Summary
Detta papper presenterar metoder för växande hjärt myocyter med olika former, som representerar olika patologier, och sortering dessa vidhäftande hjärt myocyter baserat på deras morfologi på en enda cell nivå. Den föreslagna plattformen ger en ny strategi för hög genomströmning och läkemedelsscreening för olika typer av hjärtsvikt.
Abstract
Olika typer av hjärthypertrofi har associerats med en ökad volym av hjärt myocyter (CMs), tillsammans med förändringar i CM morfologi. Medan effekterna av cellvolym på genuttryck är väl kända, är effekterna av cellform inte väl förstådda. Detta dokument beskriver en metod som har utformats för att systematiskt analysera effekterna av CM morfologi på genuttryck. Den beskriver utvecklingen av en ny single-cell fångststrategi som sedan följs av encellig mRNA sekvensering. Ett mikromönster chip har också utformats, som innehåller 3000 rektangulära-formade mikromönster fibronectin. Detta gör det möjligt att odla CMs i distinkt längd:breddens proportioner (AR), motsvarande olika typer av hjärtsvikt (HF). Papperet beskriver också ett protokoll som har utformats för att plocka upp enstaka celler från deras mönster, med hjälp av en halvautomatisk mikro-pipettering cellplockare, och individuellt injicera dem i en separat lys buffert. Detta har gjort det möjligt att profilera transkriptomerna av enstaka CMs med definierade geometriska morfityper och karakterisera dem enligt en rad normala eller patologiska tillstånd: hypertrofisk kardiomyopati (HCM) eller afterload/koncentrisk kontra dilaterad kardiomyopati (DCM) eller preload/excentrisk. Sammanfattningsvis presenterar detta dokument metoder för odling av CMs med olika former, som representerar olika patologier, och sortera dessa anhängare CMs baserat på deras morfologi på en encellig nivå. Den föreslagna plattformen ger en ny strategi för hög genomströmning och drogscreening för olika typer av HF.
Introduction
Enligt Världshälsoorganisationen är hjärt-kärlsjukdom (CVD) en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. CVD påverkar dramatiskt kvaliteten på människors liv och har en enorm socioekonomisk inverkan. Kardiomyopatier, såsom HCM och DCM, är primära störningar i hjärtmuskeln och stora orsaker till HF har associerats med hög sjuklighet och dödlighet. Det finns många orsaker till HF, inklusive miljöeffekter, såsom infektioner och exponering för gifter eller vissa läkemedel8. HF kan också orsakas av genetisk predisposition, nämligen mutationer9. Man tror att de förändringar i genetisk sammansättning som påverkar extracellulära matris (ECM) molekyler, integriner eller cytoskelealproteiner kunde vara ansvarig för nedsatt mekanosensation och olika typer av hjärtsjukdom10.
Det viktigaste inslaget i HCM är oförklarlig hypertrofi av den vänstra Ventrikel11, och ibland av den högra Ventrikel12, och detta ofta presenterar med dominerande deltagande av interventricular septum. HCM kännetecknas också av diastolisk dysfunktion och myocyte oordning och fibros13. I de flesta fall påverkas hjärtats kontraktilapparat av mutationer i sarkomeriska proteiner, vilket leder till ökad kontraktilitet hos myocyterna14. Däremot är DCM kännetecknas av dilatation av en, eller båda, ventriklar och har en familjär etiologi i 30% till 50% av fallen15. DCM påverkar ett brett spektrum av cellulära funktioner, vilket leder till nedsatt sammandragning av myocyterna, celldöd och fibrotisk reparation16.
Genetik har visat att vissa typer av mutationer tvinga enstaka CMs att anta särskilda form egenskaper under HCM3, nämligen kvadratformade celler med en längd:bredd AR som är nästan lika med 1:14 (AR1). Detsamma gäller för DCM, med långsträckta celler med en AR som är nästan lika med 11:1 (AR11). Dessutom kan HF orsakas av ökad afterload (t.ex. vid högt blodtryck). I dessa fall, hemodynamiska krav kraft CMs att ta på kvadratiska former, enligt Laplace lag, och AR ändras från 7:15 (AR7) till 1:16,7. HF kan också orsakas av en ökning av förspänning (t.ex. under förhållanden som leder till volymöverbelastning). När detta händer, de biofysiska begränsningar tvinga CMs att förlänga och AR ändras från 7:1 till 11:1.
Signalering aktivitet vid membran beror på globala parametrar cell geometri, såsom cellulära AR, storlek, membran yta och membranet krökning18. När neonatal råtta CMs var pläterade på substrat som var mönstrade för att begränsa cellerna i en specifik längd:bredd AR, visade de den bästa kontraktil funktion när nyckeltal liknade cellerna i en frisk vuxen hjärta. Däremot presterade de dåligt när nyckeltalen liknade de hos myocyter i sviktande hjärtan19. I de tidiga stadierna av hypertrofi blir celler bredare, vilket återspeglas av en ökning av tvärsnittsområdet. HF förekommer i de senare stadierna av hypertrofi och celler visas vanligtvis avlånga. Därför är det inte förvånande att in vivo råtta modeller av kronisk hypertrofi har rapporterat en ökning av vänster ventrikulär myocyte längd på runt 30%20, men vuxna CMs från transgen mus modell som var akut behandlas med hypertrofisk stimuli in vitro visat liknande ökningar i cell bredd istället21.
Encelliga RNA-sekvensering, som möjliggör exakt analys av transkriptomet hos enstaka celler, revolutionerar för närvarande förståelsen av cellbiologi. Denna teknik var den föredragna metoden när det gällde att svara på frågan om hur enskilda cellformer påverkade genuttrycket. Vi jämförde enstaka celler med olika former, i synnerhet med ARs av 1:1, 7:1 eller 11:1. Detta gjordes genom sådd neonatal råtta ventrikulära CMs på en speciellt utformad chip fylld med fibronectin-belagda mikromönster2 med definierade ARs av 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikropetorna tillverkades med hjälp av fotolitografiteknik. Mikromönster var belagda med fibronectin, omgiven av cytofoba yta. Därför kommer CMs fästa, sprida och fånga den definierade AR av mikromönster genom att enbart växa på fibronectin substrat, samtidigt som man undviker det cytofoba området. Mikroputtern är inte i ett välformat format. Istället är fibronectin nivån exakt på samma höjd av det omgivande cytofoba området. Detta gav liknande villkor som växande celler i en petriskål, eftersom det inte finns någon stress från de omgivande väggarna. Dessutom är ytan av mikromönster med olika ARs lika.
Det fanns två särskilt viktiga aspekter av den experimentella utformningen, vilket ledde till användning av encellig RNA-sekvensering istället för bulk RNA-sekvensering. Först kan endast några procenttal av mikromönsteren upptas av en enda cell. För det andra, ibland en enda cell inte helt upptar mikromönster ytan. Enstaka celler som helt täcker en mikromönsteryta måste plockas för encellig RNA-analys. Eftersom endast en undergrupp av de pläterade cellerna på ett chip uppfyllde båda kriterierna, var det inte möjligt att helt enkelt trypsinize hela chipet och samla alla celler för bulk RNA sekvensering. Kvalificerade celler behövde plockas individuellt med hjälp av en halvautomatisk cellväljare.
Det för närvarande är okänt om CM-formen, av sig själv, har en intrafunktionell inverkan på hjärtinfarkt syncytium. Huvudsyftet med de metoder som föreslås i detta dokument var att utveckla en ny plattform för att studera om cellformen i sig hade en inverkan på transkriptomet17. Även om in vitro-studier skiljer sig från in vivo-studier, var syftet med denna studie att undersöka effekten av olika cellformer på genuttryck, med tanke på att det är ytterst krävande att jämföra celler med olika former in vivo. Dessa experiment var inspirerade av Kuo et al.19, som använde en liknande metod och rapporterade att de observerade förändringar i fysiologiska parametrar på grund av förändringar i cellform.
Protocol
Alla de förfaranden som omfattade djur var i enlighet med föreskrifterna från den djuretiska kommittén vid Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige.
1. Micro-mönstrad chip layout
- Använd ett specialdesignat chip (Table of Materials) ( Bild1A): en 19,5 mm x 19,5 mm täckbild med aktiverade mikromönster, tryckta med fotolitografi på borosilikatglas.
OBS: Dessa mikromönster omges av ett cytofoba område. Därför kan en sådd cell bara fästa och växa på en av dessa mikromönster och fånga AR av det mikromönster. Chipet är indelat i tre zoner och varje zon består av mikromönster med ett specifikt AR. Spånlayouten visas i figur 1B. De definierade ARs geometri presenteras i tabell 1. Förstorade fluorescerande bilder av de olika formerna hos mikromäterna fibronectin visas i de lägre bilderna i figur 1B.
2. Beläggning mikromönster chips
- Bered 2x beläggningsproteinlösning för varje chip genom att tillsätta 80 μg fibronectin till 2 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS-/-).
- Överför ett chip till en 35 mm Greiner Petri-skål och tillsätt omedelbart 2 mL PBS-/-. Tillsätt sedan 2 mL av 2x beläggningsproteinlösningen.
- Inkubera flisen i rumstemperatur i 2 h.
- Tvätta beläggningslösningen genom successiva utspädningssteg med PBS-/-. Spånytan ska alltid vara våt. Sedan, byt ut PBS med 2 mL pläteringsmedium och inkubera vid 37 °C tills såddceller.
3. Isolering av CMs
- Förbered pläteringsmediet genom att komplettera DMEM:M199 (4:1) med 10% hästserum, 4% fetalt bovint serum, 2% HEPES (1 M) och 1% penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)22.
- Dissekera vävnaden från den vänstra ventrikeln av 2-dagsgamla neonatal råtta hjärtan och överföring till en 10 cm maträtt som innehåller PBS. Skär vävnaden i ungefär 1 mm3 bitar.
- Överför den skördade vävnaden till ett rotor-cap rör, utrustad med en rotor i locket för vävnadsupplösning (Table of Materials). Låt vävnaden slå sig ner och ta sedan försiktigt bort supernatanten.
- Tillsätt 2,5 mL av blandningen av enzymblandning 1 och 2, beredd med hjälp av Neonatal Heart Dissociation Kit (Table of Materials), till C-röret och stäng locket tätt.
- Sätt i rotor-lockets rör på hylsan på dissociator, utrustad med värmare (Figur 2A och B) ( Tabellof Materials). Kör inkubationsprogrammet 37C_mr_NHDK_1 (Bild 2C), som varar ungefär en timme.
- Medan inkubationsprogrammet körs, förbereda PEB buffert som innehåller 2 mM EDTA och 0,5% bovint serum albumin (BSA) i PBS, pH 7,2, och hålla den på 4 °C .
- Efter uppsägning av inkubationsprogrammet, lossa rotor-cap röret (Figur 2D) och tillsätt 7,5 mL förvättning plätering medium.
- Gör provet på nytt och filtrera cellupphängningen med hjälp av en 70 μm sil.
- Tvätta silen med ytterligare 3 mL pläteringsmedium.
- Centrifugera cellupphängningen vid 600 x g i 5 min. Aspirera supernatanten helt.
- Resuspend cell pelleten i 60 μL av kall PEB buffert.
- Tillsätt 20 μL av Neonatal Kardiomyocyte Isoleringscocktail (Tabell av material), innehållande micron-sized pärlor som riktar sig till icke-CMs.
- Tillsätt 20 μL av Anti-Red Blood Cell pärlor (Tabell över material).
- Blanda upphängningen och inkubera vid 4 °C i 15 min.
- Tillsätt 400 μL PEB-buffert.
- Applicera cellupphängningen på LD-kolonnen (Table of Materials), som har förts in vertikalt i ett magnetstativ och tvättats väl med PEB-buffert.
- Samla omärkta celler och tvätta kolonn med 0,5 mL PEB buffert.
- Tillsätt 8 mL pläteringsmedium och överför cellupphängningen till en 75 cm2 obelagd odlingskolv och inkubera vid 37 °C i 1,5 h. De återstående icke-CMs kommer att börja följa den obelagda cellkulturen och cellfjädringen kommer att berikas av CM befolkningen.
4. M-skivor med mönstning
OBS: Vi jämförde enda CMs med ARs av 1:1, 7:1 eller 11:1. Detta görs genom att de isolerade neonatalråtråns CMs sådd sås på ett specialdesignat chip fyllt med fibronectinbelagda mikromönster med definierade ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikromönster var belagda med fibronectin, omgiven av cytofoba yta. Därför kommer CMs fästa, sprida och fånga den definierade AR av mikromönster genom att enbart växa på fibronectin substrat. Mönster de isolerade CMs enligt följande steg.
- Överför cellupphängningen till ett 15 mL-rör, räkna cellerna och späd till en koncentration av 100 000 celler per mL genom att tillsätta lämpligt pläteringsmedium.
- Tillsätt 2 mL cellupphängning på chipet, som redan har dränkts i 2 mL varmpläteringsmedium inuti en 35 mm Greiner Petri-skål.
- Inkubera skålen vid 37 °C med 5% CO2 för att låta CMs fästa vid de fibronectin-belagda mikromönster och låta varje CM att förvärva AR av dess substrat mikromönster.
- Efter 18 h, kontrollera chipet. Om de flesta av cellerna har fäst, lossa och ta bort skräp och döda celler som är knutna till den mönstrade cellen. Gör detta genom att ta bort pläteringsmediet och försiktigt lägga TILL PBS-/- droppvis, med början från mitten av chipet sedan rör sig mot sidorna. Upprepa 2 gånger.
- Aspirera PBS med färskt underhållsmedium genom att komplettera DMEM:M199 (4:1) med 4% hästserum, 4% fetalt bovint serum, 2% HEPES (1 M) och 1% penicillin/streptomycin (10,000 U/mL).
5. Plockning av vidhäftande CMs
OBS: Efter en odlingsperiod på 72 timmar plockas mönstrade enstaka CMs från sina mikromönster i fibronectin med hjälp av en halvautomatisk cellväljare (Table of Materials) ( Figur3). Cellväljaren använder en programvara23 för att styra den motoriserade scenen (Bild 3A). En 70 μm mikrokapillär i glas (figur 3B) används för att plocka och injicera de mönstrade neonatalråttanS. Cellplockaren sorterar vidhäftande celler genom att generera ett vakuum och injicera cellerna genom att utöva tryck. Vakuumet i sprut nummer 1 appliceras genom att sprutan drar med hjälp av sprutpumpen (Figur 3C). Det hydrostatiska trycket är baserat på gravitation och framkallas genom att sprutans nummer 2 placeras på ett avstånd av 87 cm över mikroskopet. Sprutor 1 respektive 2 ansluts via PTFE-rör, till ventilerna 1 och 2, som är inbäddade i styrenheten (Bild 3D). PTFE-rören är helt fyllda med RNase-fritt vatten. Den plockade encellen injiceras sedan till polymeras kedjereaktion (PCR) röret, innehållande 3,55 μL av lysbuffert.
- Efter en kulturingsperiod på 72 timmar, ta bort det gamla mediet och spola försiktigt spånytan med varma DPBS-/-.
- Håll skålen platt och aspirera det gamla mediet försiktigt med en 1000 μL pipett från ena sidan av skålen. Se till att chipet förblir vått hela tiden.
- Lägg till 2 mL DPBS-/- försiktigt och droppvis lösgör de flesta av de döda celler som är fästa vid de mönstrade cellerna, med början från mitten av chipet och sedan flytta till dess sidor.
- Aspirera de flesta av DPBS att ta bort så många fristående flytande celler som möjligt, med början från mitten av chip och sedan flytta till sidorna.
- Upprepa steg 5.1.2 och 5.1.3 en gång till.
- Använd vinklade forceps för att ta tag i kanten av chipet och omedelbart överföra den till en ny steril 35 mm Greiner Petri skålen för att minska antalet flytande celler medan plockning.
- Lägg omedelbart till 1,5 mL DPBS-/- så att chippet inte torkar ut.
- Tillsätt 1,5 μL av Vibrant Dye Cycle grön för att visualisera kärnorna i de levande cellerna.
- Placera chipet i mitten av Greiner Petri-skålen genom att använda spets på tärnarna.
- Sätt en kammare (Tabell av material) över chipet. Kammaren kommer att fixa chipet till botten av skålen, utan att blockera åtkomsten till cellmönstren.
- Montera Greiner Petri-skålen på cellplockarstadens fathållare och sätt in magnetlocket.
- Kalibrera den automatiserade injektionen.
- Leta reda på hårkorset, som är ingraverat på den motoriserade scenen mitt i bilden i Live View-fönstret.
- Fokusera på hårkorset och välj knappen Kalibrering för automatiserad insprutning i fönstret Skanning och sortering.
- Ersätt DPBS-/- med 1,5 mL DPBS/trypsin-/- (1:1) medan skålen är på scenen, för att lossa cellerna från fibronectin så att ett fluidiskt vakuum kan användas för att plocka cellerna.
- Skanna hela chipet med hjälp av fliken Skanning i fönstret Skanning och sortering. Leta upp det övre vänstra hörnet av chipet i synfältet och klicka på Få aktuellt mikroskopläge i den övre vänstra hörnet raden.
- Flytta sedan den motoriserade scenen till det nedre högra hörnet av chipet. Fokusera mikroskopet och klicka på Få aktuell mikroskop position i nedre högra hörnet raden.
- Klicka på Set skarpaste plan knappen och på popped upp fönstret klicka på Gå till det övre högra hörnet. Fokusera mikroskopet och klicka på Gå till det nedre vänstra hörnet och ställ in fokus. När klar klicka på knappen Slutför och börja skanna.
- När skanningen avslutas går du till fliken Analysera och väljer de enstaka celler som klarar studiekriterierna.
- Se till att glasmikrör är mitt i mikroskopets livevy.
- Styr sprutpumpen med hjälp av programvarans pumpfönster. Skapa ett vakuum genom att dra tillbaka 4 mL från en 50 mL nummer 1 spruta, som har en diameter på 27 mm.
- I fliken Sortering
- Ställ in ventilernas insprutningsparametrar. Man räknade ut att injektionsvolymen som levererade en plockad encell var 1 μl, om ventil 2 öppnades för 120 millisekunder och sedan ventil 1 öppnades i 20 var millisekunder efter en tidsfördröjning på 200 millisekunder. På grund av elasticiteten i rören, öppna ventil 1 för att stoppa injicera flödet.
- Ställ in ventilernas upphämtningsparametrar. Man räknade ut att om ventil 1 öppnades i 20 millisekunder och sedan öppnades ventil 2 i 10 millisekunder, efter en tidsfördröjning på 10 millisekunder, kan de flesta mönstrade celler plockas upp. Detta beror på att deras fibronectin bindningar lossades efter att ha behandlats av trypsin.
- Klicka på Compute knappen path. Programvaran beräknar den snabbaste vägen från cell till cell, att plocka upp och injicera de valda cellerna i hela chipet.
- Fokusera mikroskopet på en mönstrad cell på spånytan.
- Använd joysticken, flytta mikrokapillären nedåt försiktigt, så att den skarpaste bilden av toppen av mikrokapillären kan erhållas utan att cellen vidrörs.
- Klicka på knappen Ange i avsnittet Micropipette offset. Ett nytt fönster kommer att dyka upp, som visar mikrokapillär tvärsnitt. Klicka på den exakta mitten av kapillären. Programvaran kommer då att spela in spetsförskjutningen av kapillären i koordinaterna x, y och z.
- Starta sortering med knappen Börja sortera.
Representative Results
Vävnad var dissekeras från den vänstra ventrikel av 2-dagsgamla neonatal råtta hjärtan och delas upp i enstaka celler. Då de berikade CMs var seedade på ett chip som innehåller fibronectin mönster med distinkta ARs. Efter 72 timmars odling ersattes mediet av 1:1000 Vibrant Dye Cycle green i DPBS-/- i 2 min för att visualisera kärnorna i de levande cellerna. Därefter behandlades cellerna med DPBS-/-/trypsin (1:1) för att lossa cellerna från fibronectin, så att ett fluidiskt vakuum kunde användas för att underlätta cellplockning. Under tiden skannades hela chipet med en förstoring på 10x, med hjälp av ett inverterat mikroskop som är anslutet till cellväljaren. Detta genomfördes innan cellerna blev avrundade på grund av trypsin behandling. De kvalificerade cellerna valdes, baserat på den skannade bilden, och deras koordinater sparades i cellväljarens programvara. Mikromönster var endast utvalda om de innehöll en mononukleerad enda cell och endast när cellen helt täckte dess fibronectin mikromönster. Cell sorteraren plockade de valda cellerna en efter en och varje enskild cell som framgångsrikt plockades injicerades omedelbart i ett enskilt PCR-rör och placeras på mikroskopet scenen. Varje PCR-rör innehöll 3,55 μL lysbuffert (Tabell 2). Sorteringsprocessen, som började med att ta bort mediet, slutfördes inom 40 minuter. Den kompletterande deoxyribonukleinsyran (cDNA) syntes, PCR förförstärkning och rening utfördes på de lysade enstaka cellerna, baserat på Smart-Seq2-protokollet24 (Tabell 3). Kvaliteten på den renade cDNA kontrollerades av en automatiserad elektroforesanalysator. Elektroferogrammet för den förförstärkta cDNA av en plockad enda cell presenteras i figur 4. RNA-Seq-biblioteken utarbetades enligt Smart-Seq2-protokollet24.
För att observera sarcomere strukturen av de mönstrade CMs, var de mönstrade CMs färgas med sarcomeric α-aktinin antikropp. Cellerna inkuberades med Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 för 1 timme vid rumstemperatur för den sekundära färgning. Kärnor var färgas med 1 μg/mL DAPI. Immunofluorescerande bilder förvärvades med ett inverterat konfokalmikroskop, med hjälp av ett 63x olje-nedsänkning (NA 1.4) objektiv (Figur 5).
Bild 1: Layout av chipet med mikromönster i fibronectin.
(A) Bild av det specialdesignade chipet. Chipet är en 19,5 mm x 19,5 mm täckbild med mikromönster med fibronectin, tryckt av fotolitografi på ett borosilikatglas. (B) Chip layout. Chipet är uppdelat på tre zoner och varje zon består av mikromönster i fibronectin med specifika AR. Fluorescerande bilder av olika former av mikromönster av fibronectin visas i förstorad vy för varje zon. Denna siffra har modifierats från "kompletterande material 1" av Haftbaradaran Esfahani et al.2, som används under http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Dissociator utrustad med värmare apparatur.
(A) Hela dissociatorinstrumentet som används för den helt automatiserade dissociationen av 2-dagsgamla neonatalråttan vänsterkammar. (B) Värmeenhet. (C) Rotor-cap rör. (D) Färdiga att använda program för ett helt automatiserat arbetsflöde av vävnads-dissociation. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Cellplockarapparat.
(A) Förstorad vy över cellväljarens motoriserade stadium. En Petri-skålhållare och 80 hål för 10 PCR-remsor och ett hål för kalibrering hårkors är inbäddad på scenen. (B) Förstorad vy över en mikrokapillär av glas. (C) Sprutan pumpen. (D) Styrenheten, som styr öppnings- och stängningstidsfönstret på ventilerna 1 och 2, monterad inuti styrenheten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Elektroferogrammet för den förförstärkta cDNA i en plockad enda cell.
19 PCR-cykler av förförstärkning användes för att erhålla 15 μL av 1 ng/μL renat cDNA-utbyte. Ett klart band i gelliknande densitometristäpp observeras vilket motsvarar toppen på 1852 bp i elektroferogrammet. Den genomsnittliga storleken på fragment är 1588 bp. Den lilla mängd fragment som är kortare än 300 bp anger dessutom ett bra cDNA-bibliotek. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Immunfluorescerande färgning av α-aktinin sarkomerisk struktur (grön) och kärna (blå) av mönstrade CMs med olika ARs.
Kromatin var färgas av DAPI. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Morfityp | Ar | Längd (μm) | Bredd (μm) | Område med fibronectin (μm2) |
| AR1 | 1:1 | 47 | 47 | 2209 |
| Ar7 | 7:1 | 126 | 18 | 2268 |
| AR11 | 11:1 | 155 | 14 | 2170 |
Tabell 1: Geometri för mönstrade CMs.
| Komponent | Volym (μL) |
| Nucleas-fritt vatten | 0.65 |
| (0,4% vol/vol) Triton X-100 | 1.8 |
| dNTP mix (25 mM) | 0.8 |
| RNashämmare (40 U μL-1) | 0.1 |
| Oligo-dT30VN oligonukleotider (100 μM) | 0.1 |
| ERCC RNA Spike-In Mix (2,5 x 105 utspädning) | 0.1 |
| Injicerad encellig | 1 |
| Total volym | 4.55 |
Tabell 2: Enkelcells anpassad lysbuffert.
| Komponent | Volym (μL) |
| Superscript II första-strand buffert (5x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| Mgcl2 (1 M) | 0.1 |
| RNashämmare (40 U μL-1) | 0.25 |
| Upphöjd II omvänd transkriptas (200 U μL-1) | 0.5 |
| TSO (100 μM) | 0.1 |
| Total volym | 5.45 |
Tabell 3: Blanda omvänd transkription (RT) för en RT-reaktion för att syntetisera första-strand cDNA från lysate av en enda CM.
Discussion
Denna studie används encelliga RNA sekvensering, som är en ny och kraftfull teknik som kan upptäcka transkriptom av enstaka celler. Det kombinerades med ett innovativt tillvägagångssätt för att kultföra enda CMs, så att de tog på olika ARs som annars bara kunde ha observerats in vivo.
Studien hade vissa begränsningar. Till exempel måste neonatal-CMs användas för att generera olika morftyper, eftersom det är exceptionellt utmanande att kulturen tillräckligt med vitala vuxna CMs för 72 timmar i definierade former. Dessutom var CMs odlade i 72 timmar ex vivo, vilket kan ha haft en inverkan på genuttryck mönster. Denna odling var dock nödvändig, så att cellerna kunde bilda specifika morftyper. Dessutom valdes endast enstaka celler som var mononucleerade och helt täckte mikromönster fibronectin mikromönster för sortering. Mönstrade celler på varje chip måste sorteras bara i en omgång sortering. Slutligen, cirka 50 celler som är ungefär en tredjedel av de valda cellerna framgångsrikt plockas upp från varje chip. Det finns två orsaker som begränsade antalet framgångsrikt plockade celler. Först var vissa celler för tätt knutna till fibronectin mönstret och pickup flödet var inte tvång nog att framgångsrikt plocka upp dem. För det andra, på grund av trypsinbehandlingen, blev bilagan mellan vissa celler och fibronectin för lös. Följaktligen var dessa celler skjuts bort från deras fibronectin mikromönster, när microcapillary närmade sig dem, och de var inte plockas upp. Författarna hävdar inte att denna inställning är densamma som en in vivo miljö, men det visade sig vara en livskraftig metod för att besvara forskningsfrågan.
Den föreslagna metoden är tillämplig på olika celltyper (t.ex. för hiPS-CMs). Följande faktorer bör dock optimeras för att studera andra cell-typer. Lämpliga ECM-limmolekyler för fastsättning av den specifika cell-typen bör användas för beläggning av mikromönsterna. Mikromönsternas geometri bör modifieras enligt studiefrågan och cell-typ. Den culturing perioden kan ändras baserat på studien fråga. Reagensen för lösgöring och dess inkubationstid bör optimeras exakt för studien cell-type. Till exempel, Accutase kan användas i stället för TryplE för lossnar av embryonala och neuronala stamceller. Ventilernas öppningstidsparametrar bör granskas för att plocka celler framgångsrikt, men försiktigt. Sammanfattningsvis konstruerade vi en ny plattform för att studera cellform som kan ge en värdefull resurs för forskare inom området. I detta sammanhang utformade vi en experimentell metod som härmade in vitro karakteristiska former som åläggs CM in vivo av hemodynamic begränsningar för att identifiera samspelet mellan cellulär arkitektur och genuttryck. Vi rapporterar också utvecklingen av en ny plattform för att studera HF in vitro och identifiering av cellform som en kraftfull determinant för genuttryck. Detta är en ny observation med långtgående konsekvenser för biologi och medicin.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
- Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7 (2019).
- Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836 (2012).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
- Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
- Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A. Controversies in ventricular remodelling. Lancet. 367 (9507), 356-367 (2006).
- Braunwald, E. Cardiomyopathies: An Overview. Circulation Research. 121 (7), 711-721 (2017).
- Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
- Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
- Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
- Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
- McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
- Schultheiss, H. P., et al. Dilated cardiomyopathy. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 32 (2019).
- Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
- Rangamani, P., et al. Decoding information in cell shape. Cell. 154 (6), 1356-1369 (2013).
- Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
- Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
- Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).
