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Medicine

वयस्क जेब्राफिश में सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित एक्यूट किडनी इंजरी मॉडल

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/61575
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Immunology, University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, Federal University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क जेब्राफिश में एक्यूट किडनी इंजरी (AKI) को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में सिस्प्लैटिन का उपयोग करके प्रेरित करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। हमने तकनीक की प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कदम और गुर्दे के ऊतकों में सूजन और सेल मृत्यु का विश्लेषण करने के लिए दो तकनीकों को विस्तृत किया, प्रवाह साइटोमेट्री और ट्यूनल, क्रमशः।

Abstract

सिस्प्लैटिन आमतौर पर कीमोथेरेपी के रूप में प्रयोग किया जाता है। हालांकि कैंसर के इलाज वाले व्यक्तियों में इसका सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, लेकिन सिस्प्लैटिन अपने कम आणविक वजन के कारण गुर्दे में आसानी से जमा हो सकता है। इस तरह के संचय ट्यूबलर कोशिकाओं की मौत का कारण बनता है और तीव्र गुर्दे की चोट (AKI) के विकास को प्रेरित कर सकता है, जो गुर्दे के कार्य, ऊतक क्षति और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ में त्वरित कमी की विशेषता है। यदि विशिष्ट खुराक में प्रशासित सिस्प्लैटिन पशु मॉडल में एक AKI प्रेरक के रूप में एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। ज़ेब्राफ़िश गुर्दे के कार्य, गुर्दे के उत्थान और चोट का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल के रूप में दिखाई दिया है, क्योंकि गुर्दे की संरचनाएं स्तनधारियों के साथ कार्यात्मक समानताओं का संरक्षण करती हैं। सिस्प्लैटिन के साथ इंजेक्शन वयस्क जेब्राफिश से पता चलता है कि 24 घंटे के बाद इंजेक्शन (एचपीआई) के बाद जीवित रहने, गुर्दे की कोशिका मृत्यु और सूजन मार्कर में कमी आई है। इस मॉडल में इम्यून सेल्स घुसपैठ और सेल डेथ का आकलन फ्लो साइटोमेट्री और ट्यूनल परख से किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल इंट्रापेरिटोनियल सिस्प्लैटिन इंजेक्शन द्वारा वयस्क जेब्राफिश में AKI को प्रेरित करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है और बाद में यह दर्शाता है कि प्रवाह साइटोमेट्री प्रसंस्करण और सेल डेथ ट्यूनल परख के लिए गुर्दे के ऊतकों को कैसे इकट्ठा किया जाए। ये तकनीकें सिस्प्लैटिन के प्रभावों को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में समझने के लिए उपयोगी होंगी और वयस्क जेब्राफिश में AKI मॉडल के विस्तार में योगदान देंगी। इस मॉडल का उपयोग गुर्दे के उत्थान का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, उन यौगिकों की तलाश में जो गुर्दे की क्षति का इलाज या रोकथाम करते हैं और AKI में सूजन का अध्ययन करते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले तरीकों से ऊतक क्षति और सूजन के लक्षण वर्णन में सुधार होगा, जो गुर्दे से जुड़े comorbidities में चिकित्सीय लक्ष्य हैं।

Introduction

गुर्दे कई महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं जो होमोसेस्टेसिस को बनाए रखते हैं, जैसे रक्त निस्पंदन, अतिरिक्त अवशेषों को हटाना, और आयन सांद्रता का विनियमन1। गुर्दे के ऊतकों की क्षति एक विषम गुर्दे की चोट (AKI) नामक एक विषम स्थिति का कारण बन सकती है, जिसे चिकित्सकीय रूप से ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं, एंडोथेलियल सेल चोट और ल्यूकोसिटे घुसपैठ 2, 3के विनाश और मृत्यु के कारण गुर्दे के कार्य में तेजी से कमी के रूप में वर्णित कियाजाताहै। AKI एक ऐसी स्थिति है जो अस्पताल में प्रवेश के 8-16% में होने का अनुमानहै, 4,उच्च मृत्यु दर के साथ जो गहन चिकित्सा इकाई (आईसीयू) 5 में 20 से50%तक है। यह बीमारी अस्पताल में रहने और वित्तीयसंसाधनोंके पर्याप्त उपयोग से जुड़ी है । एटियोलॉजिक कारकों में निर्जलीकरण, सदमे, संक्रमण, सेप्सिस, हृदय रोग, और नेफ्रोटॉक्सिक दवाएं शामिल हैं6। नेफ्रोटॉक्सिसिटी को दवाओं द्वारा प्रेरित गुर्दे की चोट के रूप में परिभाषित किया गया है, जिससे एकी, ट्यूबुलोपैथी और ग्लोमेरूपैथी7के रूप में प्रभाव पड़ता है। नेफ्रोटॉक्सिकिटी आईसीयू के दो-तिहाई रोगियों को प्रभावित करती है, क्योंकि आईसीयू में निर्धारित दवाओं का लगभग 20% नेफ्रोटॉक्सिक8,9 मानाजाताहै, इसमें नॉनस्टेरॉयड एंटी-भड़काऊ दवाएं (NSAIDs), वैनकोमाइसिन और अमीनोग्लाइकोसाइड्स जैसी एंटीबायोटिक्स, और मेथोट्रेक्सेट और सिस्प्लैटिन7जैसे कीमोथ्यूटिक एजेंट शामिल हैं। सिस्प्लैटिन सबसे शक्तिशाली और आम कीमोथेरेपी दवाओं में से एक है, जो ठोस ट्यूमर के इलाज में उपयोग की जाती है, जैसे सिर और गर्दन, वृषण, अंडाशय, और मूत्राशय10। गुर्दे में, सिस्प्लैटिन को कार्बनिक cationic ट्रांसपोर्टर 2 (OCT-2) के माध्यम से समीपस्थ जटिल ट्यूब (पीसीटी) में आंतरिक किया जाता है और उच्च सांद्रता में डीएनए ट्रिगर सेल मौत के रास्ते7,10, 11,12से बांधता है। गुर्दे में इस दवा के जमा होने से मृत्यु और सूजन के साथ नेफ्रोटॉक्सिकिटी में योगदान होता है13. यह हानिकारक दुष्प्रभाव सिस्प्लैटिन उपचार से गुजर रहे कैंसर रोगियों के एक तिहाई के जीवन और पूर्वानुमान को अत्यधिक प्रभावित करता है, इसलिए आवश्यक है कि नए उपचारों का शोध जो कैंसर कोशिकाओं पर हत्या प्रभाव को खोने के बिना नेफ्रोटॉक्सिकिटी को कम कर सकता है10।

इस नेफ्रोटॉक्सिक प्रभाव के कारण, सिस्प्लैटिन का उपयोग आमतौर पर प्रयोगात्मक पशु मॉडल में अकी के प्रेरक के रूप में किया जाता है, जैसा कि आगे वर्णित है। कृंतक में, सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित पहला एकी मॉडल 1 971 14 में सूचित किया गया था लेकिन वर्तमान में, सिस्प्लैटिन15के खुराक-निर्भर और संचयी प्रभावों का उपयोग करके कई अलग-अलग प्रोटोकॉल उभरे हैं। इस प्रकार, अनुप्रयोगों की खुराक और संख्या के आधार पर,गुर्दे की चोट की गंभीरता के विभिन्न ग्रेड16, 17,18, 19,20,21प्रेरित किए जा सकते हैं। सबसे लगातार विधि में सिस्प्लैटिन की एक खुराक का इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन होता है जिसके बाद निम्नलिखित दिनों में इच्छामृत्यु होती है। इस क्लासिक प्रोटोकॉल में, सिस्प्लैटिन की एक उच्च नेफ्रोटॉक्सिक खुराक (चूहों में 10-13 मिलीग्राम/किलो और चूहों में 3-8 मिलीग्राम/किलो) गंभीर हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन लाती है, जैसे ब्रश सीमा और ट्यूबलर ल्यूमेन के अंदर सेल मलबे का नुकसान, सिस्प्लैटिन इंजेक्शन के कुछ दिन बाद । हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों की गंभीरता खुराक पर निर्भर है, और पुनर्जनन के लक्षण सिस्प्लैटिन इंजेक्शन16, 17के 7 दिन बाद देखे जातेहैं।

हालांकि कृंतक मॉडल अच्छी तरह से स्थापित हैं, हमने जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)पर अपने अध्ययन को केंद्रित करते हुए एक और कशेरुकी की विशेषताओं का लाभ उठाने का फैसला किया। इस मछली को बड़े पैमाने पर मानव रोगों मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि इसके छोटे आकार, बाहरी निषेचन, उच्च प्रजनन दर, तेजी से विकास, भ्रूण और लार्वा की पारदर्शिता, कम रखरखाव लागत, स्तनधारियों के समान शरीर रचना (कुछ अपवादों के साथ), उच्च ऊतक उत्थान क्षमता, सामाजिक व्यवहार, मनुष्यों के साथ आनुवंशिक समानता का ७०% और मानव रोगों से जुड़े जीन22के साथ ८४% । स्ट्रीसिंगर एट अल23,24,25 ने जेब्राफिश के साथ अध्ययन शुरू किया जिसने कशेरुकी विकास के आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस मॉडल जीव का उपयोग करने की व्यावहारिकता की पुष्टि की। किडनी रिसर्च में जेब्राफिश न सिर्फ विकासात्मक अध्ययनों में बल्कि किडनी की स्थिति26से जुड़े नए जीन की तलाश में जेनेटिक टूल के रूप में भी सामने आई है । इसके अलावा, निशान गठन के बिना पुनर्जनन की क्षमता और उनके जीवन के माध्यम से नेफ्रॉन उत्पन्न करने की क्षमता, जिसे नियोनेफ्रोजेनेसिस कहा जाता है, जेब्राफिश को पुनर्जनन अनुसंधान27,28के लिए एक प्रमुख पशु मॉडल बनाते हैं। इसके अलावा, तीव्र और क्रोनिक किडनी इंजरी सहित विभिन्न गुर्दे की बीमारी के लिए प्रायोगिक मॉडलों की उपलब्धता, इस प्रयोगात्मक जीव26,29की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है। स्तनधारियों की तरह, जेब्राफिश के गुर्दे के जनक मध्यवर्ती मेसोडर्म से प्राप्त होते हैं। इस तरह के गुर्दे के जनक प्रोप्रोफस उत्पन्न करते हैं जो बाद में मेसोनेफ्रोस में विकसित होंगे, जिसे वयस्कता29,30तक एक परिपक्व अंग के रूप में बनाए रखा जाएगा।

वयस्क जेब्राफिश किडनी तैरने वाले मूत्राशय औररीढ़ 29के बीच शरीर की पृष्ठीय दीवार पर स्थित है। एक वेंट्रल व्यू से, जेब्राफिश को तीन क्षेत्रों(चित्रा 1A):सिर (एच), ट्रंक (टीआर), और पूंछ(टीए) 29में विभाजित किया जा सकता है। स्तनधारियों के समान, जेब्राफिश में गुर्दे की कार्यात्मक इकाइयों के रूप में नेफ्रॉन होते हैं, जिन्हें ट्यूबल सेगमेंट(चित्रा 1A): गुर्देके कॉर्पसकल (आरसी), समीपस्थ जटिल ट्यूबुल (पीसीटी), समीपस्थ सीधे ट्यूबल (पीएसटी), डिस्टल अर्ली (डीई), लेट डिस्टल (डीएल) और डक्ट (सीडी)29का संग्रह करने में विभाजित किया जाता है। ज़ेब्राफ़िश मानव नेफ्रॉन(चित्रा 1 बी)के साथ आनुवंशिक संरक्षण और संरचनात्मक समानताएं साझा करता है, लेकिन इसमें मध्यवर्ती ट्यूबल जैसे कुछ संरचनाओं का अभाव है, जिसे हेनले (एलएच)29,31के लूप के रूप में भी जाना जाता है। जेब्राफिश जैसी मीठे पानी की मछलियां आम तौर पर बहुत कम ऑस्मोलैरिटी वाले माध्यम से घिरी होती हैं, इस वजह से, वे हाइपरमोस्मोटिक हो जाती हैं और गहरे नाले, शुरुआती चरणों में त्वचा, और ओस्मोलैरिटी और पानी के उत्सर्जन को विनियमित करने के लिए गुर्दे पर निर्भर करती हैं32। प्रोप्रोफस द्वारा पृष्ठीय महाधमनी से रक्त का निस्पंदन 48 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ)33, 34के आसपास शुरूहोताहै। जेब्राफिश की किडनी न केवल मेटाबॉलिक वेस्ट एक्साइटिंग ऑर्गन है बल्कि 4 दिन बाद फर्टिलाइजेशन (डीपीएफ) से वयस्कता तक हेमेटोपोइटिक ऑर्गन के तौर पर भी काम करती है और यह स्तनधारियों35में बोन मैरो के बराबर है। विकास के दौरान, हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) गुर्दे को बीज देगा, आत्म-पुनर्निर्मित, और माइलॉयड, एरिथ्रोइड और लिम्फोइड सेल वंश उत्पन्न करेगा, प्रतिलेखन कारकों को बनाए रखेगा, अणुओं का संकेत देगा, और स्तनधारियों के साथ अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक कार्यक्रम36,37। अध्ययनों से पता चला है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की अधिकांश एरिथ्रोइड, थ्रोम्बोसाइटिक, माइलॉयड और लिम्फाइड कोशिकाएं जेब्राफिश37, 38में मौजूद हैं। इस जानवर की अनूठी विशेषताओं और मानव गुर्दे के साथ संरक्षित विशेषताओं ने गुर्दे के कार्य, चोट और उत्थान के शोध में इस मॉडल जीव को लाभप्रद बना दिया।

यद्यपि जेब्राफिश के गुर्दे का अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है और एकेआई के कुछ मॉडल पहले से ही लार्वा और वयस्क जेब्राफिश28में उपलब्ध हैं, इस प्रोटोकॉल की स्थापना के समय वयस्क जेब्राफिश में रासायनिक रूप से प्रेरित गैर-एंटीबायोटिक AKI मॉडल का कोई सबूत नहीं था। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला पुनर्जनन और गुर्दे की क्षति का अध्ययन करने के लिए प्रोबायोटिक बैक्टीरिया और माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न यौगिकों का परीक्षण करने पर केंद्रित है, इस प्रकार हमने वयस्क मछलियों में एक नया सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI मॉडल बनाने में अपने प्रयासों को केंद्रित किया। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत वीडियो लेख 120 यूजी सिस्प्लैटिन प्रति ग्राम पशु (120 माइक्रोग्राम/जी) (चित्रा 2 ए) के एक आईपी इंजेक्शन का उपयोग करके AKI प्रेरण के एक नए मॉडल के लिए प्रक्रियाओंको दर्शाता है। यह खुराक शुरू में मुरीन मॉडल में सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित एकी के अध्ययन पर आधारित थी जो लगभग 10 मिलीग्राम/किलो (10 माइक्रोग्राम/जी के बराबर)14,15,16,17के आसपास चली गई, हालांकि, यह खुराक नेफ्रोटॉक्सिकिटी (डेटा नहीं दिखाए गए) से संबंधित गुर्दे की क्षति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं थी। इस प्रकार, हमने इस अध्ययन(चित्रा 2B)में उपयोग किए जाने वाले लोगों को खुराक में वृद्धि की। हमारे काम गुर्दे के ऊतक क्षति 24 hpi के शामिल करने के साथ इंजेक्शन के बाद जीवित रहने की दर में सिस्प्लैटिन के एक खुराक पर निर्भर प्रभाव से पता चला के रूप में ट्यूबलर संरचना के नुकसान से दिखाया गया है, भड़काऊ घुसपैठ में वृद्धि हुई है, और सेल मौत की उच्च दर । यहां, हम सेल डेथ को मापने के लिए सेल घुसपैठ और ट्यूनल का विश्लेषण करने के लिए सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI के विकास का विश्लेषण करने के लिए दो तकनीकों का वर्णन करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री एक ऐसी तकनीक है जो कोशिकाओं की भौतिक (आकार और दानेदारता) और रासायनिक (फ्लोरोसेंट यौगिकों) विशेषताओं को मापती है। साइटोमीटर के अंदर सेल सस्पेंशन एक म्यान तरल पदार्थ के माध्यम से चलता है जो कोशिकाओं को एक ही पंक्ति में व्यवस्थित करता है, जिससे उन्हें एक समय में लेजर बीम वन सेल(चित्रा 3 ए)से गुजरने की अनुमति देता है। प्रकाश बीम के सामने एक डिटेक्टर फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) को मापेगा, जो सेल आकार से संबंधित है, और साइड में डिटेक्टर साइड स्कैटर (एसएससी) को मापेंगे जो कोशिकाओं की दानेदारता से संबंधित है। अन्य डिटेक्टर कणों, फ्लोरोसेंट-प्रोटीन, या एंटीबॉडी लेबल वाली कोशिकाओं39,40से फ्लोरेसेंस को मापेंगे। चूंकि जेब्राफिश के लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी आजकल दुर्लभ हैं, पशु संवाददाताओं और फ्लोरोसेंट बायोमार्कर का उपयोग इस विश्लेषण में सुधार करने और विविधकोशिकाआबादी 41,42, 43की पहचान करने की अनुमतिदेताहै। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला एक अन्य उपकरण टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफरेज (टीडीटी) डयूटीप निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल) परख था। ट्यूनल परख एक देर से चरण एपोप्टोसिस डिटेक्शन विधि है जो खंडित डीएनए की पहचान करने के लिए टीडीटी की क्षमता पर निर्भर करती है और इसे फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग किए गए डिऑक्सी न्यूक्लियोटाइड के साथ लेबल करती है जिसे बाद में माइक्रोस्कोपी44 (चित्रा 3 बी)द्वारा कल्पना और मात्रात्मक किया जा सकताहै। यह देखते हुए कि AKI की सबसे हड़ताली विशेषताओं में से एक ट्यूबलर किडनी कोशिकाओं3में एपोप्टोसिस का प्रेरण है, यह तकनीक बेहद लाभप्रद है क्योंकि इसका विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री और/या माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है ।

इस लेख में प्रस्तुत दृष्टिकोण AKI स्थिति के अवलोकन की अनुमति देता है और AKI विकारों का अध्ययन करने के लिए एक नया तीव्र मॉडल प्रदान करता है जो सिस्प्लैटिन से संबंधित AKI में नए चिकित्सीय लक्ष्यों के शोध के लिए उपयोगी हो सकता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं को पहले साओ पाउलो विश्वविद्यालय के जैव चिकित्सा विज्ञान संस्थान की पशु उपयोग आचार समिति द्वारा जेब्राफिश मॉडल में उपयोग करने की मंजूरी दी गई थी।

1. सिस्प्लैटिन इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा AKI प्रेरण

  1. 0.9% एनएसीएल में 850 μg/l करने के लिए स्टॉक समाधान को कमजोर करके सिस्प्लैटिन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। कमरे के तापमान पर रखें, प्रकाश से संरक्षित।
    सावधानी: फैब्रिकेंट काले चश्मे, दस्ताने और प्रयोगशाला कोट सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ सिस्प्लैटिन के हेरफेर की सिफारिश करता है। कमरे के तापमान पर स्टॉक समाधान स्टोर करें, प्रकाश से संरक्षित।
  2. सिस्टम वाटर45में 150 मिलीग्राम/एल एमएस-222 (ट्राइकेन) एनेस्थेटिक तैयार करें। लगभग 1-2 मिनट के लिए विसर्जन करके वयस्क जेब्राफिश (5-9 महीने) को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: प्रभावी रूप से एनेस्थेटाइज्ड मछली को छूने के लिए लापरवाही होनी चाहिए। प्रभावी संज्ञाहरण का परीक्षण करने के लिए, प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए धीरे-धीरे कौडल फिन दबाएं।
    सावधानी: ट्राइकेन त्वचा और आंखों के लिए एक अड़चन है, हेरफेर करने के लिए पीपीई का उपयोग करें।
  3. एक प्लास्टिक चम्मच का उपयोग शरीर के चारों ओर अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए मछली को एक शोषक सतह पर स्थानांतरित करता है, जैसे कि पेपर तौलिए। फिर, प्लास्टिक चम्मच के साथ मछली को एक पैमाने पर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और मछली का वजन करें। मछली के वजन पर ध्यान दें क्योंकि यह खुराक गणना के लिए आवश्यक होगा।
    नोट: मछली से अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने से जानवर के वजन को अधिक अनुमान लगाने से रोकता है, अधिक शुष्क नहीं है क्योंकि मछली के लिए प्रतिकूल है।
  4. वजन के 120 μg/ सिस्प्लैटिन वर्किंग सॉल्यूशन (850 माइक्रोग्राम) के माइक्रोग्राम के अनुसार अंतिम खुराक (120 माइक्रोग्राम) के माइक्रोग्राम को विभाजित करें और इस संख्या को 1000 के लिए गुणा करके माइक्रोलीटर (माइक्रोल) में परिवर्तित करें, ताकि सिस्प्लैटिन (141.2 माइक्रोन) की 120 माइक्रोग्राम की मात्रा प्राप्त की जा सके। फिर अंतिम मात्रा को इंजेक्ट करने के लिए मछली (जी) के वजन के लिए इस संख्या (141.2 μL) को गुणा करें।
  5. एक प्लास्टिक चम्मच के साथ, मछली को गीले स्पंज पर थोड़ा कट के साथ स्थानांतरित करें, इसे पकड़ने के लिए, वेंट्रल साइड अप के साथ। स्पंज सिस्टम के पानी में एनेस्थेटिक से गीला होना चाहिए।
  6. सिस्प्लैटिन वर्किंग सॉल्यूशनकी गणना की गई मात्रा के साथ 31 जी 1.0 एमएल इंसुलिन सिरिंज भरें।
  7. विस्सरा(चित्रा 2 ए)को पंचर करने से बचने के लिए एक उथले कोण पर, पेल्विक फिन के पास जानवर के इंट्रापेरिटोनियल हिस्से में सुई डालें। फिर धीरे-धीरे समाधान इंजेक्ट करें।
  8. इंजेक्शन के बाद एनेस्थीसिया से ठीक होने के लिए मछली को टैंक में रखें। सामान्य वसूली के संकेतों के लिए मछली देखें(उदाहरण के लिए, तैराकी आंदोलन, ऑपर्युलर आंदोलन)।
    नोट: जानवर अगले 3-5 मिनट में ठीक हो जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो मछली को प्लास्टिक के चम्मच, एक पाश्चर प्लास्टिक पिपेट के साथ ले जाकर उत्तेजित करें, या इसे बुलबुले के साथ नली के करीब रख दें।
  9. मछली को नियंत्रित करने के लिए, 0.9% एनएसीएल के समाधान को इंजेक्ट करके एक ही प्रक्रिया करें। शरीर के वजन के अनुपात के बाद एक ही गणना का उपयोग करें: इंजेक्शन की मात्रा मछली (जी) के वजन से गुणा 141 μL हो जाएगा।
  10. अगले दिनों में दिन में कम से कम दो बार मछली के अस्तित्व की निगरानी करें(चित्रा 2B)।

2. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री के लिए किडनी आइसोलेशन और ऊतक प्रसंस्करण

  1. इस प्रक्रिया के लिए, प्रतिरक्षा सेल-फ्लोरोसेंट चिह्नित ट्रांसजेनिक जानवरों(जैसे,टीजी(एमपीओ: जीएफपी)का उपयोग करें।
  2. 120 μg/g सिस्प्लैटिन के 24 एचपीआई के बाद, हाइपोथर्मल शॉक (रैपिड द्रुतशीतन) द्वारा जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: हाइपोथर्मल शॉक को एमएस-222 ओवरडोज की तुलना में इच्छामृत्यु विधि के रूप में अधिक प्रभावी होने के लिए प्रदर्शित किया गया है। हाइपोथर्मल शॉक एमएस-222 के उपयोग की तुलना में कर्मियों के लिए कम तनावपूर्ण, तेज, सुसंगत और सुरक्षित है, पहले46,47वर्णित है।
  3. एक बाहरी क्रॉसिंग टैंक में बर्फ के 5:1 अनुपात में बर्फ-पानी को सिस्टम के पानी में तैयार करें, भीतरी टैंक को बर्फ के ऊपर स्क्रीन के साथ रखें, तब तक इंतजार करें जब तक कि पानी 2-4 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
    नोट: मछलियों को बर्फ के सीधे संपर्क में नहीं होना चाहिए, क्योंकि इससे थर्मल जलने और दर्द हो सकता है।
  4. बर्फ के पानी में जानवर स्थानांतरित करें, कम से कम 10 मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि अभिविन्यास की हानि न हो और कोई ऑपर्युलर आंदोलन न हो।
  5. एक प्लास्टिक चम्मच के साथ, अतिरिक्त पानी को सुखाने के लिए मछली को कागज के तौलिए पर रखें।
  6. मछली को 3% एगर उठे विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे ऊपरी प्रकाश के साथ स्टीरियोस्कोप के नीचे ले जाएं। कैंची के साथ, आंखों के ठीक पीछे तेजी से कटौती करने वाली मछली को काटना, और सिर को हटा दें।
  7. ठीक कैंची के साथ खुले पक्ष से क्लोका में एक कट बनाते हैं और ठीक संदंश के साथ आंतरिक अंगों को हटा दें।
  8. शव को खोलने और रीढ़ की हड्डी से जुड़ी किडनी को बेनकाब करने के लिए शरीर की दीवारों के किनारों को चुटकी लेने के लिए कीट पिन का उपयोग करें।
  9. ठीक संदंश के साथ गुर्दे अलग और 1x PBS/2% FBS के एक ठंडे समाधान के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में अंग जगह है । बर्फ पर रखें।
  10. एक पाश्चर प्लास्टिक पिपेट के साथ ऊतक उठाओ और एक ५० एमएल ट्यूब पर एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से ऊतक पारित, धीरे से यह एक सिरिंज प्लंजर के साथ macerating ।
  11. 1x पीबीएस/2% एफबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धोएं और 50 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  13. ध्यान से 1 एमएल माइक्रोपिपेट के साथ सभी सुपरनेट उठाओ और इसे त्यागें। कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए कोल्ड 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें 5 एमएल फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में रखें। बर्फ पर रखें।
  14. न्यूबॉयर चैंबर में कोशिकाओं की गणना करें जो ट्राइपैन ब्लू में 1:10 कमजोर पड़ने वालीहैं (उदाहरण के लिए,नमूने के 10 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू के 90 माइक्रोन के साथ मिलाएं)। मिश्रण के 10 माइक्रोल को एक न्यूबॉयर कक्ष में जोड़ें और माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: इष्टतम परिणाम 1-5 x 106 कोशिकाओं/एमएल और >८०% व्यवहार्यता के साथ होने की उम्मीद है ।
    सावधानी: ट्राइपैन ब्लू एक कैंसरजनक एजेंट है, संभालने के लिए पीपीई का उपयोग करें।
  15. कोशिकाओं को एक साइटोमीटर द्वारा पढ़ने के लिए ले लो। फिर ब्याज की आबादी का चयन करने वाले परिणामों का विश्लेषण करें।

3. ट्यूनल परख के लिए वयस्क जेब्राफिश किडनी ऊतक की प्रसंस्करण

  1. इस प्रक्रिया के लिए, ट्यूनल किट की तुलना में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंग वाले जंगली प्रकार के जानवरों(जैसे,एबी, तुबिनजेन, आदि) या ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करें, क्योंकि इसी तरह की फ्लोरेसेंस ट्यूनल के विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकती है।
  2. 120 μg/g सिस्प्लैटिन के 24 एचपीआई के बाद, हाइपोथर्मल शॉक (रैपिड द्रुतशीतन) द्वारा जानवरों को इच्छामृत्यु दें। 2.3-2.4 देखें।
  3. 2.5-2.6 में वर्णित मछली को विच्छेदन करें; गुर्दे को निर्धारण प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी से जुड़ा रहना चाहिए (नीचे समझाया गया)।
  4. कीट पिन का उपयोग करके, शव को खोलने के लिए शरीर की दीवारों के किनारों को चुटकी लें और गुर्दे को उजागर रखने के लिए इसे कॉर्क सतह पर पिन करें।
    नोट: यह प्रक्रिया यह सुनिश्चित करती है कि गुर्दे बाद के विश्लेषण के लिए सही स्थिति में रहता है।
  5. फिर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के एक हौसले से बनाए गए समाधान पर 6 अच्छी तरह से प्लेट में नीचे का सामना करना पड़ गुर्दे के साथ कॉर्क सतह जगह है । इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    सावधानी: पीएफए त्वचा और श्लेष्म सतहों के लिए कैंसरजनक और अड़चन है। नेत्र संरक्षण उपकरण सहित पीपीई का उपयोग करके रासायनिक हुड के तहत पीएफए समाधान तैयार करें।
  6. अगले दिन, गुर्दे को 2.8 की तरह विच्छेदन करें। गुर्दे को 1x पीबीएस के साथ 60 मिमी पेट्री डिश में रखें और 1x पीबीएस में दो बार कुल्ला करें।
  7. ऊतक के लिए एक समर्थन मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए 2% एग्रिस तैयार करें।
  8. पेट्री डिश से शेष सभी 1x पीबीएस को त्यागें और पूरे अंग को कवर करने के लिए धीरे-धीरे 2% एग्रिस डालें। फिर गुर्दे को गुना करने से रोकने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे ठीक संदंश का उपयोग करके गुर्दे की स्थिति। चलो agarose कमरे के तापमान पर जमना ।
    नोट: यह प्रक्रिया हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण के माध्यम से अंग के अभिविन्यास और आकार को बनाए रखेगी क्योंकि अंग के पत्ते की तरह आकार एक सहायक मैट्रिक्स के अंदर नहीं होने पर गुना करने की प्रवृत्ति का कारण बनता है।
  9. एगर उठे ठोसकरण के बाद, ऊतक के चारों ओर एग्रास को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, छोटे क्यूब्स बनाते हैं, और ऊतक के चारों ओर एगर उठे की अधिकता को हटा दें।
  10. हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग के लिए उपयुक्त कैसेट में एगर उठे क्यूब्स रखें।
    नोट: निम्नलिखित चरण मैन्युअल रूप से या स्वचालित ऊतक प्रोसेसर में किए जा सकते हैं।
  11. सबसे पहले, कमरे के तापमान पर 45 मिनट प्रत्येक के लिए अगले चरणों के बाद कैसेट में ऊतक की प्रक्रिया: 50% इथेनॉल का एक स्नान, 70% इथेनॉल का स्नान, 95% इथेनॉल के लगातार दो स्नान, और 100% इथेनॉल के लगातार तीन स्नान। इसके बाद, जाइलीन के लगातार दो स्नान और पैराफिन के लगातार तीन स्नान में ऊतक की प्रक्रिया; उत्तरार्द्ध 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक रहता है।
    सावधानी: एक रासायनिक हुड के तहत परिवर्तन करें, इथेनॉल और जाइलीन से वाष्प परेशान और जहरीले हैं।
  12. पैराफिन ब्लॉक तैयार करने के लिए पैराफिन दाल को 60 डिग्री सेल्सियस तक पिघलाएं।
  13. प्लास्टिक की कैसेट को अंदर के टिश्यू से खोलकर गर्म प्लेट पर रख दें। पैराफिन के लिए वार्म-अप धातु मोल्ड।
  14. चिमटी के साथ ऊतक को धातु के मोल्ड के ऊपर रखें ताकि गुर्दे की लंबाई मोल्ड बेस के समानांतर हो। पैराफिन जोड़ें, यदि आवश्यक हो तो ऊतक को फिर से स्थापित करें।
  15. कैसेट के आधार के साथ मोल्ड को कवर करें और ग्रिड को कवर करने तक पैराफिन जोड़ें। कमरे के तापमान पर जमना और फिर एक तेज ठोस प्रक्रिया के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जगह दें।
  16. 20-30 मिनट के आसपास धातु मोल्ड से पैराफिन ब्लॉक बाद में जारी करें।
  17. एक माइक्रोटॉम के साथ, पैराफिन में एम्बेडेड ऊतक को 5 माइक्रोन मोटाई तक अनुभाग करें। ऊतक को इकट्ठा करने के लिए सीलनीकृत या सकारात्मक रूप से चार्ज ग्लास स्लाइड का उपयोग करें।

4. ट्यूनल परख

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल सीटू सेल डेथ डिटेक्शन किट (सामग्रियों की तालिका) का उपयोग करता है।

  1. डेवेक्स टिश्यू स्लाइड उन्हें 5 मिनट के लिए जाइलीन के लगातार दो स्नान में रखते हैं। फिर इथेनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से ऊतक को फिर से हाइड्रेट करें: 100%-95%-70%-50%, 5 मिनट के लिए प्रत्येक।
  2. इथेनॉल को खंगालने के लिए ठंडे नल के पानी को चलाने में स्लाइड्स रखें । स्लाइड्स में आसुत पानी में रखें।
  3. एक डार्क इनक्यूबेटर चैंबर तैयार करें। इनक्यूबेशन चरणों के दौरान नमी रखने के लिए नीचे गीले कागज तौलिए जोड़ें।
    नोट: एक इनक्यूबेटर चैंबर की कमी में नीचे और दो टूथपिक्स में नम कागज के साथ एक पेट्री पकवान का उपयोग करने के लिए स्लाइड जगह संभव है ।
  4. ताजा प्रोटीन के कार्य समाधानतैयार करें: 10 μg/mL में 10 mM Tris/HCl, पीएच 7.4-8 ।
    नोट: प्रोटीनेज के का उपयोग एक परमीलता एजेंट के रूप में किया जाता है, जैसा कि फैब्रिकेंट द्वारा अनुशंसित है।
  5. स्लाइड्स में डार्क इनक्यूबेटर चैंबर में रखें और कवर सैंपल तक प्रोटीनेज के वर्किंग सॉल्यूशन डालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. जबकि नमूने इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रणतैयार करें: 450 माइक्रोन लेबल समाधान में एंजाइम समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें। प्रकाश से रक्षा करें।
    नोट: तैयार की जाने वाली मात्रा को उसी 1:10 अनुपात में समायोजित किया जा सकता है। मात्रा प्रत्येक खंड के लिए मिश्रण के 50 माइक्रोन होने की गणना की जाती है; यह नमूनों के आकार के आधार पर बदल सकता है।
  7. डार्क चैंबर उठाओ और 1x PBS के साथ दो बार स्लाइड धो ।
  8. इसके बाद, शोषक कागज का उपयोग करके नमूने के चारों ओर के क्षेत्र को सुखाएं और प्रत्येक ऊतक स्लाइड पर ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें, समाधान फैलाएं ताकि पूरा नमूना कवर हो सके। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्रकाश से रक्षा करें।
  9. इनक्यूबेशन के बाद, स्लाइड को 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला करें और पेपर टॉवेल का उपयोग करके नमूने के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं।
  10. नमूनों में DAPI 1:1000 के 50 μL जोड़ें, परमाणु काउंटरस्टेटिंग के लिए, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। प्रकाश से रक्षा करें।
  11. 1x पीबीएस के साथ फिर से तीन बार कुल्ला और नमूना के आसपास के क्षेत्र सूखी ।
  12. एक एंटी-फीका हाइड्रोफिलिक माध्यम के साथ स्लाइड माउंट करें, एक कवरस्लिप रखें, और नेल पॉलिश के साथ सील करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित क्षैतिज स्लाइड स्टोर करें।
    नोट: बढ़ते माध्यम के विरोधी फीका गुण नमूनों के फ्लोरेसेंस को संरक्षित करने के लिए कर रहे हैं, लेकिन किसी भी हाइड्रोफिलिक उपलब्ध माध्यम का उपयोग करने के लिए संभव है । निर्जलीकरण से बचने के लिए नेल पॉलिश के साथ अंतिम सीलिंग कदम महत्वपूर्ण है।
  13. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों की कल्पना करें। फ्लोरोसेंट वर्णक के इस प्रकार के लिए, 520-560 एनएम (ग्रीन) की सीमा में एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें और 570-620 एनएम (लाल) की सीमा में पता लगाने।

Representative Results

जेब्राफिश की किडनी एक सपाट पिगमेंटेड अंग है जो पृष्ठीय दीवार पर स्थित है और इसकी मूल कार्यात्मक इकाई, नेफ्रॉन, स्तनधारियों(चित्रा 1)के साथ संरक्षितहै। पुनर्जनन की उच्च क्षमता के साथ सिर्फ एक गुर्दा होने की विशिष्टता इस मॉडल जीव मॉडल गुर्दे की चोट के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाता है । इस काम में प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क जेब्राफिश(चित्रा 2)में सिस्प्लैटिन के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा AKI को प्रेरित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और बाद में पहले विस्तृत दो तकनीकों द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए: फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 3 ए)और ट्यूनल(चित्रा 3 बी)। इस पूरी प्रक्रिया का एक प्रवाह चित्र 4में दर्शाया गया है . सिस्प्लैटिन की खुराक शुरू में माउस मॉडल15, 16, 17में वर्णित लोगों पर आधारित थी, जिसमें उपयोग किया जाने वाला मानक 10-13 मिलीग्राम सिस्प्लैटिन प्रति किलोग्राम पशु (मिलीग्राम/किलो) है। हालांकि, जेब्राफिश ने माउस (नहीं दिखाए गए डेटा) की तुलना में सिस्प्लैटिन के लिए अधिक प्रतिरोधी दिखाया, और अंतिम खुराक बढ़ा दी गई। जब हमने जानवरों के जीवित रहने की दर का मूल्यांकन किया, तो प्रयोगों ने सिस्प्लैटिन(चित्रा 5A)का खुराक-निर्भर प्रभाव दिखाया। इस वजह से, हम निर्देशों का पालन करने की सलाह देते हैं जैसा कि इस प्रोटोकॉल में समझाया गया है और किसी भी सामग्री को इकट्ठा करने से पहले प्रजनन क्षमता के उपाय के रूप में जानवरों की जीवित रहने की दर की लगातार निगरानी करते हैं। 120 μg/g सिस्प्लैटिन(चित्रा 5A,लाल रेखा)के आईपी इंजेक्शन के बाद, पहले 24 घंटे में लगभग 30% जानवरों के अस्तित्व में कमी देखी गई और जीवित रहने के दिन 5 के बाद इंजेक्शन पर जीवित जानवरों के लगभग 20% तक पहुंचने तक धीरे से कमी आई, फिर स्थिर(चित्रा 5A)। सिस्प्लैटिन विषाक्तता जानवरों के लिंग से प्रभावित नहीं थी, क्योंकि पुरुषों और महिलाओं में समान अस्तित्व घटता है(चित्रा 5B)।

सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI के काइनेटिक्स के विश्लेषण से पता चला कि गुर्दे में सूजन और कोशिका मृत्यु 24 एचपीआई है। सूजन का मूल्यांकन करने के सबसे तेज़ और मात्रात्मक तरीकों में से एक प्रवाह साइटोमेट्री है, लेकिन इस तकनीक के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेब्राफिश एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी की कमी को देखते हुए, प्रतिरक्षा मार्कर के साथ ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करना आवश्यक है। आजकल, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लेबल करने वाली कई जेब्राफिश लाइनें सुलभ हैं(तालिका 1)। इन रेखाओं का उपयोग अकेले या संयोजन में किया जा सकता है, विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रदर्शनों की सूची दी गई48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,59,60। यह तकनीक को काफी सरल बनाता है क्योंकि किसी भी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन कदम आवश्यक नहीं है, इसके विपरीत, यांत्रिक अलगाव द्वारा कोशिकाओं के अलगाव के बाद, साइटोमीटर पर प्रत्यक्ष पठन संभव है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, जेब्राफिश की किडनी न केवल होमोस्टैटिक कार्यों के साथ एक रक्त निस्पंदन अंग है बल्कि वयस्कों में हेमेटोपोइसिस की शारीरिक साइट भी है, जो स्तनधारियों में अस्थि मज्जा के बराबरहै 33,34,35। इस तरह जब हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इसका विश्लेषण करते हैं तो मानव रक्त61, 62(चित्रा6 ए) के बराबर कोशिका आबादी में अंतर करना संभव है, यह हमें शुरू में आकार और दानेदारता द्वारा सेल आबादी की पहचान करने और मलबे को बाहर करने की अनुमति देता है। इस मामले में, हमने टीजी (एमपीओ: जीएफपी)52 नामक एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग किया जो एंजाइम माइलोट्रोक्सिडेज के साथ एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करता है, जो न्यूट्रोफिल में मौजूद है। यह जानते हुए, हमारी गेट रणनीति ग्रेनुलोसाइट कीआबादी (चित्रा 6B)के प्रारंभिक अलगाव पर आधारितथी। इसके बाद, डबल कोशिकाओं को बाहर रखा गया था, क्योंकि वे विश्लेषण को काफी बदल सकते हैं और गलत निष्कर्षों का कारण बन सकते हैं। एक डबल एक एकल घटना है जिसमें 2 स्वतंत्र कण होते हैं और एक फॉरवर्ड स्कैटर हाइट (एफएससी-एच) बनाम एक फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) घनत्व साजिश(चित्रा 6C)का चयन करके बाहर रखा जा सकताहै। इस कदम के बाद, फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की पहचान की गई और उनका चयन किया गया(चित्रा 6 डी)। अंत में, जनसंख्या के आंकड़े विश्लेषण से निकाले गए और कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्लॉट किए गए(चित्रा 6E)।

सिस्प्लैटिन नेफ्रोटॉक्सिसिटी की सबसे प्रमुख विशेषताओं में से एक ट्यूबलर सेल डेथ10है, और इसे आसानी से कल्पना करने के लिए हमने एपोप्टोसिस डिटेक्शन के लिए ट्यूनल परख का उपयोग किया। इस विधि में जंगली प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों का उपयोग करने की सिफारिश की गई है जिनमें फ्लोरोसेंट मार्कर की कमी होती है, क्योंकि समानांतर फ्लोरेसेंस विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा, जेब्राफिश के मामले में एबी, तुबिनजेन, टैब, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन जैसे जंगली प्रकार की लाइनों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो ट्यूनल फ्लोरेसेंस रंग में हस्तक्षेप नहीं करती है। ट्यूनल तकनीक प्रवाह साइटोमेट्री या माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विश्लेषण की अनुमति देती है। माइक्रोस्कोपी ऊतक संरचना के संरक्षण का लाभ है, जो कोशिकाओं को मर रहे है देखने के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत, एपोटोटिक कोशिकाओं के उज्ज्वल नाभिक को पृष्ठभूमि से आसानी से अलग किया जा सकता है। सिस्प्लैटिन(चित्रा 7B)के साथ इंजेक्ट किए गए जानवरों में 24 एचपीआई पर नियंत्रण(चित्रा 7A)की तुलना में अधिक मृत कोशिकाएं होती हैं। अंतिम मात्रा फिजी सॉफ्टवेयर के सेल-काउंटर विकल्प के साथ की गई थी और नियंत्रण की तुलना में सिस्प्लैटिन-इलाज गुर्दे में सांख्यिकीय रूप से अधिक मृत कोशिकाओं को दिखाया गया था(चित्रा 7 सी)

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल से पता चला कि वयस्क जेब्राफिश में AKI के प्रेरक के रूप में सिस्प्लैटिन का उपयोग कैसे करें, जो खुराक-प्रतिवादी, तेज और विश्वसनीय है। जीवित रहने की दरों से प्राप्त आंकड़ों और सूजन (प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया) और सेल डेथ (ट्यूनल परख द्वारा पता लगाया गया) सहित सिस्प्लैटिन की नेफ्रोटॉक्सिटी के संकेतों के माप के आधार पर, हम इस मॉडल को सिस्प्लैटिन नेफ्रोटॉक्सिसिटी के अध्ययन के साथ-साथ AKI से संबंधित बीमारियों में भविष्य के उपचार के लिए प्रस्तावित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:जेब्राफिश और मानव गुर्दे की संरचना और तुलना। A. (1) तैरने वाले मूत्राशय (एसबी) और रीढ़ के बीच मछली की पृष्ठीय दीवार में स्थित गहरे भूरे रंग में प्रतिनिधित्व करने वाले गुर्दे के साथ एक वयस्क जेब्राफिश का पार्श्व दृश्य। (2) गुर्दे का वेंट्रल दृश्य जो संग्रह वाहिनी (नीला) से जुड़ा नेफ्रॉन (पीला) दिखाता है। गुर्दे के विभिन्न क्षेत्रों को हरी झंडी दिखाई जाती है: सिर (एच), ट्रंक (टीआर), और पूंछ (टीए)। (3) जेब्राफिश नेफ्रॉन का प्रतिनिधित्व करने वाली योजनाबद्ध और उनके खंडों को मानव नेफ्रॉन के साथ आनुवंशिक संरक्षित क्षेत्रों से मेल खाने के लिए लेबल और रंगीन किया गया है। B. (1) एक मानव गुर्दे का Sagittal दृश्य । (2) योजनाबद्ध लेबल और रंगीन खंडों के साथ एक मानव नेफ्रॉन चित्रण । आर सी: गुर्दे का कोष; पीसीटी: समीपस्थ जटिल ट्यूबल; पीएसटी: समीपस्थ सीधे ट्यूबल; टीएल: पतला अंग; एलएच: हेनले का लूप; टीएएल: मोटा आरोही अंग; डे: डिस्टल जल्दी; डीएल: देर से डिस्टल; डीसीटी: डिस्टल जटिल ट्यूबल; सीडी: वाहिनी का संग्रह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI के लिए प्रायोगिक डिजाइन। A. इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सुई की स्थिति की ओर इशारा करते हुए वयस्क जेब्राफिश का पार्श्व और वेंट्रल दृश्य। सुई पेट से 20-30 डिग्री कोण पर प्रवेश करती है और आंत को पंचर करने से बचने के लिए वेंट्रल दीवार के समानांतर धीरे-धीरे डाली जाती है। B. सिस्प्लैटिन-प्रेरित AKI का प्रायोगिक डिजाइन: (1) दिन शून्य पर प्रति पशु सिस्प्लैटिन 120 माइक्रोन/जी का इंजेक्शन। (2) चरण 3 के प्रयास से पहले, इंजेक्शन के बाद मछलियों के अस्तित्व की निगरानी एक दिन से दस दिन तक की सिफारिश की जाती है। (3) आगे की प्रसंस्करण तकनीकों के लिए सिस्प्लैटिन इंजेक्शन के एक दिन बाद गुर्दे का विच्छेदन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:प्रवाह साइटोमेट्री और ट्यूनल तकनीकों के तंत्र। A. प्रवाह साइटोमीटर का अवलोकन: कोशिकाओं का निलंबन एक म्यान तरल पदार्थ द्वारा एक ही लाइन पर हाइड्रोडायनामिक रूप से केंद्रित होता है, जिससे कोशिकाएं लेजर बीम के सामने एक-एक करके गुजरती हैं। सामने और साइड में डिटेक्टर आगे स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी) और कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस को मापते हैं। B. ट्यूनल परख का सिद्धांत। टर्मिनल डिऑक्सीन्यूनियोटोटिल ट्रांसफरेज (टीडीटी) एक खंडित डीएनए के फ्लोरोसेंट-मार्क्ड डीयूटीपी को 3'-ओह सिरों के अलावा मध्यस्थता करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:प्रतिनिधित्व तकनीकों का फ्लोचार्ट। A. एक फ्लॉर्चर्ट जो प्रवाह साइटोमेट्री (नारंगी) या ट्यूनल (नीला) के माध्यम से गुर्दे के ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए चुनते समय चरणों का पालन करने के लिए दिखाता है, जब सिस्प्लैटिन इंजेक्शन (ग्रे) द्वारा AKI को प्रेरित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:सिस्प्लैटिन इंजेक्शन मछली के अस्तित्व की निगरानी। A. सिस्प्लैटिन इंजेक्शन (25 - 50 - 112.5 - 120 μg/g) के विभिन्न खुराकों की जीवित रहने की दर। लॉग-रैंक (Mantel-कॉक्स) परीक्षण, ** पी < ०.०१ । B. पुरुषों बनाम महिलाओं की जीवित रहने की दर १२० μg/g सिस्प्लैटिन के साथ इंजेक्शन । लॉग-रैंक (Mantel-कॉक्स) परीक्षण, *** पी < ०.००१ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइन के लिए गेट रणनीति। A. जेब्राफिश वयस्क गुर्दे की कोशिकाओं के घनत्व भूखंड, आबादी आकार (एफएससी-ए) और दानेदारता (एसएससी-ए) से अलग हैं। विभिन्न आबादी रंगीन अंडाकार/हलकों द्वारा चयनित कर रहे हैं । गुलाबी: एरिथ्रोइड; काला: लिम्फोइड; पीला: अग्रदूत; लाल: ग्रैनुलोसाइट्स। B. गुर्दे में ग्रैनुलोसाइट्स आबादी के चयन के लिए साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) और फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) का घनत्व प्लॉट। सी. ग्रेनुलोसाइट गेट के अंदर सिंगल्स आबादी के चयन के लिए फॉरवर्ड स्कैटर हाई (एफएससी-एच) और फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) का घनत्व प्लॉट। डी. आगे स्कैटर क्षेत्र (एफएससी-ए) और फिटसी-ए: एमपीओ के चयन के लिए एमपीओ: जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाएं (न्यूट्रोफिल) गुर्दे में। फ्लोरेसेंस तीव्रता के 10 3 के आसपास एक सकारात्मकआबादी मानी जाती है। ई. एमपीओ के प्रतिशत का ग्राफ: नियंत्रण बनाम सिस्प्लैटिन जानवरों में जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाएं (न्यूट्रोफिल), 24 एचपीआई। अकर्षित टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:सिस्प्लैटिन इंजेक्शन मछली की ट्यूनल परख। A. 120 माइक्रोग्राम/जी सिस्प्लैटिन इंजेक्शन के बाद फिक्स्ड एडल्ट किडनी 24 एच के माइक्रोफोटोग्राफ। नियंत्रण 0.9% एनएसीएल के साथ इंजेक्ट किए जाते हैं। ट्यूनल सकारात्मक कोशिकाएं (एपोप्टोटिक कोशिकाएं) लाल (सफेद तीर) में दाग दी जाती हैं। DAPI (नीला) एक परमाणु प्रतिदाता के रूप में प्रयोग किया जाता है। स्केल बार: 50 माइक्रोन 20x आवर्धन। B. ग्राफ 20x क्षेत्र द्वारा गुर्दे में मृत कोशिकाओं की संख्या का मात्राकरण दिखा। अकर्पायर टी-टेस्ट,* पी < ०.०५ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ट्रांसजेनिक लाइन सेल टाइप लेबल संदर्भ
Tg (spi1:EGFP) pA301 माइलॉयड कोशिकाएं वार्ड एट अल 200348
टीजी (zpu1:GFP) माइलॉयड कोशिकाएं सू एट अल. 200449
टीजी (mhc2dab:GFP) sd6 मोनोसाइट्स विटमेर एट अल. 201150
टीजी (lysC:DsRED2) न्यूट्रोफिल्स हॉल एट अल 200751
टीजी (एमपीओ:जीएफपी) न्यूट्रोफिल्स मैथस एट अल 200652
टीजी (mpeg1:mCherry) मैक्रोफेज एललेट एट अल 201153
टीजी (mpeg1:Dendra2) मैक्रोफेज हार्वी एट अल 201354
टीजी (एलसीके:जीएफपी) टी-सेल लैंगनौ एट अल 200455
TgBAC (ikaros:EGFP) टी-सेल बाजोगली एट अल. 200956
टीजी (rag1:GFP) टी-सेल जेसेन एट अल. 199957
Tg (rag2: GFP) टी-सेल जेसेन एट अल. 200158
टीजी (सीडी 79:जीएफपी) बी-सेल लियू एट अल २०१७५९
Tg (CD45:DsRed) ल्यूकोसाइट्स बर्ट्रेंड एट अल 200860

तालिका 1: प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए जेब्राफिश ट्रांसजेनिक लाइनें। टेबल संबंधित प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिका लेबल और संदर्भ लेख जहां वे निर्माण किया गया था के साथ जेब्राफिश रिपोर्टर लाइनों के नाम शुरू । इन जेब्राफिश लाइनों का एक संयोजन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सेल चयन की नई संभावनाओं की पेशकश कर सकते हैं।

Discussion

गुर्दे की बीमारी की व्यापकता दुनिया भर में बढ़ती जा रही है, एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बन गई है जो लाखों लोगों को प्रभावित करती है६३। गुर्दे के घायल व्यक्तियों के इलाज के लिए एक रास्ता ढूंढना सर्वोपरि महत्व का है और साथ ही उनके एटियोलॉजी और प्रगति के बारे में अधिक समझते हैं । कई अध्ययनों से गुर्दे की क्षति को समझने के लिए पशु मॉडल का उपयोग किया गया है । जेब्राफिश किडनी (चित्रा 1) का अध्ययन विकासात्मक जीव विज्ञान और चोट अनुसंधान में वर्षों से किया गया है क्योंकि इसकी आत्म-पुनर्जनन क्षमताओं और आनुवंशिक समानता29,64के कारण है । यहां, हम वयस्क जेब्राफिश में एक नया AKI मॉडल पेश करते हैं जो सिस्प्लैटिन के गुणों को नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में उपयोग करता है, जो 24 एचपीआई (चित्रा 2) के रूप में जल्द ही दिखाई देने वाले नुकसान के साथ एक तेज और तीव्र प्रतिक्रिया को पूरा करने के लिएकदमों का ब्यौरा देता है। इसके अलावा, यहां हम दो तकनीकों की व्याख्या करते हैं जो सिस्प्लैटिन इंजेक्शन, फ्लो साइटोमेट्री और ट्यूनल(चित्रा 3)के बाद ऊतक क्षति के मूल्यांकन में मदद करेंगे।

वयस्क जेब्राफिश में वर्तमान AKI मॉडल में जेंटामिसिन का आईपी इंजेक्शन शामिल है जो नेफ्रॉन और ट्यूबल विनाश में व्यापक क्षति को प्रेरित करता है, नियोनेफ्रोजनेसिस घटनाएं 5 दिन से शुरू होती हैं, और पुनर्जनन इंजेक्शन65के बाद 21 दिनों तक पूरा हो जाता है। दूसरी ओर, सेप्सिस से जुड़े एक्यूट किडनी इंजरी (एस-एकी) का एक मॉडल एडवर्ड्सिएला टार्डाके साथ संक्रमण द्वारा स्थापित किया गया था, क्योंकि इंसुलिन जैसे विकास कारक-बाध्यकारी प्रोटीन-7 (आईजीएफबीपी 7), मेटाल्लोप्रोटीन्स 2 (टीएमपी-2) के ऊतक अवरोधक, और गुर्दे की चोट अणु-1 (किम-1), लार्वा और जेब्रा666 मेंकाफी वृद्धि हुई है। ज़ेब्राफ़िश चिकित्सकीय एजेंटों की खोज के लिए एक उच्च-थ्रूपुट जानवर होने के लिए जाना जाता है और इसमें गुर्दे के कार्य और पुनर्जनन67का अध्ययन करने के लिए प्रोबायोटिक्स और माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स का उपयोग शामिल है। हालांकि, उपलब्ध मॉडल सीधे इन उपचारों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, हमने वयस्क जेब्राफिश(चित्रा 4)में AKI को प्रेरित करने के लिए एक अलग विधि स्थापित की, जो सिस्प्लैटिन का उपयोग एक ज्ञात नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में करती है, जिसका मछली माइक्रोबायोटा पर प्रत्यक्ष ज्ञात प्रभाव नहीं होगा, जैसा कि एक एंटीबायोटिक होने के लिए जेंटामिसिन मॉडल होगा, या ई. टार्डाके साथ संक्रमण, एक सेप्सिस मॉडल होने के लिए। हालांकि, उसी समय जब हम अपने सिस्प्लैटिन प्रोटोकॉल विकसित कर रहे थे, एक अन्य समूह ने वयस्क जेब्राफिश में सिस्प्लैटिन के नेफ्रोटॉक्सिक प्रभावों का भी पता लगाया, खुराक को प्रति पशु6810-20-30 माइक्रोन तक सरल बनाया। यद्यपि उन्होंने जीवित रहने में सिस्प्लैटिन खुराक-निर्भर प्रभाव भी दिखाया, हम सभी मछलियों के लिए सिस्प्लैटिन की एक मात्रा का उपयोग करने में सावधानी की सलाह देते हैं, क्योंकि एक ही उम्र से जेब्राफिश में बहुत अलग आकार और वजन हो सकता है और यहपरिणाम 69,70में भिन्नता को प्रेरित कर सकता है। हमें लगता है कि जानवर के इसी वजन के लिए खुराक को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि चूहों और इस अध्ययन में किया जाता है।

वयस्क जेब्राफिश के साथ हमारे प्रयोगों में, सिस्प्लैटिन ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रभाव दिखाया। यह सिस्प्लैटिन इंजेक्शन(चित्रा 5)के बाद जानवरों के जीवित रहने की दर की निगरानी करके कल्पना की गई थी। हमने सिस्प्लैटिन की खुराक की तीव्रता का अनुमान लगाने के तरीके के रूप में अस्तित्व का उपयोग किया और नेफ्रोटॉक्सिसिटी के उपाय के रूप में नहीं, क्योंकि निगरानी के समय कोई अन्य भौतिक संकेत दिखाई नहीं देता है। यह कृंतक के साथ तुलनीय हो सकता है, जिसमें गुर्दे की चोट की गंभीरता को सिस्प्लैटिन इंजेक्शन15की खुराक और आवृत्ति द्वारा संग्राहक किया जा सकता है, जो सिस्प्लैटिन71की उच्च सांद्रता के साथ घातक खुराक प्राप्त करता है। मृत भी सिस्प्लैटिन 72 के लार्वा मॉडल में अगले दिनों मेंदेखा जाताहै. चूंकि हमारा उद्देश्य कुछ दिनों में एक तीव्र चोट को प्रेरित करना था, इसलिए हमने सिस्प्लैटिन की 120 माइक्रोग्राम/जी खुराक का चयन किया जैसा कि इंजेक्शन के बाद गुर्दे की क्षति 24 घंटे का निरीक्षण करना संभव है, हालांकि, इसे अध्ययन के उद्देश्यों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।

मनुष्यों में, AKI चिकित्सकीय रूप से कम चमकदार निस्पंदन दर (जीएफआर), ऊंचा सीरम क्रिएटिनिन, और रक्त यूरिया नाइट्रोजन 3 द्वारा निदान कियाजाताहै। जेब्राफिश में, एकेआई मॉडल के प्रदर्शनों की सूची में कुछ आनुवंशिक-सशर्त मॉडल73, 74और कुछ दवा से संबंधित मॉडल65,72 शामिल हैं, लेकिन तकनीकी कठिनाइयों(जैसे, रक्त संग्रह) के कारण जेब्राफिश पर कुछ AKI कार्यात्मक मापदंडों को मापा नहीं जा सकता है, अधिकांश शोधअकी1,75 की विशेषताओं का निरीक्षण करने के लिए रूपात्मक और दृश्य तकनीकों को अपनाते हैं जैसे कि हमारे अध्ययन।

कृंतक में, सिस्प्लैटिन समीपस्थ और डिस्टल ट्यूबल में एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रवेश करता है, कोशिका के अंदर मेटाबोलिक सक्रियण से गुजरता है और सेल ऑर्गेनेल्स पर अत्यधिक प्रतिक्रियाशील अभिनय हो जाता है और कोशिका संरचना में परिवर्तन को प्रेरित करता है। ये परिवर्तन बहुत अधिक मात्रा में एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी और यहां तक कि परिगलन को प्रेरित कर सकते हैं। इस क्षति के जवाब में, कई साइटोकिन्स जारी किए जाते हैं और ल्यूकोसाइट्स को भर्ती किया जाता है जिससे सूजन होती है और अंग15की कार्यक्षमता प्रभावित होती है। यह यह आकलन करने के महत्व पर प्रकाश डालता है कि घायल गुर्दे में किस प्रकार की कोशिकाएं पाई जा सकती हैं, निवासियों या घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में। यहां हमने दिखाया कि आजकल उपलब्ध ट्रांसजेनिक प्रतिरक्षा रिपोर्टर लाइनों(टेबल 1)का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इसका आकलन कैसे करें। सिस्प्लैटिन ने इंजेक्शन(चित्र 6)के बाद गुर्दे में न्यूट्रोफिल(एमपीओ: जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं) का प्रतिशत बढ़ाया। जेब्राफिश के मामले में, गुर्दे एचएससी का आला है जो विभिन्न रक्त कोशिका प्रकारों को जन्म देता है। फिर भी, कई ग्रैनुलोसाइट्स और मैक्रोफेज सामान्य रूप से रक्त में घूम रहे हैं। हमारे उदाहरण में, हमने एमपीओ: जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग किया जो न्यूट्रोफिल52के माइलोप्रोक्सिडेस के प्रमोटर के तहत जीएफपी व्यक्त करता है। एमपीओ के मूल अध्ययन: जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइन ने न्यूट्रोफिल परिपक्वता76 के विभिन्न राज्यों में माइलोप्रोक्सिडेस की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया लेकिन हमारी गेट रणनीति ग्रेनुलोसाइट अंश पर केंद्रित थी जिसमें रक्त52से आने वाली परिपक्व कोशिकाएं शामिल हैं, इस तरह से हमारे विश्लेषण में घुसपैठ कोशिकाएं शामिल हैं न कि निवासी कोशिकाएं। वांछित कोशिका आबादी को अलग करते समय इस पर विचार करना महत्वपूर्ण है।

जैसा कि ऊपर बताया गया है, एपोप्टोसिस सिस्प्लैटिन से संबंधित अकी का सबसे क्लासिक मार्कर है। यहां, हमने ट्यूनल परख द्वारा मृत कोशिकाओं के स्थानीयकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। सिस्प्लैटिन इंजेक्शन ने एपोटोटिक कोशिकाओं की संख्या 24 एचपीआई(चित्रा 7)में वृद्धि की। यह ऊतक से मृत कोशिकाओं को सीधे गिनती करके आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फिर भी, सेल-विशिष्ट मृत्यु की पहचान के लिए वांछित कोशिका(जैसे, ट्यूबलर कोशिकाओं) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग, या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन के उपयोग का उपयोग इस तकनीक के साथ एक साथ किया जा सकता है। जब AKI के gentamicin प्रेरित मॉडल के साथ तुलना में, सिस्प्लैटिन एक अधिक गंभीर मॉडल प्रतीत होता है, क्योंकि जेंटामिसिन एपोप्टोसिस इंजेक्शन65के बाद तीसरे दिन अधिक था।

विभिन्न प्रकार के दुष्प्रभाव होने के बावजूद, सिस्प्लैटिन का उपयोग अभी भी कैंसर चिकित्सा में व्यापक रूप से किया जाता है, क्योंकि कार्सिनोमा, रोगाणु कोशिका ट्यूमर, लिंफोमास और सारकोमा77सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर के खिलाफ इसकी प्रभावशीलता के कारण। नेफ्रोटॉक्सिकिटी सिस्प्लैटिन10के साथ उपचार में रोगियों के एक तिहाई में होती है, इस प्रकार रणनीतियों की खोज जो इस प्रभाव को कम कर सकती हैं और रेनोप्रोटेक्शन को बढ़ा सकती हैं। हमारा मानना है कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तरीकों और तकनीकों से गुर्दे की चोट के तंत्र को स्पष्ट करने और चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने में मदद मिलेगी जो गुर्दे की जटिलताओं से पीड़ित व्यक्तियों के जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं, मुख्य रूप से सिस्प्लैटिन के उपयोग से संबंधित हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को फंडाकाओ डी एम्पारो à पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो - एफएपीपी (2015/21644-9; 2017/05264-7 द्वारा समर्थित किया गया था; 2017/05687-5; 2018/20722-4), कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेवोल्विमेंटो सिएंटीफिको ई टेकनोलोलोगिको (सीएनपीक्यू) और कोर्डेनाकाओ डी एपेरफेइकोओमेंटो डी पेसोसोल डी एनीवेल सुपीरियर (केप्स), वित्तीय कोड 001। हम साओ पाउलो विश्वविद्यालय के जैव विज्ञान संस्थान में मारिया रीता डॉस सैंटोस ई पासोस-ब्यूनो और जेनेटिक्स और विकासवादी जीव विज्ञान विभाग की जेब्राफिश सुविधा की प्रयोगशाला में अपने सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। हम कृपया पांडुलिपि पर टिप्पणियों और सुझावों के लिए क्रिस्टियान नफाह डी सूजा ब्रेडा और थेरेसा रक़ील डी ओलिविएरा रामल्हो को धन्यवाद देते हैं । हम इस वीडियो की रिकॉर्डिंग, संस्करण और उत्पादन के लिए बायोमेडिकल साइंसेज संस्थान की मल्टीमीडिया टीम से मार्सिओ विल्लर मार्टिंस की बहुत सराहना करते हैं और धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140

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