Summary
Burada sunulan bir standart in vitro hemodinamik döngü modeli için bir protokoldür. Bu model perfüzyon tüpleri veya vasküler stentlerin hemouyumluluğunun ISO (International Organization for Standardization) standardı 10993-4'e uygun olarak test edilmesine olanak sağlar.
Abstract
Bu çalışmada, polivinil klorürden (PVC) yapılmış ve farklı biyoaktif konjugatlarla kaplanmış 5 mm'lik iç çapı olan tüplerin hemouyumluluğu, pvc tüplerin içine yerleştirilen intravasküler uygulama için kaplamasız PVC tüpler, lateks tüpler ve bir stent ile karşılaştırıldı. Hemokompatiyonisin değerlendirilmesi ISO standardı 10993-4 tarafından önerilen in vitro hemodinamik döngü modeli kullanılarak yapıldı. Tüpler aynı uzunlukta parçalar halinde kesilmiş ve splice herhangi bir boşluk kaçınarak döngüler oluşturmak için kapalı, daha sonra insan kanı ile doldurulmuş ve 37 °C'de bir su banyosunda 3 saat döndürülür. Daha sonra tüplerin içindeki kan tam kan hücre sayımı, hemoliz (serbest plazma hemoglobini), kompleman sistemi (sC5b-9), koagülasyon sistemi (fibrinopeptid A) ve lökosit aktivasyonu (polimorfonükleer elastaz, tümör nekroz faktörü ve interlökin-6) analizi için toplandı. Trombosit aktivasyonu, lökosit integrin durumu ve akış sitometrisi kullanılarak monosit trombosit agregaları için konak hücre aktivasyonu belirlendi. Yanlış döngü kapanmasının etkisi x-ışını mikrotomografisi ve taramalı elektron mikroskobu ile incelendi, bu da splice'de trombüs oluşumunu gösterdi. Lateks tüpleri, hem plazma hem de hücresel kan bileşenlerinin en güçlü aktivasyonunu gösterdi, bu da kötü bir hemokomuuyumolduğunu gösteriyor, bunu stent grubu ve kaplamasız PVC tüpler izledi. Kaplamalı PVC tüpler trombosit aktivasyon durumunda önemli bir azalma göstermedi, ancak kaplamasız PVC tüplere göre kompleman ve pıhtılaşma basamaklarında artış gösterdi. Döngü modelinin kendisi hücrelerin aktivasyonuna veya çözünen faktörlere yol açmadı ve hemoliz düzeyi düşüktü. Bu nedenle, sunulan in vitro hemodinamik döngü modeli mekanik kuvvetler tarafından kan bileşenlerinin aşırı aktivasyon unu önler ve donör kan ve vasküler tıbbi cihazlar arasındaki in vitro etkileşimleri araştırmak için bir yöntem olarak hizmet vermektedir.
Introduction
Tıbbi cihazların hemokomupati testi, ekstrakorporeal membran oksijenasyonu için vasküler stent ler veya perfüzyon tüpleri gibi yeni cihazların geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Bugüne kadar, hayvan modelleri insanlarda uygulanmadan önce tıbbi cihazların test prosedürü sonuçlandırmak için standart araçlar olarak kabul edilir. Bundan böyle, hayvanlar üzerinde yapılan araştırmaların en aza indirilmesine yardımcı olacak alternatif in vitro modelleri bulmak gerekmektedir. Bu çalışmada, bu nedenle, bir minyatür in vitro hemodinamik döngü modeli araştırdık. Sunulan bu yöntemin amacı, tıbbi cihazların in vitro kan uyumluluğunu ISO 10993-4 standardına uygun olarak test etmektir.
ISO 10993-4 standardı, kan örneğinde araştırılacak standart klinik parametreler kümelerini tanımlar1. Kısaca tromboz (trombosit agregasyonu ve sayısı), koagülasyon (fibrinopeptid A, FPA), hematolojik analiz (tam kan hücre sayımı), hemoliz indeksi (serbest plazma hemoglobin) ve kompleman sistemi (terminal kompleman kompleksi, sC5b9). Ancak, nötrofil polimorfonükleer elastaz (PMN), interlökin 6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü - lökositlerin aktivasyon durumunu yansıtan alfa (TNF) gibi ek belirteçler de ölçümler için hesaplanabilir. Belirlemek ve kan plazmasında mevcut dolaşan hücre serbest proteinleri ölçmek için, sandviç enzimatik bağlı immünosorbent tahsiyon (ELISA) geleneksel ve en güvenilir yöntem2temsil ,3. Aynı şekilde, konak hücrelerin fenotip ve aktivasyon durumu (örneğin, lökositler) akış sitometri (FACS) tarafından moleküllerin hücre yüzey ekspresyonunu tespit ederek ölçülebilir tek hücre süspansiyon tabanlı okumalar sağlar, floresan etiketli belirli antikorlar hedeflenen hücre yüzey molekülleri bağlı4. IsO 10993-4 standart1ile test edilen malzemede trombüs oluşumunu belirlemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) de önerilir. Bu yöntem X-ışını mikrotomografisi (μCT) ile tamamlanabilir, trombüs örneğin, kalınlığı, boyutu ve lokalizasyonu için yapısal analiz yapmak için 3D render görüntü5.
Bu in vitro hemodinamik modeli kullanmanın ardındaki mantık, primer hemostaz veya lökositler ile ilgili trombositler ve farklı vasküler cihazlarla etkileşimi olan trombositler gibi kan bileşenlerinin temel fizyolojik dinamiklerini anlayarak en iyi performans gösteren ve uyumlu tıbbi cihazları taramaktır. Bu tür in vitro sistemleri hayvan çalışmaları için ihtiyacı azaltmak gibi son derece talep edilmektedir.
Burada sunulan döngü modeli bu talepleri karşılar. Bu model ilk olarak 1958 yılında A.B. Chandler tarafından kan trombüsünün üretimi için tanımlanmıştır ve bu nedenle Chandler Loop modeli6olarak da adlandırılır. Şimdiye kadar, bu model tıbbi cihazların kan biyouyumluluğunu araştırmak için deneyler ve değişiklikler bir dizi kullanılmıştır7,8,9,10,11,12,13,14. Kısmen kanla doldurulmuş ve yeniden tıkalı döngülere dönüşen polimer tüplerden oluşur. Bu döngüler, hemorheolojik etkileri ile vasküler akış koşullarını simüle etmek için sıcaklık kontrollü bir su banyosunda döner. Pompa tahrikli modeller veya polimer tüpler içinde bir kan akışını neden döngüler içinde mekanik bilyalı vanalar kullanan modeller gibi alternatif yöntemler zaten tarif edilmiştir15,16. Ancak, burada sunulan yöntemin genel avantajı, kan hücreleri ve proteinlere uygulanan mekanik kuvvetin düşük olması, hemolizden kaçınılması ve kan ve konektörler arasında herhangi bir temas olmamasıdır, bu da muhtemelen akış türbülanslarına ve kan bileşenlerinin aktivasyonuna yol açabilir. Döngü içindeki ana aktive edici faktörler test materyalinin kendisi ve içinde sıkışıp kalan havadır. Bu ölçüm hata kaynaklarını en aza indirmek ve yüksek tekrarlanabilirlik sunmak için yardımcı olur, kan-hava arayüzü protein denatürasyonu yol açabilir bile17. Uzunluk veya boyut kısıtlaması olmaksızın tüp malzeme çeşitlerinin ve stent çaplarının araştırılması da mümkündür. Ayrıca, yanlış döngü kapatma ve kaplamasız tüp yüzeyine maruz kalma konak hemouyumlulukları araştırmak da mümkündür. Bu in vitro hemodinamik döngü modelinin diğer benzer tıbbi uygulamalar da immünoterapötikler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir olmasıdır (ilaçlar) ve kan bileşenleri ilk-in-man faz I klinik deneme öncesinde ya preklinik gelişim veya bireysel ilaç güvenliği taraması sırasında, ya da daha fazla deney de kullanılabilir trombüs malzeme üretimi için18,19,20.
Bu çalışmada perfüzyon tüpleri ve / veya stent hemouyumlulukları test etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Burada, kaplamasız ve kaplamalı PVC tüpler (hepPVC: heparin kaplama, poliPVC: biyoaktif polimer ile kaplama) arasındaki karşılaştırma. Trombositlerin indirilmiş aktivasyonu, ancak pıhtılaşma sisteminin daha yüksek aktivasyonu (FPA) kaplamasız tüplere kıyasla her iki kaplamalı tüp için de bulunmuştur. Burada kullanılan hepPVC tüpler kovalent bağlı heparin ile trombodirençli21 yapmak için modifiye edilir ve zaten optimize etmek ve farklı parametreleri karakterize etmek için bir döngü modeli nde istihdam edilmiştir22. Bu çalışmada kullanılan poliPVC tüpler, ekstrakorporeal kan perfüzyonunun klinik ortamlarında kullanılan ticari olarak mevcut tüplerdir ve trombojenitelerini azaltmak için heparin polimer ile kaplanır23. Bazen klinik uygulamalarda kaplamasız PVC tüpler bile kullanılır. Bu nedenle trombositlerin aşırı aktivasyonu, pıhtılaşma sistemi ve IL-6, TNF ve PMN elastaz gibi çözünür faktörleri gösteren pozitif kontrol grubu olarak lateks tüpleri dahil ettik. Yanlış döngü kapatma simüle edildiğinde trombüs oluşumu fark edildi. Bu da koagülasyon ve kompleman sisteminin aktivasyonunun yanı sıra taban koşulları ile karşılaştırıldığında lökosit ve trombositlerin aktivasyonuna yol açmıştır. Ayrıca, burada kullanılan stent malzemeye kan teması (çıplak metal nitinol stent, karbon emdirilmiş genişletilmiş politetetrafloroetilen ile kaplı) PMN elastaz açısından daha yüksek trombosit ve lökosit aktivasyonuna yol açtı. Genel olarak, sunulan model, kırmızı kan hücresi (RBC) hemolizi bariz olduğu lateks tüpleri dışında, bazal veya statik koşullarla karşılaştırılabilir olarak test edilen vasküler cihazların hiçbirinde hemolizi neden olmadı. Ayrıca bu perfüzyon tüpleri görüntüleme veya histoloji ile incelenebilir. Histolojik değerlendirmeler mümkün olsa da, daha çok elisa ve akış sitometrisi üzerinde yoğunlaştık ve böylece birçok laboratuvar için burada sunulan modele dayalı deneylerin yürütülmesinin fizibilitelerini sağladık. Bu yöntem, vasküler tıbbi cihazların kan biyouyumluluğunu ISO 10993-4 standardının önerileri doğrultusunda test etmek için uygulanabilir bir yöntemi temsil eder. Ayrıca, bu yöntem kan ve malzemeler arasındaki etkileşim akış koşulları altında test edilmelidir zaman kullanılabilir, in vivo koşulları taklit.
Protocol
Bu çalışma, Üniversite Hastanesi Magdeburg Tıp Fakültesi Etik Kurulu (başvuru numarası 88/18) ve kan çekme işleminden önce yazılı bilgilendirilmiş onay verilen konular tarafından onaylanmıştır.
1. Heparin stok hazırlama ve kan örneklemesi
- Tüm deneyler için gereken kan miktarını hesaplayın.
NOT: Çoğaltılmış (döngüler) her vasküler cihaz için neredeyse 5 mL heparinize kan gereklidir. Aynı şekilde, oda sıcaklığında bir kenara tutulan her bazin ve statik durum için 5 mL kan gereklidir. - Deiyonize suda kırılmamış heparini (örneğin Rotexmedia) seyrelterek 100 IU/mL konsantrasyonunda bir heparin stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL taze kanın heparinizasyonu için bu çözeltinin 150 μL'sini kullanın.
- Tam kan hücresi sayımı, ELISA ve FACS tahlilleri için gerekli olan kan miktarını ve plazma miktarını hesaplayın.
NOT: Bu çalışmada temsil edilen ölçümler, toplam kan hacmi 10 mL olan paralel (biri mükerrer) iki ilmekten elde edilir. - Kan miktarına bağlı olarak, 10 mL şırıngaları 150 μL heparin stok çözeltisi ile doldurun ve kan pıhtılaşmasını 1,5 IU/mL kan ile önleyin.
- Kelebek kullanarak kan çizin (boyut: 21 G). Aşırı vakum nedeniyle hemolizi veya hücre aktivasyonunu önlemek için şırıngaları çok hafifçe doldurun.
NOT: Deneyler başlamadan önce yerel etik kuruldan izin alınmalıdır. Her insan kan bağışçısından bilgilendirilmiş onay alın. Kan donörü sağlıklı olduğundan emin olun ve herhangi bir ilaç almaz, deneylerden önce en az 10 gün boyunca antiplatelet ajanlar veya non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar. Bu yazıda ilk kez farklı vasküler cihazlar karşılaştırılırken aynı donör tercih edilmektedir. Bireysel farklılıkları daha fazla değerlendirmek için protokol farklı bağışçılarla tekrarlanabilir. - Bir cam kabında kan toplamak, aşırı ajitasyon kaçının.
2. In vitro hemodinamik döngü montajı
- Su seviyesi dönme ünitesinin merkezine ulaşana kadar su banyosunu doldurun. Su sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- Farklı boru malzemelerini (polyPVC, hepPVC, PVC ve lateks) test etmek için döngü montajı
- Her tüp malzemesinden (iç çap 5 mm) iki adet 50 cm uzunluğunda ki parçayı boru kesiciile kesin. Kesme yüzeyinin düz olduğundan emin olun, çünkü bu özellikle küçük çaplı döngüler için mükemmel bir kapatma için önemlidir, böylece kan montaj kenarında herhangi bir bozulma olmadan akar.
NOT: Bu protokolün tamamı, iç çapı 5 mm olan tüpleri kullanır. - İşlemi kolaylaştırmak ve döndürme den sonra numune sonrası işlem gecikmesini önlemek için, paralel olarak yalnızca dört döngü (yinelenen 2 malzeme) çalıştırın.
- Bir döngü şekli oluşturmak için, tüplerin açık uçları nın araştırma tüpünün dış çapına uygun silikon tüpün kısa bir parçasına takın.
- Döngülerin düzgün kapanmasını sağlamak için polikarbonat gerilim bantlarını kullanın. İlk kez kullanıldığında, gerilim bandını makasla keserek, ilmek dış çapına uyacak şekilde bantların uzunluğunu ayarlayın ve 3 mm tork anahtarı yla sabitlein.
- Gerilim bandı konektörünün kilitleme vidasını, tüp uçlarının incelenmesi altında dikkatlice sıkın. Kapanış kuvvetini, tüp uçları arasında boşluk kalmayacak şekilde ayarlayın. Kilitleme vidası tamamen sıkılırsa ve polikarbonat bandının gerilimi tüp uçları arasındaki boşluğu kapatamayacak kadar düşük görünüyorsa, kilitleme sistemini açın ve gerilim bandının birkaç mm'sini kesin. Bunu, doğru döngü kapatma elde edilene kadar tekrarlayın (Şekil 1A).
- Boru malzemesi çok yumuşaksa ve gerilim bantlarının içine kayma eğilimindeyse, gerilim bandına elektrik bandı ile döngüyü düzeltin(Şekil 1B,C).
- Test döngüleriyle aynı boyutlarda sıcaklık kontrolü için ek bir PVC döngüsü hazırlayın.
- Dönme ünitesinin döngü beşiğindeki döngüleri su banyosunun dışında sabitleyin. Bundan sonra, döngü beşiği su banyosu içindeki dönme ünitesine takın (Şekil 1E).
- Gerilim bandını kısmen döngülerden çıkarın ve döngüyü açmak için her tüpün bir ucunu çıkarın.
- Her döngüyü 5 mL kan la 5 mL serolojik pipetle hafifçe doldurun. Halkalara yüklemeden önce yavaşça yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak kanı cam kabında yavaşça iki kez karıştırın.
- Tek kullanımlık termometreyi alın ve sıcaklık kontrol halkasının içine yerleştirin. Termometre çok büyükse, daha küçük tüpleri sığdırmak için makasla kesin. Döngüyü oda sıcaklığında 5 mL deiyonize su ile doldurun.
- Döngüleri kapatın ve döngülerin, gerilim bantlarının ve rafın düzgün şekilde takılı olup olmadığından emin olun.
- Dönüş hızını dakikada 30 mermiye (rpm) ayarlayın ve 3 saat döndürün.
- Her tüp malzemesinden (iç çap 5 mm) iki adet 50 cm uzunluğunda ki parçayı boru kesiciile kesin. Kesme yüzeyinin düz olduğundan emin olun, çünkü bu özellikle küçük çaplı döngüler için mükemmel bir kapatma için önemlidir, böylece kan montaj kenarında herhangi bir bozulma olmadan akar.
- Yanlış döngü kapatma (boşluk) etkisini test etmek için döngü montajı
- 2.2'de açıklandığı gibi dört döngü (polyPVC) hazırlayın.
- İki döngüyü gerilim bantlarıyla düzgün bir şekilde kapatın ve tüp uçları arasındaki boşluktan kaçının.
- Diğer iki döngü için 2.2.3'te açıklandığı gibi açık uçları büyük tüpe takın, ancak döngü uçları arasında 1-2 mm'lik bir boşluk bırakın. Bu döngüler için gerilim bantları kullanmayın (Şekil 1D).
- 2.2.7 ve 2.2.11'de açıklandığı gibi bir sıcaklık kontrol döngüsü hazırlayın.
- 2.2.10'da açıklandığı gibi tüm döngüleri kanla doldurun.
- Dönüş hızını 30 rpm'e ayarlayın ve 3 saat döndürün.
- Stent testi için döngü montajı
- 2.2 ve aşağıdaki açıklandığı gibi dört döngüler hazırlayın.
NOT: Stentlerin kan biyouyumluluğunu değerlendirmek için, hücre aktivasyonunun maskelemesini önlemek için tüp materyalinin kendisi biyouyumlu olacak şekilde test edilmelidir. Veri yoksa, tüp malzemenin kendisi 2.2'de açıklandığı şekilde test edilebilir. Ayrıca, stent içindeki çap aralığı uygulanabilir (üreticinin talimatlarına bakınız) ve tüp malzemenin iç çapına uygun olmalıdır. - Döngülerden ikisini açın ve tüpü gerilim bandı sisteminden çıkarın.
- Üreticinin talimatlarına göre stenti tüpün ortasına takın.
- Kontrol olarak stent olmadan diğer iki döngü kullanın. 2.2.10'da açıklandığı gibi tüm döngüleri kanla doldurun.
- Dönüş hızını 30 rpm'e ayarlayın ve 3 saat döndürün.
- 2.2 ve aşağıdaki açıklandığı gibi dört döngüler hazırlayın.
- Sıcaklık kontrolü
- Süre boyunca ve rotasyon durdurulduğunda herhangi bir zamanda, döngülerin içindeki kanın sıcaklığı sıcaklık kontrol döngüsü içindeki termometre ile gösterilir. Sıcaklığı okumak için, döndürmeyi durdurun ve termometrenin gösterdiği sıcaklığı hemen okuyun.
3. Kan örneği işleme
- Döndükten sonra, döngüler 2 dakika boyunca rafta bekletin ve kan döngülerin altında birikmesini sağlar ve döngüleri açarken dökülmeyi önler.
- Statik koşullar için sol kan inceleyin: Bu kan pıhtılaşmış ise, uygunsuz bir heparinizasyon sonuçta şüphelenilir. Bu durumda, tercihen başka bir kan donörü ile de deneyi tekrarlayın.
- Döngüleri dikkatlice raftan çıkar. Konektörleri açın ve kanın 10 mL cam kabına akmasına izin verin.
- Yinelenen tüplerden gelen kanı birleştirin.
- 1.5 ve 1.6'da açıklandığı gibi aynı donörden temel analiz için taze kan çekin.
- Sodyum sitrat kanı toplama
- Sodyum sitrat kanının toplanması için, sodyum sitrat tüplerinden toplanan 111°L sodyum sitrat çözeltisi ile her biri 1,5 mL'lik dört tüpü doldurun ve sodyum sitratın %3,2'sini kesin olarak toplayın.
- Her tüpü 1.6 ve 3.3'te açıklandığı gibi cam gagalardan 1 mL kan ile doldurun.
- Oda sıcaklığında kan tutun ve 12 açıklandığı gibi FACS analizleri için bu kan kullanın.
NOT: Farklı deneysel kurulumlar için döngülerin uzunluğunu değiştirmek için, yapılacak ölçümlerin miktarına göre düzgün bir şekilde aliquots planlayın. Döngülerde kan hacmitüm ölçümler için yeterli olduğundan emin olmak için gerçek deneyler öncesinde taze kan ile gerekli tüm ölçümleri kurmak gerekli olabilir.
- Etilendimintetraasetik asit (EDTA) kan ve plazma örneklerinin toplanması.
- Kan ile her cam kabından (bakınız 1.6 ve 3.3) bir 5 ml EDTA tüpü içine kan 4.5 ml transfer. Her 10 ml cam kabından iki EDTA tüpünü kanla doldurun.
- Kanı yavaşça karıştırın ve buzda tutun.
- 2 mL'lik bir kanın 2 mL kilitlenme santrifüj tüpüne aktarılması ve bu kanın kan hücresi sayımı ve 5'te açıklandığı gibi serbest hemoglobin ölçümü için kullanılması. Ve 6.
- Kalan kanı 20 dk için 3.500 x g olarak santrifüj edin.
- Plazmayı 500°L aliquots'ta dikkatlice toplayın ve -80 °C'de hemen dondurun.
4. Taramalı elektron mikroskobu ve μCT görüntüleri
- Kan örneği işleme işleminden sonra, her biri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2,3'te tarif edildiği gibi hazırlanan boşdöngüleri durular.
- Her tüpün her iki ucundan 1 cm uzunluğunda bir numuneyi neşterle dikkatlice kesin.
- %2 glutaraldehit çözeltisi içinde 4 °C'de tüplü numune.
DİkKAT: Aldehit buharlarının solunması burun cevheri nin sürekli tıkanması ve hava yolu tahrişi gibi burun semptomlarına neden olabilir ve deri ile temas dermatite neden olur. Eldiven, koruyucu gece elbisesi ve güvenlik gözlüğü giyerken aldehitler duman kaputu içinde kullanılmalıdır. - Örneği (3 kez) PBS ile durulayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca deiyonize su ve kuluçka numunesinde %1 oranında osmiyum tetroksit (OsO4)çözeltisi hazırlayın.
DİkKAT: OsO4 güçlü bir oksitleyici maddedir, ışığa maruz kalarak azaltılabilir. Hazırlık sırasında azalmaönlemek için, kahverengi bir cam şişede OsO4 saklayın. OsO4 son derece uçucu, onun dumanları gözler, burun ve boğaz için toksik. Her zaman bir duman-başlık altında çalışmak ve eldiven kullanın ve giyim koruma, vücudun hiçbir parçası OsO4maruz kalmasını sağlamak. Atık bertaraf ve depolama nın işlenmesiyle ilgili olarak kurumunuzun yönergelerine başvurun. Genel olarak, OsO4 birkaç ay için saklanabilir, ama Teflon astar ve kurutucu ile özel cam şişeler ihtiyacı var, OsO4 sızdıran dumanlar varlığında iç yüzeyleri ve buzdolabı içeriğini renklendirebilir çünkü. - Örnekleri alın, 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve pbs ile 3 kez durulayın.
- Değişen konsantrasyonlarda bir dizi etanol hazırlayın (%25, %50, %75, %95, %100)
- Etanolde dehidrat örnekleri: 20 dk her biri için %25, %50, %75 ve %90 ve %100'de 30 dk kuluçka.
- % 100 etanol örnekleri alın ve oda sıcaklığında bir gecede kuru hava sağlar.
- Taramalı elektron mikroskobundaki örnekleri 5 kV'luk bir ivme gerilimi ve X-ışını μCT tarayıcısı ile inceleyin.
5. Kan hücresi sayısı
- 3.7.3'te açıklandığı şekilde elde edilen EDTA kanının 2 mL'sini alın
- Tüpü otomatik hematoloji analizörüne yerleştirin ve üreticinin talimatlarına uyun.
6. Plazmada serbest hemoglobin (fHb) ölçümü
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin. Eritmeden sonra buz üzerinde saklayın.
NOT: 37 °C'de bir su banyosunda dondurulmuş plazma örneklerini her zaman eritin ve sıcaklığı düşürmek için hemen biraz su içeren buza aktarın. Bu çözülme sırasında kan bileşenlerinin aktivasyonu önlemek için önemlidir. - fHb reaktifini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun. Açtıktan sonra kontaminasyonu önleyin ve reaktifi doğrudan ışığa (güneş, UV ışığı) karşı koruyun.
- 1:5 seyreltme ile bir pipetleme şeması kullanın (üreticinin talimatlarına bakın).
- 1.6 mL yarı mikro cuvette hemoglobin reaktif1000 μL ekleyin. Boş değeri belirlemek için bu cuvette kullanın.
- 1000 μL hemoglobin reaktifi ve plazma örneğinin 250 μL'sini başka bir yarı mikro cuvette ekleyin.
- Pipeti tekrar tekrar reaksiyon karışımıyla doldurarak her iki cuvettes içinde karıştırın ve oda sıcaklığında en az 3 dakika kuluçka.
- FHb reaktifine karşı numunenin (E) boş reaktif olarak neslinin tükenmesini belirleyin. Numunenin fHb konsantrasyonu (mmol/l) hesaplayın: E540-E680 x 0,452.
7. FPA ölçümü
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin ve çözüldükten sonra buz üzerinde saklayın.
- FPA Elisa kitini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
8. sC5b9 ölçümü
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin ve çözüldükten sonra buz üzerinde saklayın.
- sC5b-9 ELISA kitini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
9. PMN ölçümü
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin ve çözüldükten sonra buz üzerinde saklayın.
- PMN-Elastase ELISA kitini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
10. TNF Ölçümü
- Mikro plakalar ELISA'yı çalıştırmadan bir gün önce kaplanmalıdır. Kaplama için, tüm kuyulara 100°L yakalama antikor çözeltisi ekleyin, plakayı kapatın ve gece boyunca 2 °C-8 °C'de inkübedin.
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin. Eritmeden sonra buz üzerinde saklayın.
- TNF ELISA kitini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
11. IL-6 Ölçümü
- Mikroplakalar deneyden bir gün önce yakalama antikorları ile kaplanmalıdır. Kaplama için, 4 °C'de set, sızdırmazlık plakası ve inkübasyon ile sağlanan mikroplakanın tüm kuyularına 100°L yakalama antikor çözeltisi ekleyin
- 3.7.5'te açıklandığı gibi elde edilen her durumdan bir plazma örneğini eritin. ve eritme sonra buz üzerinde saklayın.
- IL-6 ELISA kitini kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun...
12. FACS analizleri
- 10 mL fetal baldır serumu ve 2 mL EDTA çözeltisi (0,5 M) ila 488 mL 1x PBS ekleyerek 500 mL FACS tamponhazırlayın. FACS tamponu 4°C'de 4 hafta saklanabilir.
- Her boyama işlemi (monosit trombosit agregaları (MPA), trombosit aktivasyonu (PA), lökosit integrinleri (LI)) için sodyum sitrat kanının 100 μL'sini kullanın (bkz. 3.6.3).
- Pipet her örnekten 100 μL kan 5 mL FACS tüpiçine. Her numuneden, MPA (monosit trombosit agregaları) paneli, PA (trombosit agregaları) paneli ve LI (lökosit integrin) paneli ile antikor boyama ve etiket için 3 tüp hazırlayın.
- 4 numunenin geri kalanını tek bir 5 mL FACS tüpe karıştırın. Lekesiz ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için bu karışımı kullanın.
- Her tüpe 100 μL karışık numune kanını pipetleyerek 6 FACS tüpü hazırlayın. Lekesiz olarak etiket 3 tüpler ve FMO-CD41, FMO-CD62P ve FMO-CD162 olarak 3 tüpler.
- 100 μL %4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
DİkKAT: Paraformaldehit cilt ve gözler için toksiktir. Solunduğunda ciddi pulmoner tahrişe neden olabilir ve uzun süreli maruz kaldıktan sonra akciğer hasarına yol açabilir. Ayrıca, bir karsinojen ve üreme toksin olarak sınıflandırılır. Her zaman eldiven ve güvenlik gözlüğü takın ve duman kaputunun altında çalışın. - 5 dk için 287 x g her tüp ve santrifüj için yıkama tampon 1 mL ekleyin. Supernatant atın ve yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- Kırmızı kan hücresi (RBC) lysis için, 1 mL 1x tampon RBC lysis tampon ekleyin (seyreltik 10x RBC lysis tampon deiyonize suda), yavaş yavaş yukarı ve aşağı borulama ve karanlıkta RT 5 dakika kuluçka tarafından karıştırın.
- Tek lekeler için tazminat boncukları hazırlayın. 1 mL FACS arabelleği için her pozitif ve negatif boncuk 4 damla ekleyin. Girdap kapsamlı ve bir 5 mL FACS tüp için boncuk çözeltisi 100 μL ekleyin.
- CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC ve CD62P-PE olarak boncuk ve etiket ile 4 tüpler hazırlayın. Her tüp ve santrifüj için 1 mL FACS tampon ekleyin 287 x g 5 dakika için. Supernatant atın ve buz üzerinde tutun.
- RBC lysis sonra, her tüp için FACS tampon 1 mL ekleyin ve 12.7 açıklandığı gibi yıkayın. Supernatant atın.
- Antikor kokteylleri hazırlayın:
- MPA paneli: 4 μL CD45-APC, 4 μL CD14-FITC ve 4 μL CD41-BV421 ila 388 μL FACS arabelleği ekleyin.
- PA panel: 1.6 μL CD41-BV421 ve 12 μL CD62P-PE 386.4 μL FACS tampon ekleyin.
- LI panel: 4 μL CD45-APC ve 8 μL CD162-BV421 ila 388 μL FACS arabelleği ekleyin. Buzda kal.
- Tek lekeler hazırlayın: CD14-FITC, CD41-BV421 ve CD45-APC için her biri 0,5 μL ila 499,5 l FACS tampon ekleyin. CD62P-PE için 499,7 μL FACS arabelleği 0,3 μL ekleyin. Buzda kal.
- FMO kontrollerini hazırlayın: (i) MPA paneli (FMO-CD41): 98 μL FACS arabelleği için 1 μL CD14-FITC antikor ve 1 μL CD45-APC antikor ekleyin. (ii) PA panel (FMO-CD62P): 0,4 μL CD41-BV421 ila 99,6 μL FACS arabelleği ekleyin. (iii) LI paneli (FMO-CD162): 99 μL FACS arabelleği için 1 μL CD45-APC ekleyin. FMO kontrollerini buzda tutun.
- Girdap antikor kokteylleri ve 12.12 yılında hazırlanan her antikor kokteylinin 12.3'te açıklandığı şekilde etiketlenmiş tüplerin (MPA, PA ve LI paneli) 100°L'sini ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. Karanlıkta RT'ye devam et.
- Vortex tek leke antikor seyreltmeleri ve 12.13 yılında hazırlanan tek leke antikor seyreltme 100 μL ekleyin. 12.7'de açıklandığı gibi boncuklu etiketli tüplerin her birine ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. Karanlıkta RT'ye devam et.
- Vortex FMO antikor kokteylleri ve 12.14 yılında hazırlanan her FMO-1 antikor kokteyl100 μL ekleyin. 12.5'te açıklandığı gibi ilgili etiketli tüplerin (FMO kontrolleri) her birine. ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak hafifçe karıştırın. Karanlıkta RT'de kal.
- Karanlıkta RT'de 30 dakika boyunca antikor boyama ile tüm tüpleri kuluçkaya yatırın.
- Lekesiz kontrol için üç tüpü alın (bkz. 12.4) ve 250 μL FACS tamponunda peleti askıya alın. Buzda kal.
- Kuluçka süresinden sonra, lekesiz kontroller hariç tüm tüpleri 12.7'de açıklandığı gibi FACS tamponu ile bir kez yıkayın. 250 μL FACS arabelleğiiçinde peleti yeniden askıya alın ve akış sitometresi hakkında veri elde edin.
- FACS yazılımında pozitif ayarlar için negatif ayarlar ve telafi fare boncukları için lekesiz hücreleri kullanın. Ayrıca, FMO-CD41 MPA panelinde kullanılan, FMO-CD62P'nin PA panelinde, FMO-CD162'nin ISE LI panelinde kullanıldığı gating stratejisini kontrol etmek için FMO'yu kullanın.
- FACS için tüp başına neredeyse 0,5 x 106 - 0,25 x 106 olay elde edin. Veri kaydedin ve bir analiz yazılımı (sürüm 9.9.6) ile analiz edin.
Representative Results
FACS çizimleri dışında sunulan tüm veriler bir istatistik yazılımı ile analiz edildi. FACS çizimleri akış sitometri yazılımı kullanılarak analiz edildi.
Tam kan hücre sayımı analizi, test edilen tüm koşullar arasında eritrositler açısından anlamlı bir farklılık göstermedi(Şekil 2). Ancak, trombositler ve lökositler lateks grubunda büyük ölçüde azaltıldı, lateks çok kötü bir biyouyumluluk gösteren. Bu durum lateks grubunda serbest hemoglobin düzeylerinin artmasıyla daha da vurgulanır ve lateks grubu dışında diğer vasküler cihazların veya koşulların hiçbirinin geniş hemolize yol açamamaz(Şekil 2). Ayrıca, kaplamalı PVC tüpler, polyPVC ve hepPVC, test edilen stent trombosit ve lökosit kaybı ile tromboza yol açmazken, lateks en yüksek trombosit ve lökosit kaybını sergilerken, bunu azalmış bir eğilim gösteren kaplamasız PVC tüpler izledi.
Tüm test edilen vasküler cihazlar pıhtılaşma sistemi (FPA) ve kompleman bileşeninin (sC5b-9) aktivasyonunun artmasına yol açsa da, hepPVC döngüleri özellikle poliPVC döngülere kıyasla FPA ve sC5b-9 seviyelerinde azalma eğilimi sergilemiştir(Şekil 3). İlginçtir, kaplamasız PVC ve Gap döngüleri, istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşmasa da, polyPVC'ye göre daha düşük FPA seviyeleri gösterdi. Bununla birlikte, lateks döngüler taban çizgisi ve statik koşullara kıyasla FPA düzeylerinde önemli ölçüde artış sergiledi.
Tüm kan hücresi sayımlarına uygun olarak, lateks döngüleri tnf, IL-6 ve PMN elastaz(Şekil 4)en yüksek düzeyde sergilenen, TNF ve IL-6(Şekil 4A,B)açısından grupların geri kalanı ile karşılaştırıldığında istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşan , PMN elastaz açısından statik ve temel koşullara ise (Şekil 4C). Bu sonuçlar lökositlerin lateks ile güçlü aktivasyonunu göstermektedir. Aktivasyon belirteçlerinin temel düzeyleri her zaman statik koşullarla karşılaştırılabilir, kan uygun bir heparinizasyon gösteren.
İlginçtir ki, gap kaynaklı döngüler için trombosit ve lökosit sayılarının koagülatör sistemi (FPA) ve lökositlerin (PMN elastaz) orta düzeyde aktivasyonu ile azaldığı gösterilmiştir, ancak ortaya çıkan akış türbülansları ve kan teması yla yanlış döngü kapanması, kaplamasız, pürüzlü kesme yüzeyine konik olarak görünür pıhtılaşmasına yol açmıştır (Şekil 1F). Pıhtılar ve tüm birleştirme yüzeyi üzerindeki dağılımı μCT ve SEM görüntüleri ile belirginken, döngüler dış kapatma cihazı ile kapatıldığında pıhtı bulunamadı ve döngü uçları arasında boşluk kalmamıştır(Şekil 5).
Trombosit spesifik belirteçleri, CD41 ve trombosit aktivasyon markerı CD62P ile boyanmış konak kan hücrelerinin akış sitometrik analizi Şekil 6A,B'degösterilmiştir. Burada, kan trombositlerinde CD62P için son derece yüksek ortanca floresan yoğunluğu (MFI) sergilenen lateks tüpleri, stent takip ederken, heparin kaplı poliPVC tüpler poliPVC tüplerin anti-trombojenik özelliğini gösteren trombositlerin minimal aktivasyonunu sergilemiştir. Ayrıca lökositler CD45 ve SSC (yan dağılım) esaslı granülerite (i) granülositlere göre sınıflandırıldı; (ii) monositler ve (iii) lenfositler (Şekil 7), ve CD162+ integrin ekspresyonu trombositler üzerinde CD62P ile etkileşime girdiği bilinen lökositlerin her bir alt popülasyonunda tespit edildi24. Bu integrin ifadeleri büyük ölçüde granülositler ve lenfositler lateks döngüler azalmıştır fark edildi. Bu sonuç lateks döngülerindeki lökositlerin toplam frekanslarının düşük seviyeleri ile uyumluydu(Şekil 2). Genel olarak granülositler ve lenfositlere göre monositler arasında integrin düzeyleri daha yüksekti, bu da aktive trombositlerle monosit etkileşiminin olasılığını gösteriyordu. Bu bağlamda, monosit trombosit agregaları da CD14 (monosit marker olarak) ve CD41 (trombosit marker olarak) ile kan hücreleri boyama ve sonuçta çift pozitif hücreleri yani CD14+CD41+MPA (Şekil 8) olarak değerlendirildi. Burada, stent grubunun MPA'da en yüksek CD41 ifadesini sergilediğini, bunu lateks grubunun izlediğini ve monosit sıklığının azalmasına rağmen MPA'yı oluşturma eğiliminin arttığını gösterdiğini fark ettik (<1 %) lateks döngüleri içinde.
Şekil 1: In vitro hemodinamik döngü modeline ve modifikasyonlarına genel bakış. (A) Dış döngü kapatma sistemi ile boşluk deneyi için döngü, splice hiçbir boşluk bırakarak. (B) PoliPVC kaplı PVC tüp ve stent içinde (ok) yapılmış döngü. (C) Lateks tüpten oluşan döngü. (D) Dış döngü kapatma sistemi tüp uçları (ok) arasında bir boşluk bırakarak olmadan boşluk deneyi için döngü. (E) Su banyosunun içindeki döngü beşiğine yerleştirilen ve kanla doldurulmuş döngüler. (F) Trombüs, döndürmeden sonra splice (ok) boşluğuna neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan hücre sayımı ve plazma hemoglobin sonuçları. (A) Eritrositsayısı. (B) Trombosit sayısı. (F) Lökosit sayısı. (D) Serbest plazma hemoglobin. Sonuçlar lateksin yetersiz biyouyumluluğunu gösteriyor, aşırı hemolise yol açıyor. Veriler ortalama değer olarak sunulur; hata çubukları SEM. n=1'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pıhtılaşma ve kompleman sisteminin aktivasyonu için sonuçlar. (A) Koagülasyon sistemi aktivasyonu, Fibrinopeptid A (FPA) (B) Kompleman sistemi aktivasyonu düzeyleri ile ölçülen, sC5b-9 düzeyleri ile ölçülür. Lateks tüplerfpa önemli yüksek seviyelerde uyarılmış iken, kompleman aktivasyonu tüm test malzemeler için güçlüydü. Veriler ortalama değer olarak sunulur, hata çubukları SEM. *p<0.05, n=1'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lökosit aktivasyon belirteçleri. (A) Tümör nekroz faktör alfa (TNF). (B) Interlökin 6 (IL-6) (C) PMN Elastaz. Sonuçlar, analiz edilen belirteçlerin yüksek düzeyleri nedeniyle lökositlerin aktivasyonunun arttığını, bunu stent döngülerinin izlediğini ve bunun sadece PMN Elastaz için artışa yol açtığını, ancak TNF veya IL-6'nın değil. Veriler ortalama değer olarak sunulur, hata çubukları SEM. *p<0.5; **p<0.01, n=1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Döngülerin birleştirilmesi. (A) μ bilgisayarlı tomografi (μCT) yanlış kapanış (boşluk) ile döngüler. Kırmızı alanlar trombüs materyalini gösteriyor. (B) Tüpün luminal tarafının işlenmesi. Dikdörtgen seçim tarama elektron mikroskopisi (SEM)(C)için alanı gösterir. (D) harici döngü kapatma cihazı ile döngülerin ct ve splice hiçbir boşluk ve (E) render ve luminal yüzey görünümü. Trombüs malzemesi bulunamadı. (F) (E) dikdörtgen seçimSEM görüntü . Kesme yüzeyinde trombüs malzemesi bulunamadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Trombosit aktivasyonu için FACS çizimi (CD62P). (A) Temsili FACS arsa (temel durum) kan CD41+ trombosit gösteren. (B) Statik RT ve taban çizgisi koşullarına göre farklı vasküler cihazların ortalama floresan yoğunluğu (MFI) tarafından yansıtılan trombosit aktivasyon durumunu gösteren grafik. Veri çubukları tek ölçümlerden elde edilen verileri sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Lökosit integrin (CD162) için FACS çizimi. (A) Temsili FACS çizimi (temel durum) kan CD45+ lökosit ve alt grupları gösteren(B) Lökosit CD162+ integrin ortalama floresan yoğunluğunu gösteren grafik (MFI) statik ve temel koşullara göre vasküler cihazların farklı türleri. Veri çubukları tek ölçümlerden elde edilen verileri sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Trombosit monosit agregaları için FACS çizimi (CD41/CD14). (A) Temsili FACS arsa (temel durum) kan monositler için gating gösteren (CD45+/ CD14+), trombosit (CD41+) ve monosit trombosit agregalar (CD41+/CD14+) (B) Grafik CD41 gösteren+ ortalama floresan yoğunluğu (MFI) çeşitli vasküler cihazlar için monosit trombosit agregalar statik ve taban koşulları ile karşılaştırıldığında. Veri çubukları tek ölçümlerden elde edilen verileri sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu çalışma, sunulan in vitro hemodinamik döngü modelinin, tıbbi cihazların in vitro kan uyumluluğunu ISO 10993-4 standardına uygun olarak test etmek için güvenilir bir yöntem sunduğunu göstermiştir.
Protokoldeki kritik adımlar arasında kan çekilmesi ve tüplerin kanla doldurulması yer almakta olup, kan bileşenlerinin işlem prosedürü ile aktivasyonundan kaçınmak için aşırı vakum veya ajitasyondan kaçınılmalıdır. Ayrıca, tamamlayıcı ve pıhtılaşma sistemi aktivasyonu daha uzun bir süre oda sıcaklığında tutularak değiştirilebilir gibi, plazma örnekleri hemen dondurmak ve erime sonra buz üzerinde tutmak çok önemlidir.
Bu model, diğer in vitro modellere kıyasla hem yararları hem de cezaları olduğundan, deneylertasarlarken çeşitli faktörlerin dikkate alınması gerekir.
İlk olarak, döngüler çeşitli deneysel kurulumları uyacak şekilde uzunluk ve çap olarak çeşitli olabilir. Kurulum, değişen iç çaplarda zıt tüpler içeriyorsa, çap farklılıklarının farklı kesme kuvvetlerine yol açacağı ve pıhtılaşmayı etkileyip basamaklama7'yitamamladığı unutulmamalıdır. İkinci olarak, bu deneyde dönüş hızı 30 rpm olarak ayarlandı. Bu yaklaşık bir kan akımı neden olacak 25 cm / s, hangi insan koroner arter bypass greftleri kan akımı hızı ile karşılaştırılabilir25. Döngülerin döndürülmesi ile oluşturulan gerinim hızı, hücreler ve hücresiz proteinler de dahil olmak üzere kan bileşenlerinin biyokimyasal basamaklarını başlatacak başlıca parametredir. Ama kan newton olmayan bir sıvı olduğu için, gerinim oranı da tüp eğriliği, sırasıyla döngüler10kapalı tüplerin uzunluğu etkilenecektir. Döndürme hızı veya döngü boyutu değiştirildiğinde, gerilme hızı ile dönüş hızı arasındaki korelasyonun doğrusal olmadığını göz önünde bulundurmak önemlidir. Dönüş hızı ile gerinim hızı arasındaki korelasyon günümüze kadar yeterince incelenmemekte ve bu özel parametrelerin10,26,27olarak araştırılması için ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir. Ancak, laminar sınır tabakası için bir modele göre, verilen tüp çapı 5 mm ve 25 cm/s dönüş hızı, duvar kesme stresinin kaba bir tahmini (WSS) kan yoğunluğu 1060 kg*m-3 olduğu tahmin edildiğinde ve kinistik viskozite 0,0025 pascal *s28,29olarak ayarlanır ken tüp duvarına 1,00-0,01 mm bir mesafe için 2.20-22.00 pascal arasındaki değerleri gösterir. İlginçtir, ayrıca insan koroner arterlerin eğrilik akış dinamikleri daha ayrıntılı bir hesaplama analizi 11,33 ile 16,77 pascal arasında değişen WSS değerleri gösterdi kabaca karşılaştırılabilir parametrelerde kan30.
Bu sınırlamanın yanı sıra, sunulan döngü modeli, insan vasküler sisteminin intravasküler kan basıncı oranlarını taklit etmeyen basınçsız bir sistemdir.
Bir sonraki önemli sınırlama, kanın döngülerin içindeki havayla temas halinde olmasıdır, bu da ek parazitler getirir. Böyle bir kan-hava teması tüplerin gaz geçirgenliği ve kan ile doldururken döngüler içinde hava nın istinat içeren iki parametre tarafından etkilenir. Her tüp malzeme tüpler içinde gaz konsantrasyonlarında önemli değişikliklere yol açabilir belirli bir gaz geçirgenlik vardır. Bazı yazarlar kan bileşenlerinin aktivasyonu üzerinde gaz geçirgenliği sonucu etkisi belirsiz kalır devletiken 31, Bu kan pıhtılaştırıcıların fonksiyonu son derece bir pH-shift duyarlı olduğu bilinmektedir, BU CO2 difüzyon neden olabilir32,33,34. Burada, kapalı hava koşullarında kan perfüzyon tüplerinin biyouyumluluğunu test ettik, ekstrakorporeal kan perfüzyonunun klinik senaryoları ile karşılaştırılabilir. Sunulan modelin gelecekteki iyileştirmeleri için, co2 inkübatörde tüm modelin kuluçkaya yatırılması ve kuluçkadan önce ve sonra kan pH doğrulaması yapılması bu modeli daha da standartlaştırmak için yararlı olabilir.
Ayrıca, döngüler içinde kan-hava arayüzü plazma proteinleri ve kan hücre fraksiyonları aktivasyonu yol açabilir35,36. Tüpler içinde hava olmadan silindir pompası tahrikli cihazlar kan-hava arayüzü sorunu önlemek olabilir, ama kesinlikle burada sunulan döngü modeli ile karşılaştırıldığında hemoglobin önemli yüksek seviyelerde kan hücrelerine zarar neden, ve plazma hemoglobin ELISA test analit duyarlılığı ile müdahale edebilir16. Bu çalışmada heparin kaplı PVC tüpler gibi biyouyumlu malzemeler kullanılırken döngü modelinin hemolitik etkisinin minimal düzeyde kalmıştır. Böylece, model, bir yandan, pompa tahrikli modellere göre aşırı hücre hasarına neden değil, diğer taraftan kan hava sılatemas nedeniyle plazma proteinleri indükleyen. Dikkat, van Oeveren ve ark döngüler içinde hava kaçınarak bir top-valf tabanlı döngü modeli geliştirdi16. Burada sunulan döngü modeli için bu umut verici alternatif kan-hava arayüzü sorunu üstesinden gelebilir, Ancak, burada sunulan modelile karşılaştırıldığında, trombosit yapışma sıyrık hala top-valf tabanlı döngü modeli için daha yüksektir.
Statik kontrol ile ilgili olarak, bu cam kendisi koagülör sisteminin güçlü bir aktivatör olduğu gösterilmiştir dikkat edin37. Ancak, sunulan kurulumda, bir cam kabındaki kuluçka (statik kontrol) aşırı konak hücre aktivasyonuna veya pıhtılaşma sisteminin aktivasyonuna doğrudan kan çektikten sonra temel seviyelere göre yol açmadı. Sonuç olarak, statik kontrol yüksek düzeyde aktivasyon gösteriyorsa, örneğin polipropilen tüpleri kullanmak yararlı olabilir.
Ne olursa olsun bir döngü tabanlı veya pompa odaklı bir model olup olmadığını, bu in vitro modelleri tamamen esas olarak sağlam bir endotel tarafından katkıda bulunulan otantik biyolojik etkileşimleri eksikliği, ideal bir kan temas yüzeyi. Bu sorunun arkasındaki mantık, endotel varlığında kan bileşenleri ile etkileşimi sırasında, aktivasyon ve plazma proteinleri açısından farklı sonuçlar verebilir bir stent gibi bir tıbbi cihaz test edilirken daha belirgindir. Bu dolaşım sistemini taklit eden tüm in vitro sistemlerin önemli bir dezavantajı olarak ilan eder. Bu nedenle, bu sorunu aşmak için, tamamen endotel ile kaplı yeni mikroakışkan sistemler büyük ilgi kazanıyor, ama yine de burada sunulan döngü modeli ile karşılaştırıldığında, hala daha küçük kan hacimleri ve minimum akış oranları karşılamak için sınırlıdır38,39
Böylece, Chandler Loop modeli kardiyovasküler araştırma alanında vasküler tıbbi cihazların kan biyouyumluluğu üzerinde standart testler yapmak için sağlam bir model olmaya devam ettiği sonucuna varıyoruz.
Disclosures
Funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Almanya] bu el yazması [Max Wacker] yazarına sarf malzemeleri ve yayın ücretleri şeklinde bir mali destek sağladı. Fon, çalışmanın tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı veya makalenin hazırlanmasında ek bir rol emmedi.
Acknowledgments
Yazarlar Bayan Elena Denks'e teknik yardımlarından dolayı müteşekkirler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
