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Genetics

एकल सेल स्तर पर आकार-निर्भर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61577
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Medicine, Integrated Cardio Metabolic Centre (ICMC), Heart and Vascular Theme, Karolinska Institutet, 2Bioscience Cardiovascular, Research and Early Development, Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca

Summary

यह पेपर विभिन्न आकृतियों के साथ कार्डियक मायोसाइट्स को बढ़ाने के तरीके प्रस्तुत करता है, जो विभिन्न विकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और एक ही कोशिका स्तर पर उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर इन अनुयायी कार्डियक मायोसाइट्स को छांटते हैं। प्रस्तावित मंच विभिन्न प्रकार के दिल की विफलता के लिए उच्च थ्रूपुट और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Abstract

विभिन्न प्रकार की कार्डियक हाइपरट्रॉफी को सीएम मॉर्फोलॉजी में बदलाव के साथ-साथ कार्डियक मायोसाइट्स (सीएम) की बढ़ी हुई मात्रा के साथ जोड़ा गया है । जबकि जीन अभिव्यक्ति पर सेल की मात्रा के प्रभाव अच्छी तरह से जाना जाता है, सेल के आकार के प्रभाव को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है । यह पत्र एक विधि का वर्णन करता है जिसे जीन अभिव्यक्ति पर सीएम आकृति विज्ञान के प्रभावों का व्यवस्थित रूप से विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह एक उपन्यास एकल-सेल ट्रैपिंग रणनीति के विकास का विवरण देता है जिसे तब एकल-सेल एमआरएनए अनुक्रमण द्वारा पीछा किया जाता है। एक माइक्रोपैटर्नेड चिप भी डिजाइन की गई है, जिसमें 3000 आयताकार आकार के फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न होते हैं। यह अलग-अलग लंबाई में सीएम विकसित करना संभव बनाता है: चौड़ाई पहलू अनुपात (एआर), विभिन्न प्रकार के दिल की विफलता (एचएफ) के अनुरूप। पेपर में एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया गया है जिसे उनके पैटर्न से एकल कोशिकाओं को लेने के लिए डिज़ाइन किया गया है, एक अर्ध-स्वचालित माइक्रो-पिपटिंग सेल बीनने का उपयोग करके, और व्यक्तिगत रूप से उन्हें एक अलग लाइसिस बफर में इंजेक्ट करें। इससे परिभाषित ज्यामितीय मॉर्फोटाइप के साथ एकल सीएम के ट्रांसक्रिप्टोम को प्रोफाइल करना संभव हो गया है और उन्हें सामान्य या रोग संबंधी स्थितियों की एक श्रृंखला के अनुसार चिह्नित किया गया है: हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी (एचसीएम) या आफरलोड/गाढ़ा बनाम डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) या प्रीलोड/सनकी । संक्षेप में, यह पेपर विभिन्न आकृतियों के साथ बढ़ते सीएम के लिए तरीके प्रस्तुत करता है, जो विभिन्न विकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और एकल-कोशिका स्तर पर उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर इन अनुयायी सीएम को छांटते हैं। प्रस्तावित मंच एचएफ के विभिन्न प्रकार के लिए उच्च थ्रूपुट और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार हृदय रोग (सीवीडी) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। सीवीडी नाटकीय रूप से लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करता है और एक बड़ा सामाजिक आर्थिक प्रभाव पड़ता है। एचसीएम और डीसीएम जैसे कार्डियोमायोपैथी हृदय की मांसपेशियों के प्राथमिक विकार हैं और एचएफ के प्रमुख कारण उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़े हुए हैं। एचएफ के कई कारण हैं, जिनमें पर्यावरणीय प्रभाव शामिल हैं, जैसे संक्रमण और विषाक्त पदार्थों के संपर्क में या कुछ दवाएं8। एचएफ आनुवंशिक गड़बड़ी के कारण भी हो सकता है, अर्थात् उत्परिवर्तन9। ऐसा माना जाता है कि आनुवंशिक संरचना में परिवर्तन जो बाहृशियल मैट्रिक्स (ईसीएम) अणुओं, इंटीग्रीन या साइटोस्केलेल प्रोटीन को प्रभावित करते हैं, बिगड़ा मेकेनोसेंसेशन और विभिन्न प्रकार के हृदय रोग10के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं।

एचसीएम की मुख्य विशेषता बाएं वेंट्रिकल11की अस्पष्टीकृत हाइपरट्रॉफी है, और कभी-कभी दाएं वेंट्रिकल12की, और यह अक्सर हस्तक्षेप सेप्टम की प्रमुख भागीदारी के साथ प्रस्तुत करता है। एचसीएम की विशेषता डायस्टोलिक डिसफंक्शन और मायोसाइट अव्यवस्था और फाइब्रोसिस13भी है । ज्यादातर मामलों में, दिल का अनुबंध तंत्र सारकोमरिक प्रोटीन में उत्परिवर्तन से प्रभावित होता है, जिससे मायोसाइट्स14की संकुचनता बढ़ जाती है। इसके विपरीत, डीसीएम को एक, या दोनों, वेंट्रिकल्स के फैलाव की विशेषता है और15मामलों के 30% से 50% में पारिवारिक एटियोलॉजी है। डीसीएम सेलुलर कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करता है, जिससे मायोसाइट्स, सेल डेथ और फाइब्रोटिक रिपेयर16का संकुचन बिगड़ा हुआ है।

जेनेटिक्स ने दिखाया है कि कुछ प्रकार के उत्परिवर्तन एकल सीएम को एचसीएम 3 केदौरानविशिष्ट आकार की विशेषताओं को अपनाने के लिए मजबूर करते हैं, अर्थात् लंबाई के साथ वर्ग के आकार की कोशिकाएं: चौड़ाई एआर जो लगभग 1:14 (एआर 1) के बराबर है। एक एआर के साथ लम्बी कोशिकाओं के साथ डीसीएम के लिए भी यही सच है जो लगभग 11:1 (AR11) के बराबर है। इसके अलावा, एचएफ बढ़े हुए आफ़ोड़ा (जैसे उच्च रक्तचाप में) के कारण हो सकता है। इन मामलों में, हेमोडायनामिक मांग करता है कि केंद्रीय बल वर्ग आकार पर ले, Laplace के कानून के अनुसार, और एआर 7:15 (AR7) से 1:16,7के लिएबदलताहै । एचएफ प्रीलोड में वृद्धि के कारण भी हो सकता है (उदाहरण के लिए, उन स्थितियों में जो वॉल्यूम अधिभार का कारण बनती हैं)। जब ऐसा होता है, जैव भौतिक बाधाओं को बढ़ाना और एआर 7:1 से 11:1 के लिए राज्य के लिए मजबूर ।

झिल्ली पर सिग्नलिंग गतिविधि वैश्विक सेल ज्यामिति मापदंडों पर निर्भर करती है, जैसे सेलुलर एआर, आकार, झिल्ली सतह क्षेत्र और झिल्ली वक्रता18। जब नवजात चूहे के सीएमएस को सब्सट्रेट्स पर चढ़ाया गया था जो कोशिकाओं को एक विशिष्ट लंबाई में विवश करने के लिए पैटर्न किए गए थे: चौड़ाई एआर, उन्होंने सबसे अच्छा संकुचन कार्य का प्रदर्शन किया जब अनुपात एक स्वस्थ वयस्क दिल में कोशिकाओं के समान थे। इसके विपरीत, उन्होंने खराब प्रदर्शन किया जब अनुपात असफल दिलों में मायोसाइट्स के समान थे19। हाइपरट्रॉफी के शुरुआती दौर में, कोशिकाएं व्यापक हो जाती हैं, जैसा कि क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में वृद्धि से परिलक्षित होता है। एचएफ हाइपरट्रॉफी के बाद के चरणों में होता है और कोशिकाएं आमतौर पर लम्बी दिखाई देती हैं। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि क्रोनिक हाइपरट्रॉफी के वीवो चूहे मॉडल में लगभग 30%20की बाईं वेंट्रिकुलर मायोसाइट लंबाई में वृद्धि की सूचना दी गई है, लेकिन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से वयस्क सीएम जिन्हें तीव्रता से विट्रो में हाइपरट्रोफिक उत्तेजनाओं के साथ इलाज किया गया था,21के बजाय सेल की चौड़ाई में इसी तरह की वृद्धि का प्रदर्शन किया गया ।

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण, जो एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है, वर्तमान में सेल जीव विज्ञान की समझ में क्रांतिकारी बदलाव है। यह तकनीक पसंदीदा तरीका था जब यह सवाल का जवाब देने के लिए आया था कि व्यक्तिगत कोशिका आकार जीन अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करते हैं । हमने एकल कोशिकाओं की तुलना विभिन्न आकृतियों से की, विशेष रूप से 1:1, 7:1 या 11:1 रुपये के साथ। यह नवजात चूहे वेंट्रिकुलर सीएम को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित माइक्रोपैटर्न 2 से भरे विशेष रूप से डिजाइन की गई चिप पर सीडिंग करके किया गया था, जिसमें1:1, 7:1 या 11:1 के परिभाषित आरै के साथ । फोटोलिथोग्राफी तकनीक का उपयोग करके माइक्रोपैटर्न गढ़े गए थे। माइक्रोपैटर्न फाइब्रोनेक्टिन द्वारा लेपित थे, जो साइटोफोबिक सतह से घिरे हुए थे। इसलिए, सीएम साइटोफोबिक क्षेत्र से बचते हुए, पूरी तरह से फाइब्रोनेक्टिन सब्सट्रेट पर बढ़कर माइक्रोपैटर्न के परिभाषित एआर को संलग्न, प्रसार और कैप्चर करेंगे। माइक्रोपैटर्न एक अच्छी तरह से आकार के प्रारूप में नहीं हैं। इसके बजाय, फाइब्रोनेक्टिन स्तर आसपास के साइटोफोबिक क्षेत्र की एक ही ऊंचाई पर बिल्कुल है। यह एक पेट्री डिश में बढ़ती कोशिकाओं के लिए इसी तरह की स्थिति प्रदान की है, के रूप में वहां आसपास की दीवारों से कोई तनाव नहीं है । इसके अलावा, विभिन्न आरै के साथ माइक्रोपैटर्न का सतह क्षेत्र बराबर है।

प्रायोगिक डिजाइन के दो विशेष रूप से महत्वपूर्ण पहलू थे, जिसके कारण थोक आरएनए अनुक्रमण के बजाय एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण का उपयोग हुआ। सबसे पहले, केवल कुछ प्रतिशत माइक्रोपैटर्न को एक ही कोशिका द्वारा कब्जा किया जा सकता है। दूसरा, कभी-कभी एक एकल कोशिका पूरी तरह से माइक्रोपैटर्न सतह पर कब्जा नहीं करती है। एकल कोशिकाएं जो पूरी तरह से माइक्रोपैटर्न सतह को कवर करती हैं, उन्हें एकल-सेल आरएनए विश्लेषण के लिए चुना जाना चाहिए। क्योंकि केवल एक चिप पर चढ़ाया कोशिकाओं के एक उपसमूह दोनों मानदंडों को संतुष्ट, यह संभव नहीं था बस पूरी चिप की कोशिश करो और थोक आरएनए अनुक्रमण के लिए सभी कोशिकाओं को इकट्ठा । योग्य कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से एक अर्द्ध स्वचालित सेल बीनने का उपयोग कर उठाया जाना चाहिए ।

यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या सीएम आकार, अपने आप में, मायोकार्डियल सिंक्टियम पर एक अंतर-कार्यात्मक प्रभाव पड़ता है। इस पत्र में प्रस्तावित तरीकों का मुख्य उद्देश्य यह अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास मंच विकसित करना था कि क्या प्रति सेल आकार का ट्रांसक्रिप्टोम17पर प्रभाव पड़ा है। हालांकि इन विट्रो अध्ययन वीवो अध्ययनों से अलग हैं, इस अध्ययन का उद्देश्य जीन अभिव्यक्ति पर विभिन्न कोशिकाओं के आकार के प्रभाव की जांच करना था, जो इस बात को ध्यान में रखते हुए कि वीवो में विभिन्न आकृतियों के साथ कोशिकाओं की तुलना करना बेहद मांग है। ये प्रयोग कुओ एट अल19से प्रेरित थे, जिन्होंने इसी तरह के दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया और बताया कि उन्होंने कोशिका के आकार में बदलाव के कारण शारीरिक मापदंडों में बदलाव देखा ।

Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट, स्टॉकहोम, स्वीडन की पशु आचार समिति के नियमों के अनुसार थीं ।

1. माइक्रो पैटर्न चिप लेआउट

  1. एक कस्टम-डिज़ाइन की गई चिप(सामग्री की तालिका)(चित्रा 1A):19.5 मिमी x 19.5 मिमी कवरलिप का उपयोग सक्रिय माइक्रोपैटर्न के साथ, बोरोसिलिकेट ग्लास पर फोटोलिथोग्राफी द्वारा मुद्रित।
    नोट: ये माइक्रोपैटर्न एक साइटोफोबिक क्षेत्र से घिरे हुए हैं। इसलिए, एक वरीयता प्राप्त कोशिका केवल इन माइक्रोपैटर्न में से एक पर संलग्न और विकसित हो सकती है और उस माइक्रोपैटर्न के एआर पर कब्जा कर सकती है। चिप को तीन क्षेत्रों में विभाजित किया गया है और प्रत्येक क्षेत्र में एक विशिष्ट एआर के साथ माइक्रोपैटर्न होते हैं। चिप लेआउट चित्रा 1Bमें दिखाया गया है । परिभाषित आरै की ज्यामिति तालिका 1में प्रस्तुत की गई है। फिगर 1बीमें निचली छवियों में फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न के विभिन्न आकृतियों की बढ़ाया फ्लोरोसेंट छवियां दिखाई गई हैं।

2. माइक्रोपैटर्न्ड चिप्स को कोटिंग

  1. फॉस्फेट-बफर खारा(पीबीएस-/-)के 2 मिलील में 80 माइक्रोग्राम फाइब्रोनेक्टिन जोड़कर प्रत्येक चिप के लिए 2x कोटिंग प्रोटीन समाधान तैयार करें।
  2. एक चिप को 35 मिमी ग्रेनर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और तुरंत पीबीएस के 2 एमएलजोड़ें -/-। इसके बाद 2x कोटिंग प्रोटीन सॉल्यूशन का 2 एमएल डालें।
  3. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर चिप्स इनक्यूबेट।
  4. पीबीएस के साथ लगातार कमजोर पड़ने के कदम से कोटिंग समाधानधोएं-/। चिप की सतह हमेशा गीली होनी चाहिए। फिर पीबीएस को 2 एमएल प्लेटिंग मीडियम से बदलें और सीडिंग सेल्स तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. सीएम का अलगाव

  1. डीएमईएम को पूरक करके चढ़ाना माध्यम तैयार करें: M199 (4:1) 10% घोड़े सीरम, 4% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2% HEPES (1 M) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०,००० यू/एमएल)22के साथ ।
  2. ऊतक को 2-दिन पुराने नवजात चूहे के दिलों के बाएं वेंट्रिकल से विच्छेदन करें और पीबीएस युक्त 10 सेमी डिश में स्थानांतरित करें। ऊतक को लगभग 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें।
  3. काटे गए ऊतकों को रोटर-कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें, जो ऊतक वियोजन(सामग्रियों की तालिका) केलिए टोपी में रोटर से लैस है। टिश्यू को व्यवस्थित होने दें और फिर सावधानी से सुपरनैंट को हटा दें।
  4. एंजाइम मिश्रण 1 और 2 के मिश्रण का 2.5 एमएल जोड़ें, जो नवजात हृदय वियोजन किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके तैयार किया गया है, सी ट्यूब में और टोपी को कसकर बंद करें।
  5. हीटर(चित्रा 2ए और बी)(सामग्रीकी तालिका) से सुसज्जित, वियोजन की आस्तीन पर रोटर-कैप ट्यूब डालें। इनक्यूबेशन प्रोग्राम 37C_mr_NHDK_1चलाएं (चित्रा 2C),जो लगभग एक घंटे तक रहता है।
  6. जबकि इनक्यूबेशन प्रोग्राम चल रहा है, पीईबी बफर तैयार करें जिसमें पीबीएस, पीएच 7.2 में 2 एमएम ईडीए और 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) शामिल हैं, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. इनक्यूबेशन कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, रोटर-कैप ट्यूब(चित्रा 2D)को अलग करें और प्री-वार्म्ड प्लेटिंग माध्यम के 7.5 एमएल जोड़ें।
  8. नमूना को फिर से खर्च करें और 70 माइक्रोन छलनी का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को फ़िल्टर करें।
  9. प्लेटिंग माध्यम के एक और 3 एमएल के साथ छलनी धोएं।
  10. 5 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  11. कोल्ड पीईबी बफर के 60 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीस्ब करें।
  12. नवजात कार्डियोमायोसाइट आइसोलेशन कॉकटेल (सामग्री कीतालिका) के20 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें माइक्रोन आकार के मोती होते हैं जो गैर-सीएम को लक्षित करते हैं।
  13. एंटी-रेड ब्लड सेल मोतियों(सामग्रियोंकी तालिका) के 20 माइक्रोल जोड़ें।
  14. सस्पेंशन को मिलाएं और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  15. पीईबी बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें।
  16. एलडी कॉलम(सामग्री की तालिका)पर सेल निलंबन लागू करें, जिसे चुंबक स्टैंड में खड़ी डाला गया है और पीईबी बफर के साथ अच्छी तरह से धोया गया है।
  17. अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें और पीईबी बफर के 0.5 एमएल के साथ कॉलम धोएं।
  18. चढ़ाना माध्यम के 8 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को 75-सेमी2 अनकोटेड कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। शेष गैर सीएम अनकोटेड सेल कल्चर का पालन करना शुरू कर देंगे और सेल सस्पेंशन से सीएम आबादी समृद्ध होगी।

4. पैटर्निंग सीएम

नोट: हमने एकल सीएम की तुलना 1:1, 7:1 या 11:1 के एआरएस से की है। यह 1:1, 7:1 या 11:1 के परिभाषित आरै के साथ फाइब्रोनेक्टिन-लेपित माइक्रोपैटर्न से भरी विशेष रूप से डिजाइन की गई चिप पर अलग-थलग पड़े नवजात चूहे के सीएम को सीडिंग करके किया जाता है। माइक्रोपैटर्न फाइब्रोनेक्टिन द्वारा लेपित थे, जो साइटोफोबिक सतह से घिरे हुए थे। इसलिए, सीएम पूरी तरह से फाइब्रोनेक्टिन सब्सट्रेट पर बढ़कर माइक्रोपैटर्न के परिभाषित एआर को संलग्न, प्रसार और कैप्चर करेंगे। निम्नलिखित चरणों के अनुसार अलग-थलग पड़े सीएम को पैटर्न करें।

  1. कोशिका निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं की गणना करें और उचित प्लेटिंग माध्यम जोड़कर प्रति एमएल 100,000 कोशिकाओं की एकाग्रता में पतला करें।
  2. चिप पर सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें, जो पहले से ही एक ३५ मिमी Greiner पेट्री डिश के अंदर गर्म चढ़ाना माध्यम के 2 मिलील में जलमग्न हो गया है ।
  3. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर डिश को इनक्यूबेट करें ताकि सीएम फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड माइक्रोपैटर्न से जुड़ सके और प्रत्येक सीएम को अपने सब्सट्रेट माइक्रोपैटर्न के एआर को प्राप्त करने की अनुमति दी जा सके।
  4. 18 घंटे के बाद, चिप की जांच करें। यदि अधिकांश कोशिकाएं संलग्न हैं, तो नमूनों की कोशिका से जुड़ी मलबे और मृत कोशिकाओं को अलग और हटा दें। चढ़ाना माध्यम को हटाकर और धीरे से PBSजोड़ने-/-dropwise, चिप के केंद्र से शुरू तो पक्षों की ओर बढ़ द्वारा ऐसा करते हैं । 2 बार दोहराएं।
  5. डीएमईएम: एम 199 (4:1) के साथ 4% घोड़े सीरम, 4% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2% HEPES (1 M) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू/एमएल) के साथ ताजा रखरखाव माध्यम के साथ पीबीएस को एस्पिरेट करें।

5. अनुयायी सीएम उठा

नोट: 72 घंटे की खेती की अवधि के बाद, पैटर्न वाले एकल सीएम को अर्ध-स्वचालित सेल बीनने(सामग्री की तालिका)(चित्र 3)का उपयोग करके उनके फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न से चुना जाता है। सेल पिकर मोटरचालित चरण(चित्रा 3A)को नियंत्रित करने के लिए एक सॉफ्टवेयर23 का उपयोग करता है। एक 70 माइक्रोम ग्लास माइक्रोकैपिलरी(चित्रा 3 B)पैटर्न नवजात चूहा सीएम लेने और इंजेक्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सेल पिकर एक वैक्यूम पैदा करके और दबाव लागू करके कोशिकाओं को इंजेक्शन देकर अनुयायी कोशिकाओं को सॉर्ट करता है। सिरिंज नंबर 1 में वैक्यूम सिरिंज पंप(चित्रा 3 सी)का उपयोग करके सिरिंज खींचकर लागू किया जाता है। हाइड्रोस्टैटिक दबाव गुरुत्वाकर्षण पर आधारित है और माइक्रोस्कोप डेस्क के ऊपर 87 सेमी की दूरी पर सिरिंज संख्या 2 रखकर प्रेरित किया जाता है। सीरिंज 1 और 2 क्रमशः पीएफई ट्यूबों के माध्यम से, वाल्व 1 और 2 से जुड़े हुए हैं, जो नियंत्रण इकाई(चित्रा 3 डी)में एम्बेडेड हैं। पीएफई ट्यूब पूरी तरह से RNase मुक्त पानी से भर रहे हैं। इसके बाद चुने गए सिंगल सेल को पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब में इंजेक्ट किया जाता है, जिसमें लाइसिस बफर का 3.55 माइक्रोन होता है।

  1. ७२ घंटे की एक खेती की अवधि के बाद, पुराने माध्यम को हटा दें और धीरे गर्म DPBS के साथ चिप की सतहफ्लश-/-।
    1. डिश को सपाट रखें और पुराने माध्यम को धीरे-धीरे डिश के एक तरफ से 1000 माइक्रोन पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। सुनिश्चित करें कि चिप हर समय गीली रहती है।
    2. डीपीबीएस के 2 एमएलजोड़ें-/-धीरे और ड्रॉप-वार अलग मृत कोशिकाओं है कि नमूनों कोशिकाओं से जुड़े हुए हैं, चिप के केंद्र से शुरू और फिर अपने पक्षों में जा रहे हैं ।
    3. अधिकांश डीपीबीएस को चिप के केंद्र से शुरू करने और फिर पक्षों में जाने के लिए संभव के रूप में कई अलग फ्लोटिंग कोशिकाओं को हटाने के लिए एस्पिरेट करें।
    4. एक बार फिर चरण 5.1.2 और 5.1.3 दोहराएं।
  2. चिप के किनारे हड़पने के लिए कोण संदंश का उपयोग करें और तुरंत इसे एक नए बाँझ 35 मिमी ग्रेनर पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए जबकि उठा फ्लोटिंग कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए।
  3. तुरंत डीपीबीएस के 1.5 एमएल जोड़ें-/- ताकि चिप सूख न जाए।
  4. लाइव कोशिकाओं के नाभिक की कल्पना करने के लिए वाइब्रेंट डाई साइकिल ग्रीन के 1.5 माइक्रोन जोड़ें।
  5. चिप को फोर्स्प की नोक का इस्तेमाल कर के ग्रेनर पेट्री डिश के केंद्र में रखें।
  6. चिप के ऊपर एक कक्ष(सामग्री की मेज)रखो। कक्ष सेल पैटर्न तक पहुंच को अवरुद्ध किए बिना, डिश के नीचे चिप को ठीक करेगा।
  7. सेल पिकर चरण के डिश धारक पर ग्रेनर पेट्री डिश माउंट करें और मैग्नेटिक कैप डालें।
  8. स्वचालित इंजेक्शन को कैलिब्रेट करें।
    1. क्रॉसहेयर का पता लगाएं, जो लाइव व्यू विंडो में छवि के बीच में मोटराइज्ड स्टेज पर उत्कीर्ण है।
    2. क्रॉसहेयर पर ध्यान दें और स्कैनिंग और छंटाई खिड़की में स्वचालित इंजेक्शन बटन के लिए अंशांकन का चयन करें।
  9. डीपीबीएस को बदलें-/-डीपीबीएस/ट्राइपसिन के १.५ एमएल केसाथ-/(1:1) जब डिश स्टेज पर है, फाइब्रोनेक्टिन से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए ताकि कोशिकाओं को चुनने के लिए तरल वैक्यूम का इस्तेमाल किया जा सके ।
  10. स्कैनिंग और छंटाई खिड़की में स्कैनिंग टैब का उपयोग कर पूरी चिप स्कैन करें। देखने के क्षेत्र में चिप के शीर्ष बाएं कोने का पता लगाएं और शीर्ष बाएं कोने पंक्ति में वर्तमान माइक्रोस्कोप की स्थिति प्राप्त करने पर क्लिक करें ।
    1. फिर, चिप के नीचे दाएं कोने में मोटरचालित चरण को स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोप पर ध्यान दें और नीचे दाएं कोने पंक्ति में वर्तमान माइक्रोस्कोप की स्थिति प्राप्त करें।
  11. सेट सबसे तेज विमान बटन पर क्लिक करें और पॉप अप विंडो पर शीर्ष दाएं कोने में जाने परक्लिक करें । माइक्रोस्कोप पर ध्यान दें और नीचे बाएं कोने पर जाएं और फोकस सेट करें। जब किया फिनिश बटन पर क्लिक करें और स्कैनिंग शुरू करते हैं।
  12. जब स्कैनिंग समाप्त हो जाती है, तो विश्लेषण टैब पर जाएं और अध्ययन मानदंडों को पारित करने वाली एकल कोशिकाओं का चयन करें।
  13. सुनिश्चित करें कि ग्लास माइक्रोकैपिलरी माइक्रोस्कोप के लाइव व्यू के बीच में है।
  14. सॉफ्टवेयर की पंप विंडो का उपयोग कर सिरिंज पंप को नियंत्रित करें। 50 एमएल नंबर 1 सिरिंज से 4 एमएल निकालकर वैक्यूम बनाएं, जिसका व्यास 27 एमएम हो।
  15. छंटाई टैब में
    1. वाल्व के इंजेक्शन पैरामीटर सेट करें। यह गणना की गई थी कि इंजेक्शन की मात्रा जिसने एक उठाया हुआ एकल सेल दिया था वह 1 माइक्रोन था, यदि वाल्व 2 120 मिलीसेकंड के लिए खोला गया था और फिर 20 के लिए खोला गया वाल्व 1 200 मिलीसेकंड के समय बीत जाने के बाद मिलीसेकंड था। ट्यूबों की लोच के कारण, प्रवाह को इंजेक्शन देना बंद करने के लिए वाल्व 1 खोलें।
    2. वाल्व के पिक-अप पैरामीटर सेट करें। यह गणना की गई थी कि यदि वाल्व 1 को 20 मिलीसेकंड के लिए खोला गया था और फिर वाल्व 2 को 10 मिलीसेकंड के समय बीत जाने के बाद 10 मिलीसेकंड के लिए खोला गया था, तो अधिकांश पैटर्न वाली कोशिकाओं को उठाया जा सकता है। इसका कारण यह है कि ट्राइप्सिन द्वारा इलाज किए जाने के बाद उनके फाइब्रोनेक्टिन बाइंडिंग को ढीला कर दिया गया था।
    3. पाथ बटन की गणना पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर सेल से सेल के लिए सबसे तेजी से पथ की गणना, लेने के लिए और चिप भर में चयनित कोशिकाओं सुई ।
    4. चिप की सतह पर एक नमूनों सेल पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
    5. जॉयस्टिक का उपयोग करके, माइक्रोकैपिलरी को सावधानी से नीचे ले जाएं, ताकि माइक्रोकैपिलरी की नोक की सबसे तेज छवि कोशिका को छुए बिना प्राप्त की जा सके।
    6. माइक्रोपिपेट ऑफसेट सेक्शन में सेट बटन पर क्लिक करें। माइक्रोकैपिलरी क्रॉस सेक्शन दिखाते हुए एक नई विंडो पॉप अप होगी । केशिका के सटीक केंद्र पर क्लिक करें। इसके बाद सॉफ्टवेयर एक्स, वाई और जेड निर्देशांक में केशिका की टिप ऑफसेट रिकॉर्ड करेगा ।
    7. स्टार्ट सॉर्टिंग बटन का उपयोग करके छंटाई शुरू करें।

Representative Results

ऊतक को 2 दिन पुराने नवजात चूहे के दिलों के बाएं वेंट्रिकल से विच्छेदित किया गया था और एकल कोशिकाओं में विभाजित किया गया था। फिर समृद्ध सीएम को अलग आरै के साथ फाइब्रोनेक्टिन पैटर्न वाली चिप पर वरीयता प्राप्त किया गया । ७२ घंटे की खेती के बाद, माध्यम को डीपीबीएस में 1:1000 वाइब्रेंट डाई साइकिल ग्रीन द्वारा प्रतिस्थापित किया गयाथा-/-2 मिनट के लिए जीवित कोशिकाओं के नाभिक की कल्पना करने के लिए । इसके बाद, कोशिकाओं को फाइब्रोनेक्टिन से कोशिकाओं को ढीला करने के लिएडीपीबीएस-/-/ट्राइप्सिन(1:1) के साथ इलाज किया गया, ताकि सेल पिकिंग की सुविधा के लिए एक तरल वैक्यूम का उपयोग किया जा सके । इस बीच, पूरी चिप 10x के आवर्धन पर स्कैन किया गया था, एक उल्टे माइक्रोस्कोप सेल बीनने से जुड़े का उपयोग कर । यह ट्राइप्सिन उपचार के कारण कोशिकाओं के गोल होने से पहले किया गया था। योग्य कोशिकाओं का चयन किया गया, स्कैन छवि के आधार पर, और उनके निर्देशांक सेल बीनने सॉफ्टवेयर में सहेजे गए थे । माइक्रोपैटर्न का चयन केवल तभी किया गया जब उनमें एक मोनोन्यूक्लिटेड सिंगल सेल हो और केवल तभी जब सेल ने अपने फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न को पूरी तरह से कवर किया हो। सेल सॉर्टर ने चयनित कोशिकाओं को एक-एक करके चुना और सफलतापूर्वक चुने गए प्रत्येक एकल कोशिका को तुरंत एक व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूब में इंजेक्ट किया गया और माइक्रोस्कोप चरण पर रखा गया। प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में लाइसिस बफर(टेबल 2)का 3.55 माइक्रोन होता था। मीडिया को हटाने के साथ शुरू हुई छंटाई प्रक्रिया 40 मिनट के भीतर पूरी हो गई। पूरक डिऑक्सीरिबोक्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) संश्लेषण, पीसीआर प्री-प्रवर्धन और शुद्धिकरण स्मार्ट-सेक्यू2 प्रोटोकॉल24 (तालिका 3)के आधार पर लाइसेड एकल कोशिकाओं पर किया गया था। शुद्ध सीडीएनए की गुणवत्ता की जांच एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस एनालाइजर द्वारा की गई थी। एक उठाया एकल कोशिका के पूर्व-प्रवर्धित सीडीएनए का इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्र 4में प्रस्तुत किया गया है। आरएनए-सेक्यू लाइब्रेरी स्मार्ट-सेक्यू2 प्रोटोकॉल24के अनुसार तैयार की गई थी ।

नमूनों वाले सीएम की सारकोमर संरचना का निरीक्षण करने के लिए, नमूनों वाले सीएम को सरकोमरिक α-ऐक्टिनिन एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। कोशिकाओं गधा विरोधी माउस आईजीजी एलेक्सा Fluor ४८८ 1:800 के साथ माध्यमिक धुंधला के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड थे । नाभिक 1 μg/mL DAPI के साथ दाग रहे थे । इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियों को एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था, जो 63x तेल-विसर्जन (एनए 1.4) उद्देश्य(चित्रा 5)का उपयोग करके किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न के साथ चिप का लेआउट।
(A)कस्टम डिजाइन की चिप की छवि । चिप एक 19.5 मिमी x 19.5 मिमी कवरलिप है जिसमें फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न होता है, जो बोरोसिलिकेट ग्लास पर फोटोलिथोग्राफी द्वारा मुद्रित होता है। (ख)चिप लेआउट । चिप को तीन क्षेत्रों में विभाजित किया गया है और प्रत्येक क्षेत्र में विशिष्ट एआर के साथ फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न होते हैं। प्रत्येक क्षेत्र के लिए फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न के विभिन्न आकारों की फ्लोरोसेंट छवियां दिखाई जाती हैं। इस आंकड़े को http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ के तहत उपयोग किए जाने वाले हाफबरदारन एस्फाहानी एट अल2द्वाराअनुपूरक सामग्री 1से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हीटर उपकरण से लैस वियोजना।
(क)2 दिन पुराने नवजात चूहे के पूरी तरह से स्वचालित वियोजन के लिए उपयोग किए जाने वाले संपूर्ण वियोजन यंत्र वेंट्रिकल छोड़ गए । (ख)हीटिंग यूनिट । (ग)रोटर-कैप ट्यूब। (घ)ऊतक वियोजन के पूरी तरह से स्वचालित कार्यप्रवाह के लिए तैयार कार्यक्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल पिकर उपकरण।
(क)सेल पिकर के मोटरचालित चरण का बढ़ा हुआ दृश्य। एक पेट्री-डिश होल्डर और 10 पीसीआर स्ट्रिप्स के लिए ८० होल और कैलिब्रेशन क्रॉसहेयर के लिए एक छेद स्टेज पर एम्बेडेड है । (ख)ग्लास माइक्रोकैपिलरी का बढ़ा हुआ दृश्य । (ग)सिरिंज पंप। (घ)नियंत्रण इकाई, जो वाल्व 1 और 2 के उद्घाटन और समापन समय खिड़की को नियंत्रित करती है, नियंत्रण इकाई के अंदर घुड़सवार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक उठाया एकल सेल के पूर्व-प्रवर्धित सीडीएनए के इलेक्ट्रोफेरोग्राम।
प्री-प्रवर्धन के 19 पीसीआर चक्रों का उपयोग 1 एनजी/μL शुद्ध सीडीएनए उपज के 15 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए किया गया था । जेल की तरह घनत्व साजिश में एक स्पष्ट बैंड मनाया जाता है जो इलेक्ट्रोफेरोग्राम में 1852 बीपी पर चोटी से मेल खाता है। टुकड़ों का औसत आकार 1588 बीपी है। इसके अलावा, 300 बीपी से कम होने वाले टुकड़ों की छोटी मात्रा एक अच्छी सीडीएनए लाइब्रेरी को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न आरै के साथ पैटर्न वाले सीएम के α-ऐक्टिन साकॉर्मिक स्ट्रक्चर (ग्रीन) और न्यूक्लियस (ब्लू) का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला।
क्रोमेटिन को दापी ने दाग दिया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मोरफोटाइप एआर लंबाई (माइक्रोन) चौड़ाई (माइक्रोन) फाइब्रोनेक्टिन क्षेत्र (μm2)
AR1 1:1 47 47 2209
एआर7 7:1 126 18 2268
AR11 11:1 155 14 2170

तालिका 1: नमूनों वाले सीएम की ज्यामिति।

घटक वॉल्यूम (माइक्रोन)
नाभिक मुक्त पानी 0.65
(0.4% vol/vol) ट्राइटन एक्स-100 1.8
डीएनटीपी मिक्स (25 mM) 0.8
RNase अवरोधक (40 यू माइक्रोन-1) 0.1
ओलिगो-डीटी30वीएन ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स (100 माइक्रोन) 0.1
ईआरसीसी आरएनए स्पाइक-इन मिक्स (2.5 x 105 कमजोर पड़ने) 0.1
इंजेक्शन एकल सेल 1
कुल मात्रा 4.55

तालिका 2: सिंगल सेल कस्टम लाइसिस बफर।

घटक वॉल्यूम (माइक्रोन)
सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय प्रथम-स्ट्रैंड बफर (5x) 2
डीटीटी (100 mM) 0.5
बीटाइन (5 एम) 2
एमजीसीएल2 (1 मीटर) 0.1
RNase अवरोधक (40 यू माइक्रोन-1) 0.25
सुपरस्क्रिप्ट II रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 यू माइक्रोन-1) 0.5
टीएसओ (100 माइक्रोन) 0.1
कुल मात्रा 5.45

तालिका 3: एक ही सेमी के lysate से पहली-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण करने के लिए एक आरटी प्रतिक्रिया के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) मिश्रण।

Discussion

इस अध्ययन में एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग किया गया, जो एक उपन्यास और शक्तिशाली तकनीक है जो एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम का पता लगा सकती है। इसे एकल सीएम को तैयार करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण के साथ जोड़ा गया था, ताकि उन्होंने विभिन्न आरै पर लिया, अन्यथा, केवल वीवो में ही देखा जा सकता था ।

अध्ययन की कुछ सीमाएं थीं। उदाहरण के लिए, नवजात सीएम को विभिन्न मॉर्फोटाइप उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाना था, क्योंकि परिभाषित आकृतियों में 72 घंटे के लिए पर्याप्त महत्वपूर्ण वयस्क सीएम को संस्कृति देना असाधारण रूप से चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, सीएम ७२ घंटे पूर्व वीवो, जो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न पर एक प्रभाव पड़ा हो सकता है के लिए सुसंस्कृत थे । हालांकि, यह खेती आवश्यक थी, ताकि कोशिकाएं विशिष्ट मॉर्फोटाइप बना सकें। इसके अलावा, केवल एकल कोशिकाओं को जो मोनोन्यूक्लिट किए गए थे और पूरी तरह से फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न को कवर किया गया था, छंटाई के लिए चुना गया था। प्रत्येक चिप पर नमूनों कोशिकाओं को छंटाई के एक दौर में केवल हल किया जाना चाहिए । अंत में, के बारे में ५० कोशिकाओं है कि चयनित कोशिकाओं के लगभग एक तिहाई है सफलतापूर्वक प्रत्येक चिप से उठाया गया । ऐसे दो कारण हैं जो सफलतापूर्वक चुनी गई कोशिकाओं की संख्या को प्रतिबंधित करते हैं। सबसे पहले, कुछ कोशिकाओं को भी कसकर फाइब्रोनेक्टिन पैटर्न से जुड़े थे और पिकअप प्रवाह को सफलतापूर्वक उन्हें लेने के लिए पर्याप्त नहीं था। दूसरा, ट्राइप्सिन उपचार के कारण, कुछ कोशिकाओं और फाइब्रोनेक्टिन के बीच लगाव बहुत ढीला हो गया। नतीजतन, इन कोशिकाओं को उनके फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न से दूर धकेल दिया गया, जब माइक्रोकैपिलरी ने उनसे संपर्क किया, और उन्हें नहीं उठाया गया । लेखक यह दावा नहीं करते कि यह सेटअप वीवो वातावरण में एक समान है, लेकिन यह शोध के सवाल का जवाब देने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण साबित हुआ ।

प्रस्तावित विधि विभिन्न सेल प्रकारों (उदाहरण के लिए, एचआईपीएस-सीएम के लिए) पर लागू होती है। हालांकि, निम्नलिखित कारकों को अन्य सेल-प्रकारों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। विशिष्ट सेल-प्रकार के लगाव के लिए उपयुक्त ईसीएम चिपकने वाले अणुओं का उपयोग माइक्रोपैटर्न को कोटिंग के लिए किया जाना चाहिए। अध्ययन प्रश्न और कोशिका-प्रकार के अनुसार माइक्रोपैटर्न की ज्यामिति को संशोधित किया जाना चाहिए। अध्ययन प्रश्न के आधार पर संस्कृति अवधि को संशोधित किया जा सकता है। टुकड़ी अभिकर्ण और उसके इनक्यूबेशन समय को अध्ययन सेल-प्रकार के लिए ठीक से अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, भ्रूण और न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए ट्राइप्ले के बजाय एक्यूटेस का उपयोग किया जा सकता है। वाल्व के उद्घाटन के समय मापदंडों को सफलतापूर्वक कोशिकाओं को लेने के लिए छानबीन की जानी चाहिए, लेकिन धीरे से । संक्षेप में, हमने सेल आकार का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास मंच तैयार किया जो क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान कर सकता है। इस संदर्भ में, हमने एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तैयार किया है जो सेलुलर वास्तुकला और जीन अभिव्यक्ति के बीच परस्पर क्रिया की पहचान करने के लिए हीमोडायनामिक बाधाओं द्वारा वीवो में सीएम पर लगाए गए विट्रो विशेषता आकृतियों की नकल करता है। हम एचएफ इन विट्रो का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास मंच के विकास और जीन अभिव्यक्ति के एक शक्तिशाली निर्धारक के रूप में सेल आकार की पहचान की भी रिपोर्ट करते हैं। यह जीव विज्ञान और चिकित्सा के लिए दूरगामी प्रभाव के साथ एक उपन्यास अवलोकन है ।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA Automated electrophoresis analyzer
Anti-Red Blood Cell MicroBeads Miltenyi Biotec 130-109-681
Axio Observer microscope Zeiss Z1 Inverted microscope
Betaine solution (5 M) Sigma-Aldrich, MERCK B0300
CellSorter CELLSORTER https://www.singlecellpicker.com/ Cell picker
CYTOOchamber CYTOO 30-010 Custom-designed chip
CYTOOchip CYTOO 10-950-00-18 Chamber
DMEM Thermo Fisher Scientific 31966-021 high glucose, GlutaMAX Supplement
dNTP mix (25 mM) Thermo Fisher Scientific R1122
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Abcam PLC ab150105
DTT (100 mM) Thermo Fisher Scientific 18064071
ERCC RNA Spike-In Mix Thermo Fisher Scientific 4456740
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082-147
Fibronectin Sigma-Aldrich, MERCK F4759
gentleMACS C Tube Miltenyi Biotec 130-093-237 Rotor-cap tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427 Dissociator with heater
Greiner CELLSTAR Petri dish Sigma-Aldrich, MERCK P6987
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-056
Horse Serum Sigma-Aldrich, MERCK H0146
LD column Miltenyi Biotec 130-042-901
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 31150-022
NE-1000 syringe pump New Era Pump Systems NE-1000 Syringe pump
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat Miltenyi Biotec 130-105-420
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-098-373
Oligo-dT30VN oligonucleotides IDT Technology 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′
RNAse inhibitor (40 U µL-1) Clontech 2313A
sarcomeric α-actinin Sigma-Aldrich, MERCK EA-53
SP8 confocal microscope Leica Microsystems SP8 Confocal microscope
Superscript II first-strand buffer (5x) Thermo Fisher Scientific 18064071
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) Thermo Fisher Scientific 18064071
Triton X-100 Sigma-Aldrich, MERCK T9284
TryplE Express enzyme, no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013
TSO (100 µM) QIAGEN 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′
Vibrant Dye Cycle green Thermo Fisher Scientific V35004

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References

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Haftbaradaran Esfahani, P., Knöll, R. An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level. J. Vis. Exp. (165), e61577, doi:10.3791/61577 (2020).

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