Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Akutt nyreskademodell indusert av Cisplatin i voksen sebrafisk

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/61575
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Immunology, University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, Federal University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere akutt nyreskade (AKI) hos voksne sebrafisk ved hjelp av cisplatin som nefrotoksisk middel. Vi detaljerte trinnene for å evaluere reproduserbarheten av teknikken og to teknikker for å analysere betennelse og celledød i henholdsvis nyrevevet, strømningscytometri og TUNEL.

Abstract

Cisplatin brukes ofte som kjemoterapi. Selv om det har positive effekter hos kreftbehandlede individer, kan cisplatin lett akkumuleres i nyrene på grunn av sin lave molekylvekt. Slik akkumulering forårsaker død av rørformede celler og kan indusere utviklingen av akutt nyreskade (AKI), som er preget av en rask reduksjon i nyrefunksjon, vevsskade og immuncelleinfiltrasjon. Hvis det administreres i bestemte doser, kan cisplatin være et nyttig verktøy som AKI-induser i dyremodeller. Sebrafisken har dukket opp som en interessant modell for å studere nyrefunksjon, nyreregenerering og skade, da nyrestrukturer sparer funksjonelle likheter med pattedyr. Voksen sebrafisk injisert med cisplatin viser redusert overlevelse, nyrecelledød og økte betennelsesmarkører etter 24 timer etter injeksjon (hpi). I denne modellen kan immunceller infiltrasjon og celledød vurderes ved strømningscytometri og TUNEL-analyse. Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere AKI i voksen sebrafisk ved intraperitoneal cisplatin injeksjon og deretter demonstrerer hvordan å samle nyrevev for strømning cytometri behandling og celle død TUNEL analyse. Disse teknikkene vil være nyttige for å forstå effekten av cisplatin som et nefrotoksisk middel og vil bidra til utvidelse av AKI-modeller i voksen sebrafisk. Denne modellen kan også brukes til å studere nyreregenerering, i søket etter forbindelser som behandler eller forhindrer nyreskade og for å studere betennelse i AKI. Videre vil metodene som brukes i denne protokollen forbedre karakteriseringen av vevsskade og betennelse, som er terapeutiske mål i nyrerelaterte komorbiditeter.

Introduction

Nyrene er ansvarlige for flere viktige fysiologiske funksjoner som opprettholder homeostase, for eksempel blodfiltrering, fjerning av overflødige rester og regulering av ionkonsentrasjoner1. Skade på nyrevev kan føre til en heterogen tilstand kalt Akutt nyreskade (AKI), som klinisk beskrives som en rask reduksjon i nyrefunksjon forårsaket av ødeleggelse og død av rørformede epitelceller, endotelcelleskade og leukocyttinfiltrasjon 2,3. AKI er en tilstand som forventes å skje i 8-16% av sykehusinnleggelser4, med en høy dødelighet som varierer fra 20 til 50% på intensivavdelingen (intensivavdelingen)5. Denne sykdommen er forbundet med økt sykehusopphold og betydelig bruk av økonomiske ressurser5. Etiologiske faktorer inkluderer dehydrering, sjokk, infeksjoner, sepsis, kardiovaskulær sykdom og nefrotoksiske legemidler6. Nefrotoksisitet er definert som en nyreskade indusert av narkotika, forårsaker effekter som AKI, tubulopatier og glomerulopatier7. Nefrotoksisitet påvirker to tredjedeler av intensivpasienter, da omtrent 20% av legemidlene som er foreskrevet på intensivavdelingen, regnes som nefrotoksiske8,9, dette inkluderer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs), antibiotika som vancomycin og aminoglykosider, og kjemoterapeutiske midler som metotreksat og cisplatin7. Cisplatin er et av de mest potente og vanlige kjemoterapimedisinene, som brukes til behandling av faste svulster, som hode og nakke, testikkel, eggstokk og blære10. I nyrene internaliseres cisplatin i det proksimale konvoluterte røret (PCT) gjennom den organiske kationiske transportøren 2 (OCT-2) og i høye konsentrasjoner binder seg til DNA-utløsende celledødsveier7,10,11,12. Akkumuleringen av dette stoffet i nyrene bidrar til nefrotoksisitet med død og betennelse13. Denne skadelige bivirkningen påvirker enormt livet og prognosen til en tredjedel av kreftpasienter som gjennomgår cisplatinbehandling, så det er viktig forskningen på nye terapier som kan senke nefrotoksisiteten uten å miste drapseffekten på kreftceller10.

På grunn av denne nefrotoksiske effekten brukes cisplatin ofte som en induktor av AKI i eksperimentelle dyremodeller, som beskrevet fremover. Hos gnagere ble den første AKI-modellen indusert av cisplatin rapportert i 197114, men for tiden har mange forskjellige protokoller dukket opp ved hjelp av de doseavhengige og kumulative effektene av cisplatin15. Dermed, avhengig av dosering og antall applikasjoner, kan forskjellige karakterer av alvorlighetsgraden av nyreskade induseres16,17,18,19,20,21. Den hyppigste metoden består av en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en dose cisplatin etterfulgt av eutanasi i de følgende dagene. I denne klassiske protokollen induserer en enkelt høy nefrotoksisk dose cisplatin (10-13 mg/kg hos mus og/eller 3-8 mg/kg hos rotter) alvorlige histologiske endringer, som tap av børstekant og celleavfall inne i den rørformede lumen, noen dager etter cisplatinininjeksjon. Alvorlighetsgraden av histologiske endringer er doseavhengig, og tegn på regenerering observeres 7 dager etter cisplatin injeksjon16,17.

Selv om gnagermodeller er godt etablert, bestemte vi oss for å dra nytte av egenskapene til en annen virveldyr, med fokus på sebrafisken (Danio rerio). Denne fisken har blitt mye brukt til modellering av menneskelige sykdommer, på grunn av sin lille størrelse, ekstern befruktning, høye reproduksjonshastigheter, rask utvikling, gjennomsiktighet av embryoer og larver, lav vedlikeholdskostnad, lignende anatomi som pattedyr (med noen unntak), høy vevsregenereringskapasitet, sosial atferd, 70% genetisk likhet med mennesker og 84% med menneskelige sykdommer-assosierte gener22. Streisinger et al.23,24,25 startet studiene med sebrafisk som bekreftet praktiseringen av å bruke denne modellorganismen for genetisk analyse av virveldyrutvikling. I nyreforskning har sebrafisken dukket opp ikke bare i utviklingsstudier, men også som et genetisk verktøy i søket etter nye gener knyttet til nyreforhold26. Videre gjør regenereringskapasiteten uten arrdannelse og evnen til å generere nefroner gjennom livet, kalt neonephrogenesis, sebrafisken til en nøkkeldyrmodell for regenereringsforskning27,28. Videre viser tilgjengeligheten av eksperimentelle modeller for forskjellig nyresykdom, inkludert akutt og kronisk nyreskade, allsidigheten til denne eksperimentelle organismen26,29. Som hos pattedyr, er renal forfedre av sebrafisken avledet fra mellomliggende mesoderm. Slike nyregenitorer genererer de utsattephros som senere vil utvikle seg til mesonephros, som vil bli opprettholdt som et modent organ til voksen alder29,30.

Den voksne sebrafisk nyre ligger på kroppens dorsale vegg, mellom svømmeblæren og ryggraden29. Fra ventral visning kan sebrafisken segmenteres i tre regioner (Figur 1A): hode (H), bagasjerom (Tr) og hale (Ta)29. Samme som pattedyr, har sebrafisken nephrons som funksjonelle enheter av nyrene, som er delt inn i tubule segmenter (Figur 1A): nyrekorpuskel (RC), proksimal konvolutert tubule (PCT), proksimal rett tubule (PST), distal tidlig (DE), sen distal (DL) og samle kanal (CD)29. Sebrafisk deler genetisk bevaring og strukturelle likheter med menneskelige nephrons (Figur 1B), men mangler noen konformasjoner som mellomliggende tubule, også kjent som løkken til Henle (LH)29,31. Ferskvannsfisk som sebrafisk er normalt omgitt av et medium med svært lav osmolaritet, på grunn av dette har de en tendens til å være hyperosmotiske og avhenger av gjellene, huden i tidlige stadier og nyrene for å regulere osmolaritet og vannutskillelse32. Filtreringen av blod fra dorsal aorta av pronephros begynner rundt 48 h etter befruktning (hpf)33,34. Nyrene i sebrafisken er ikke bare et metabolsk avfallsutskillelsesorgan, men fungerer også som et hematopoietisk organ fra 4 dager etter befruktning (dpf) til voksen alder, og det tilsvarer benmargen hos pattedyr35. Under utviklingen vil hematopoietiske stamceller (HSC) frø nyrene, selvrenovere og generere myeloid, erythroid og lymfoide celleavstamninger, opprettholde transkripsjonsfaktorer, signalmolekyler og høyt bevarte genetiske programmer med pattedyr36,37. Studier har avslørt at de fleste erythroid, trombocytiske, myeloide og lymfoide celler i det menneskelige immunsystemet er til stede i sebrafisk37,38. De unike egenskapene til dette dyret og de konserverte egenskapene med den menneskelige nyre gjorde denne modellorganismen fordelaktig i forskningen på nyrefunksjon, skade og regenerering.

Selv om zebrafiskens nyre er godt studert og noen modeller av AKI allerede er tilgjengelige i larve og voksen sebrafisk28, på tidspunktet for etableringen av denne protokollen var det ingen bevis for en kjemisk indusert ikke-antibiotika AKI-modell i voksen sebrafisk. Foruten dette fokuserer laboratoriet vårt på å teste probiotiske bakterier og mikrobiota-avledede forbindelser for å studere regenerering og nyreskade, og dermed konsentrerte vi vår innsats for å skape en ny cisplatin-indusert AKI-modell hos voksne fisk. Videoartikkelen som presenteres i dette manuskriptet demonstrerer prosedyrene for en ny modell av AKI-induksjon ved hjelp av en i.p. injeksjon av 120 ug cisplatin per g dyr (120 μg/g) (Figur 2A). Denne dosen var opprinnelig basert på studier av AKI indusert av cisplatin i murinmodeller som gikk rundt 10 mg / kg (tilsvarende 10 μg / g)14,15,16,17, men denne dosen var ikke tilstrekkelig til å indusere nyreskade relatert til nefrotoksisitet (data ikke vist). Dermed økte vi dosen til de som ble brukt i denne studien (Figur 2B). Vårt arbeid avdekket en doseavhengig effekt av cisplatin i overlevelsesrate etter injeksjon med induksjon av nyrevevsskade 24 hpi som vist ved tap av rørformet struktur, økt inflammatorisk infiltrat og høy grad av celledød. Her beskriver vi to teknikker for å analysere utviklingen av cisplatin-indusert AKI: flowcytometri, for å analysere celleinfiltrasjon og TUNEL, for å måle celledød. Flow cytometri er en teknologi som måler de fysiske (størrelse og granularitet) og kjemiske (fluorescerende forbindelser) egenskaper av cellene. Inne i cytometeret går cellefjæringen gjennom en kappevæske som organiserer cellene i en enkelt linje, slik at de kan passere gjennom en laserstråle en celle om gangen (Figur 3A). En detektor foran lysstrålen vil måle Forward Scatter (FSC), som korrelerer med cellestørrelsen, og detektorer til siden vil måle sidespredningen (SSC) som korrelerer med cellenes granularitet. Andre detektorer vil måle fluorescensen fra partikler, fluorescerende proteiner eller antistoffmerkede celler39,40. Ettersom kommersielle antistoffer for sebrafisk er knappe i dag, gjør bruk av dyrereportere og fluorescerende biomarkører det mulig å forbedre denne analysen og identifisere forskjellige cellepopulasjoner41,42,43. Et annet verktøy som ble brukt i denne protokollen var Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analyse. TUNEL-analysen er en senfase apoptosedeteksjonsmetode som er avhengig av TdTs evne til å identifisere fragmentert DNA og merke det med deoksynukleotider merket med en fluorescerende markør som senere kan visualiseres og kvantifiseres ved mikroskopi44 (figur 3B). Tatt i betraktning at en av de mest slående egenskapene til AKI er induksjon av apoptose i rørformede nyreceller3, er denne teknikken ekstremt fordelaktig siden den kan analyseres ved strømningscytometri og / eller mikroskopi.

Tilnærmingene som presenteres i denne artikkelen tillater observasjon av AKI-statusen og tilbyr en ny akutt modell for å studere AKI-lidelser som kan være nyttige for forskning av nye terapeutiske mål i cisplatin-relatert AKI.

Protocol

Prosedyrene beskrevet i denne protokollen ble tidligere godkjent for bruk i sebrafiskmodellen av Animal Use Ethics Committee ved Institutt for biomedisinske vitenskaper ved Universitetet i São Paulo.

1. AKI-induksjon ved Cisplatin intraperitoneal injeksjon

  1. Forbered cisplatin arbeidsløsning ved å fortynne lagerløsningen til 850 μg / ml i 0,9% NaCl. Oppbevars ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
    FORSIKTIG: Fabrikanten anbefaler manipulering av cisplatin med personlig verneutstyr (PVU) inkludert vernebriller, hansker og labfrakk. Oppbevar lagerløsningen ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  2. Forbered 150 mg/L MS-222 (Tricaine) bedøvelse i systemvann45. Bedøv voksen sebrafisk (5-9 måneder) ved nedsenking i ca. 1-2 min.
    MERK: Effektivt bedøvet fisk bør være uansvarlig å berøre. For å teste effektiv anestesi, trykk forsiktig på kaudalfinen for å observere reaksjon.
    FORSIKTIG: Trikain er irriterende for hud og øyne, bruk PVU til å manipulere.
  3. Ved hjelp av en plastskje overføres fisken til en absorberende overflate, for eksempel papirhåndklær, for å fjerne overflødig vann rundt kroppen. Deretter, med plastskjeen, overfør fisken til en Petri-tallerken over en skala og vei fisken. Legg merke til fiskens vekt, da det vil være nødvendig for doseberegninger.
    MERK: Absorbering av overflødig vann fra fisk forhindrer overestimering av dyrets vekt, ikke overtørk siden det er fordomsfullt for fisken.
  4. For å oppnå den endelige dosen på 120 μg/g vekt, del μg av den endelige dosen (120 μg) per μg av cisplatin arbeidsløsningen (850 μg) og konverter dette tallet til mikroliter (μL) ved å multiplisere for 1000, for å få volumet på 120 μg cisplatin (141,2 μL). Multipliser deretter dette tallet (141,2 μL) for fiskens vekt (g) for å få det endelige volumet som skal injiseres.
  5. Med en plastskje, overfør fisken på en våt svamp med et lite kutt for å holde den, med ventralsiden opp. Svampen skal være våt med bedøvelse i systemvann.
  6. Fyll en 31 G 1,0 ml insulinsprøyte med beregnet volum cisplatin arbeidsløsning.
  7. Sett nålen inn i dyrets intraperitoneale del nær bekkenfinnen, i en grunn vinkel for å unngå å punktere viscera (Figur 2A). Injiser deretter løsningen langsomt.
  8. Etter injeksjon plasser fisken i en tank for å gjenopprette fra anestesi. Se fisken etter tegn på normal utvinning(f.eks. svømmebevegelser, operkulære bevegelser).
    MERK: Dyret skal komme seg i løpet av de neste 3-5 min. Om nødvendig stimulere fisken ved å flytte den med en plastskje, en Pasteur plastpipette, eller legg den nær en slange med bobler.
  9. For kontrollfisk, utfør samme prosedyre ved å injisere en løsning på 0,9% NaCl. Bruk samme beregning etter andelen kroppsvekt: volumet som skal injiseres vil bli 141 μL multiplisert med fiskens vekt (g).
  10. Overvåk overlevelsen av fisk minst to ganger om dagen i de påfølgende dagene (Figur 2B).

2. Nyreisolasjon og vevsbehandling for strømningscytometri av immunceller

  1. For denne prosedyren, bruk immuncelle-fluorescerende merkede transgene dyr (f.eks., Tg (mpo:GFP)).
  2. Etter 24 hk av 120 μg/g cisplatin, avlive dyr ved hypotermisk sjokk (rask kjøling).
    MERK: Hypotermisk sjokk har vist seg å være mer effektivt som eutanasimetode enn MS-222 overdose. Hypotermisk sjokk er mindre stressende, raskt, konsistent og tryggere for personell enn bruken av MS-222, har tidligere beskrevet46,47.
  3. I en ytre kryssingstank forbereder isvann i et 5:1-forhold mellom is og systemvann, legg den indre tanken med en skjerm over isen, vent til vannet når 2-4 °C.
    MERK: Fiskene skal ikke være i direkte kontakt med isen, da dette kan forårsake termiske brannskader og smerter.
  4. Overfør dyr til isvann, vent minst 10 min til det er tap av orientering og ingen operkulær bevegelse.
  5. Med en plastskje legger du fisken på papirhåndklær for å tørke av overflødig vann.
  6. Overfør fisken til en 3% agarose disseksjonsplate og ta den under et stereoskop med øvre lys. Med saks, halshugge fisk som gjør et raskt kutt like bak øynene, og fjern hodet.
  7. Med fin saks gjør et kutt fra den åpne siden til cloaca og fjern de indre organene med fine tang.
  8. Bruk insektpinner for å klemme sidene av kroppsveggene for å åpne slaktkroppen og eksponere nyrene festet til ryggraden.
  9. Løsne nyrene med fine tang og legg orgelet i en 6 brønnplate med en kald løsning på 1x PBS / 2% FBS. Hold deg på isen.
  10. Plukk opp vevet med en Pasteur plastpipette og før vevet gjennom en 40 μm cellesil over et 50 ml rør, og macerer det forsiktig med et sprøytestempel.
  11. Vask to ganger med 1 ml 1x PBS/2% FBS og samle cellene i et 50 ml rør.
  12. Sentrifuger celler ved 400 × g i 5 min ved 4 °C.
  13. Plukk forsiktig opp all supernatanten med en 1 ml mikropipette og kast den. Tilsett 500 μL kald 1x PBS for å resuspendere cellene og plassere dem i 5 ml strømningscytometrirør. Hold deg på isen.
  14. Tell celler i Neubauer-kammeret som gjør en 1:10 fortynning i Trypan Blue (f.eks.ta 10 μL av prøven og bland med 90 μL Trypan Blue). Tilsett 10 μL av blandingen til et Neubauer-kammer og tell celler under mikroskopet.
    MERK: Optimale resultater forventes med 1-5 x 106 celler /ml og >80% levedyktighet.
    FORSIKTIG: Trypan blue er et kreftfremkallende middel, bruk PPE til å håndtere.
  15. Ta cellene som skal leses av et cytometer. Analyser deretter resultatene som velger populasjonen av interesse.

3. Behandling av voksen sebrafisk nyrevev for TUNEL analyse

  1. For denne prosedyren, bruk villtype dyr (f.eks., AB, Tübingen, etc.) eller et transgent dyr med forskjellig fluorescerende farge enn TUNEL-settet, da lignende fluorescens kan forstyrre TUNELs analyse.
  2. Etter 24 hk av 120 μg/g cisplatin, avlive dyr ved hypotermisk sjokk (rask kjøling). Se 2.3-2.4.
  3. Disseker fisken som beskrevet i 2,5-2,6; nyrene må forbli festet til ryggraden under fikseringsprosedyren (forklart nedenfor).
  4. Bruk insektpinner, klem sidene av kroppsveggene for å åpne slaktkroppen og fest den på en korkoverflate for å holde nyrene utsatt.
    MERK: Denne prosedyren sikrer at nyrene forblir i riktig posisjon for senere analyse.
  5. Plasser deretter korkoverflaten med nyrene vendt ned i en 6 brønnplate over en nylaget løsning på 4% paraformaldehyd (PFA). Oppbevar den over natten ved 4 °C.
    FORSIKTIG: PFA er kreftfremkallende og irriterende for hud og slimete overflater. Forbered PFA-løsninger under en kjemisk hette ved hjelp av PVU, inkludert øyebeskyttelsesutstyr.
  6. Neste dag dissekerer nyrene som i 2,8. Legg nyrene i en 60 mm Petri-tallerken med 1x PBS og skyll to ganger i 1x PBS.
  7. Forbered 2% agarose for å generere en støttematrise for vevet.
  8. Kast alle gjenværende 1x PBS fra Petri-parabolen og hell 2% agarose sakte for å dekke hele orgelet. Plasser deretter nyrene ved hjelp av fine tang under et stereomikroskop for å forhindre at nyrene brettes. La agarose størkne ved romtemperatur.
    MERK: Denne prosedyren vil holde organets orientering og form gjennom histologisk behandling siden den bladlignende formen på orgelet forårsaker en tendens til å brettes hvis den ikke er inne i en støttende matrise.
  9. Etter agarose størkning, bruk en skalpell for å kutte agarose rundt vevet, danne små terninger, og fjern overskuddet av agarose rundt vevet.
  10. Plasser agarose kubene i en kassett egnet for histologisk behandling.
    MERK: Følgende trinn kan gjøres manuelt eller i en automatisk vevsprosessor.
  11. Først behandler du vevet i kassetten ved å følge de neste trinnene i 45 minutter hver ved romtemperatur: ett bad med 50% etanol, ett bad på 70% etanol, to påfølgende bad på 95% etanol og tre påfølgende bad på 100% etanol. Deretter behandler vevet i to påfølgende bad av Xylen og tre påfølgende bad av paraffin; sistnevnte varer 1 time hver ved 60 °C.
    FORSIKTIG: Gjør endringer under en kjemisk hette, damper fra etanol og xylen er irriterende og giftige.
  12. For å forberede parafinblokker, smelt parafin linser til 60 °C.
  13. Åpne plastkassetten med vevet inni og hold den på en varm tallerken. Oppvarming av metallformer til paraffin.
  14. Med pinsett plasser vevet over en metallform slik at nyrelengden er parallell med muggbasen. Tilsett paraffin, omfordel vevet om nødvendig.
  15. Dekk formen med bunnen av kassetten og legg til paraffin til rutenettet er dekket. La størkne ved romtemperatur og plasser deretter ved -20 °C for en raskere størkningsprosess.
  16. Løsne parafinblokken fra metallformen rundt 20-30 min senere.
  17. Med en mikrotom, seksjon vevet innebygd i paraffin til 5 μm tykkelse. Bruk silaniserte eller positivt ladede glasssklier for å samle vevet.

4. TUNEL-analyse

MERK: Følgende protokoll bruker et In Situ Cell Death Detection Kit (materialfortegnelsestabell).

  1. Dewax vev lysbilder plassere dem i to påfølgende bad av xylen i 5 min. Deretter rehydrerer vevet gjennom en gradert serie etanol: 100% -95% -70% -50%, i 5 min hver.
  2. Plasser sklier i rennende kaldt vann fra springen for å skylle av etanolet. Oppbevar skliene i destillert vann.
  3. Forbered et mørkt inkubatorkammer. Tilsett våte papirhåndklær på bunnen for å holde fuktigheten under inkubasjonstrinnene.
    MERK: Mangel på inkubatorkammer er mulig å bruke en Petri-tallerken med fuktig papir i bunnen og to tannpirkere for å plassere lysbildet.
  4. Forbered fersk Proteinase K arbeidsløsning:10 μg/ml i 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8.
    MERK: Proteinase K brukes som et permeabiliseringsmiddel, som anbefalt av fabrikanten.
  5. Plasser lysbildene i det mørke inkubatorkammeret og tilsett Proteinase K arbeidsløsning til dekselprøver. Inkuber i 30 min ved 37 °C.
  6. Mens prøver inkuberer, klargjør tunel reaksjonsblandingen: Tilsett 50 μL enzymoppløsning til 450 μL etikettløsning. Beskyttes mot lys.
    MERK: Volumet som skal klargjøres, kan justeres i samme andel på 1:10. Volumet beregnes til å være 50 μL av blandingen for hver seksjon; Dette kan endres avhengig av størrelsen på eksemplene.
  7. Plukk opp det mørke kammeret og vask lysbildene to ganger med 1x PBS.
  8. Tørk deretter regionen rundt prøven ved hjelp av absorberende papir og tilsett 50 μL TUNEL reaksjonsblanding over hvert vevssklie, spre løsningen slik at hele prøven er dekket. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Beskyttes mot lys.
  9. Etter inkubasjon, skyll lysbildet tre ganger med 1x PBS og tørk regionen rundt prøven ved hjelp av papirhåndklær.
  10. Tilsett 50 μL DAPI 1:1000 i prøvene, for kjernefysisk motspenning og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Beskyttes mot lys.
  11. Skyll igjen tre ganger med 1x PBS og tørk regionen rundt prøven.
  12. Monter lysbildet med et anti-fade hydrofilt medium, legg en dekslelip og tetning med neglelakk. Oppbevar sklier horisontalt, beskyttet mot lys ved 4 °C.
    MERK: Monteringsmediets antifadeegenskaper er for å bevare fluorescensen til prøvene, men er mulig å bruke ethvert hydrofilt medium som er tilgjengelig. Det siste tetningstrinnet med neglelakk er avgjørende for å unngå dehydrering.
  13. Visualiser prøvene under et fluorescensmikroskop. For denne typen fluorescerende pigment, bruk en eksitasjonsbølgelengde i området 520-560 nm (grønn) og deteksjon i området 570-620 nm (rød).

Representative Results

Nyrene i sebrafisken er et flatt pigmentert organ som ligger på dorsalveggen og dens grunnleggende funksjonelle enhet, nephron, er bevart med pattedyr (Figur 1). Spesielt ved å ha bare en nyre med høy regenereringskapasitet gjør denne modellorganismen til et utmerket valg for modell nyreskade. Protokollene som presenteres i dette arbeidet er utformet for å indusere AKI ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av cisplatin hos voksne sebrafisk (figur 2) og senere analyseres ved hjelp av to teknikker som er beskrevet før: flowcytometri (Figur 3A) og TUNEL (Figur 3B). Et flytskjema for hele prosessen er avbildet i figur 4. Dosene av cisplatin ble først brukt basert på de som er beskrevet i musemodeller15,16,17, der standarden som brukes er 10-13 mg cisplatin per kg dyr (mg / kg). Sebrafisken viste seg imidlertid å være mer motstandsdyktig mot cisplatin enn musen (data ikke vist), og den endelige dosen ble økt. Da vi evaluerte dyrenes overlevelsesrate, viste forsøkene en doseavhengig effekt av cisplatin (figur 5A). På grunn av dette anbefaler vi å følge instruksjonene nøyaktig som forklart i denne protokollen og overvåke overlevelsesraten til dyrene hele tiden som et mål på reproduserbarhet, før du samler noe materiale. Etter i.p. injeksjon av 120 μg/g cisplatin (Figur 5A, rød linje), ble det observert en reduksjon i overlevelse på rundt 30% av dyrene i de første 24 timer og overlevelsen redusert gradvis til de nådde rundt 20% av levende dyr på dag 5 etter injeksjon, deretter stabilisert ( Figur5A). Cisplatin toksisitet ble ikke påvirket av dyrets kjønn, siden menn og kvinner har lignende overlevelseskurver (Figur 5B).

Analyse av kinetikken til cisplatinindusert AKI viste økt betennelse og celledød i nyrene 24 hk. En av de raskeste og kvantitative måtene å evaluere betennelse på er strømningscytometri, men gitt mangel på antistoffer mot sebrafiskantigener tilgjengelig kommersielt for denne teknikken, er nødvendig å bruke en transgen linje med en immunmarkør. I dag er mange sebrafisklinjer som merker immunceller tilgjengelige (Tabell 1). Disse linjene kan brukes digitalt eller i kombinasjon, gitt nok repertoar til analyse48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Dette forenkler enormt teknikken siden det ikke er nødvendig noe antistoffinkubasjonstrinn, tvert imot, etter at cellene er isolert ved mekanisk separasjon, er direkte avlesning på cytometeret mulig.

Som nevnt tidligere er nyrene til sebrafisken ikke bare et blodfiltreringsorgan med homeostatiske funksjoner, men også det anatomiske stedet for hematopoiesis hos voksne, tilsvarende benmargen hos pattedyr33,34,35. På denne måten når vi analyserer det ved strømning cytometri er mulig å skille cellepopulasjoner som kan sammenlignes med det menneskelige blodet61,62 (figur 6A), lar dette oss identifisere cellepopulasjonene i utgangspunktet etter størrelse og granularitet og utelukke rusk. I dette tilfellet brukte vi en transgen linje kalt Tg(mpo:GFP)52 som uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) sammen med enzymet myeloperoxidase, som er tilstede i nøytrofiler. Når vi visste dette, var portstrategien vår basert på den første separasjonen av granulocyttens befolkning (figur 6B). Etter dette ble doble celler utelukket, siden de kan endre analysen betydelig og føre til unøyaktige konklusjoner. En dobbel er en enkelt hendelse som består av to uavhengige partikler og kan utelates ved å velge en fremoverspredningshøyde (FSC-H) kontra et foroverspredningsområde (FSC-A) tetthetsplott (Figur 6C). Etter dette trinnet ble cellene som uttrykte fluorescerende markør identifisert og valgt (Figur 6D). Til slutt ble populasjonsstatistikken hentet ut fra analysen og tegnet inn som prosentandel av celler (Figur 6E).

En av de mest fremtredende egenskapene til cisplatin nefrotoksisitet er rørformet celledød10, og for å enkelt visualisere dette brukte vi TUNEL-analysen for apoptosedeteksjon. Denne metoden anbefaler å bruke ville celler og vev som mangler fluorescerende markører, siden parallell fluorescens vil forstyrre analysen, når det gjelder sebrafisk anbefales å bruke ville linjer, for eksempel AB, Tübingen, TAB eller en transgen linje med et fluorescerende protein som ikke forstyrrer TUNEL fluorescensfargen. TUNEL-teknikken tillater analysen via strømningscytometri eller mikroskopi. Mikroskopi har fordelen av å bevare vevsstrukturen, slik at man kan se hvilke celler som dør. Under det fluorescerende mikroskopet kan de lyse kjernene i apoptotiske celler lett skilles fra bakgrunnen. Dyr injisert med cisplatin (Figur 7B) har flere døde celler enn kontrollen (Figur 7A) ved 24 hk. Den endelige kvantifiseringen ble gjort med celletelleralternativet til FIJI Software og viste statistisk flere døde celler i cisplatinbehandlede nyrer enn i kontrollene (Figur 7C)

Protokollen beskrevet i dette manuskriptet viste hvordan man bruker cisplatin som induserer av AKI i voksen sebrafisk, som er dose-respondent, rask og pålitelig. Basert på dataene hentet fra overlevelsesrater og måling av tegn på nefrotoksisitet av cisplatin inkludert betennelse (påvist ved strømningscytometri) og celledød (påvist av TUNEL-analyse), foreslår vi denne modellen for studiet av cisplatin nefrotoksisitet samt for fremtidige behandlinger i AKI-relaterte sykdommer.

Figure 1
Figur 1: Struktur og sammenligning av sebrafisk og menneskelige nyrer. A. (1) Lateral utsikt over en voksen sebrafisk med nyrene representert i mørk brun plassert i fiskens dorsale vegg, mellom svømmeblæren (sb) og ryggraden. (2) Ventral visning av nyrene som viser nefroner (gul) koblet til oppsamlingskanalen (blå). De forskjellige områdene i nyrene er flagget: hode (H), stamme (Tr) og hale (Ta). (3) Skjematisk som representerer sebrafisk nefroner og deres segmenter merket og farget for å matche genetiske bevarte regioner med menneskelig nefro. B. (1) Sagittal syn på en menneskelig nyre. (2) Skjematisk som skildrer en menneskelig nefron med segmenter merket og farget. RC: nyrekorpuskel; PCT: proksimal innviklet tubule; PST: proksimal rett tubule; TL: tynn lem; LH: Henles løkke; TAL: tykk stigende lem; DE: distal tidlig; DL: distal sent; DCT: distal innviklet tubule; CD: samle rør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentell design for cisplatinindusert AKI. A. Lateral og ventral visning av voksen sebrafisk som peker nålens posisjon under injeksjonsprosedyren. Nålen trenger inn i en 20-30 ° vinkel fra magen og settes sakte parallelt med ventralveggen for å unngå å punktere viscera. B. Eksperimentell design av cisplatin-indusert AKI: (1) Injeksjon av cisplatin 120 μg/g per dyr på dag null. (2) Før forsøk på trinn 3, anbefales overlevelsesovervåking av fisk etter injeksjon fra dag én til dag ti. (3) Nyre disseksjoner en dag etter cisplatin injeksjon for videre behandlingsteknikker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mekanismer for strømningscytometri og TUNEL-teknikker. A. Oversikt over strømningscytometeret: En suspensjon av celler er hydrodynamisk fokusert på en enkelt linje av en hylsevæske, noe som får cellene til å passere en etter en foran en laserstråle. Detektorer foran og på siden måler fremoverspredningen (FSC), sidespredningen (SSC) og fluorescensen til cellene. B. Prinsippet om TUNEL-analyse. Terminal deoksynukleotidyloverføring (TdT) formidler tilsetningen av en fluorescerende merket dUTP til 3'-OH ender av et fragmentert DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Flytskjema for representerte teknikker. A. Et flytskjema som viser trinnene du må følge når du velger å analysere nyrevevet gjennom strømningscytometri (oransje) eller TUNEL (blå), når du induserer AKI ved cisplatinininjeksjon (grå). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Overlevelsesovervåking av cisplatin injisert fisk. A. Overlevelsesrate for forskjellige doser av cisplatin injeksjoner (25 - 50 - 112,5 - 120 μg / g). Log-rank (Mantel-Cox)-test, ** p < 0,01. B. Overlevelsesrate for menn vs. kvinner injisert med 120 μg/g cisplatin. Log-rank (Mantel-Cox)-test, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Portstrategi for transgen sebrafisklinje. A. Tetthet plott av sebrafisk voksne nyreceller, populasjoner er skilt etter størrelse (FSC-A) og granularitet (SSC-A). Ulike populasjoner velges av fargede ovaler/sirkler. Rosa: Erythroid; Svart: Lymfoid; Gul: Forløpere; Rød: Granulocytter. B. Tetthetsplott av sidespredningsområde (SSC-A) og fremoverspredningsområde (FSC-A) for valg av Granulocytterpopulasjon i nyrene. C. Tetthetsplott av fremover spredt høy (FSC-H) og fremover scatter område (FSC-A) for valg av singlets befolkning inne granulocyte gate. D. Tetthetsplott av fremoverspredningsområde (FSC-A) og FITC-A:MPO for valg av mpo:GFP positive celler (nøytrofiler) i nyrene. En positiv befolkning regnes som rundt 103 på, av fluorescensintensitet. E. Graf over prosentandelen av mpo:GFP positive celler (nøytrofiler) i Kontroll vs. Cisplatin dyr, 24 hpi . Ubetalt t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: TUNEL-analyse av cisplatin injisert fisk. A. Mikrofotografer av fast voksen nyre 24 timer etter 120 μg/ g cisplatin injeksjon. Kontroller injiseres med 0,9 % NaCl. TUNEL positive celler (apoptotiske celler) er farget i rødt (hvite piler). DAPI (blå) brukes som kjernefysisk motstain. Skalastang: 50 μm. 20x forstørrelse. B. Graf som viser kvantifisering av antall døde celler i nyrene med 20x felt. Ubetalt t-test, * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Transgen linje Celletype merket Referanser
Tg(spi1:EGFP)pA301 Myeloid celler Avdeling et al. 200348
Tg(zpu1:GFP) Myeloid celler Hsu et al. 200449
Tg(mhc2dab:GFP)sd6 Monocytter Wittamer et al. 201150
Tg(lysC:DsRED2) Nøytrofile Hall et al. 200751
Tg(mpo:GFP) Nøytrofile Mathias et al. 200652
Tg(mpeg1:mCherry) Makrofager Ellett et al. 201153
Tg(mpeg1:Dendra2) Makrofager Harvie et al. 201354
Tg(lck:GFP) T-celler Langenau et al. 200455
TgBAC(ikaros:EGFP) T-celler Bajoghli et al. 200956
Tg(rag1:GFP) T-celler Jessen et al. 199957
Tg(rag2:GFP) T-celler Jessen et al. 200158
Tg (CD79:GFP) B-celler Liu et al. 201759
Tg(CD45:DsRed) Leukocytter Bertrand et al. 200860

Tabell 1: Sebrafisk transgene linjer for immunceller. Tabell som gjenopptar navnene på sebrafiskreporterlinjer med den respektive typen immuncelle merket og referanseartiklene der de ble konstruert. En kombinasjon av disse sebrafisklinjene kan gi nye muligheter for cellevalg ved strømningscytometri.

Discussion

Utbredelsen av nyresykdom har fortsatt å øke over hele verden, og blir et globalt folkehelseproblem som rammer millioner av mennesker63. Å finne en måte å behandle nyre skadede individer er av avgjørende betydning, så vel som å forstå mer om deres etiologi og progresjon. Flere studier har brukt dyremodeller for å forstå nyreskader. Sebrafisk nyre (Figur 1) har blitt studert i årevis i utviklingsbiologi og skadeforskning på grunn av sin selvregenererende kapasitet og genetiske likhet29,64. Her presenterer vi en ny AKI-modell i voksen sebrafisk ved hjelp av egenskapene til cisplatin som nefrotoksisk middel, som beskriver trinnene for å oppnå en rask og akutt reaksjon med skade synlig så snart 24 hpi (Figur 2). Videre forklarer vi her to teknikker som vil bidra til evaluering av vevsskaden etter cisplatinin-injeksjonen, strømningscytometri og TUNEL (figur 3).

Nåværende AKI-modeller i voksen sebrafisk inkluderer i.p. injeksjon av gentamicin som induserer omfattende skade i nephron og tubule ødeleggelse, neonephrogenesis hendelser starter fra dag 5, og regenerering er fullført med 21 dager etter injeksjon65. På den annen side ble en modell av sepsis-assosiert akutt nyreskade (S-AKI) etablert av infeksjonen med Edwardsiella tarda, siden betydelig økt uttrykket av AKI-markører, som insulinlignende vekstfaktorbindende protein-7 (IGFBP7), vevshemmer av metalloproteinaser 2 (TIMP-2) og nyreskademolekyl-1 (KIM-1), i larver og voksen sebrafisk6. Sebrafisken er kjent for å være et høygjennomstrømningsdyr for søking av terapeutiske midler, og dette inkluderer bruk av probiotika og mikrobiota-avledede metabolitter for å studere nyrefunksjon og regenerering67. De tilgjengelige modellene kan imidlertid direkte påvirke utfallet av disse behandlingene. Dermed etablerte vi en annen metode for å indusere AKI i voksen sebrafisk (figur 4), ved hjelp av cisplatin som et kjent nefrotoksisk middel som ikke ville ha direkte kjente effekter på fiskens mikrobiota, som gentamicinmodellen for å være et antibiotika, eller infeksjonen med E. tarda, for å være en sepsismodell. Men samtidig som vi utviklet cisplatinprotokollen vår, utforsket en annen gruppe også nefrotoksiske effekter av cisplatin hos voksen sebrafisk, og forenklet dosen til 10-20-30 μg per dyr68. Selv om de også viste cisplatin doseavhengig effekt i overlevelse, anbefaler vi forsiktighet ved bruk av en enkelt mengde cisplatin for alle fisk, da sebrafisk fra samme alder kan ha svært forskjellige størrelser og vekt, og dette kan indusere variasjoner i resultatene69,70. Vi tror det er viktig å justere dosen til dyrets tilsvarende vekt, som det gjøres hos mus og denne studien.

I våre eksperimenter med voksen sebrafisk viste cisplatin en doseresponseffekt. Dette ble visualisert ved å overvåke overlevelsesraten til dyrene etter cisplatinininjeksjon (figur 5). Vi brukte overlevelse som en måte å estimere intensiteten av dosen av cisplatin og ikke som et mål på nefrotoksisitet, da ingen andre fysiske tegn er synlige i løpet av overvåkingstiden. Dette kan sammenlignes med gnagere, hvor alvorlighetsgraden av nyreskaden kan moduleres ved dosering og hyppighet av cisplatin injeksjon15, oppnå dødelige doser med høyere konsentrasjoner av cisplatin71. Døde er også sett i de følgende dagene i larvalmodellen av cisplatin72. Siden vårt mål var å indusere en akutt skade på få dager, valgte vi 120 μg / g dose cisplatin som mulig for å observere nyreskade 24 timer etter injeksjonen, men dette kan justeres avhengig av målene i studien.

Hos mennesker diagnostiseres AKI klinisk ved redusert glomerulær filtreringshastighet (GFR), forhøyet serumkreatinin og blodurea nitrogen3. I sebrafisk inneholder repertoaret til AKI-modeller noen genetisk betingede modeller73,74 og noen legemiddelrelaterte modeller65,72, men som noen av AKI funksjonelle parametere kan ikke måles på sebrafisk på grunn av tekniske vanskeligheter(f.eks. blodsamling), vedtar de fleste forskning morfologiske og visuelle teknikker for å observere egenskapene til AKI1,75 som vår studie.

Hos gnagere kommer cisplatin inn i epitelcellene i de proksimale og distale tubuliene, inne i cellen gjennomgår metabolsk aktivering og blir svært reaktivt som virker på celleorganeller og induserer endringer i cellestrukturen. Disse endringene kan indusere apoptose og autofagi og til og med nekrose, ved svært høye doser. Som svar på denne skaden frigjøres mange cytokiner og leukocytter rekrutteres som fører til betennelse og påvirker funksjonaliteten til orgelet15. Dette understreker viktigheten av å vurdere hvilken type celler som finnes i den skadede nyren, som innbyggere eller infiltrerte immunceller. Her viste vi hvordan du vurderer dette ved strømningscytometri, ved hjelp av de transgene immunreporterlinjene som er tilgjengelige i dag (Tabell 1). Cisplatin økte prosentandelen nøytrofiler (mpo:GFP positive celler) i nyrene 24 timer etter injeksjonen (Figur 6). Når det gjelder sebrafisken, er nyrene nisjen til HSC-er som gir opphav til forskjellige blodcelletyper. Likevel sirkulerer mange granulocytter og makrofager normalt i blodet. I vårt eksempel brukte vi mpo: GFP transgen linje som uttrykker GFP under promotoren av myeloperoxidase av nøytrofiler52. Opprinnelige studier av mpo: GFP transgen linje demonstrert uttrykk for myeloperoxidase i ulike tilstander av nøytrofil modning76, men vår gate strategi fokusert på granulocytt brøkdel som består av modne celler som kommer fra blodet52, på denne måten vår analyse inkluderer infiltrerte celler og ikke bosatte celler. Dette er viktig å vurdere når du isolerer ønsket cellepopulasjon.

Som forklart ovenfor er apoptose den mest klassiske markøren for cisplatin-relatert AKI. Her demonstrerte vi en enkel protokoll for lokalisering av døde celler av TUNEL-analysen. Cisplatinininjeksjon økte antallet apoptotiske celler 24 hk (figur 7). Dette kan lett kvantifiseres ved å telle direkte de døde cellene fra vevet. Likevel, for identifisering av cellespesifikk død, kan bruk av antistoffer mot ønsket celle(f.eks. rørformede celler), eller bruk av en transgen reporterlinje brukes sammen med denne teknikken. Sammenlignet med den gentamicininduserte modellen av AKI, synes cisplatin å være en mer alvorlig modell, siden gentamicin apoptose var høyere på den tredje dagen etter injeksjon65.

Til tross for å ha en rekke bivirkninger, er cisplatin fortsatt mye brukt i kreftbehandling, på grunn av effektiviteten mot ulike typer kreft, inkludert karsinomer, bakteriecelletumorer, lymfomer og sarkomer77. Nefrotoksisitet forekommer hos en tredjedel av pasientene i behandling med cisplatin10, og dermed er søket etter strategier som kan redusere denne effekten og øke renoprotection viktig. Vi tror at metodene og teknikkene som presenteres i dette manuskriptet vil bidra til å belyse mekanismer for nyreskade og finne terapeutiske mål som kan være avgjørende for å forbedre livskvaliteten til personer som lider av nyrekomplikasjoner, hovedsakelig de som er relatert til bruk av cisplatin.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finanskode 001. Vi takker våre samarbeidspartnere ved Laboratoriet til Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno's og Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, i Bioscience Institute ved University of São Paulo. Vi takker Cristiane Naffah de Souza Breda og Theresa Raquel de Oliveira Ramalho for kommentarene og forslagene til manuskriptet. Vi setter stor pris på og takker Marcio Villar Martins, fra multimediateamet til Institute of Biomedical Sciences, for innspilling, utgave og produksjon av denne videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish Renal Pathology: Emerging Models of Acute Kidney Injury. Current Pathobiology Reports. 3 (2), 171-181 (2015).
  2. Guo, C., Dong, G., Liang, X., Dong, Z. Epigenetic regulation in AKI and kidney repair: mechanisms and therapeutic implications. Nature Reviews Nephrology. 15 (4), 220-239 (2019).
  3. Makris, K., Spanou, L. Acute Kidney Injury: Definition, Pathophysiology and Clinical Phenotypes. Clinical Biochemist Reviews. 37 (2), 85-98 (2016).
  4. Sawhney, S., et al. Intermediate and Long-term Outcomes of Survivors of Acute Kidney Injury Episodes: A Large Population-Based Cohort Study. American Journal of Kidney Diseases. 69 (1), 18-28 (2017).
  5. Saxena, A., Meshram, S. V. Predictors of Mortality in Acute Kidney Injury Patients Admitted to Medicine Intensive Care Unit in a Rural Tertiary Care Hospital. Indian Journal of Critical Care Medicine. 22 (4), 231-237 (2018).
  6. Sawhney, S., Fraser, S. D. Epidemiology of AKI: Utilizing Large Databases to Determine the Burden of AKI. Advances in Chronic Kidney Disease. 24 (4), 194-204 (2017).
  7. Sales, G. T. M., Foresto, R. D. Drug-induced nephrotoxicity. Revista da Associação Médica Brasileira. 66, Suppl 1 82-90 (2020).
  8. Perazella, M. A. Drug use and nephrotoxicity in the intensive care unit. Kidney International. 81 (12), 1172-1178 (2012).
  9. Taber, S. S., Mueller, B. A. Drug-associated renal dysfunction. Critical Care Clinics. 22 (2), 357-374 (2006).
  10. Pabla, N., Dong, Z. Cisplatin nephrotoxicity: mechanisms and renoprotective strategies. Kidney International. 73 (9), 994-1007 (2008).
  11. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 307-320 (2005).
  12. Shirmanova, M. V., et al. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 8911 (2017).
  13. Xu, Y., et al. A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (11), 2647-2658 (2015).
  14. Kociba, R. J., Sleight, S. D. Acute toxicologic and pathologic effects of cis-diamminedichloroplatinum (NSC-119875) in the male rat. Cancer Chemotherapy Reports. 55 (1), 1-8 (1971).
  15. Perše, M., Večerić-Haler, Ž Cisplatin-Induced Rodent Model of Kidney Injury: Characteristics and Challenges. BioMed Research International. 2018, 1462802 (2018).
  16. Dobyan, D. C., Levi, J., Jacobs, C., Kosek, J., Weiner, M. W. Mechanism of cis-platinum nephrotoxicity: II. Morphologic observations. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 213 (3), 551-556 (1980).
  17. Singh, G. A possible cellular mechanism of cisplatin-induced nephrotoxicity. Toxicology. 58 (1), 71-80 (1989).
  18. Jodrell, D. I., et al. The renal effects of N10-propargyl-5,8-dideazafolic acid (CB3717) and a non-nephrotoxic analogue ICI D1694, in mice. British Journal of Cancer. 64 (5), 833-838 (1991).
  19. McKeage, M. J., et al. Lack of nephrotoxicity of oral ammine/amine platinum (IV) dicarboxylate complexes in rodents. British Journal of Cancer. 67 (5), 996-1000 (1993).
  20. Gautier, J. C., et al. Evaluation of novel biomarkers of nephrotoxicity in two strains of rat treated with Cisplatin. Toxicologic Pathology. 38 (6), 943-956 (2010).
  21. Vinken, P., et al. Tissue Kim-1 and urinary clusterin as early indicators of cisplatin-induced acute kidney injury in rats. Toxicologic Pathology. 40 (7), 1049-1062 (2012).
  22. Zorzetto, R., Guimarães, M. Um peixe modelo. Pesquisa FAPESP. 209, 16-21 (2013).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Chakrabarti, S., Streisinger, G., Singer, F., Walker, C. Frequency of gamma-Ray Induced Specific Locus and Recessive Lethal Mutations in Mature Germ Cells of the Zebrafish, BRACHYDANIO RERIO. Genetics. 103 (1), 109-123 (1983).
  25. Walker, C., Streisinger, G. Induction of Mutations by gamma-Rays in Pregonial Germ Cells of Zebrafish Embryos. Genetics. 103 (1), 125-136 (1983).
  26. Morales, E. E., Wingert, R. A. Zebrafish as a Model of Kidney Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 60, 55-75 (2017).
  27. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney International. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  28. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Translational Research. 163 (2), 109-122 (2014).
  29. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods in Cell Biology. 100, 233-260 (2010).
  30. Saxén, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1 (3), 385-392 (1987).
  31. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  32. Hill, A. J., Bello, S. M., Prasch, A. L., Peterson, R. E., Heideman, W. Water permeability and TCDD-induced edema in zebrafish early-life stages. Toxicological Sciences. 78 (1), 78-87 (2004).
  33. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
  34. Majumdar, A., Drummond, I. A. Podocyte differentiation in the absence of endothelial cells as revealed in the zebrafish avascular mutant, cloche. Developmental Genetics. 24 (3-4), 220-229 (1999).
  35. Song, H. D., et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (46), 16240-16245 (2004).
  36. Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
  37. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
  38. Palis, J., Yoder, M. C. Yolk-sac hematopoiesis: the first blood cells of mouse and man. Experimental Hematology. 29 (8), 927-936 (2001).
  39. O'Donnell, E. A., Ernst, D. N., Hingorani, R. Multiparameter flow cytometry: advances in high resolution analysis. Immune Network. 13 (2), 43-54 (2013).
  40. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  41. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118 (2), 289-297 (2011).
  42. Kulkeaw, K., et al. Purification of zebrafish erythrocytes as a means of identifying a novel regulator of haematopoiesis. British Journal of Haematology. 180 (3), 420-431 (2018).
  43. Ratnayake, D., Currie, P. D. Fluorescence-Activated Cell Sorting of Larval Zebrafish Muscle Stem/Progenitor Cells Following Skeletal Muscle Injury. Methods in Molecular Biology. 1889, 245-254 (2019).
  44. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  45. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  46. Wilson, J. M., Bunte, R. M., Carty, A. J. Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (6), 785-789 (2009).
  47. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  48. Ward, A. C., et al. The zebrafish spi1 promoter drives myeloid-specific expression in stable transgenic fish. Blood. 102 (9), 3238-3240 (2003).
  49. Hsu, K., et al. The pu.1 promoter drives myeloid gene expression in zebrafish. Blood. 104 (5), 1291-1297 (2004).
  50. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  51. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  52. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1281-1288 (2006).
  53. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  54. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate immune response to Streptococcus iniae infection in zebrafish larvae. Infection and Immunity. 81 (1), 110-121 (2013).
  55. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  56. Bajoghli, B., et al. Evolution of genetic networks underlying the emergence of thymopoiesis in vertebrates. Cell. 138 (1), 186-197 (2009).
  57. Jessen, J. R., Willett, C. E., Lin, S. Artificial chromosome transgenesis reveals long-distance negative regulation of rag1 in zebrafish. Nature Genetics. 23 (1), 15-16 (1999).
  58. Jessen, J. R., Jessen, T. N., Vogel, S. S., Lin, S. Concurrent expression of recombination activating genes 1 and 2 in zebrafish olfactory sensory neurons. Genesis. 29 (4), 156-162 (2001).
  59. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
  60. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135 (10), 1853-1862 (2008).
  61. de Jong, J. L., Zon, L. I. Histocompatibility and hematopoietic transplantation in the zebrafish. Advances in Hematology. 2012, 282318 (2012).
  62. Ossowski, P., et al. Differentiation of morphotic elements in human blood using optical coherence tomography and a microfluidic setup. Optics Express. 23 (21), 27724-27738 (2015).
  63. McCullough, K., et al. Measuring the population burden of chronic kidney disease: a systematic literature review of the estimated prevalence of impaired kidney function. Nephrology Dialysis Transplantation. 27 (5), 1812-1821 (2012).
  64. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  65. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of Cellular Dynamics during Zebrafish Adult Kidney Regeneration. Stem Cells International. 2015, 547636 (2015).
  66. Wen, X., et al. A zebrafish model of infection-associated acute kidney injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 291-299 (2018).
  67. Gong, J., Noel, S., Pluznick, J. L., Hamad, A. R. A., Rabb, H. Gut Microbiota-Kidney Cross-Talk in Acute Kidney Injury. Seminars in Nephrology. 39 (1), 107-116 (2019).
  68. Kim, M. J., Moon, D., Jung, S., Lee, J., Kim, J. Cisplatin nephrotoxicity is induced via poly(ADP-ribose) polymerase activation in adult zebrafish and mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 318 (5), 843-854 (2020).
  69. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental Dynamics. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  70. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: a staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  71. Wagner, T., Kreft, B., Bohlmann, G., Schwieder, G. Effects of fosfomycin, mesna, and sodium thiosulfate on the toxicity and antitumor activity of cisplatin. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 114 (5), 497-501 (1988).
  72. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (5), 923-929 (2005).
  73. Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (6), 1039-1047 (2012).
  74. Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney International. 83 (6), 1193-1200 (2013).
  75. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. Journal of Visualized Experiments. (96), e52540 (2015).
  76. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult zebrafish. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  77. Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).

Tags

Medisin Utgave 171 Nyre Akutt nyreskade (AKI) Cisplatin Sebrafisk Betennelse Strømningscytometri TUNEL Celledød
Akutt nyreskademodell indusert av Cisplatin i voksen sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Fénero, C., Padovani,… More

Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter