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Biochemistry

प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61580
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। विभिन्न सॉल्वेंट एडिटिव्स और लिगामेंट्स में विभिन्न हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई गुण होते हैं। विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन संरचना की तुलना करने के लिए, प्रतिक्रिया में उत्पन्न हाइड्रोक्सिल कणों के वास्तविक समय के मुआवजे की प्रतिक्रिया स्थितियों को सामान्य करने के लिए आवश्यक है।

Abstract

प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफपीओपी) एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक है जो प्रोटीन के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र की जांच करती है। यह तकनीक हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के साथ अमीनो एसिड साइड चेन की प्रतिक्रिया पर निर्भर करती है जो समाधान में स्वतंत्र रूप से फैलाना है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लेजर फोटोलिसिस द्वारा सीटू में इन कणों को उत्पन्न करता है, जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का एक फट पैदा करता है जो माइक्रोसेकंड के क्रम पर समाप्त हो जाता है। जब ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स सॉल्वेंट-सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, तो प्रतिक्रिया उत्पाद एक बड़े पैमाने पर बदलाव प्रदर्शित करते हैं जिसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि अमीनो एसिड की प्रतिक्रिया की दर उस अमीनो एसिड की औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह पर निर्भर करती है, इसलिए प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में मापा गया परिवर्तन विभिन्न अनुरूपों के बीच उस क्षेत्र की विलायक पहुंच में परिवर्तन से सीधे सहसंबद्ध हो सकता है (जैसे, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-फ्री, मोनोमर बनाम कुल, आदि) एफपीओपी को जीव विज्ञान में कई समस्याओं में लागू किया गया है, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन कॉन्फॉर्मेशनल बदलाव और प्रोटीन-लिगांड बाइंडिंग शामिल हैं । चूंकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों की उपलब्ध एकाग्रता एफओपी प्रयोग में कई प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न होती है, इसलिए प्रभावी कट्टरपंथी खुराक की निगरानी करना महत्वपूर्ण है जिसके लिए प्रोटीन एनालिटे उजागर होता है। इस निगरानी को FPOP प्रतिक्रिया से संकेत को मापने के लिए एक इनलाइन डोसिमेटर को शामिल करके कुशलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है, जिसमें ऑक्सीकरण की वांछित मात्रा को प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में लेजर फ्लूसेंस समायोजित किया जाता है। इस मुआवजे के साथ, प्रोटीन स्थलाकृति में परिवर्तन अनुरूप परिवर्तन, ligand बाध्यकारी सतहों को दर्शाती है, और/या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन इंटरफेस अपेक्षाकृत कम नमूना मात्रा का उपयोग कर विषम नमूनों में निर्धारित किया जा सकता है ।

Introduction

प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP) प्रोटीन के विलायक उजागर सतह क्षेत्र के अल्ट्रा-फास्ट सहसंयोजक संशोधन द्वारा प्रोटीन स्थलाकृतिक परिवर्तनों के निर्धारण के लिए एक उभरती हुई तकनीक है जिसके बाद एलसी-एमएस1द्वारा पता लगाया जाता है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के यूवी लेजर फ्लैश फोटोलिसिस द्वारा सीटू में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की उच्च सांद्रता उत्पन्न करता है। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स बहुत प्रतिक्रियाशील और अल्पकालिक होते हैं, जो एफओपी शर्तों2के तहत लगभग एक माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर खपत होते हैं। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स पानी के माध्यम से फैलते हैं और गतिज दरों पर समाधान में विभिन्न कार्बनिक घटकों को ऑक्सीकरण करते हैं आम तौर पर तेजी से (~ 106 एम-1 एस-1)से लेकरप्रसार-नियंत्रित 3तक। जब हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी एक प्रोटीन सतह का सामना करता है, तो कट्टरपंथी प्रोटीन सतह पर अमीनो एसिड साइड चेन को ऑक्सीकरण करेगा, जिसके परिणामस्वरूप उस अमीनो एसिड (आमतौर पर एक ऑक्सीजन परमाणु का शुद्ध जोड़)4का एक बड़ा बदलाव होगा। किसी भी अमीनो एसिड पर ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की दर दो कारकों पर निर्भर करती है: उस अमीनो एसिड की अंतर्निहित प्रतिक्रियाशीलता (जो साइड चेन और अनुक्रम संदर्भ पर निर्भर करती है)4,,5 और उस साइड चेन की पहुंच डिफ्यूजिंग हाइड्रोक्सिल रेडिकल से होती है, जो औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह क्षेत्र6,,7से निकटता से संबंधित है। ग्लाइसिन को छोड़कर सभी मानक अमीनो एसिड FPOP प्रयोगों में इन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों द्वारा लेबल के रूप में देखा गया है, हालांकि व्यापक रूप से अलग पैदावार पर; व्यवहार में, सेर, थ्र, एसेन और अला को शायद ही कभी उच्च कट्टरपंथी खुराकों को छोड़कर अधिकांश नमूनों में ऑक्सीकृत के रूप में देखा जाता है और सावधान और संवेदनशील लक्षित ईटीडी विखंडन8, 9,द्वारा पहचानाजाताहै। ऑक्सीकरण के बाद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और माध्यमिक ऑक्सीडेंट (सुपरऑक्साइड, सिंगलेट ऑक्सीजन, पेप्टिडाइल हाइड्रोपेरॉक्साइड आदि) को हटाने के लिए नमूने बुझाए जाते हैं। शमन नमूनों को ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स के मिश्रण उत्पन्न करने के लिए प्रोटियोलिटिक रूप से पचाया जाता है, जहां संरचनात्मक जानकारी विभिन्न पेप्टाइड्स(चित्रा 1)के ऑक्सीकरण उत्पादों के पैटर्न में रासायनिक "स्नैपशॉट" के रूप में जम जाती है। उस पेप्टाइड के ऑक्सीकृत और अक्ओसीडीकृत संस्करणों की सापेक्ष तीव्रता के आधार पर दिए गए प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड में अमीनो एसिड के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। विभिन्न अनुरूप परिस्थितियों (उदाहरण के लिए, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-मुक्त) के तहत प्राप्त एक ही प्रोटीन के इस ऑक्सीडेटिव पदचिह्न की तुलना करके, प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में अंतर सीधे उस क्षेत्र के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र में अंतर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है6,,7। प्रोटीन स्थलाकृतिक जानकारी प्रदान करने की क्षमता प्रोटीन चिकित्सीय खोज और विकास10, 11,11सहित प्रोटीन के उच्च क्रम संरचना निर्धारण के लिए एफओपी एक आकर्षक तकनीक बनाती है।

Figure 1
चित्रा 1: FPOP का अवलोकन। प्रोटीन की सतह को अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कणों द्वारा सहसंयोजक रूप से संशोधित किया जाता है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स प्रोटीन की अमीनो एसिड साइड चेन के साथ एक दर पर प्रतिक्रिया करेंगे जो साइड चेन की सॉल्वेंट पहुंच से दृढ़ता से प्रभावित होता है। स्थलाकृतिक परिवर्तन (उदाहरण के लिए, ऊपर दिखाए गए लिगामेंट के बाध्यकारी के कारण) हाइड्रोक्सिल कणों के साथ प्रतिक्रिया करने से बातचीत के क्षेत्र में अमीनो एसिड की रक्षा करेगा, जिसके परिणामस्वरूप एलसी-एमएस सिग्नल में संशोधित पेप्टाइड की तीव्रता में कमी आएगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एफओपी समाधान में मौजूद विभिन्न घटकों (उदाहरण के लिए, लिगांड, एक्सपिएजेंट्स, बफ़र्स) में हाइड्रोजन पेरोक्साइड3के लेजर फोटोलिसिस पर उत्पन्न हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की ओर अलग-अलग सफाई गतिविधि होती है। इसी तरह, पेरोक्साइड एकाग्रता, लेजर फ्लूसेंस और बफर संरचना में एक छोटा सा परिवर्तन प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बदल सकता है, जिससे नमूनों में और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच एफपीओपी डेटा का प्रजनन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए , यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने में प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोज की तुलना करने में सक्षम होना चाहिए, जिसमें से एक कई उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोसीमीटर12,13 ,14,15,16में16से एक है । हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी कणों के पूल के लिए एनालिट (और समाधान में सभी सफाई कर्मियों के साथ) के साथ प्रतिस्पर्धा करके हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसिमेटर कार्य करते हैं; हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की प्रभावी खुराक को डोसिमीटर के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापकर मापा जाता है। ध्यान दें कि "प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक" हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पन्न की प्रारंभिक एकाग्रता और कट्टरपंथी के आधे जीवन दोनों का एक कार्य है। ये दोनों पैरामीटर आंशिक रूप से एक-दूसरे पर निर्भर हैं, जिससे सैद्धांतिक गतिज मॉडलिंग कुछ जटिल(चित्रा 2)हो जाती है । दो नमूनों बेतहाशा अलग प्रारंभिक कट्टरपंथी आधा जीवन हो सकता है, जबकि अभी भी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी का गठन की प्रारंभिक एकाग्रता को बदलने के द्वारा एक ही प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बनाए रखने; वे अभी भी समान पैरों के निशानउत्पन्न करेंगे 17. एडेनिन13 और ट्राइस12 सुविधाजनक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसीमीटर हैं क्योंकि ऑक्सीकरण के उनके स्तर को वास्तविक समय में यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक के साथ समस्या होने पर जल्दी से पहचानने और उनकी समस्या का निवारण करने की अनुमति मिलती है। इस समस्या को हल करने के लिए, विकिरण की साइट के बाद सीधे प्रवाह प्रणाली में स्थित एक इनलाइन डोसिमेटर जो वास्तविक समय में एडेनिन अवशोषण परिवर्तनों से संकेत की निगरानी कर सकता है महत्वपूर्ण है। यह बफ़र्स या किसी अन्य एक्सपिएजेंट में एफपीओपी प्रयोगों को करने में मदद करता है जिसमें हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता17के व्यापक रूप से भिन्न स्तर हैं । इस कट्टरपंथी खुराक मुआवजा वास्तविक समय में किया जा सकता है, प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को समायोजित करके एक ही अनुरूप के लिए सांख्यिकीय अविवेच्य परिणाम उपज ।

इस प्रोटोकॉल में, हमारे पास आंतरिक ऑप्टिकल कट्टरपंथी डोसिमेटर के रूप में एडेनिन का उपयोग करके कट्टरपंथी खुराक मुआवजे के साथ एक विशिष्ट एफओपी प्रयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं हैं। यह विधि जांचकर्ताओं को एफपीओपी स्थितियों में पैरों के निशान की तुलना करने की अनुमति देती है जिनमें वास्तविक समय में मुआवजा देकर अलग-अलग सफाई क्षमता होती है।

Figure 2
चित्रा 2: डोसिमेट्री-आधारित मुआवजे का काइनेटिक सिमुलेशन। 1 एमएमए एडीन डोसिमेटर प्रतिक्रिया को 1 एमएम प्रारंभिक हाइड्रोक्सिल रेडिकल एकाग्रता (▪ओएच टी1/2=53 एनएस) के साथ 5 माइक्रोन लिसोजिमे विश्लेषण में मापा जाता है, और एक लक्ष्य डोसिमेटर प्रतिक्रिया (काला) के रूप में निर्धारित किया जाता है। मेहतर के 1 mm के अलावा हिस्टिडीन उत्तेजित, डोसिमेटर प्रतिक्रिया (नीला) आनुपातिक तरीके से प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा के साथ कम हो जाती है (सियान)। हाइड्रोक्सिल रेडिकल का आधा जीवन भी कम हो जाता है (▪ओएच टी1/2=39 एनएस)। जब हाइड्रोक्सिल रेडिकल उत्पन्न की मात्रा में वृद्धि होती है, तो 1 एमएम हिस्टिडीन मेहतर के साथ नमूने में ऑक्सीडाइज्ड डोसिमेटर की बराबर उपज देने के लिए, जैसा कि मेहतर (लाल) की अनुपस्थिति में 1 एमएम हाइड्रोक्सिल रेडिकल के साथ हासिल किया जाता है, तो प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा जो होती है वह समान (मैजेंटा) हो जाती है, जबकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी आधा जीवन और भी कम हो जाता है (▪ ओह टी1/2=29 ns) । शार्प जेएस, एएम फार्मासियूट रेव 22, 50-55, 2019 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. एफओपी के लिए ऑप्टिकल बेंच और केशिका तैयार करें

सावधानी: KrF एक्सिमर लेजर अत्यधिक आंखों के खतरे हैं, और प्रत्यक्ष या परिलक्षित प्रकाश स्थायी आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। हमेशा उचित आंखों की सुरक्षा पहनें, बीम पथ के पास किसी भी चिंतनशील वस्तुओं की उपस्थिति से बचें जब संभव हो, और एक सक्रिय लेजर तक अनधिकृत पहुंच को रोकने और किसी भी आवारा प्रतिबिंब को नियंत्रित करने के लिए इंजीनियरिंग नियंत्रण का उपयोग करें।

  1. एफओपी ऑप्टिकल बेंच तैयार करें।
    1. गर्म करने के लिए लेजर चालू करें। बाहरी ट्रिगर, निरंतर ऊर्जा, कोई गैस प्रतिस्थापन के लिए लेजर सेट करें। प्रति नाड़ी लेजर ऊर्जा सेट (आमतौर पर 80-120 mJ/पल्स के बीच) ।
    2. लेजर बीम के रास्ते में सीधे प्लैनो-उत्तल लेंस (30 मिमी व्यास x 120 मिमी एफएल अनकोटेड) और चित्र 3 एमें दिखाए गए प्रकाश को अवशोषित करने के लिए एक गैर-चिंतनशील बैकस्टॉप के साथ ऑप्टिकल बेंच स्थापित करें।

Figure 3
चित्रा 3: FPOP प्रयोग के लिए ऑप्टिकल बेंच। (क)नमूने में एच 2 ओ2,एडेनिन रेडिकल डोसिमेटर औरग्लूटामीनमेहतर को मिलाया जाता है और सिरिंज में लोड किया जाता है । नमूना एक KrF एक्सिमर यूवी लेजर के केंद्रित बीम पथ के माध्यम से जुड़े सिलिका केशिका के माध्यम से धक्का दिया है। यूवी लाइट फोटोलाइज एच2ओ2 को हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स में ले जाता है, जो प्रोटीन और एडेनिन डोसिमेटर को ऑक्सीकरण करता है । सिरिंज प्रवाह प्रकाशित क्षेत्रों के बीच एक unilluminated अपवर्जन मात्रा के साथ, अगले लेजर पल्स से पहले लेजर के रास्ते से बाहर प्रबुद्ध नमूना धक्का । ऑक्सीकरण के तुरंत बाद, नमूना एक इनलाइन यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से पारित किया जाता है, जो 265 एनएम पर एडेनिन के यूवी अवशोषण को मापता है। इसके बाद बचे हुए एच 2 ओ2और सेकेंडरी ऑक्सीडेंट्स को खत्म करने के लिए सैंपल को क्वेंच बफर में जमा कियाजाता है। (ख)248 एनएम पर लेजर के साथ केशिका के पीछे चिपके एक रंगीन चिपचिपा नोट को विकिरणित करने के बाद स्पॉट आकार मापा जाता है। स्पॉट की चौड़ाई का उपयोग नमूना प्रवाह दर की गणना के लिए किया जाता है, और स्थान के केंद्र में केशिका के सिल्हूट का उपयोग ऑप्टिकल बेंच को संरेखित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. फ्यूज्ड सिलिका केशिका (360 माइक्रोन बाहरी व्यास और 100 माइक्रोन आंतरिक व्यास) की उचित लंबाई काटें और आस्तीन का उपयोग करके, कम मृत मात्रा कनेक्टर का उपयोग करके गैस-तंग सिरिंज से कनेक्ट करें।
  2. धीरे-धीरे उस स्थान पर ब्यूटेन टॉर्च के साथ केशिका की पॉलीमाइड कोटिंग जलाएं जहां इनलाइन डॉसिमेटर नमूनों के लेजर एक्सपोजर के बाद 265 एनएम पर अवशोषण संकेत पढ़ता है। एक लिंट-फ्री पोंछ पर मेथनॉल का उपयोग करके धीरे-धीरे केशिका पर मलबे को मिटा दें। लेजर घटना की साइट पर पॉलीमाइड कोटिंग या तो इसी तरह ब्यूटेन मशाल के साथ बंद जला दिया जा सकता है या कम शक्ति पर एक्सिमर लेजर फायरिंग के साथ बंद जला दिया ।
    नोट: केशिका को ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें क्योंकि गर्म केशिका पर मेथनॉल का उपयोग करना एक आग का खतरा है।
  3. लेजर के बीम पथ के माध्यम से और इनलाइन डॉसिमेटर में इस केशिका रखें।
    1. काज खोलने के लिए लीवर को इनलाइन डॉसिमेटर के ऊपर दबाएं। चुंबकीय धारकों को हटा दें। केशिका को इनलाइन डॉसिमेटर के मशीनी नाली में रखें, चुंबकीय धारकों का उपयोग करके केशिका को जगह में रखें। डोसिमेटर को केशिका पर टिका बंद करें, इसे तब तक दबाएं जब तक कि लीवर जगह में ताले न हो जाए।
  4. डॉसिमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, एक्सिमर लेजर को फायरिंग शुरू करने के लिए स्टार्ट फ्लैश बटन पर क्लिक करें। लेजर कंट्रोल सॉफ्टवेयर पर ही 50-100 मेगा/पल्स के बीच प्रीसेट लेजर पावर सेट करें और डोसिमेट्री सॉफ्टवेयर के सेटिंग्स टैब में 10-20 हर्ट्ज के बीच प्रीसेट पुनरावृत्ति दर सेट करें ।
    1. एक रैखिक मोटराइज्ड स्टेज पर घुड़सवार प्लानो उत्तल लेंस का उपयोग करके लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करें। चित्रा 3बीमें दिखाए गए घटना प्रवाह (एमजे/एमएम2)की गणना करने के लिए कैलिपर का उपयोग करके एक चिपचिपा नोट पर केशिका की स्थिति पर लेजर स्पॉट की चौड़ाई और ऊंचाई को मापें।
  5. लेंस के मूवमेंट या लेजर18की प्रति नाड़ी ऊर्जा को बदलने के कारण बीम के आकार में परिवर्तन की परवाह किए बिना केशिका की लगातार प्रबुद्ध चौड़ाई सुनिश्चित करने के लिए केशिका के पास एक अपारदर्शी एपर्चर रखें ।
    1. लेजर फायरिंग के साथ, गति की अपनी सीमा के माध्यम से मोटर चालित चरण ले जाएँ। सुनिश्चित करें कि बीम एपर्चर पर केंद्रित रहता है और केशिका के सिल्हूट को पूरे देखा जा सकता है। एपर्चर का व्यास मोटर चालित चरण की सीमा में हर बिंदु पर इम्पिंग केंद्रित बीम की चौड़ाई से छोटा होना चाहिए।
  6. केशिका को धोने के लिए कम से कम एक मिनट के लिए 20 माइक्रोन/मिनट पर केशिका के माध्यम से पानी चलाएं।
    1. डोसिमेटर को पानी में शून्य करने और डेटा संग्रह शुरू करने के लिए डोसिमेटर सॉफ्टवेयर पर स्टार्ट डेटा + ऑटोजीरो बटन पर क्लिक करें।
      नोट: यदि एफओपी के लिए बफर सिस्टम में 265 एनएम पर महत्वपूर्ण यूवी अवशोषण है, तो एफओपी प्रणाली को बफर पर चुना जाना चाहिए, पानी नहीं।
  7. सिरिंज पंप पर गणना प्रवाह दर निर्धारित करें।
    1. प्रोटीन नमूने की प्रवाह दर प्रति शॉट विकिरणित मात्रा,(वीआईआरआर),प्रति सेकंड लेजर शॉट्स की संख्या(आर)और वांछित यूनिरिडिएटेड अपवर्जन वॉल्यूम अंश(एफएक्स)पर निर्भर करती है ताकि लेमिनार प्रवाह प्रभाव और नमूना प्रसार (0.15-0.30 अनुशंसित)2, 19,,20के लिए सही किया जा सके ।19 मिमी(डी)में केशिका के आंतरिक व्यास और लेजर स्पॉट की चौड़ाई के आधार पर वीआईआरआर (μL में) की गणना करें जो निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके मिमी(डब्ल्यू)में केशिका (यानी, एपर्चर की चौड़ाई) पर अतिक्रमण करता है:
      वीIrr = π (d/2)2w
    2. निम्नलिखित समीकरण के आधार पर वांछित प्रवाह दर (μL/मिनट में) की गणना करें:
      फ्लो = 60आर[वीआईआरआर (1 + एफपूर्व)]

2. FPOP के लिए प्रोटीन समाधान की तैयारी

  1. संरचना परिवर्तनों का पता लगाने के लिए तुलना की जाने वाली दो या अधिक विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन तैयार करें (उदाहरण के लिए, लिगांड-बाउंड और लिगांड-फ्री; कुल और मोनोमर; अकेले और प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी साथी के साथ; आदि) ।
  2. प्रयोग की जरूरतों को पूरा करने के लिए एफपीओपी के लिए उपयोग की जाने वाली कुल मात्रा निर्धारित करें। न्यूनतम सीमा आमतौर पर विकिरण केशिका की मात्रा और मजबूत पता लगाने और सापेक्ष मात्राकरण के लिए आवश्यक सामग्री पर निर्भर करती है, और मोटे तौर पर एलसी-एमएस/एमएस प्रणाली का उपयोग किया गया और पोस्ट-लेबलिंग नमूना प्रसंस्करण विधि पर निर्भर करेगा। हमारे समूह में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एफओपी समाधानों के लिए कुल मात्रा हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा 20 माइक्रोन है। प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता आमतौर पर 1-10 माइक्रोन है, जिसमें 17 एमएम ग्लूटामाइन (हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी के जीवनकाल को सीमित करने के लिए), 1 एमएमए एडेनाइन (एक कट्टरपंथी डोसिमेटर के रूप में कार्य करने के लिए)13,,17 और 10 m फॉस्फेट बफर (एक बफर जो हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों का एक गरीब सफाई कर्ता है)। नमूने आम तौर पर परिणामों के सांख्यिकीय मॉडलिंग के लिए अनुमति देने के लिए कई प्रतिकृति के साथ तैयार किए जाते हैं।
    1. अधिकांश सामान्य उद्देश्यों के लिए, दोनों राज्यों में ट्रिपलीकेट में नमूने तैयार करें, साथ ही पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण को मापने के लिए नो-लेजर नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए कम से कम एक नमूना। इस FPOP समाधान मिश्रण के 18 μL तैयार करें।
      नोट: बायोकेमिस्ट्री में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कई बफ़र्स और एडिटिव्स हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई कर्मी हैं। इन योजक और बफ़र्स का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, बफर के हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई के कारण ऑक्सीकरण में कटौती हो सकती है। सामान्य तौर पर, प्रोटीन ऑक्सीकरण उपज को अधिकतम करने के लिए जैविक प्रणाली द्वारा आवश्यक न्यूनतम सभी एडिटिव्स को रखें। माध्यमिक कण उत्पन्न करने की प्रवृत्ति के कारण डिमेथिल सल्फोक्साइड से बचा जाना चाहिए; डाइमेथाइलफॉर्मेमाइड हमारे हाथों में एक उपयोगी विकल्प रहा है। मजबूत हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई कर्मियों वाले बफ़र्स का उपयोग करते समय, ग्लूटामाइन को अक्सर एफओपी समाधान मिश्रण से बाहर रखा जा सकता है।
  3. एफओपी प्रयोग से तुरंत पहले 1 मीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड तैयार करें।
    नोट: विक्रेताओं द्वारा आमतौर पर बेचे जाने वाले 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में एक स्टेबलाइजर शामिल है, जो शेल्फ जीवन को बढ़ाता है। एक बार पतला होने के बाद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग जल्दी से किया जाना चाहिए, निश्चित रूप से उसी दिन के भीतर। हाइड्रोजन पेरोक्साइड को हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोसिमेटर का उपयोग करके एफपीओपी द्वारा अपघटन के लिए नियमित रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।
  4. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसमें 0.5 माइक्रोन/मेथिनिन अमीड के 0.5 माइक्रोन घोल और 0.5 माइक्रोन/माइक्रोल कैटालेस के 25 माइक्रोन घोल होते हैं। यदि एफओपी के लिए 20 माइक्रोन से अधिक नमूना मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो आनुपातिक रूप से शमन समाधान मात्रा बढ़ाएं।

3. FPOP प्रयोग करें

  1. एफओपी समाधान मिश्रण के 18 माइक्रोन में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 2 माइक्रोल जोड़ें। सामग्री को धीरे-धीरे एक पिपेट के साथ मिलाएं और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के नीचे समाधान को जल्दी से स्पिन करें। तुरंत एक गैसटाइट सिरिंज के साथ इकट्ठा करें और सिरिंज पंप में लोड करें।
  2. डोसिमेटर सॉफ्टवेयर पर स्टार्ट पंप बटन पर क्लिक करके चरण 1.8.1 (आमतौर पर 8-16 μL/min के बीच) में निर्धारित प्रवाह दर के साथ सिरिंज पंप पर प्रवाह शुरू करें।
  3. इनलाइन डोसिमेटर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके वास्तविक समय एडेनिन पढ़ने की निगरानी करें और कचरे में नमूना एकत्र करें। एबीएस265 सिग्नल को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  4. पूर्व निर्धारित पुनरावृत्ति दर और ऊर्जा पर लेजर फायरिंग शुरू करने के लिए dosimeter सॉफ्टवेयर में स्टार्ट फ्लैश बटन पर क्लिक करें।
  5. इनलाइन डोसिमेटर का उपयोग करके वास्तविक समय एडेनिन पढ़ने की निगरानी करें (सामग्री की तालिकादेखें); लेजर बंद और लेजर के साथ Abs265 में अंतर 175 पढ़ने है।265
    नोट: हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में लेजर फायरिंग पर अत्यधिक अस्थिर Abs265 रीडिंग की उपस्थिति समाधान में बुलबुले की पीढ़ी के कारण है। बुलबुले को खत्म करने के लिए लेजर और/या हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एकाग्रता के प्रवाह को कम करें ।

4. मुआवजा प्रदर्शन

नोट: विभिन्न लिगामेंट्स, बफ़र्स आदि में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की ओर अलग-अलग सफाई क्षमता हो सकती है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न नमूनों में प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए तुलनीय प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक उपलब्ध हैं। यह नमूनों के बीच समान हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसिमेटर प्रतिक्रिया सुनिश्चित करके पूरा किया जाता है। एडेनिन डोसिमेट्री का उपयोग करके, 265 एनएम (एएब्स265)पर यूवी अवशोषण में परिवर्तन प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक को दर्शाता है; 265जितना बड़ा होगा, प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक जितनी अधिक होगी।

  1. पूर्व प्रयोगों या नियंत्रणों द्वारा प्राप्त वांछित265 पठन के साथ इनलाइन डॉसिमेटर के साथ प्राप्त एएब्स265 रीडिंग की तुलना करें। वांछित पढ़ने की तुलना में कम पढ़ने वाले एक एएब्स265 हाइड्रोक्सिल कणों की अपर्याप्त प्रभावी खुराक को इंगित करता है; एक ΤAbs265 पढ़ने एक प्रभावी कट्टरपंथी खुराक है कि बहुत अधिक है इंगित करता है। यदि एएब्स265 रीडिंग वांछित स्तर पर है, तो क्वेंच बफर17में लेजर विकिरण के तुरंत बाद नमूना एकत्र करें।
  2. प्रभावी कट्टरपंथी खुराक की भरपाई करने के लिए1015बराबर . यह मुआवजा तीन तरीकों से किया जा सकता है: हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता को बदलें, प्रति पल्स लेजर ऊर्जा को बदलकर लेजर फ्लूसेंस बढ़ाएं, या फोकसिंग लेंस के फोकल प्लेन को बदलकर लेजर फ्लूसेंस बढ़ाएं।
    1. 265 रीडिंग में बड़ा बदलाव (>10 mAU) बनाने के लिए, नमूने को कम या ज्यादा हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ रीमेक करें और धारा 3 के अनुसार नमूना फिर से चलाएं।
    2. वास्तविक समय में265 पढ़ने में एक छोटा सा परिवर्तन करने के लिए, 50 मिमी मोटर चालित चरण का उपयोग कर फोकसिंग लेंस की स्थिति को समायोजित करके घटना बीम के फोकल प्लेन को समायोजित करें। फोकल प्लेन को केशिका की स्थिति के करीब लाने से265 पठन-पाठन में वृद्धि होगी; फोकल प्लेन को केशिका की स्थिति से आगे लाने से265 रीडिंग कम हो जाएगी।
  3. लेजर विकिरण13के बाद नमूने में मौजूद हाइड्रोक्सिल रेडिकल की प्रभावी मात्रा को मापने के लिए एडेनिन एएब्स265 की निगरानी करें। एक इनलाइन यूवी केशिका डिटेक्टर के साथ वास्तविक समय की निगरानी वास्तविक समय मुआवजे के लिए अनुमति देता है जैसा कि 4.2.2 में वर्णित है; मोटराइज्ड स्टेज का उपयोग करके लेंस की स्थिति को समायोजित करें जब तक कि एएब्स265 पढ़ना वांछित पढ़ने के बराबर न हो जाए। यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ प्रयोगात्मक अवशोषण के बाद के माप भी सटीक हैं, लेकिन प्रत्येक प्रभावी कट्टरपंथी खुराक के लिए नए नमूनों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

5. प्रोटीन के नमूनों को पचाें

नोट: ट्रिप्सिन का उपयोग आमतौर पर एफओपी के लिए प्रोटीन नमूनों को पचाने के लिए किया जाता है, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्रोटीज़ है। यह एक विश्वसनीय प्रोटीज़ है जो एन-और सी-टर्मिनस दोनों में बुनियादी साइटों के साथ पेप्टाइड उत्पन्न करता है, जो एमएस में गुणा चार्ज पेप्टाइड आयनों को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, यह लिसिन और आर्जिनिन के बाद क्लीव्स, दो अमीनो एसिड जो हाइड्रोक्सिल कणों के लिए केवल मामूली प्रतिक्रियाशील हैं; इसलिए, एनालिट ऑक्सीकरण के कारण पाचन पैटर्न में परिवर्तन दुर्लभ है। अन्य प्रोटीज का सफलतापूर्वक FPOP21के साथ उपयोग किया गया है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि पाचन पैटर्न अरोक्सिडाइज्ड और ऑक्सीकृत नमूनों के बीच तुलनीय हैं।

  1. शमन FPOP नमूने की अंतिम मात्रा को मापें। 50 m Tris, 1 m CaCl 2 और 5 mM DTT के अंतिम एकाग्रता के लिए शमन के बाद प्रोटीन समाधान के लिए प्रोटीन समाधान के लिए 50 mM CaCl2 के साथ 500 mM Tris, पीएच8.0 जोड़ें।
  2. प्रोटीन के नमूने को 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  3. तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना ठंडा।
  4. नमूनों में 1:20 ट्राइपसिन/प्रोटीन वजन अनुपात जोड़ें ।
  5. प्रोटीन को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिक्सिंग के साथ पचा लें।
  6. 0.1% फोर्मिक एसिड के अलावा और/
  7. नमूनों में 2 एमएम डीटीटी जोड़ें और एलसी-एमएस/एमएस से पहले तुरंत 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें।
    नोट: जबकि अन्य समूहों ने FPOP प्रयोगों में थिओलों के एल्किलेशन की सूचना दी है, हमारे हाथों में हमने ऑक्सीडाइज्ड प्रोटीन के एल्किलेशन पर साइड उत्पादों को नोट किया है (संभवतः एक मामूली ऑक्सीकरण उत्पाद के रूप में गठित न्यूक्लियोफिलिक कार्बोनाइल के साथ प्रतिक्रिया के कारण)। इसलिए, हम संभव होने पर थिओल्स के एल्किलेशन से बचने के लिए चुनते हैं।

6. तरल क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) करें

  1. मोबाइल चरण एक में 0.1% फोर्मिक एसिड और मोबाइल चरण बी युक्त पानी तैयार करें जिसमें 0.1% फोर्मिक एसिड के साथ एसीटोनिट्रील शामिल है।
  2. नमूना पहले C18 ट्रैप कॉलम (300 माइक्रोम आईएम 5 एमएम 100 Å पोर आकार, 5 माइक्रोन कण आकार) पर लोड करें कारतूस को ट्रैप करना और लवण और हाइड्रोफिलिक छोटे अणुओं को हटाने के लिए 5.0 माइक्रोन/मिन की प्रवाह दर पर 3 मिनट के लिए 2% विलायक बी के साथ धोएं।
  3. फिर C18 नैनोकोलम (0.75 मिमी x 150 मिमी, 2 माइक्रोन कण आकार, 100 Å pore आकार) पर पेप्टाइड्स को 300 nL/मिनट की प्रवाह दर पर अलग करें। ढाल 22 मिनट से अधिक 2 से ३५% विलायक बी से एक रैखिक वृद्धि के होते हैं, 5 मिनट से अधिक ९५% विलायक बी के लिए ramped और कॉलम धोने के लिए 3 मिनट के लिए आयोजित किया, और फिर 3 मिनट से अधिक 2% बी को लौट आए और 9 मिनट के लिए आयोजित करने के लिए फिर से कॉलम समतुल्य ।
    नोट: यह ढाल सबसे एक के एलसी-एमएस/एमएस के लिए पर्याप्त है-और दो प्रोटीन FPOP मिश्रण पेप्टाइड स्तर मात्राकरण करने की मांग । विलायक बी के प्रतिशत को दुर्लभ मामलों में पेप्टाइड संकल्प को बढ़ाने के लिए बदलने की आवश्यकता हो सकती है जहां पेप्टाइड्स समान प्रतिधारण समय और एम/जेड मूल्यों के कारण एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप करते हैं । प्रोटेम-स्केलएफओपी 22 या पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पाद आइसोमर्स,1,23, 24,,,25को लंबे समय तक एलसी ग्रेडिएंट की आवश्यकता हो सकती है और इस रिपोर्ट के दायरे से बाहर हैं।25
  4. एक प्रवाहकीय नैनोस्प्रे उत्सर्जक का उपयोग करके पेप्टाइड्स को सीधे उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के नैनोस्प्रे स्रोत में एल्यूट करें।
  5. सकारात्मक आयन मोड में डेटा प्राप्त करें। स्प्रे वोल्टेज को 2400 वी तक सेट करें, और आयन ट्रांसफर ट्यूब का तापमान 300 डिग्री सेल्सियस तक।
  6. 60,000 के एम/जेड 200 में एक नाममात्र के संकल्प पर एम/जेड 250 से 2000 तक पूर्ण एमएस स्कैन प्राप्त करें और इसके बाद आठ बाद के डेटा-निर्भर रैखिक आयन ट्रैप एमएस/एमएस स्कैन शीर्ष आठ सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड आयनों का उपयोग करके पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए 35% सामान्यीकृत ऊर्जा पर प्रेरित वियोजन। 30 एस के भीतर पांच बार पेप्टाइड्स को खंडित करें और फिर 60 एस के लिए एक अपवर्जन सूची में स्थानांतरित करें।

7. पेप्टाइड्स के औसत ऑक्सीकरण की डेटा प्रोसेसिंग और गणना

  1. एमएस/एमएस प्रोटेओमिक्स सर्च इंजन का उपयोग करके प्रोटीन, एम/जेड मूल्यों और अनऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स के प्रतिधारण समय के अनुक्रम कवरेज का निर्धारण करें ।
  2. 10 पीपीएम के लिए अग्रदूत जन सहिष्णुता सेट करें और मानक ट्राइप्सिन दरार विशिष्टता का उपयोग करके ट्राइपसिन पचाने वाले नमूनों के लिए दो छूटे हुए क्लीवेज साइटों को अनुमति दें।
  3. पेप्टाइड मास टुकड़ा मास सहिष्णुता 0.4 डाल्टन के लिए सेट करें।
  4. पता नहीं लगाया असंशोधित पेप्टाइड्स के,एम / जेड अनुपात और प्रमुख ऑक्सीकरण उत्पादों के ज्ञात द्रव्यमान बदलावों के आधार पर, प्रत्येक पेप्टाइड 4 , 26 ,,,27,28, 29के विभिन्न सैद्धांतिक ऑक्सीकरण उत्पादों के एम / जेड की गणना करें ।4,2829
  5. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक रन(चित्रा 4)को देखने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इन m/z मूल्यों के निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम की पहचान करें। पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पादों की पहचान उनके एम/जेड,उनके प्रभारी राज्य के आधार पर, और असंशोधित पेप्टाइड के लिए समय को पूरा करने में समानता । हमारे हाथों में, पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पाद ऊपर एलसी ढाल का उपयोग करके असंशोधित पेप्टाइड के बाद 240 सेकंड से पहले 180 सेकंड तक विस्तारित होते हैं। चूंकि ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप अक्सर कई आइसोमेट्रिक ऑक्सीकरण उत्पाद होंगे, इसलिए पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पादों के निकाले गए आयन क्रोमेकोग्राम में कई आंशिक रूप से हल की गई चोटियों का निरीक्षण करना आम है, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम में चोटी (ओं) के क्षेत्र के आधार पर पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पादों की मात्रा निर्धारित की जाती है।

Figure 4
चित्रा 4: FPOP के बाद पेप्टाइड और उसके ऑक्सीकरण उत्पादों के निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम। पेप्टाइड ऑक्सीकरण उत्पादों के एम/जेड की गणना अनऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड और ज्ञात ऑक्सीकरण उत्पादों के एम/जेड के आधार पर की जाती है; और इन पेप्टाइड उत्पादों के क्षेत्र निर्धारित किए जाते हैं। पेप्टाइड उत्पादों के क्षेत्र का उपयोग पेप्टाइड प्रति औसत ऑक्सीकरण घटनाओं की गणना के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर पेप्टाइड्स के औसत ऑक्सीकरण की गणना करें।

Equation 1

जहां पी पेप्टाइड अणु प्रति ऑक्सीकरण घटनाओं की औसत संख्या को दर्शाता है, और मैं अनऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड(Iunoxidized)और एन ऑक्सीकरण घटनाओं के साथ पेप्टाइड के शिखर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । ध्यान दें कि मैं (अकेले ऑक्सीकरण) में न केवल एक ऑक्सीजन परमाणु के अतिरिक्त बल्कि अन्य कम-आम एकल ऑक्सीकरण घटनाओं को भी शामिल किया जाएगा जिन्हें जांचकर्ता मापने के लिए चुन सकते हैं (उदाहरण के लिए, ऑक्सीडेटिव डिकार्बोक्सिलेशन, कार्बोनिल फॉर्मेशन, आदि) 4,26,27,28,29.

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Representative Results

फॉस्फेट बफर में अडालिमुमाब बायोसमान के भारी चेन पेप्टाइड पदचिह्न की तुलना और जब 1 एच के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म दिलचस्प परिणाम दिखाते हैं। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग पेप्टाइड्स की पहचान के लिए किया जाता है जो इन दो स्थितियों (पी ≤ 0.05) में काफी बदल जाते हैं। पेप्टाइड्स 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413, और 414-420 सॉल्वेंट से महत्वपूर्ण सुरक्षा दिखाते हैं जब प्रोटीन को समग्र रूप में गर्म किया जाता है(चित्रा 5)30। इस प्रयोग ने पेप्टाइड क्षेत्रों की पहचान की जो हीटिंग और एकत्रीकरण पर स्थलाकृतिक परिवर्तनों का अनुभव करते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: अदलीमुम्ब की भारी श्रृंखला का पेप्टाइड स्तर पदचिह्न। कमरे के तापमान पर adalimumab (नीला) के पेप्टाइड औसत ऑक्सीकरण, और (नारंगी) के बाद adalimumab 1 घंटे के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाता है, तो कमरे के तापमान को ठंडा । त्रुटि सलाखों ट्रिपलिकेट माप के एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। तारांकन पेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करता है जो दो स्थितियों(पी ≤ 0.05) में काफी बदल जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मायोग्लोबिन का एफओपी प्रयोग 10 एमएम फॉस्फेट और 10 एमएम 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेलसुल्फोनिक एसिड (एमईएस) बफर की उपस्थिति में किया गया था। एमईएस बफर लेजर विकिरण के संपर्क में आने के बाद हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस पर उत्पन्न हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के एक अच्छे मेहतर के रूप में कार्य करता है। एडेनिन के अवशोषण में अंतर वास्तविक समय में एक इनलाइन डॉसिमेटर का उपयोग करके निगरानी की जाती है। लेजर फ्लूंस को फॉस्फेट बफर(चित्रा 6)17की तुलना में एमईएस बफर में एडेनिन अवशोषण स्तर में तुलनीय परिवर्तन करने के लिए एक तरह से समायोजित किया जाता है । फॉस्फेट बफर की तुलना में एमईएस बफर की उपस्थिति में पेप्टाइड्स का औसत ऑक्सीकरण कम था। हालांकि, लेजर फ्लूसेंस को समान एडेनिन डोसिमेट्री प्रतिक्रिया के लिए बढ़ाया गया था, एमईएस बफर और फॉस्फेट बफर(चित्रा 7)17में एफओपी के बाद औसत पेप्टाइड ऑक्सीकरण मूल्य काफी अलग नहीं थे। यह प्रयोग संकेत के मुआवजे के महत्व को दर्शाता है ताकि पदचिह्न की तुलना दो एफओपी स्थितियों के साथ की जा सके जिनमें अलग-अलग सफाई क्षमता है। इसी तरह के प्रयोगों ने30की तैयारी में आम एक्सपिएजेंट्स के संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच करने के लिए एडेनिन आधारित मुआवजे का सफलतापूर्वक उपयोग किया है ।

Figure 6
चित्रा 6: एडेनिन डोसिमेट्री रीडिंग का मुआवजा। लेजर विकिरण से पहले और बाद में एडीन पढ़ने को इनलाइन डोसिमेटर का उपयोग करने के साथ 265 एनएम पर फॉस्फेट बफर में एफओपी के लिए दर्ज किया गया था। चूंकि एमईएस हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का एक अच्छा मेहतर है, इसलिए एडेनिन रीडिंग में अंतर कम था। एमईएस बफर के साथ FPOP समाधान के लेजर प्रवाह में वृद्धि हुई "क्षतिपूर्ति" और एमईएस बफर के प्रभाव को दूर करने के लिए फॉस्फेट बफर के रूप में इसी तरह के एडीन पढ़ने है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: इनलाइन एडेनिन डोसिमेट्री द्वारा मायोग्लोबिन ऑक्सीकरण का वास्तविक समय मुआवजा। Myoglobin में ऑक्सीकरण (नीला) 10 mm फॉस्फेट बफर और (नारंगी) 10 mM एमईएस बफर (नारंगी) । जैसा कि उल्लेख किया गया है, एमईएस बफर में पेप्टाइड्स का ऑक्सीकरण कम है। चूंकि एमईएस बफर में नमूनों के लिए लेजर फ्लूसेंस बढ़ जाता है, फॉस्फेट बफर (ग्रे) की तुलना में लगभग समान एडेनिन डोसिमेट्री स्तर होता है, पेप्टाइड स्तर ऑक्सीकरण भी फॉस्फेट बफर के साथ नमूनों में देखे गए ऑक्सीकरण स्तर के समान होता है। यह आंकड़ा एनालिटिकल केमिस्ट्री 2018, 90, 21, 12625-12630 से अनुमति लेकर अनुकूलित किया गया है। कॉपीराइट 2018 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक तकनीकों, जिसमें हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज, रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग, सहसंयोजक लेबलिंग, और देशी स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आयन गतिशीलता शामिल हैं, उनके लचीलेपन, संवेदनशीलता और जटिल मिश्रण को संभालने की क्षमता के कारण लोकप्रियता में तेजी से वृद्धि हो रही है। FPOP कई फायदे समेटे हुए है कि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक तकनीकों के क्षेत्र में अपनी लोकप्रियता को बढ़ावा दिया है । अधिकांश सहसंयोजक लेबलिंग रणनीतियों की तरह, यह प्रोटीन स्थलाकृति का एक स्थिर रासायनिक स्नैपशॉट प्रदान करता है जो अधिकांश पोस्ट-लेबलिंग प्रक्रियाओं (जैसे, ट्राइप्सिन पाचन, deglycosylation, आदि) के साथ संगत है, बैक-एक्सचेंज के मुद्दों से बचते हुए और हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज में बाधा डालने वाले पांव मारते हैं। हालांकि, पारंपरिक सहसंयोजक लेबलिंग प्रौद्योगिकियों के विपरीत जो विशिष्ट अमीनो एसिड को लक्षित करते हैं, एफओपी एक ही प्रयोग में अमीनो एसिड की एक विस्तृत सरणी को लेबल करने में सक्षम है। इसके अलावा, एफओपी प्राथमिक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी-प्रोटीन प्रतिक्रिया को तेजी से पूरा करने में सक्षम है, जबकि प्रोटीन देशी संरचना14के रासायनिक स्नैपशॉट को फ्रीज करने में सक्षम हैं, हालांकि कुछ माध्यमिक प्रतिक्रियाएं धीमी टाइमस्केल20,31, 32,32पर हो सकती हैं।, एक्स-रे सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन का उपयोग करके हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में पहले के प्रयोगों के विपरीत, एफओपी इस अल्ट्रा-रैपिड लेबलिंग को बेंचटॉप प्रारूप33,,34में अनुमति देता है। विशिष्ट प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री लैब द्वारा सामना की जाने वाली एफओपी में प्रमुख बाधाएं एफओपी, लेजर-आधारित ऑक्सीकरण और डेटा विश्लेषण के लिए नमूनों को संभालने में अनुभव है। इस रिपोर्ट का लक्ष्य नए जांचकर्ताओं को मूल्यवान और प्रजनन योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए इन बाधाओं को दूर करने में मदद करना है ।

प्रोटीन पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण से गुजर सकता है जो गलत तरीके से पहचाने गए पेप्टाइड्स पर ऑक्सीकरण की सीमा प्रदान कर सकता है। इसे बेहतर ढंग से समझने के लिए, एफओपी नमूनों के साथ प्रतिकृति में एक नियंत्रण नमूना तैयार किया जाता है जिसमें लेजर को छोड़कर सभी चरण किए जाते हैं (चरण 3.4)। नो-लेजर कंट्रोल में ऑक्सीकरण का स्तर बैकग्राउंड ऑक्सीकरण के स्तर का पता चलता है। पेप्टाइड्स का इन-सोर्स ऑक्सीकरण मनाया पेप्टाइड ऑक्सीकरण की दिशा में योगदान कर सकता है, और असंशोधित पेप्टाइड और संशोधन उत्पाद के एलसी एल्यूशन प्रोफाइल द्वारा आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। यदि एल्यूशन प्रोफाइल समान रूप से ओवरलैप होता है, तो ऑक्सीकरण उत्पाद लगभग निश्चित रूप से पोस्ट-कॉलम इन-सोर्स ऑक्सीकरण के कारण होता है। इन-सोर्स ऑक्सीकरण आमतौर पर आयनीकरण वोल्टेज को कम करके और/या उत्सर्जक और आयन हस्तांतरण ट्यूब के बीच की दूरी को बढ़ाकर कम किया जा सकता है । अन्य पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण या तो FPOP उपचार से पहले प्रोटीन में मौजूद हो सकता है, या यह हाइड्रोजन पेरोक्साइड के संपर्क में आने से प्रेरित किया जा सकता है। बाद हाइड्रोजन पेरोक्साइड का इस्तेमाल किया की एकाग्रता कम से कम किया जा सकता है और/या समय प्रोटीन शमन से पहले हाइड्रोजन पेरोक्साइड में है कम ।

पहली बार FPOP का प्रयास करने वाले प्रयोगकर्ताओं द्वारा अक्सर सामना की जाने वाली एक प्रमुख समस्या उच्च पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण है। यह उच्च पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण आमतौर पर विश्लेषण से पहले नमूने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा के कारण होता है। जबकि हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा दो इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण हाइड्रोक्सिल कणों द्वारा एक इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण की तुलना में बहुत धीमा है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड अभी भी आसानी से मिनटों के टाइमस्केल पर कुछ अमीनो एसिड (सबसे विशेष रूप से मेथियोनाइन और सिस्टीन) को ऑक्सीकरण करने में सक्षम है। जबकि एफओपी मिश्रण में अन्य घटक बहुत अधिक स्थिर हैं, हाइड्रोजन पेरोक्साइड को एफओपी द्वारा ऑक्सीकरण से पहले सीधे जोड़ा जाना चाहिए। अंगूठे के नियम के रूप में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा और क्वेंच समाधान में नमूने के पूर्ण जमाव के बीच का समय पांच मिनट के नीचे रखा जाना चाहिए। यह हमेशा एक नहीं लेजर नियंत्रण इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है (जहां प्रोटीन FPOP के लिए सामांय रूप में संभाला है, लेकिन लेजर निकाल नहीं है) नमूना ऑक्सीकरण के साथ किसी भी समस्याओं का पता लगाने के लिए, या तो लंबे समय तक पेरोक्साइड जोखिम के कारण या प्रोटीन शुद्धिकरण और भंडारण के कारण । उन मामलों के लिए जहां प्रोटीन विशेष रूप से हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रति संवेदनशील है, एक्सिमर लेजर के साथ विकिरण से पहले हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ ऑन-लाइन मिश्रण सेकंड या उससे कम31,,35के संपर्क को सीमित कर सकता है। हालांकि, ज्यादातर प्रोटीन के लिए, ऑनलाइन मिश्रण अनावश्यक है।

कई नौसिखिए एफओपी प्रयोगकर्ताओं के लिए अगली कठिन बाधा ऑप्टिकल पथ का सेटअप है। यह महत्वपूर्ण है कि लेजर हाइड्रोजन पेरोक्साइड की अच्छी फोटोलिसिस प्राप्त करने के लिए केशिका पर पूरी तरह से अतिक्रमण करता है। जबकि यूवी लेजर प्रकाश अदृश्य है, यह रंगीन कागज में मौजूद कई रंगों को दृश्यमान रेंज में फ्लोरोरेस करने के लिए पैदा करेगा। इसलिए, बैकस्टॉप पर रंगीन निर्माण कागज के एक टुकड़े का उपयोग करने से लेंस और केशिका के संरेखण में मदद मिल सकती है। कागज का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि लेजर ध्यान केंद्रित लेंस के केंद्र पर हड़ताली है, और फिर लेजर बैकस्टॉप पर रंगीन कागज का एक टुकड़ा यह बताने में मदद कर सकता है कि कब केशिका ध्यान केंद्रित बीम के केंद्र में सफलतापूर्वक तैनात है, क्योंकि केशिका का विवर्तन बीम प्रोफाइल(चित्रा 3 बी)में सिल्हूट का कारण बनेगा।

यह भी अक्सर नौसिखिया जांचकर्ताओं द्वारा सराहना नहीं की है कि बीम पार अनुभागीय क्षेत्र पल्स ऊर्जा के आधार पर बदलता है । इसलिए, यदि कोई अन्वेषक 100 एमजे/पल्स की लेजर ऊर्जा के आधार पर सिरिंज पंप प्रवाह दर की गणना करता है, और फिर लेजर ऊर्जा को 120 mJ/पल्स तक बढ़ाता है, तो लेजर बीम की चौड़ाई इसी तरह बढ़ जाएगी जिससे गणना गलत होगी। इस समस्या को रोकने के लिए, अपारदर्शी एपर्चर के उपयोग की सिफारिश की जाती है। वाणिज्यिक excimer पराबैंगनीकिरण के लिए हम के साथ काम किया है, जब नाड़ी प्रति लेजर ऊर्जा बढ़ जाती है सबसे बड़ा परिवर्तन बीम के पार अनुभाग में है, नहीं लेजर प्रवाह । चूंकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों की एकाग्रता घटना यूवी प्रकाश के प्रवाह पर भाग में आधारित है, केवल प्रति पल्स लेजर ऊर्जा को बदलना अक्सर प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक बढ़ाने में अक्षम होता है।

प्रजनन नौसिखिए जांचकर्ताओं को दूर करने के लिए एक और आम बाधा है । सबसे अधिक, प्रजनन क्षमता की कमी विभिन्न प्रतिकृति में समकक्ष हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक उत्पन्न करने में विफलता के कारण होती है। यह अनुचित ऑप्टिकल बेंच संरेखण, हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई एजेंटों के विभिन्न स्तरों के अनजाने उपयोग, या वृद्ध हाइड्रोजन पेरोक्साइड के उपयोग के कारण हो सकता है। सभी मामलों के लिए, एक आंतरिक डोसिमेटर का उपयोग प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक के साथ समस्याओं की तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है। हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी कणों के पूल के लिए एनालिट (और समाधान में सभी सफाई कर्मियों के साथ) के साथ प्रतिस्पर्धा करके हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसिमेटर कार्य करते हैं; हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की प्रभावी खुराक को डोसिमीटर के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापकर मापा जाता है। ध्यान दें कि "प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक" हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पन्न की प्रारंभिक एकाग्रता और कट्टरपंथी के आधे जीवन दोनों का एक कार्य है। ये दोनों पैरामीटर आंशिक रूप से एक-दूसरे पर निर्भर हैं, जिससे सैद्धांतिक गतिज मॉडलिंग कुछ जटिल(चित्रा 2)हो जाती है । दो नमूनों बेतहाशा अलग प्रारंभिक कट्टरपंथी आधा जीवन हो सकता है, जबकि अभी भी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी का गठन की प्रारंभिक एकाग्रता को बदलने के द्वारा एक ही प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बनाए रखने; वे अभी भी समान पैरों के निशानउत्पन्न करेंगे 17. एडेनिन13 और ट्राइस12 सुविधाजनक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसीमीटर हैं क्योंकि ऑक्सीकरण के उनके स्तर को वास्तविक समय में यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक के साथ समस्या होने पर जल्दी से पहचानने और उनकी समस्या का निवारण करने की अनुमति मिलती है।

डेटा विश्लेषण किसी भी FPOP प्रयोग का सबसे अधिक समय-गहन हिस्सा बना हुआ है। जबकि ऑक्सीकरण उत्पादों की मात्रा निर्धारित करने के लिए वाणिज्यिक पैकेजों का उपयोग करके रिपोर्ट मौजूद है, इन मात्राकरण एल्गोरिदम को आंशिक रूप से हल किए गए, ऑक्सीकरण आइसोमर्स21के समूहों से उत्पन्न विषम चोटियों में पीक क्षेत्रों को ठीक से परिभाषित करने में कठिनाइयां होती हैं। हमारे हाथों में, जबकि वर्तमान उपलब्ध स्वचालित सॉफ्टवेयर पैकेज आमतौर पर ऑक्सीकरण में परिवर्तनों की सही पहचान कर सकते हैं, वे अक्सर उन परिवर्तनों (अप्रकाशित डेटा) के परिमाण को सही ढंग से नहीं बताते हैं, जिसके बाद विश्लेषण ऑडिटिंग और सुधार की आवश्यकता होती है। FPOP डेटा द्वारा प्रस्तुत कठिनाइयों को देखते हुए, उपलब्ध डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की वर्तमान स्थिति FPOP मात्राकरण को संभालने में सक्षम है; हालांकि, निरंतर सॉफ्टवेयर विकास सटीकता और विश्वसनीयता में वृद्धि के साथ क्षेत्र को लाभ होगा।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन पैरों के निशान का पेप्टाइड स्तर का स्थानिक संकल्प उत्पन्न करता है। अमीनो एसिड स्तर तक स्थानिक समाधान उत्पन्न करना संभव है; हालांकि, क्षेत्र में असहमति इस उच्च संकल्प FPOP डेटा उत्पन्न करने के विभिन्न तरीकों की पूर्ण सटीकता के बारे में बनी हुई है। हाल ही में हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज और एफओपी की तुलना करने वाले एक अध्ययन में पाया गया कि एफओपी डेटा उप-अमीनो एसिड स्तर३६पर सॉल्वेंट पहुंच की जांच कर सकता है । एक विधि एचपीएलसी का उपयोग ऑक्सीकरण आइसोमर को यथासंभव हल करने के लिए करती है, और फिर प्रत्येक आइसोमर को पीक एरिया1,23,,,24, 25,25से निर्धारित करने के लिए। हालांकि, जब इस विधि द्वारा सिंथेटिक पेप्टाइड ऑक्सीकरण आइसोमर के एक साधारण मिश्रण की मात्रा निर्धारित की गई थी, तो पूर्ण मात्राकरण में त्रुटियां पाई गई थीं और पिछली रिपोर्टों में यह संकेत दिया गया था कि टकराव-प्रेरित वियोजन एमएस/एमएस ऑक्सीकरण37, 38,38की साइटों को गलत पहचान सकते हैं। इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर डिसोसिएशन (ईटीडी) द्वारा क्वांटिफिकेशन को सिंथेटिक मानकों और प्रोटीन पर सटीक दिखाया गया है, लेकिन इस विधि के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग के लिए सभी ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड आइसोमर्स के सह-संवष्करण की आवश्यकता होती है जिन्हें उत्क्रमित चरण एचपीएलसी का उपयोग करके पूरा नहीं किया जा सकता है और आम तौर पर आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी या एचआईएलआईसी7,39,,,40, 41,41की आवश्यकता होती है । अन्यथा, जटिल और समय लेने वाले लक्षित ईटीडी,विश्लेषणों का उपयोग7,,8,9किया जाना चाहिए । क्षेत्र में वर्तमान आम सहमति यह प्रतीत होती है कि एलसी पीक क्षेत्र आधारित अमीनो एसिड स्तर मात्राकरण कम से कम ऑक्सीकरण की साइटों की पहचान करने लगता है जो परिवर्तन की सापेक्ष मात्रा को बदलते हैं और सही ढंग से पहचानते हैं (यानी, अमीनो एसिड एक्स का ऑक्सीकरण संरचना बी की तुलना में संरचना ए में वाई% तक कम हो जाता है, लेकिन ऑक्सीकरण की मात्रा (यानी, अमीनो एसिड एक्स वाई% ऑक्सीडाइज्ड है) की मात्रा की सटीकता विवाद में बनी हुई है।

एक ही प्रयोग में कई साइटों पर प्रोटीन स्थलाकृति की जांच के लिए एक लचीला बेंचटॉप विधि के रूप में FPOP की ताकत इस तकनीक में जारी रुचि चला रहा है, नौसिखिया अन्वेषक के लिए वर्तमान बाधाओं के बावजूद । FPOP प्रदर्शन के लिए वाणिज्यिक विकल्प सिर्फ बाजार पर आना शुरू कर रहे हैं; हालांकि, इच्छुक अन्वेषक के लिए अपने स्वयं के एफओपी ऑप्टिकल बेंच को विकसित करना और आमतौर पर उपलब्ध डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रयोग करना काफी संभव है। जैसे-जैसे क्षेत्र बढ़ता है और उपलब्ध उपकरणों में सुधार जारी रहता है, एफओपी प्रौद्योगिकी तक पहुंच की आसानी में वृद्धि होगी।

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Disclosures

जोशुआ एस शार्प ने जेननेक्स्ट टेक्नोलॉजीज, इंक में एक महत्वपूर्ण वित्तीय हित का खुलासा किया, जो हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन फुटप्रिंटिंग सहित प्रोटीन उच्च क्रम संरचना विश्लेषण के लिए प्रौद्योगिकियों का व्यावसायीकरण करने की मांग करने वाली एक छोटी कंपनी है ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान अनुदान R43GM125420-01 से अनुसंधान वित्तपोषण को स्वीकार करते हैं, जो उच्च ऊर्जा एफओपी के लिए मानकीकरण और डॉसिमेट्री प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक बेंचटॉप एफपीओपी डिवाइस और R01GM127267 के वाणिज्यिक विकास का समर्थन करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 163 प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफओपी) प्रोटीन फुटप्रिंटिंग बायोसमान मुआवजा तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस)
प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना
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Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling… More

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

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