उच्च सक्रियता पाई गई। यहां उपयोग की जाने वाली हेपपीवीसी ट्यूबों को एक सहलेता हुआ बाध्य हेपरिन के साथ संशोधित किया जाता है ताकि उन्हें थ्रोम्बोरिस्ट21 बनाया जा सके और विभिन्न मापदंडों को अनुकूलित करने और चित्रित करने के लिए पहले से ही एक लूप मॉडल मेंनियोजितकिया जा चुका है । इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पॉलीपीवीसी ट्यूब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूब हैं जो एक्सट्राकॉर्पोरल ब्लड परफ्यूजन की नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग की जाती हैं और उनकी थ्रोम्बोजेनिसिटी23को कम करने के लिए हेपरिन बहुलक से लेपित की जाती हैं। कभी-कभी, नैदानिक अनुप्रयोगों में भी अनकोटेड पीवीसी ट्यूब का उपयोग किया जाता है। इसलिए, हमने लेटेक्स ट्यूबों को एक सकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में शामिल किया जिसमें प्लेटलेट्स, जमाव प्रणाली और आईएल-6, टीएनएफ और पीएमएन इलास्टेस जैसे घुलनशील कारकों की अत्यधिक सक्रियता दिखाई गई। थ्रॉम्बस गठन तब देखा गया जब गलत लूप क्लोजर नकली था। इससे बेसलाइन स्थितियों की तुलना में जमाव और पूरक प्रणाली के साथ-साथ ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की सक्रियता हुई। इसके अलावा, यहां इस्तेमाल किए गए स्टेंट सामग्री (नंगे धातु नितिनोल स्टेंट, कार्बन-गर्भवती विस्तारित पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन से ढके हुए) के लिए रक्त संपर्क ने पीएमएन इलास्टेस के संदर्भ में प्लेटलेट और ल्यूकोसिट सक्रियण को अधिक प्रेरित किया। कुल मिलाकर, प्रस्तुत मॉडल ने किसी भी परीक्षण किए गए संवहनी उपकरणों में हीमोलिसिस को प्रेरित नहीं किया क्योंकि वे लेटेक्स ट्यूबों को छोड़कर बेसलाइन या स्थिर स्थितियों के बराबर थे, जहां लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) हीमोलिसिस स्पष्ट था। इसके अलावा, इन पर्फ्यूजन ट्यूबों की जांच या तो इमेजिंग द्वारा या हिस्टोलॉजी द्वारा की जा सकती है। हालांकि हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन व्यवहार्य हो सकता है, हमने मुख्य रूप से एलिसा और प्रवाह साइटोमेट्री पर ध्यान केंद्रित किया ताकि इन प्रयोगों को अंजाम दिया जा सके और इस तरह कई प्रयोगशालाओं के लिए यहां प्रस्तुत मॉडल के आधार पर प्रयोगों के संचालन की व्यवहार्यता को सक्षम किया जा सके। इस प्रकार, यह विधि आईएसओ 10993-4 मानक की सिफारिशों के अनुसार संवहनी चिकित्सा उपकरणों की रक्त जैव अनुकूलता का परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार्य विधि का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग तब भी किया जा सकता है जब भी रक्त और सामग्रियों के बीच बातचीत का प्रवाह स्थितियों के तहत परीक्षण किया जाना चाहिए, वीवो स्थितियों में नकल करना।

Protocol

इस अध्ययन को विश्वविद्यालय अस्पताल मैगडेबर्ग (आवेदन संख्या 88/18) के चिकित्सा संकाय की आचार समिति और रक्त आहरण प्रक्रिया से पहले लिखित सूचित सहमति प्रदान किए गए विषयों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. हेपरिन स्टॉक तैयारी और रक्त नमूना

  1. पूरे प्रयोगों के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा की गणना करें।
    नोट: डुप्लिकेट (छोरों) में प्रत्येक संवहनी उपकरण के लिए लगभग, 5 एमएल हेपरिनाइज्ड रक्त की आवश्यकता होती है। इसी तरह, प्रत्येक बेसलाइन और स्थिर स्थिति के लिए 5 एमएल रक्त की आवश्यकता होती है जिसे कमरे के तापमान पर अलग रखा जाता है।
  2. डिएक्शन्ड पानी में बिना उल्लंघन वाले हेपरिन (जैसे, रोटेक्समीडिया) को कमजोर करके 100 आईयू/एमएल की एकाग्रता पर एक हेपरिन स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 एमएल फ्रेश ब्लड के हेपरिनाइजेशन के लिए इस घोल के 150 माइक्रोन का इस्तेमाल करें।
  3. रक्त की मात्रा के साथ-साथ प्लाज्मा की गणना करें जो पूरे रक्त कोशिका गणना, एलिसा और FACS परख के लिए आवश्यक हैं।
    नोट: इस अध्ययन में प्रतिनिधित्व माप 10 मिलीएल की कुल रक्त मात्रा के साथ समानांतर (डुप्लिकेट के रूप में एक) में चल रहे दो छोरों से प्राप्त कर रहे हैं ।
  4. रक्त की आवश्यक मात्रा के आधार पर, 1.5 आईयू/एमएल रक्त की अंतिम हेपरिन एकाग्रता के साथ रक्त जमावट को रोकने के लिए 150 माइक्रोन हेपरिन स्टॉक समाधान के साथ 10 एमएल सीरिंज भरें।
  5. तितली (आकार: 21 जी) का उपयोग करके रक्त ड्रा करें। अत्यधिक वैक्यूम के कारण हीमोलिसिस या सेल एक्टिवेशन से बचने के लिए सीरिंज को बहुत धीरे से भरें।
    नोट: प्रयोगों के शुरू होने से पहले स्थानीय नैतिक समिति से अनुमति प्राप्त की जानी चाहिए । प्रत्येक मानव रक्तदाता से सूचित सहमति प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि रक्तदाता स्वस्थ है और कोई दवा नहीं लेता है, विशेष रूप से प्रयोगों से कम से कम 10 दिनों के लिए कोई एंटीप्लेटलेट एजेंट या गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाएं नहीं लेती हैं। ध्यान दें, इस पांडुलिपि में प्रस्तुत पहली बार विभिन्न प्रकार के संवहनी उपकरणों की तुलना करते समय एक ही दाता को पसंद किया जाता है। अंतर-व्यक्तिगत मतभेदों का मूल्यांकन करने के लिए, प्रोटोकॉल को विभिन्न दानदाताओं के साथ दोहराया जा सकता है।
  6. एक गिलास बीकर में रक्त एकत्र करें, अत्यधिक आंदोलन से बचें।

2. इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप असेंबली

  1. जब तक पानी का स्तर रोटेशन इकाई के केंद्र तक नहीं पहुंच जाता तब तक पानी स्नान भरें। पानी का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. विभिन्न ट्यूबिंग सामग्रियों (पॉलीपीवीसी, हेपपीवीसी, पीवीसी और लेटेक्स) के परीक्षण के लिए लूप असेंबली
    1. ट्यूब कटर के साथ प्रत्येक ट्यूब सामग्री (आंतरिक व्यास 5 मिमी) के दो 50 सेमी लंबे टुकड़े काटें। सुनिश्चित करें कि काटने की सतह सपाट है, क्योंकि यह छोटे व्यास वाले छोरों के लिए सही बंद करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ताकि फिटिंग किनारे पर किसी भी विरूपण के बिना रक्त बहता है।
      नोट: यह पूरा प्रोटोकॉल 5 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ ट्यूबों का उपयोग करता है।
    2. हैंडलिंग को कम करने और रोटेशन के बाद नमूना प्रसंस्करण में देरी से बचने के लिए, समानांतर में केवल चार छोरों (डुप्लिकेट में 2 सामग्री) चलाएं।
    3. एक पाश आकार उत्पन्न करने के लिए, खोजी ट्यूब के बाहरी व्यास फिटिंग सिलिकॉन ट्यूब के एक छोटे टुकड़े में ट्यूबों के खुले अंत प्लग।
    4. छोरों के उचित समापन सुनिश्चित करने के लिए पॉली कार्बोनेट टेंशन बैंड का उपयोग करें। जब पहली बार के लिए इस्तेमाल किया, आवश्यक लंबाई में कैंची के साथ तनाव बैंड काटने और एक 3 मिमी टोक़ रिंच के साथ सुरक्षित द्वारा पाश के बाहरी व्यास फिट करने के लिए बैंड की लंबाई समायोजित करें ।
    5. ध्यान से ट्यूब अंत के निरीक्षण के तहत तनाव बैंड कनेक्टर के लॉकिंग पेंच कस। समापन बल को समायोजित करें ताकि ट्यूब अंत के बीच कोई अंतर न रहे। यदि लॉकिंग पेंच पूरी तरह से कड़ा हो जाता है और पॉलीकार्बोनेट बैंड का तनाव ट्यूब अंत के बीच के अंतर को बंद करने के लिए बहुत कम लगता है, तो लॉकिंग सिस्टम को खोलें और कुछ एमएम टेंशन बैंड को काट लें। इसे दोहराएं, जब तक सटीक लूप क्लोजर हासिल न हो जाए(चित्रा 1 ए)।
    6. यदि ट्यूबिंग सामग्री बहुत नरम है और तनाव बैंड के अंदर पर्ची करने के लिए जाता है, तनाव बैंड(चित्रा 1बी, सी)के लिए बिजली के टेप के साथ पाश ठीक है ।
    7. परीक्षण लूप के समान आयामों के साथ तापमान नियंत्रण के लिए पीवीसी का एक अतिरिक्त लूप तैयार करें।
    8. पानी स्नान के बाहर रोटेशन इकाई के पाश पालने में छोरों को सुरक्षित करें। इसके बाद, पानी स्नान(चित्रा 1E)के अंदर रोटेशन इकाई के लिए पाश पालना संलग्न करें ।
    9. लूप खोलने के लिए प्रत्येक ट्यूब के एक छोर को खोलने के लिए आंशिक रूप से लूप से तनाव बैंड को खत्म करें।
    10. धीरे-धीरे प्रत्येक लूप को 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 5 एमएल रक्त से भरें। छोरों में लोड होने से पहले धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ग्लास बीकर में दो बार रक्त मिलाएं।
    11. डिस्पोजेबल थर्मामीटर लें और इसे तापमान नियंत्रण लूप के अंदर रखें। यदि थर्मामीटर बहुत बड़ा है, तो छोटी ट्यूबों को फिट करने के लिए इसे कैंची से काट लें। कमरे के तापमान पर डिएकोन्ड पानी के 5 एमएल के साथ लूप भरें।
    12. छोरों को बंद करें और सुनिश्चित करें कि छोरों, तनाव बैंड और रैक ठीक से फिट हैं।
    13. प्रति मिनट (आरपीएम) 30 राउंड के लिए रोटेशन गति निर्धारित करें और 3 घंटे के लिए घुमाएं।
  3. अनुचित लूप क्लोजर (गैप) के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लूप असेंबली
    1. 2.2 में वर्णित चार छोरों (पॉलीपीवीसी) तैयार करें।
    2. तनाव बैंड के साथ दो छोरों को ठीक से बंद करें और ट्यूब अंत के बीच किसी भी अंतर से बचें।
    3. अन्य दो लूप के लिए खुले अंत को बड़ी ट्यूब में प्लग करें जैसा कि 2.2.3 में वर्णित है, लेकिन लूप अंत के बीच में 1-2 मिमी का अंतर छोड़ दें। इन छोरों(चित्रा 1D)के लिए टेंशन बैंड का उपयोग न करें।
    4. 2.2.7 और 2.2.11 में वर्णित एक तापमान नियंत्रण लूप तैयार करें।
    5. 2.2.10 में वर्णित रक्त के साथ सभी छोरों को भरें।
    6. रोटेशन की गति को 30 आरपीएम तक सेट करें और 3 घंटे के लिए घुमाएं।
  4. स्टेंट परीक्षण के लिए लूप असेंबली
    1. 2.2 में वर्णित चार छोरों और निम्नलिखित में तैयार करें।
      नोट: स्टेंट की रक्त जैव संगति का आकलन करने के लिए, टयूबिंग सामग्री को सेल सक्रियण के मास्किंग को रोकने के लिए जैव संगत होने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि कोई डेटा मौजूद नहीं है, तो ट्यूब सामग्री का परीक्षण 2.2 में वर्णित किया जा सकता है। इसके अलावा, स्टेंट के भीतर व्यास सीमा लागू किया जा सकता है (निर्माता के निर्देश देखें) और ट्यूब सामग्री के भीतरी व्यास फिट होना चाहिए।
    2. छोरों के दो खोलें और तनाव बैंड प्रणाली से बाहर ट्यूब ले।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्टेंट को ट्यूब के बीच में डालें।
    4. नियंत्रण के रूप में स्टेंट के बिना अन्य दो छोरों का उपयोग करें। 2.2.10 में वर्णित रक्त के साथ सभी छोरों को भरें।
    5. रोटेशन की गति 30 आरपीएम निर्धारित करें और 3 घंटे के लिए घुमाएं।
  5. तापमान नियंत्रण
    1. अवधि के दौरान किसी भी समय और जब रोटेशन बंद कर दिया जाता है, तो छोरों के अंदर रक्त का तापमान तापमान नियंत्रण लूप के अंदर थर्मामीटर द्वारा इंगित किया जाता है। तापमान को पढ़ने के लिए, रोटेशन को रोकें और तुरंत थर्मामीटर द्वारा इंगित तापमान को पढ़ें।

3. रक्त नमूना प्रसंस्करण

  1. रोटेशन के बाद, छोरों को ऊपर की स्थिति में 2 मिनट के लिए रैक में खड़े होने दें ताकि छोरों को खोलते समय किसी भी रिसाव से बचने के लिए छोरों के नीचे रक्त जमा हो सके।
  2. स्थिर स्थितियों के लिए छोड़े गए रक्त का निरीक्षण करें: यदि यह रक्त जमा हुआ है, तो अंततः एक अनुचित हेपरिनाइजेशन संदिग्ध है। इस मामले में, प्रयोग को अधिमानतः किसी अन्य रक्तदाता के साथ भी दोहराएं।
  3. ध्यान से रैक से बाहर छोरों ले। कनेक्टर खोलें और रक्त को 10 एमएल ग्लास बीकर में प्रवाहित होने दें।
  4. डुप्लीकेट में चलने वाली नलियों से खून पूल करें।
  5. 1.5 और 1.6 में वर्णित एक ही दाता से बेसलाइन विश्लेषण के लिए ताजा रक्त ड्रा करें।
  6. सोडियम साइट्रेट रक्त का संग्रह
    1. सोडियम साइट्रेट रक्त के संग्रह के लिए, सोडियम साइट्रेट ट्यूबों से एकत्र 111 माइक्रोन सोडियम साइट्रेट समाधान के साथ चार 1.5 एमएल ट्यूब भरें, सोडियम साइट्रेट के 3.2% की अंतिम एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए।
    2. 1.6 और 3.3 में वर्णित ग्लास बीकर्स से 1 मिली हुई रक्त के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें।
    3. कमरे के तापमान पर रक्त रखें और 12 में वर्णित के रूप में FACS विश्लेषण के लिए इस रक्त का उपयोग करें ।
      नोट: विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअप के लिए छोरों की लंबाई को बदलने के लिए, माप की मात्रा के आधार पर ठीक से अलीकोट की योजना बनाई जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए वास्तविक प्रयोगों से पहले ताजा रक्त के साथ सभी आवश्यक माप स्थापित करने के लिए आवश्यक हो सकता है छोरों में रक्त की मात्रा सभी मापों के लिए पर्याप्त है।
  7. एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक्स एसिड (ईडीटीए) रक्त और प्लाज्मा नमूनों का संग्रह।
    1. रक्त के साथ प्रत्येक ग्लास बीकर से (1.6 और 3.3 देखें) 4.5 मिलीलीटर रक्त को 5 मिलीलीटर ईडीटीए ट्यूब में स्थानांतरित करें। रक्त के साथ प्रत्येक 10 मिलीलीटर ग्लास बीकर से दो EDTA ट्यूब भरें।
    2. धीरे-धीरे खून मिलाकर बर्फ पर रख दें।
    3. 2 एमएल लॉकिंग सेंट्रलाइजेशन ट्यूब में 2 एमएल ब्लड ट्रांसफर करें और इस ब्लड का इस्तेमाल ब्लड सेल काउंट और फ्री हीमोग्लोबिन मेजरमेंट के लिए करें जैसा कि 5 में बताया गया है । और 6.
    4. 20 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर शेष रक्त अपकेंद्रित्र।
    5. ध्यान से 500 माइक्रोन एलिकोट में सुपरनैंट में प्लाज्मा इकट्ठा करें और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और μCT छवियों

  1. रक्त नमूना प्रसंस्करण के बाद, 2.3 में वर्णित खाली छोरों को फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) प्रत्येक के 10 एमएल के साथ कुल्ला करें।
  2. ध्यान से एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक ट्यूब के प्रत्येक छोर से एक 1 सेमी लंबा नमूना काट।
  3. 2% ग्लूटारल्डिहाइड समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में इनक्यूबेट नमूना।
    सावधानी: एल्डिहाइड वाष्प का साँस लेना नाक के लक्षणों का कारण बन सकता है जैसे कि नाक अयस्क लगातार घुटन और वायुमार्ग जलन, और त्वचा के संपर्क में त्वचा के साथ संपर्क त्वचा रोग का कारण बनता है। दस्ताने, एक सुरक्षात्मक गाउन और सुरक्षा चश्मे पहने हुए एल्डिहाइड को धूम-हुड में संभाला जाना चाहिए।
  4. पीबीएस के साथ नमूना (3 बार) कुल्ला।
  5. डिओनाइज्ड पानी में ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओसो4)का 1% समाधान तैयार करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट नमूना लें।
    सावधानी: ओसो4 एक मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट है, इसे प्रकाश के संपर्क में आने से कम किया जा सकता है। तैयारी के दौरान कमी से बचने के लिए, ओसो4 को भूरे रंग की कांच की बोतल में स्टोर करें। ओसो4 बेहद अस्थिर है, इसके धुएं आंखों, नाक और गले से जहरीले होते हैं। हमेशा एक धूम-हुड के तहत काम करें और दस्ताने का उपयोग करें और कपड़ों की रक्षा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि शरीर का कोई हिस्सा ओसो4के संपर्क में नहीं है। अपशिष्ट निपटान और भंडारण की हैंडलिंग के संबंध में अपनी संस्था के दिशानिर्देशों से संपर्क करें। सामान्य तौर पर, ओसो4 कई महीनों के लिए स्टोर करने योग्य है, लेकिन इसे टेफ्लॉन लाइनर और एक डिसिकेटर के साथ विशेष ग्लास बोतलों की आवश्यकता होती है, क्योंकि ओसो4 लीक धुएं की उपस्थिति में आंतरिक सतहों और रेफ्रिजरेटर की सामग्री को बदरंग कर सकता है।
  6. नमूने लें, उन्हें एक नई 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और पीबीएस के साथ 3 बार नमूने कुल्ला करें।
  7. अलग-अलग सांद्रता के साथ इथेनॉल की एक श्रृंखला तैयार करें (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
  8. इथेनॉल में निर्जलित नमूने: 25%, 50%, 75% और 90% और 100% में 30 मिनट में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  9. 100% इथेनॉल से नमूने लें और इसे कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें।
  10. 5 केवी के त्वरण वोल्टेज पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूनों की जांच करें और एक्स-रे माइक्रोसीटी स्कैनर के साथ।

5. रक्त कोशिका गिनती

  1. 3.7.3 में वर्णित EDTA रक्त का 2 मिलियन लें
  2. स्वचालित हेमेटोलॉजी एनालाइजर में ट्यूब डालें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

6. प्लाज्मा में मुफ्त हीमोग्लोबिन (एफएचबी) का मापन

  1. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है । विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर करें।
    नोट: हमेशा 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में जमे हुए प्लाज्मा नमूनों गल और तुरंत बर्फ में स्थानांतरित, कुछ पानी युक्त, तापमान कम करने के लिए । यह विगलन के दौरान रक्त घटकों की सक्रियता से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. एफएचबी रिएजेंट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। खोलने के बाद संदूषण से बचें और अभिवार्जेंट को सीधे प्रकाश (सूर्य, यूवी लाइट) से बचाएं।
  3. 1:5 कमजोर पड़ने के साथ एक पाइपिंग योजना (निर्माता के निर्देश देखें) का उपयोग करें।
  4. 1.6 एमएल सेमी-माइक्रो क्यूवेट में हीमोग्लोबिन रिएजेंट के 1000 माइक्रोल जोड़ें। खाली मूल्य निर्धारित करने के लिए इस क्यूवेट का उपयोग करें।
  5. एक अन्य अर्ध-माइक्रो क्यूवेट में हीमोग्लोबिन रिएजेंट के 1000 माइक्रोल और प्लाज्मा नमूने के 250 माइक्रोल जोड़ें।
  6. प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ बार-बार भरकर पिपेट को अच्छी तरह से फ्लश करके दोनों क्यूवेट में सामग्री मिलाएं, और कमरे के तापमान पर कम से कम 3 मिनट को इनक्यूबेट करें।
  7. एफएचबी रिएजेंट के खिलाफ नमूने के विलुप्त होने (ई) को खाली अभिवाक के रूप में निर्धारित करें। नमूने के एफएचबी-एकाग्रता (mmol/l) की गणना करें: ई540-ई680 x 0.452।

7. एफपीए का मापन

  1. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है और विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर ।
  2. एफपीए एलिसा किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

8. sC5b9 का माप

  1. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है और विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर ।
  2. SC5b-9 एलिसा किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

9. पीएमएन का मापन

  1. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है और विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर ।
  2. पीएमएन-इलास्टेज एलिसा किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

10. टीएनएफ का मापन

  1. एलिसा चलाने से एक दिन पहले माइक्रोप्लेट को लेपित करना चाहिए। कोटिंग के लिए, सभी कुओं, सील प्लेट और 2 डिग्री सेल्सियस-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करने के लिए कैप्चर एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  2. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है । विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर करें।
  3. टीएनएफ एलिसा किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

11. आईएल-6 का मापन

  1. माइक्रोप्लेट को प्रयोग से एक दिन पहले कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाना चाहिए। कोटिंग के लिए, सेट, सील प्लेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट के साथ प्रदान की माइक्रोप्लेट के सभी कुओं के लिए कैप्चर एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें
  2. गल प्रत्येक हालत से एक प्लाज्मा नमूना प्राप्त के रूप में ३.७.५ में वर्णित है । और विगलन के बाद बर्फ पर स्टोर करें।
  3. आईएल-6 एलिसा किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें..

12. FACS विश्लेषण

  1. 1x पीबीएस के 488 मिलियन भ्रूण बछड़े सीरम के 10 एमएल और ईडीटीए समाधान (0.5 एम) के 2 एमएल जोड़कर 500 एमएल एफएस बफर तैयार करें। FACS बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक धुंधला प्रक्रिया (मोनोसाइट प्लेटलेट समुच्चय (एमपीए), प्लेटलेट एक्टिवेशन (पीए), ल्यूकोसिटे इंटीग्रिन (एलआई)) के लिए सोडियम साइट्रेट रक्त (3.6.3 देखें) के 100 माइक्रोन का उपयोग करें।
  3. पिपेट प्रत्येक नमूने से 5 एमएल एफएस ट्यूब में 100 माइक्रोन रक्त। प्रत्येक नमूने से, एमपीए (मोनोसाइट प्लेटलेट एग्रीगेट्स) पैनल, पीए (प्लेटलेट समुच्चय) पैनल और ली (ल्यूकोसिटे इंटीग्रिन) पैनल के साथ एंटीबॉडी धुंधला और लेबल के लिए 3 ट्यूब तैयार करें।
  4. बाकी 4 नमूनों को एक 5 एमएल एफएस ट्यूब में मिलाएं। इस मिश्रण का उपयोग अन दाग और फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के लिए करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में मिश्रित नमूना रक्त के 100 माइक्रोन को पाइप करके 6 FACS ट्यूब तैयार करें। लेबल 3 ट्यूब के रूप में सना हुआ और FMO-CD41, FMO-CD62P और FMO-CD162 के रूप में 3 ट्यूब ।
  6. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: पैराफॉर्मल्डिहाइड त्वचा और आंखों के लिए विषाक्त है। यह सांस लेने पर गंभीर फेफड़े की जलन पैदा कर सकता है और लंबे समय तक जोखिम के बाद फेफड़ों को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, इसे कैंसरजन और प्रजनन विष के रूप में वर्गीकृत किया गया है। हमेशा दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनें और धूम हुड के नीचे काम करें।
  7. प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 1 एमएल वॉश बफर 5 मिनट के लिए 287 x g पर जोड़ें। सुपरनेट को त्यागें और दो बार धोएं।
  8. रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लाइसिस के लिए, 1x बफर आरबीसी लाइसिस बफर (डिओनाइज्ड वॉटर में पतला 10x आरबीसी लाइसिस बफर) का 1 मिलियन मिलाना, धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके और अंधेरे में आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके मिलाएं।
  9. एकल दाग के लिए मुआवजा मोती तैयार करें। FACS बफर के 1 एमसीएल करने के लिए प्रत्येक सकारात्मक और नकारात्मक मोतियों की 4 बूंदें जोड़ें। भंवर पूरी तरह से और एक 5 एमएल FACS ट्यूब के लिए मोतियों के 100 माइक्रोन समाधान जोड़ें।
  10. CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-एपीसी और CD62P-PE के रूप में मोती और लेबल के साथ 4 ट्यूब तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल का 1 एमएल ऑफ एफएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 287 x g पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्यागें और बर्फ पर रखें।
  11. आरबीसी लाइसिस के बाद, प्रत्येक ट्यूब में FACS बफर के 1 एमएल जोड़ें और 12.7 में वर्णित के रूप में धो लें। सुपरनैंट त्यागें।
  12. एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें:
    1. एमपीए पैनल: सीडी 45-एपीसी के 4 माइक्रोन, सीडी 14-फिटसी के 4 माइक्रोन और सीडी 41-बीवी421 के 4 माइक्रोन को 388 माइक्रोन ओएफएस बफर जोड़ें।
    2. पीए पैनल: सीडी 41-बीवी421 के 1.6 माइक्रोन और सीडी 62पी-पीई के 12 माइक्रोन को 386.4 माइक्रोन में जोड़ें।
    3. ली पैनल: CD45-एपीसी के 4 माइक्रोन और CD162-BV421 के 8 μL को 388 माइक्रोन सीईएफएस बफर में जोड़ें। बर्फ पर रखें।
  13. एकल दाग तैयार करें: सीडी 14-फिटसी, सीडी 41-बीवी421 और सीडी 45-एपीसी के लिए प्रत्येक के FACS बफर के 499.5 माइक्रोन में 0.5 माइक्रोन जोड़ें। CD62P-PE के लिए 499.7 μL FACS बफर के लिए 0.3 माइक्रोन जोड़ें। बर्फ पर रखें।
  14. एफएमओ नियंत्रण तैयार करें: (i) एमपीए पैनल (एफएमओ-सीडी 41): 1 μL CD14-FITC एंटीबॉडी और सीडी 45-एपीसी एंटीबॉडी के 1 μL 98 माइक्रोन FACS बफर को जोड़ें। (ii) पीए पैनल (एफएमओ-सीडी62पी): सीएफएस बफर के सीडी 41-बीवी421 से 99.6 माइक्रोन के 04 माइक्रोन जोड़ें। (iii) ली पैनल (एफएमओ-सीडी 162): सीएफएस बफर के 99 माइक्रोन में सीडी 45-एपीसी का 1 माइक्रोल जोड़ें। बर्फ पर एफएमओ नियंत्रण रखें।
  15. भंवर एंटीबॉडी कॉकटेल और प्रत्येक एंटीबॉडी कॉकटेल के १०० μL जोड़ने के रूप में संबंधित लेबल ट्यूबों (एमपीए, पीए और ली पैनल) में से प्रत्येक के लिए १२.१२ में तैयार के रूप में १२.३ में वर्णित है और धीरे से मिश्रण ऊपर और नीचे pipetting द्वारा । अंधेरे में आरटी पर रखें।
  16. भंवर एकल दाग एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और 12.13 में तैयार के रूप में एकल दाग एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोन जोड़ें। 12.7 में वर्णित मोतियों के साथ संबंधित लेबल ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा धीरे मिलाएं। अंधेरे में आरटी पर रखें।
  17. भंवर एफएमओ एंटीबॉडी कॉकटेल और 12.14 में तैयार के रूप में प्रत्येक एफएमओ-1 एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μL जोड़ें। 12.5 में वर्णित संबंधित लेबल ट्यूब (एफएमओ नियंत्रण) में से प्रत्येक के लिए। और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। अंधेरे में आरटी पर रखें।
  18. अंधेरे में आरटी में 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी धुंधला के साथ सभी ट्यूबों इनक्यूबेट ।
  19. अन दाग नियंत्रण के लिए तीन ट्यूब ले लो (12.4 देखें) और FACS बफर के 250 μL में पुनः खर्च गोली. बर्फ पर रखें।
  20. इनक्यूबेशन समय के बाद, 12.7 में वर्णित FACS बफर के साथ एक बार अन दाग नियंत्रण को छोड़कर सभी ट्यूबों को धोएं। FACS बफर के 250 μL में गोली resuspend और प्रवाह साइटोमीटर पर डेटा प्राप्त करते हैं।
  21. FACS सॉफ्टवेयर में सकारात्मक सेटिंग्स के लिए नकारात्मक सेटिंग्स और मुआवजा माउस मोती के लिए अन दागित कोशिकाओं का उपयोग करें। इसके अलावा, गेटिंग रणनीति को नियंत्रित करने के लिए एफएमओ का उपयोग करें, जहां एमपीए पैनल में एफएमओ-सीडी 41 का उपयोग किया जाता है, एफएएमओ-सीडी 62पी का उपयोग पीए पैनल में किया जाता है और एलओओ-सीडी 162 का उपयोग ली पैनल में किया जाता है।
  22. FACS के लिए प्रति ट्यूब लगभग 0.5 x10 6 - 0.25 x10 6 घटनाओं का अधिग्रहण करें। डेटा सहेजें और एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (संस्करण 9.9.6) के साथ विश्लेषण करें।

Representative Results

FACS भूखंडों को छोड़कर सभी प्रस्तुत डेटा, एक सांख्यिकी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया । एफएसीएस भूखंडों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था।

पूरे रक्त कोशिका गिनती के विश्लेषण सभी परीक्षण शर्तों(चित्रा 2)के बीच एरिथ्रोसाइट्स के संबंध में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था । लेकिन, लेटेक्स समूह में प्लेटलेट्स और ल्यूकोसाइट्स में काफी कमी आई, जो लेटेक्स की बहुत खराब बायोकंप्मेंटेबिलिटी का संकेत है। यह आगे लेटेक्स समूह में मुफ्त हीमोग्लोबिन के स्तर में वृद्धि से रेखांकित किया गया है, इस तथ्य का संकेत है कि लेटेक्स समूह को छोड़कर, अन्य संवहनी उपकरणों या शर्तों में से कोई भी व्यापक हीमोलिसिस(चित्रा 2)का नेतृत्व नहीं करता है। इसके अलावा, लेपित पीवीसी ट्यूब, पॉलीपीवीसी और हेपपीवीसी, साथ ही परीक्षण किए गए स्टेंट ने प्लेटलेट और ल्यूकोसिटे लॉस के माध्यम से थ्रोम्बोसिस का नेतृत्व नहीं किया, जबकि लेटेक्स ने उच्चतम प्लेटलेट और ल्यूकोसिटे लॉस का प्रदर्शन किया, जिसके बाद अनकोटेड पीवीसी ट्यूबों ने कम रुझान दिखाया।

जबकि सभी परीक्षण संवहनी उपकरणों ने जमाव प्रणाली (एफपीए) और पूरक घटक (एससी5बी-9) की सक्रियता में वृद्धि की, हेपपीवीसी लूप ने विशेष रूप से पॉलीपीवीसी लूप(चित्रा 3)की तुलना में एफपीए और SC5b-9 के कम स्तर के लिए एक प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है कि अनकोटेड पीवीसी और गैप लूप ने पॉलीपीवीसी की तुलना में एफपीए के निचले स्तर को दिखाया, हालांकि सांख्यिकीय महत्व के स्तर तक नहीं पहुंच पाया। फिर भी, बेसलाइन और स्थिर स्थितियों की तुलना में लेटेक्स लूप ने एफपीए के स्तर में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया।

पूरे रक्त कोशिका की गिनती के अनुसार, लेटेक्स लूप नेटीएनएफ, आईएल-6 और पीएमएन इलास्टेज(चित्रा 4)के उच्चतम स्तर का प्रदर्शन किया, जो टीएनएफ और आईएल-6(चित्रा 4,बी)के संदर्भ में बाकी समूहों की तुलना में सांख्यिकीय महत्व के स्तर तक पहुंच गया, जबकि पीएमएन इलास्टेज(चित्रा 4C)के संदर्भ में स्थिर और आधारभूत स्थितियों के लिए । ये परिणाम लेटेक्स द्वारा ल्यूकोसाइट्स की शक्तिशाली सक्रियता का संकेत देते हैं। सक्रियण मार्कर के आधारभूत स्तर हमेशा स्थिर स्थितियों के बराबर थे, जो रक्त के उचित हेपरिनाइजेशन का संकेत देते थे।

दिलचस्प बात यह है कि यह दिखाया गया था कि गैप प्रेरित लूप के लिए प्लेटलेट और ल्यूकोसिटे गिनती केवल कोगुलेटरी सिस्टम (एफपीए) और ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन इलास्टेज) के मध्यम सक्रियण के साथ थोड़ी कम हो गई थी, हालांकि अनुचित लूप क्लोजर के साथ परिणामस्वरूप प्रवाह अशांति और अनकोटेड, रफ कटिंग सतह पर मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वालेथक्के (चित्रा 1F)पर आधारित दृश्यमान थक्के थे। थक्के और पूरे स्प्लिस सतह पर इसका वितरण μCT और SEM छवियों के साथ स्पष्ट था, जबकि कोई थक्का नहीं मिला जब लूप को बाहरी समापन उपकरण के साथ बंद कर दिया गया था जिससे लूप एंडिंग(चित्रा 5)के बीच कोई अंतर नहीं रह गया था।

प्लेटलेट विशिष्ट मार्कर, सीडी 41 और प्लेटलेट एक्टिवेशन मार्कर सीडी 62पी से सना हुआ मेजबान रक्त कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण, चित्र 6ए, बीमें दिखाया गया है। यहां, लेटेक्स ट्यूबों ने रक्त प्लेटलेट्स पर CD62P के लिए बेहद उच्च औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) का प्रदर्शन किया, जिसके बाद स्टेंट, जबकि हेपरिन कोटेड पॉलीपीवीसी ट्यूबों ने पॉलीपीवीसी ट्यूबों की एंटी-थ्रोम्बोजेनिक संपत्ति को दर्शाते हुए प्लेटलेट्स की न्यूनतम सक्रियण का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, ल्यूकोसाइट्स को सीडी 45 और एसएससी (साइड स्कैटर) आधारित दानेदारता (i) दानेदारों के आधार पर वर्गीकृत किया गया था; (ii) प्लेटलेट्स 24 पर सीडी62पी के साथ बातचीत करने के लिए जाने जाने वाले ल्यूकोसाइट्स की प्रत्येक उप-जनसंख्या पर मोनोसाइट्स और (iii) लिम्फोसाइट्स(चित्रा 7)और सीडी 162+ इंटीग्रिन की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था । यह देखा गया कि लेटेक्स लूप में ग्रेनुलोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स पर इंटीग्रिन एक्सप्रेशन काफी कम हो गए थे। यह परिणाम लेटेक्स लूप(चित्रा 2)में ल्यूकोसाइट्स की कुल आवृत्तियों के निम्न स्तर के अनुरूप था। सामान्य तौर पर, ग्रेनुलोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स की तुलना में मोनोसाइट्स के बीच इंटीग्रिन का स्तर अधिक था, जो सक्रिय प्लेटलेट्स के साथ मोनोसाइट इंटरैक्शन की संभावना को दर्शाता है। इस संबंध में, मोनोसाइट प्लेटलेट एग्रीगेट का मूल्यांकन सीडी 14 (मोनोसाइट मार्कर के रूप में) और सीडी 41 (प्लेटलेट मार्कर के रूप में) के साथ रक्त कोशिकाओं को धुंधला करके और अंततः डबल पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था यानी सीडी 14+सीडी 41+एमपीए(चित्रा 8)। यहां, हमने देखा कि स्टेंट समूह ने एमपीए पर सीडी 41 अभिव्यक्ति के उच्चतम स्तर का प्रदर्शन किया, जिसके बाद लेटेक्स समूह ने मोनोसाइट की कम आवृत्ति (<1%) लेटेक्स छोरों में।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल और इसके संशोधनों का अवलोकन। (A)बाहरी लूप क्लोजिंग सिस्टम के साथ गैप प्रयोग के लिए लूप, स्प्लिस में कोई गैप नहीं छोड़ रहा है । (ख)पॉलीपीवीसी से बना लूप परमवीर चक्र ट्यूब और स्टेंट इनसाइड (तीर) से बना। (ग)लेटेक्स ट्यूब से बना लूप। (घ)बाहरी लूप क्लोजिंग सिस्टम के बिना गैप प्रयोग के लिए लूप ट्यूब एंडिंग (तीर) के बीच एक अंतर छोड़ रहा है। (ई)लूप पानी स्नान के अंदर पाश पालने में रखा और खून से भरा । (च)थ्रोम्बस जिसके परिणामस्वरूप रोटेशन के बाद स्प्लिस (तीर) पर अंतर होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: रक्त कोशिका गिनती और प्लाज्मा हीमोग्लोबिन के लिए परिणाम । (A)एरिथ्रोसाइट्स काउंट । (ख)प्लेटलेट्स काउंट। (F)ल्यूकोसाइट्स काउंट । (घ)मुफ्त प्लाज्मा हीमोग्लोबिन। परिणाम लेटेक्स की खराब जैव अनुकूलता का संकेत देते हैं, जिससे अत्यधिक हीमोलिसिस होता है। डेटा को मतलब मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; त्रुटि सलाखों SEM. n= 1 संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: जमावट और पूरक प्रणाली के सक्रियण के लिए परिणाम। (A)जमाव प्रणाली सक्रियण, फिब्रिनोपेप्टाइड ए (एफपीए)(बी)पूरक प्रणाली सक्रियण के स्तर से मापा जाता है, जिसे SC5b-9 के स्तर से मापा जाता है। जबकि लेटेक्स ट्यूबों ने एफपीए के महत्वपूर्ण ऊंचा स्तर पैदा किए, पूरक सक्रियण सभी परीक्षण सामग्रियों के लिए मजबूत था। डेटा को मतलब मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, त्रुटि सलाखों से एसईएम इंगित करता है। * पीएंडटी;0.05, एन = 1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ल्यूकोसिटे एक्टिवेशन मार्कर। (A)ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ) । (B)इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6)(C)PMN इलास्टेज। परिणाम विश्लेषण मार्कर के ऊंचा स्तर के कारण ल्यूकोसाइट्स की सक्रियता में वृद्धि का संकेत देते हैं, जिसके बाद स्टेंट लूप्स होते हैं, जिसके कारण केवल पीएमएन इलास्टेज के लिए स्तर बढ़ जाता है लेकिन टीएनएफ या आईएल-6 नहीं। डेटा को मतलब मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, त्रुटि सलाखों से एसईएम इंगित करता है। * पी एंड एलटी; 0.5; **p<0.01, n=1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: छोरों के स्प्लिस की इमेजिंग। (A)अनुचित समापन (अंतर) के साथ छोरों की μ-कंप्यूटर टोमोग्राफी (μCT) । लाल क्षेत्र थ्रोम्बस सामग्री का संकेत देते हैं। (ख)ट्यूब के चमकदार पक्ष का प्रतिपादन। आयताकार चयन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम)(सी)स्कैनिंग के लिए क्षेत्र को इंगित करता है। (घ)बाहरी लूप क्लोजिंग डिवाइस के साथ लूप का μCT और स्प्लिस में कोई अंतर नहीं, और(ई)चमकदार सतह का प्रतिपादन और दृश्य। कोई थ्रोम्बस सामग्री नहीं मिली। (एफ)आयताकार चयन की SEM छवि(ई)में । काटने की सतह पर कोई थ्रोम्बस सामग्री नहीं मिली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्लेटलेट एक्टिवेशन (सीडी 62पी) के लिए FACS प्लॉट । (ए)ब्लड सीडी41+ प्लेटलेट्स दिखाते हुए प्रतिनिधि एफएस प्लॉट (बेसिक कंडीशन) । (ख)स्थिर आरटी और आधारभूत स्थितियों की तुलना में विभिन्न प्रकार के संवहनी उपकरणों के औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) द्वारा परिलक्षित प्लेटलेट सक्रियण स्थिति को दर्शाने वाला ग्राफ । डेटा बार एकल माप से डेटा प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ल्यूकोसाइट तेग्रिन (CD162) के लिए FACS प्लॉट। (ए)प्रतिनिधि एफएएफएस प्लॉट (मूल शर्त) रक्त सीडी 45+ ल्यूकोसाइट्स और उपसमूहों(बी)ग्राफ दिखाता है कि स्थिर और आधारभूत स्थितियों की तुलना में विभिन्न प्रकार के संवहनी उपकरणों के ल्यूकोसिटे सीडी 162+ इंटीग्रिन का मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) है । डेटा बार एकल माप से डेटा प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: प्लेटलेट मोनोसाइट एग्रीगेट (सीडी 41/सीडी 14) के लिए FACS प्लॉट। (A)प्रतिनिधि FACS प्लॉट (मूल शर्त) रक्त मोनोसाइट्स के लिए गेटिंग (सीडी 45+/सीडी14+),प्लेटलेट्स (सीडी 41+)और मोनोसाइट प्लेटलेट समुच्चय (सीडी 41+ /सीडी14+)(बी)ग्राफ दिखाता है कि स्थैतिक और बेसलाइन स्थितियों की तुलना में मोनोसाइट प्लेटलेट्स एग्रीगेट पर सीडी 41+ मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) दर्शाते हैं । डेटा बार एकल माप से डेटा प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस अध्ययन से पता चला है कि प्रस्तुत इन विट्रो हीमोडायनामिक लूप मॉडल आईएसओ 10993-4 मानक के अनुसार चिकित्सा उपकरणों की इन विट्रो रक्त अनुकूलता के परीक्षण के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में रक्त की ड्राइंग और ट्यूबों को रक्त से भरना शामिल है, जहां हैंडलिंग प्रक्रिया द्वारा रक्त घटकों को सक्रियण से रोकने के लिए अत्यधिक वैक्यूम या आंदोलन से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, प्लाज्मा के नमूनों को तुरंत फ्रीज करना और उन्हें विगलन के बाद बर्फ पर रखना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि पूरक और जमावट प्रणाली सक्रियण को लंबे समय तक कमरे के तापमान पर नमूनों को रखकर छेड़छाड़ की जा सकती है।

चूंकि इस मॉडल में अन्य इन विट्रो मॉडल की तुलना में गुण और अवगुण दोनों हैं, इसलिए प्रयोगों को डिजाइन करते समय कई कारकों को ध्यान में रखना होगा।

सबसे पहले, छोरों को विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअप फिट करने के लिए लंबाई और व्यास में भिन्न किया जा सकता है। यदि सेटअप में अलग-अलग आंतरिक व्यास की विषम ट्यूब शामिल हैं, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि व्यास में अंतर के परिणामस्वरूप विभिन्न कतरनी ताकतें होंगी, जिससे जमावट प्रभावित होगी और झरना7पूरक होगा। दूसरा, इस प्रयोग में रोटेशन की गति 30 आरपीएम तय की गई थी। इसके परिणामस्वरूप लगभग 25 सेमी/एस का रक्त प्रवाह होगा, जो मानव कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्ट25में रक्त प्रवाह वेग के बराबर है । छोरों के घूर्णन से उत्पन्न तनाव दर, प्रमुख पैरामीटर है जो कोशिकाओं और सेल-मुक्त प्रोटीन सहित रक्त घटकों के जैव रासायनिक झरने शुरू करेगा। लेकिन जैसा कि रक्त एक गैर-न्यूटोनियन तरल पदार्थ है, तनाव दर ट्यूब वक्रता से भी प्रभावित होगी, क्रमशः ट्यूबों की लंबाई जो लूप10के लिए बंद हैं। जब भी रोटेशन गति या लूप आकार बदल दिया जाता है, तो यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि तनाव दर और रोटेशन गति के बीच संबंध रैखिक नहीं है। रोटेशन की गति और तनाव दर के बीच संबंधों की आज तक पर्याप्त जांच नहीं की जाती है और इन विशेष मापदंडों की जांच करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है10,26,27. हालांकि, लैमिनार सीमा परत के लिए एक मॉडल के आधार पर, 5 मिमी का दिया ट्यूब व्यास और 25 सेमी/s की रोटेशन गति, दीवार कतरनी तनाव का एक मोटा अनुमान (WS 100-001 मिमी की दूरी के लिए 2.20-22.00 पास्कल के बीच मूल्यों को इंगित करेगा जब रक्त घनत्व 1060 किलोग्राम * मीटर-3 होने का अनुमान है और काइनेटिक चिपचिपाहट 0.0025 पास्कल * एस28,29तक सेट है। दिलचस्प बात यह है कि मानव कोरोनरी धमनियों की वक्रता में प्रवाह गतिशीलता का अधिक विस्तृत कम्प्यूटेशनल विश्लेषण भी 11.33 से 16.77 पास्कल तक रक्त30के वेग, घनत्व और चिपचिपाहट के लिए लगभग तुलनीय मापदंडों पर डब्ल्यूएसएस मूल्यों को दिखाया गया।

इस सीमा के अलावा, प्रस्तुत लूप मॉडल एक दबाव कम प्रणाली है, जो मानव संवहनी प्रणाली के इंट्रावैस्कुलर रक्तचाप अनुपात की नकल नहीं करता है।

अगली महत्वपूर्ण सीमा यह है कि रक्त छोरों के अंदर हवा के संपर्क में है, जो अतिरिक्त हस्तक्षेप लाता है। इस तरह के रक्त-वायु संपर्क दो मापदंडों से प्रभावित होते हैं, जिसमें ट्यूबों की गैस पारमशीलता और उन्हें रक्त से भरते समय छोरों के अंदर हवा का बनाए रखना शामिल है। हर ट्यूब सामग्री में एक निश्चित गैस पारग्लम्यता होती है जो ट्यूबों के अंदर गैस सांद्रता में महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण बन सकती है। जबकि कुछ लेखकों का कहना है कि रक्त घटकों की सक्रियता पर गैस पारगम्यता का परिणामी प्रभाव अस्पष्ट31बना हुआ है, यह ज्ञात है कि रक्त कोगुलेटर का कार्य पीएच-शिफ्ट के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, जो सीओ 2 प्रसार32, 33,34के कारण हो सकता है। यहां, हमने इनडोर वायु स्थितियों के तहत रक्त परफ्यूजन ट्यूबों की जैव अनुकूलता का परीक्षण किया है, जो एक्सट्राकॉर्पोरल रक्त परफ्यूजन के नैदानिक परिदृश्यों के बराबर है। प्रस्तुत मॉडल के भविष्य के सुधार के लिए, एक सीओ2 इनक्यूबेटर में पूरे मॉडल के इनक्यूबेशन और पहले और इनक्यूबेशन के बाद रक्त पीएच सत्यापन प्रदर्शन इस मॉडल को आगे मानकीकृत करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

इसके अलावा, छोरों के अंदर रक्त-वायु इंटरफेस प्लाज्मा प्रोटीन और रक्त35, 36के कोशिका अंशों की सक्रियता का कारण बनसकताहै। ट्यूबों के अंदर हवा के बिना रोलर पंप संचालित उपकरण रक्त-वायु इंटरफ़ेस के मुद्दे से बच सकते हैं, लेकिन वे निश्चित रूप से यहां प्रस्तुत लूप मॉडल की तुलना में हीमोग्लोबिन के महत्वपूर्ण ऊंचा स्तर के साथ रक्त कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हैं, और प्लाज्मा में हीमोग्लोबिन एलिसा16में परीक्षण किए गए विश्लेषण की संवेदनशीलता में हस्तक्षेप कर सकता है। इस अध्ययन में हमने दिखाया है कि हेपरिन कोटेड पीवीसी ट्यूब जैसे जैव संगत सामग्रियों का उपयोग करते समय लूप मॉडल का हीमोलिटिक प्रभाव कम रहता है। इस प्रकार, मॉडल है, एक तरफ, पंप संचालित मॉडल की तुलना में अत्यधिक सेल क्षति के कारण नहीं है, लेकिन दूसरी ओर रक्त हवा के संपर्क के कारण प्लाज्मा प्रोटीन उत्प्रेरण । ध्यान दें, वैन Oeveren एट अल. एक गेंद वाल्व आधारित पाश16छोरों के अंदर हवा से परहेज मॉडल विकसित की है । यहां प्रस्तुत लूप मॉडल का यह आशाजनक विकल्प रक्त-वायु इंटरफेस की समस्या को दूर कर सकता है, हालांकि, यहां प्रस्तुत मॉडल की तुलना में, बॉल-वाल्व आधारित लूप मॉडल के लिए प्लेटलेट आसंजन अभी भी अधिक है।

स्थिर नियंत्रण के संबंध में, यह ध्यान दें कि ग्लास को स्वयं को स्कंदरात्मक प्रणाली37का एक शक्तिशाली सक्रियक दिखाया गया है। हालांकि, प्रस्तुत सेटअप में, एक ग्लास बीकर (स्टेटिक कंट्रोल) में इनक्यूबेशन रक्त खींचने के बाद सीधे बेसलाइन स्तरों की तुलना में अत्यधिक मेजबान सेल सक्रियण या स्कंदरी प्रणाली की सक्रियता नहीं हुई। अंत में, यदि स्थिर नियंत्रण सक्रियण के उच्च स्तर को दिखाता है, तो उदाहरण के लिए पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब का उपयोग करना उपयोगी हो सकता है।

भले ही यह लूप आधारित हो या पंप-चालित मॉडल, इन इन विट्रो मॉडल में पूरी तरह से प्रामाणिक जैविक बातचीत की कमी होती है जो मुख्य रूप से एक अक्षुण्ण एंडोथेलियम द्वारा योगदान दिया जाता है, जो एक आदर्श रक्त संपर्क सतह है। इस मुद्दे के पीछे तर्क अधिक स्पष्ट है जब एक स्टेंट की तरह एक चिकित्सा उपकरण का परीक्षण किया जा रहा है, जो सक्रियण और प्लाज्मा प्रोटीन के मामले में, एंडोथेलियम की उपस्थिति में रक्त घटकों के साथ अपनी बातचीत के दौरान विभिन्न परिणाम प्रदान कर सकता है । यह संचार प्रणाली की नकल करने वाले इन विट्रो सिस्टम की चर्चा की गई सभी की एक बड़ी खामी है। इसलिए, इस मुद्दे को दूर करने के लिए, नई माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम जो पूरी तरह से एंडोथेलियम से ढके हुए हैं, अपार रुचि प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन फिर भी यहां प्रस्तुत लूप मॉडल की तुलना में, वे अभी भी छोटे रक्त की मात्रा और न्यूनतम प्रवाह दरों को समायोजित करने के लिए सीमित हैं38,39

इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि चांडलर लूप मॉडल हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में संवहनी चिकित्सा उपकरणों की रक्त जैव अनुकूलता पर मानकीकृत परीक्षण करने के लिए एक मजबूत मॉडल बना हुआ है।

Disclosures

funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, जर्मनी] इस पांडुलिपि के लेखक को उपभोग्य सामग्री और प्रकाशन शुल्क के रूप में एक वित्तीय सहायता प्रदान की [मैक्स Wacker]। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, पांडुलिपि को प्रकाशित करने या तैयार करने के निर्णय में कोई अतिरिक्त भूमिका नहीं थी।

Acknowledgments

लेखक उसकी तकनीकी सहायता के लिए सुश्री ऐलेना Denks के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml tube, K3 EDTA Sarstedt 32332
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set Becton Dickinson BioSciences 552843
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512
BD LSR Fortessa II cell analyzer Becton Dickinson 647465
BD Vacutainer Citrate Tubes Becton Dickinson 369714
BD Vacutainer one-use holder Becton Dickinson 364815
BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G Becton Dickinson 367282
Beaker glass ROTILABO short 10 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X686.1
Beaker glass ROTILABO short 50 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X688.1
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody BioLegend 328808
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody BioLegend 303730
Centrifuge ROTINA 420 | 420 R Hettich Zentrifugen 4701 | 4706
Centrifuge tubes, 50 ml Greiner Bio-One GmbH 227261
CHC Super modified, 5mm PVC tubing Corline Sweden 1807-148 Referred to as hepPVC tube
Circular Precision Cutter ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 007-20
Closing Unit (complete with tension bands) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 008-20
Electric tape Scotch Super 33+ VWR MMMA331933
ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 BioLegend 430504
ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a BioLegend 430204
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray Eppendorf AG 3123000012
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray Eppendorf AG 3123000020
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow Eppendorf AG 3123000047
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue Eppendorf AG 3123000063
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow Eppendorf AG 3123000055
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet Eppendorf AG 3123000071
Ethylenediaminetetraacetic acid solution Sigma-Aldrich 03690-100ML
FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom Corning BV 352052
Fetal bovine serum Gold Plus Bio-Sell FBS.GP.0500
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 367116
Fluency plus stent 13.5 x 60 mm Angiomed GmbH & Co FVM14060
Free Hemoglobin fHb Reagent Bioanalytics GmbH 004001-0250
Gibco PBS Tablets Thermo Fisher Scientific 18912014
Gloves Vasco Nitril white L B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208437
Gloves Vasco Nitril white M B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208429
Glutaraldehyde 25% aequous solution Sigma Aldrich G6257-100ML
Heparin, 25.000 IE in 5 ml Rotexmedica, Trittau, Germany PZN 3862340
Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit Hölzel Diagnostika abx253234
Kodan tincture forte colourless Schülke & Mayr GmbH 104012
Latex tube, ID 5 mm Laborhandel24 GmbH 305 0507
Loop Stand ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 009-20
Medimex venous tourniquet classic ROESER Medical GmbH 310005
Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex Tecan TEC006418I
Microplate shaker PMS-1000i VWR 444-0041
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm VWR NALG8703-0508 Referred to as PVC tube
NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer Medical Indicators 2112-20
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated BioLegend 423501
Osmium tetroxide solution Fisher Scientific 10256970
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
PE anti-human CD16Antibody BioLegend 302008
PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody BioLegend 304906
Pipette controller, pipetus VWR 612-1874
Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5186480
Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 9409410
Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.870
Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.919
PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit Fisher Scientific BMS269
Probe stand ROTILABO combi CARL ROTH K082.1
Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 011-20
RBC Lysis Buffer (10X) BioLegend 420301
Reagent reservoirs VWR 613-1184
Rotation Unit ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 010-20
Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409320
Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409331
sc5b9 Human ELISA KIT TECOmedicalGroup A029
Scalpel no 10 Fisher Scientific NC9999403
Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG Philips n.a.
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X715.1
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X714.1
Semi-micro cuvette 1.6 ml Sarstedt 67.746
Serological pipette 10.0 ml Corning BV 4488
Serological pipette, 25.0 ml Corning BV 4489
Serological pipette, 5.0 ml Corning BV 4487
Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm VWR BURK8803-0812
Sprout mini centrifuge Biozym 552034
Stop Solution for TMB Substrate BioLegend 77316
Swabs, sterile Fuhrmann GmbH 32055
Syringe, 10 ml Becton Dickinson 300296
Temperature controlled water basin ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 020-20
tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics Fisher Scientific 10000730
TMB Substrate Set BioLegend 421101
Trillium PVC tube, 5 mm ID Medtronic 161100107100103 Referred to as polyPVC tube
Tween 20 AppliChem A4974,0250
UV-Vis Spektrometer Lambda 2 Perkin Elmer 33539
Vornado Mini Vortexer Biozym 55BV101-B-E
XN-3000 workstation blood analyzer Sysmex Europe n.a.
μ-CT Phoenix Nanotom S GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany n.a.

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