Summary
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner är en framväxande teknik för den strukturella karakteriseringen av proteiner. Olika lösningsmedelstillsatser och ligander har varierade hydroxylradikala rensningsegenskaper. För att jämföra proteinstrukturen i olika förhållanden krävs realtidskompensation av hydroxylradikaler som genereras i reaktionen för att normalisera reaktionsförhållandena.
Abstract
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en masspektrometribaserad strukturbiologiteknik som undersöker proteiners lösningstillgängliga yta. Denna teknik bygger på reaktionen av aminosyran sidokedjor med hydroxylradikaler fritt sprida i lösning. FPOP genererar dessa radikaler på plats genom laser fotolys av väteperoxid, skapa en explosion av hydroxylradikaler som är uttömda på order av en mikrosekund. När dessa hydroxylradikaler reagerar med en lösningsmedelsåtkomlig aminosyras sidokedja uppvisar reaktionsprodukterna en massförskjutning som kan mätas och kvantifieras genom masspektrometri. Eftersom reaktionshastigheten för en aminosyra delvis beror på den aminosyrans genomsnittliga tillgängliga yta för lösningsmedel, kan uppmätta förändringar i mängden oxidation av en viss region av ett protein korreleras direkt till förändringar i lösningstillgängligheten i den regionen mellan olika konformationer (t.ex. ligandbunden ligand-fri, monomer kontra aggregera, etc.) FPOP har tillämpats i ett antal problem inom biologi, inklusive protein-protein interaktioner, protein konformationella förändringar, och protein-ligand bindning. Eftersom den tillgängliga koncentrationen av hydroxylradikaler varierar utifrån många experimentella tillstånd i FPOP-experimentet, är det viktigt att övervaka den effektiva radikaldos som proteinalyten exponeras för. Denna övervakning uppnås effektivt genom att man införlivar en inline-dosimeter för att mäta signalen från FPOP-reaktionen, med laserfluens justerad i realtid för att uppnå önskad mängd oxidation. Med denna kompensation kan förändringar i proteintopografi som reflekterar konformationsförändringar, ligandbindande ytor och/eller protein-proteininteraktionsgränssnitt bestämmas i heterogena prover med hjälp av relativt låga provmängder.
Introduction
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en framväxande teknik för bestämning av proteintopografiska förändringar genom ultrasnabb kovalent modifiering av den lösningsmedelsexponerade ytan av proteiner följt av detektion av LC-MS1. FPOP genererar en hög koncentration av hydroxylradikaler in situ genom UV-laserblixt fotolys av väteperoxid. Dessa hydroxylradikaler är mycket reaktiva och kortlivade, konsumeras på ungefär en mikrosekund tidsskala under FPOP villkor2. Dessa hydroxylradikaler sprider sig genom vatten och oxiderar olika organiska komponenter i lösning vid kinetiska satser som generellt sett sträcker sig från snabb (~106 M-1 s-1) till diffusionsstyrd3. När hydroxylradikala möter en proteinyta kommer radikalen att oxidera aminosyrans sidokedjor på proteinytan, vilket resulterar i en massförskjutning av den aminosyran (oftast den nettotillsats av en syreatom)4. Oxidationsreaktionens hastighet vid någon aminosyra beror på två faktorer: den inneboende reaktiviteten av den aminosyran (som beror på sidokedjan och sekvenssammanhang)4,5 ochden sidokedjans tillgänglighet till den spridande hydroxylradikala, som nära korrelerar till den genomsnittliga lösningsmedels åtkomliga ytan6,7. Alla av de standarda aminosyrorna utom glycin har observerats som märkta av dessa mycket reaktiva hydroxylradikaler i FPOP-experiment, om än vid vitt skilda avkastningar; i praktiken, Ser, Thr, Asn, och Ala ses sällan som oxideras i de flesta prover utom under höga radikala doser och identifieras genom noggrann och känslig riktade ETD fragmentering8,9. Efter oxidation släcks proverna för att avlägsna väteperoxid och sekundära oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider etc.) De släckta proverna är sedan proteolytiskt rötade för att generera blandningar av oxiderade peptider, där den strukturella informationen fryses som en kemisk "ögonblicksbild" i mönstren för oxidationsprodukter av de olika peptiderna (Figur 1). Vätskekromatografi som kopplas till masspektrometri (LC-MS) används för att mäta mängden oxidation av aminosyror i en given proteolytisk peptid baserat på de relativa intensiteterna hos de oxiderade och ooxiderade versionerna av den peptiden. Genom att jämföra detta oxidativa fotavtryck av samma protein som erhållits under olika konformationsförhållanden (t.ex. ligandbundet kontra ligandfritt) kan skillnader i mängden oxidation av en viss region av proteinet korreleras direkt med skillnader i den lösningsmedelstillgängliga ytan i denregionen 6,7. Förmågan att tillhandahålla protein topografisk information gör FPOP till en attraktiv teknik för högre ordningens strukturbestämning av proteiner, bland annat vid proteinterapeutisk upptäckt och utveckling10,11.
Bild 1: Översikt av FPOP. Proteinens yta kovalent modifieras av mycket reaktiva hydroxylradikaler. De hydroxylradikaler kommer att reagera med aminosyra sidokedjor av proteinet i en takt som starkt påverkas av lösningsmedel tillgänglighet av sidokedjan. Topografiska förändringar (till exempel på grund av bindningen av en ligand som visas ovan) kommer att skydda aminosyror i regionen av interaktion från att reagera med hydroxylradikaler, vilket resulterar i en minskning av intensiteten av modifierad peptid i LC-MS signalen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Olika beståndsdelar som finns i FPOP-lösningen (t.ex., ligander, hjälpämnen, buffertar) har olika rensningsaktivitet mot de hydroxylradikaler som genereras på laserfotolysen av väteperoxid3. På samma sätt kan en liten förändring i peroxidkoncentration, laserfluens och buffertkomposition ändra den effektiva radikaldosen, vilket gör reproduktionen av FPOP-data utmanande över proverna och mellan olika laboratorier. Därför är det viktigt att kunna jämföra den hydroxylradikala dos som finns att reagera med protein i varje prov med hjälp av en av flera tillgängliga hydroxylradikala dosimeter12,13,14,15,16. Hydroxylradikala dosimeters agera, genom att konkurrera med analyten (och med alla asätare i lösning) för slå samman av hydroxylradikaler; den effektiva dosen av hydroxylradikaler mäts genom mätning av mängden oxidation av dosimetern. Observera att "effektiv hydroxylradikala dos" är en funktion av både den initiala koncentrationen av hydroxylradikala genereras och halveringstiden för den radikala. Dessa två parametrar är delvis beroende av varandra, vilket gör den teoretiska kinetiska modelleringen något komplex (Figur 2). Två prover kunde ha vilt olika inledande radikala halveringstid samtidigt som samma effektiva radikal dos genom att ändra den ursprungliga koncentrationen av hydroxylradikala bildas; de kommer fortfarande att generera identiska fotavtryck17. Adenin13 och Tris12 är bekväma hydroxylradikala dosimeter eftersom deras oxidationsnivå kan mätas med UV-spektroskopi i realtid, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt identifiera när det finns ett problem med effektiv hydroxylradikala dos och att felsöka deras problem. För att lösa detta problem, en inline dosimeter som ligger i flödessystemet direkt efter platsen för bestrålning som kan övervaka signalen från adenin absorbans förändringar i realtid är viktigt. Detta hjälper i utförandet av FPOP experiment i buffertar eller någon annan hjälpämne med vitt skilda nivåer av hydroxylradikala rensning kapacitet17. Denna radikala doseringskompensation kan utföras i realtid, ger statistiskt omöjlig att skilja resultat för samma conformer genom att justera den effektiva radikal dos.
I detta protokoll, Vi har detaljerade förfaranden för att utföra en typisk FPOP experiment med radikal dosering ersättning med hjälp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Med den här metoden kan prövarna jämföra avtryck mellan FPOP-villkor som har olika rensningskapacitet genom att utföra kompensation i realtid.
Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetribaserad ersättning. 1 mM adenin dosimeter svar mäts i 5 μM lysozym analyte med en 1 mM initial hydroxylradikala koncentrationen (▪OH t1/2=53 ns), och som ett mål dosimeter svar (svart). Vid tillsats av 1 mM av asätaren excipient histidin, dosimetern svaret (blå) minskar tillsammans med mängden protein oxidation på ett proportionellt sätt (cyan). Halveringstiden för hydroxylradikala minskar också (▪ H.1/2=39 ns). När mängden hydroxylradikala genereras ökas för att ge en motsvarande avkastning av oxiderad dosimeter i provet med 1 mM histidin asopvenger som uppnås med 1 mM hydroxylradikala i frånvaro av sca med en mängd proteinoxidation som uppträder på liknande sätt blir identiskt (magenta), medan den hydroxylradikala halveringstiden minskar ännu mer (▪OH t1/2=29 ns). Anpassad med tillstånd från Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Den optiska bänken och kapillären för FPOP
FÖRSIKTIGHET: KrF-excimerlasrar är extrema ögonrisker, och direkt eller reflekterat ljus kan orsaka permanenta ögonskador. Bär alltid lämpligt ögonskydd, undvik närvaron av eventuella reflekterande föremål nära strålbanan när det är möjligt och använd tekniska kontroller för att förhindra obehörig åtkomst till en aktiv laser och för att begränsa eventuella förlupna reflektioner.
- Förbered den optiska bänken FPOP.
- Slå på lasern för att värma upp. Ställ in lasern på Extern Trigger, Konstant energi, Ingen Gas replacement. Ställ in laserenergin per puls (typiskt mellan 80-120 mJ/puls).
- Ställ in den optiska bänken med den planokonvexa linsen (30 mm Dia. x 120 mm FL obestruket) direkt i laserstrålens väg och en icke-reflekterande backspärr för att absorbera ljuset enligt figur 3A.
Bild 3: Optisk bänk för FPOP-experimentet. (A) Provet blandas med H2O2, adeninradikala dosimeter, och glutaminsopvenger och laddas i sprutan. Provet trycks genom den sammansmälta kiseldioxid kapillären genom den fokuserade strålbanan hos en KrF-excimer-UV-laser. UV-ljus fotolyzes H2O2 i hydroxylradikaler, som oxiderar proteinet och adenin dosimeter. Sprutflödet skjuter ut det belysta provet ur laserns väg före nästa laserpuls, med en oillumenerad utslagningsvolym mellan belysta regioner. Omedelbart efter oxidationen förs provet genom en inline UV-spektrofotometer, som mäter adenins UV-absorbans vid 265 nm. Provet deponeras sedan i en släckningsbuffert för att eliminera de återstående H2O2 och sekundära oxidanterna. (B) Spotstorleken mäts efter att en färgad klisternot bestrålats bakom kapillären med lasern vid 248 nm. På platsens bredd används för beräkning av provflödet, och capillaryens silhuett i mitten av platsen används för att rikta den optiska bänken. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
- Kapa en lämplig längd av den smälta silica kapillären (360 μm ytterdiameter och 100 μm innerdiameter) och med hjälp av en hylsa, anslut till den gastäta sprutan med hjälp av en kontakt med låg död volym.
- Bränn försiktigt kapillärens polyimidbeläggning med en butanbrännare på den plats där inline-dosimetern läser av absorbanssignalen vid 265 nm efter laserexponering av proverna. Torka av skräpet på kapillären försiktigt med metanol på en luddfri torka. Den polyimid beläggning på platsen för laser incidens kan antingen på samma sätt brännas bort med butan fackla eller brännas bort med excimer laser bränning på låg effekt.
OBS: Vänta tills kapillären svalnar eftersom det är en brandrisk att använda metanolen på den heta kapillären. - Placera denna kapillär genom laserns strålbana och in i inline-dosimetern.
- Tryck på spaken på ovansidan av inline-dosimetern för att öppna gångjärnet. Ta bort de magnetiska hållare. Placera kapillären i inline dosimeterns maskinerade spår, med hjälp av magnethållarna för att hålla kapillären på plats. Stäng dosimetergångjärnet över kapillären, tryck på det tills spaken låser fast.
- Använda dosimetri programvara, klicka på Start Flash-knappen för att börja avfyra excimer laser. Ställ in den förinställda lasereffekten mellan 50-100 mJ/puls på själva laserkontrollprogramvaran, och ställ in den förinställda repetitionshastigheten mellan 10-20 Hz i fliken Inställningar i dosimetriprogramvaran.
- Fokusera laserstrålen med hjälp av en planokonvex lins monterad på en linjär motoriserad scen. Mät bredden och laserfläckens höjd vid kapillärens läge på en klisternot exakt med hjälp av ett bromsok för att beräkna infallande fluence (mJ/mm2) enligt figur 3B.
- Placera en ogenomskinlig bländare nära kapillären för att säkerställa konsekvent belyst bredd på kapillären oavsett förändringar i strålstorleken på grund av linsens rörelse eller byte av energi per puls pålasern 18.
- Med laseravfyrningen flyttar du den motoriserade scenen genom sitt rörelseomfång. Se till att strålen stannar centrerad på bländaren och silhuetten av kapillären kan observeras hela. Bländarens diameter måste vara mindre än bredden på den impande fokuserade strålen vid varje punkt i området för den motoriserade scenen.
- Kör vatten genom kapillären vid 20 μL/min i minst en minut för att tvätta kapillären.
- Klicka på knappen Starta data + AutoZero på dosimeterns programvara för att nolla dosimetern för att vattna och påbörja datainsamlingen.
OBS: Om buffertsystemet för FPOP har signifikant UV-absorbans vid 265 nm, ska FPOP-systemet nollställs på bufferten, inte vatten.
- Klicka på knappen Starta data + AutoZero på dosimeterns programvara för att nolla dosimetern för att vattna och påbörja datainsamlingen.
- Ställ in den beräknade flödeshastigheten på sprutpumpen.
- Proteinprovets flödeshastighet beror på den bestrålade volymen per skott (VIrr), antalet laserskott per sekund (R), och den önskade obestrålade exkluderingsvolymfraktionen (FEx) för att korrigera för laminära flödeseffekter och provdiffusion (0,15-0,30 rekommenderas)2,19,20. Beräkna VIrr (i μL) baserat på kapillärens innerdiameter i mm (d) och bredden på den laserpunkt som impar på kapillären (dvs. bländarens bredd) i mm (w) med hjälp av följande ekvation:
VIrr = π(d/2)2w - Beräkna önskad flödeshastighet (i μL/min) baserat på följande ekvation:
Flöde = 60R[VIrr (1 + FEx)]
- Proteinprovets flödeshastighet beror på den bestrålade volymen per skott (VIrr), antalet laserskott per sekund (R), och den önskade obestrålade exkluderingsvolymfraktionen (FEx) för att korrigera för laminära flödeseffekter och provdiffusion (0,15-0,30 rekommenderas)2,19,20. Beräkna VIrr (i μL) baserat på kapillärens innerdiameter i mm (d) och bredden på den laserpunkt som impar på kapillären (dvs. bländarens bredd) i mm (w) med hjälp av följande ekvation:
2. Beredning av proteinlösningen för FPOP
- Förbered proteinet i de två eller flera olika förhållanden som ska jämföras (t.ex. ligand-bundet och ligandfritt; aggregera och monomer; ensam och med en protein-proteinbindande partner; etc.) för att påvisa konformationsförändringarna.
- Ställ in den totala volymen som används för FPOP för att passa behoven i experimentet. Minimigränsen beror vanligtvis på volymen av bestrålnings kapillären och det material som krävs för robust detektering och relativ kvantifiering, och kommer att variera beroende till stor del på vilket LC-MS/MS-system som används och metoden för bearbetning av prover efter märkning. Den totala volymen för FPOP-lösningar som vanligen används i vår grupp är 20 μL efter tillsats av väteperoxid. Den slutliga koncentrationen av proteinet är vanligen 1-10 μM, med 17 mM glutamin (för att begränsa livslängden för hydroxylradikalern), 1 mM adenin (att fungera som en radikal dosimeter)13,17 och 10 mM fosfatbuffert (en buffert som är en dålig asätare av hydroxylradikaler). Prover är i allmänhet beredda med flera replikat för att möjliggöra statistisk modellering av resultat.
- För de flesta allmänna ändamål, förbereda prover i tre exemplar i båda staterna, plus minst ett prov att använda som en no-laser kontroll för att mäta bakgrund oxidation. Bered 18 μL av denna FPOP-lösningsmix.
OBS: Många buffertar och tillsatser som vanligen används i biokemi är hydroxylradikala asätare. Dessa tillsatser och buffertar kan användas; dock kan minskningar av oxidation på grund av hydroxylradikala rensning av bufferten ske. I allmänhet, hålla alla tillsatser till det minimum som krävs av det biologiska systemet för att maximera protein oxidation avkastning. Dimetylsulfoxid bör undvikas på grund av benägenheten att generera sekundära radikaler; dimetylformamid har varit ett användbart alternativ i våra händer. Vid användning av buffertar som är starka hydroxylradikala asätare kan glutamin ofta uteslutas från FPOP-lösningsmixen.
- För de flesta allmänna ändamål, förbereda prover i tre exemplar i båda staterna, plus minst ett prov att använda som en no-laser kontroll för att mäta bakgrund oxidation. Bered 18 μL av denna FPOP-lösningsmix.
- Förbered 1 M väteperoxid omedelbart före FPOP-experimentet.
OBS: 30% väteperoxid som vanligen säljs av leverantörer inkluderar en stabilisator, vilket ökar hållbarheten. När de har spädts ut, bör väteperoxid användas snabbt, definitivt inom samma dag. Väteperoxid bör också regelbundet testas för sönderdelning genom FPOP med hjälp av en hydroxylradikala dosimeter. - Förbered mikrocentrifugrör som innehåller 25 μL släcklösning på 0,5 μg/μL metionin amid och 0,5 μg/μL katalas. Om en provvolym större än 20 μL används för FPOP, öka släck lösningsvolymen proportionellt.
3. Utför FPOP-experimentet
- Tillsätt 2 μL väteperoxid i 18 μL i FPOP-lösningsmixen. Blanda innehållet försiktigt med en pipett och snurra snabbt ner lösningen till botten av mikrocentrifugrören. Samla genast med en gastät spruta och ladda in i sprutpumpen.
- Starta flödet på sprutpumpen med flödet som bestämts i steg 1.8.1 (typiskt mellan 8-16 μL/min) genom att klicka på knappen Starta pumpen på dosimeterns programvara.
- Övervaka adeninavläsningen i realtid med hjälp av inline-dosimetern (se Tabell över material) och samla in provet i avfall. Vänta på att Abs265-signalen stabiliseras.
- Klicka på Startblixt-knappen i dosimeterns programvara för att börja avfyra lasern vid den förinställda repetitionshastigheten och energin.
- Övervaka adeninavläsningen i realtid med hjälp av en inline-dosimeter (se Tabell över material); skillnaden i Abs265 med lasern av och lasern på är ΔAbs265-avläsningen.
OBS: Utseendet på mycket instabila Abs265 avläsningar vid bränning av lasern i närvaro av väteperoxid beror på generering av bubblor i lösning. Minska fluence av lasern och / eller koncentrationen av väteperoxid för att eliminera bubblorna.
4. Utför ersättning
OBS: Olika ligander, buffertar etc. kan ha olika rensningskapacitet mot hydroxylradikaler. Det är viktigt att säkerställa att jämförbara effektiva hydroxylradikala doser finns tillgängliga för att reagera med protein över olika prover. Detta åstadkoms genom att säkerställa lika hydroxylradikala dosimetersvar mellan prover. Med hjälp av adenindosimetri återspeglar förändringen i UV-absorbans vid 265 nm (ΔAbs265) den effektiva hydroxylradikala dosen; ju större ΔAbs265, desto högre är den effektiva hydroxylradikala dosen.
- Jämför ΔAbs265-avläsningen som erhålls med inline-dosimetern med den önskade ΔAbs265-avläsningen som erhållits genom tidigare experiment eller kontroller. En ΔAbs265 läsning lägre än den önskade avläsningen indikerar en otillräcklig effektiv dos av hydroxylradikaler; en ΔAbs265-avläsning indikerar en effektiv radikal dos som är för hög. Om ΔAbs265-avläsningen är på önskad nivå, samla provet omedelbart efter laserbestrålning i släckningsbufferten17.
- Kompensera den effektiva radikaldosen för att utjämna ΔAbs265. Denna kompensation kan utföras på tre sätt: ändra väteperoxidkoncentration, öka laserfluensen genom att ändra laserenergin per puls, eller öka laserfluensen genom att ändra fokuseringslinsens fokalplan.
- För att göra en stor förändring (>10 mAU) i ΔAbs265-läsning, gör om provet med mer eller mindre väteperoxid och kör provet igen enligt avsnitt 3.
- För att göra en liten förändring i ΔAbs265-avläsning i realtid, justera infallande strålens fokalplan genom att justera placeringen av fokuseringslinsen med hjälp av 50 mm Motorized Stage. Att fokalplanet kommer närmare kapillärens position kommer att öka ΔAbs265-avläsningen; att fokalplanet förs längre från kapillärens position kommer att minska ΔAbs265-avläsningen.
- Övervaka adenin ΔAbs265 för att mäta den effektiva mängden hydroxylradikala som finns i provet efter laserbestrålning13. Realtidsövervakning med en inline UV kapillärdetektor möjliggör ersättning i realtid enligt beskrivningen i 4.2.2; justera linsläget med hjälp av det motoriserade stadiet tills ΔAbs265-avläsningen är lika med den önskade avläsningen. Post-experimentella absorbansmätningar med en UV-spektrofotometer är också noggranna, men kräver att nya prover används för varje effektiv radikal dos.
5. Smälta proteinproverna
OBS: Trypsin används oftast för att smälta proteinprover för FPOP, och är den proteas som används i detta protokoll. Det är en pålitlig proteas som genererar peptider med grundläggande platser både vid N- och C-ändstationen, främja multiplicera laddade peptidjoner i MS. Dessutom klyver det efter lysin och arginin, två aminosyror som endast är måttligt reaktiva mot hydroxylradikaler; därför är förändringar i rötningsmönstret på grund av analytoxidation sällsynt. Andra proteaser har framgångsrikt använts med FPOP21, men försiktighet bör vidtas för att säkerställa att matsmältningsmönstren är jämförbara mellan ooxiderade och oxiderade prover.
- Mät den slutliga volymen av släckt FPOP-prov. Tillsätt 500 mM Tris, pH 8.0 med 10 mM CaCl2 innehållande 50 mM dithiothreitol (DTT) till proteinlösningen efter släckning till en slutkoncentration på 50 mM Tris, 1 mM CaCl2 och 5 mM DTT.
- Värm proteinprovet vid 95 °C i 15 minuter.
- Kyl omedelbart provet på is i 2 min.
- Lägg till 1:20 trypsin/protein viktförhållandet till proverna.
- Smält proteinet över natten vid 37 °C med blandning.
- Stoppa matsmältningsreaktionen genom tillsats av 0,1% myrsyra och/eller uppvärmning av provet till 95 °C i 10 min.
- Tillsätt 2 mM DTT till proverna och värm vid 60 °C i 15 min omedelbart före LC-MS/MS.
OBS: Medan andra grupper har rapporterat alkylering av tioler i FPOP experiment, i våra händer har vi noterat sidoprodukter vid alkylering av oxiderade proteiner (möjligen på grund av reaktion med nukleofila karbonyler bildas som en mindre oxidation produkt). Därför väljer vi att undvika alkylering av tioler när det är möjligt.
6. Utför flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS)
- Förbered den mobila fasen A bestående av vatten som innehåller 0,1% myrsyra och mobil fas B bestående av acetonitril med 0,1% myrsyra.
- Fyll först på en C18-svällkolumn (300 μm I.D. x 5 mm 100 Å porstorlek, 5 μm partikelstorlek) svällningspatron och tvätta med 2% lösningsmedel B i 3 minuter vid en flödeshastighet på 5,0 μL/min för att avlägsna salter och hydrofila små molekyler.
- Därefter separera peptiderna på C18 nanokolonn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikelstorlek, 100 Å porstorlek) vid en flödeshastighet på 300 nL/min. Lutningen består av en linjär ökning från 2 till 35% lösningsmedel B över 22 min, ramped till 95% lösningsmedel B över 5 min och hölls i 3 min för att tvätta kolonnen, och sedan återvände till 2% B över 3 min och hölls i 9 min att åter jämvikt kolumnen.
OBS: Denna gradient är tillräcklig för LC-MS/MS av de flesta en- och två-protein FPOP blandningar som försöker göra peptid-nivå kvantifiering. Procenten av lösningsmedel B kan behöva ändras för att öka peptidupplösningen i sällsynta fall där peptider stör varandra på grund av liknande retentionstider och m/z-värden. Proteome-skala FPOP22 eller experimentella mönster som försöker separera peptid oxidation produkt isomerer1,23,24,25 kan kräva längre LC lutningar och är utanför ramen för denna rapport. - Eluta peptiderna direkt in i nanospray källan till en högupplöst masspektrometer med hjälp av en ledande nanospray emitter.
- Skaffa data i positivt jonläge. Ställ in sprutspänningen på 2400 V, och temperaturen på jonöverföringsröret till 300 °C.
- Förvärva hela MS skanningar från m / z 250 till 2000 vid en nominell upplösning på m / z 200 av 60.000 följt av åtta efterföljande databeroende linjärjon fälla MS / MS skanningar på topp åtta mest rikliga peptidjoner med hjälp av kollision-inducerad dissociation vid 35% normaliserad energi för att identifiera peptiderna. Fragmentera peptiderna upp till fem gånger inom 30 s och överför sedan till en uteslutningslista för 60 s.
7. Databehandling och beräkning av genomsnittlig oxidation av peptider
- Bestäm sekvenstäckningen för proteinet, m/z-värdena och retentionstiderna för ooxiderade peptider med hjälp av sökmotorn MS/MS proteomics.
- Ställ in prekursormassa tolerans till 10 ppm och tillåta upp till två missade klyvning platser för trypsin rötas prover, med hjälp av standard trypsin klyvning specificitet.
- Ställ in peptidmassans massfragmentstolerans på 0,4 Daltons.
- Baserat på m/z-förhållandet mellan de omodifierade peptider som upptäcks och de kända massförskjutningarna av de större oxidationsprodukterna, beräknar du m/z av de olika teoretiska oxidationsprodukterna av varje peptid4,26,27,28,29.
- Identifiera det extraherade jonkromatogrammet för dessa m/z-värden med hjälp av programvara för att visa masspektrometrisk körning (figur 4). Identifiera peptidoxidationsprodukterna baserat på deras m/z, deras laddningstillstånd, och likheten i elutionstiden med den omodifierade peptiden. I våra händer, peptid oxidation produkter elute mellan 240 sekunder före till 180 sekunder efter den omodifierade peptid med hjälp av LC lutning ovan. Eftersom oxidering ofta kommer att resultera i flera isomeriska oxidationsprodukter är det vanligt att observera flera delvis lösta toppar i de extraherade jonkromatogrammen av peptidoxideringsprodukter, som visas i figur 4. Peptidoxideringsprodukter kvantifieras utifrån området för toppen(med) i de extraherade jonkromatogrammen.
Figur 4: Extraherat jonkromatogram av en peptid och dess oxidationsprodukter efter FPOP. M/z av peptidoxidationprodukterna beräknas baserat på m/z av den ooxiderade peptiden och de kända oxidationsprodukterna; och områdena för dessa peptidprodukter bestäms. Området för peptidprodukterna används sedan för beräkning av de genomsnittliga oxidationshändelserna per peptid. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
- Beräkna den genomsnittliga oxidationen av peptiderna med hjälp av följande ekvation.
där P betecknar det genomsnittliga antalet oxidationshändelser per peptidmolekyl, och jag representerar toppområdet för den ooxiderade peptiden (Iunoxidized) och peptiden med n oxidationshändelser. Observera att I(singly oxiderad) skulle omfatta inte bara tillägg av en enda syreatom men även andra mindre vanliga enstaka oxidationshändelser som prövaren kan välja att mäta (t.ex. oxidativ dekarboxylering, karbonylbildning etc.) 4,26,27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse av den tunga kedjan peptid fotavtryck av adalimumab biosimilar i fosfat buffert och vid uppvärmning vid 55 °C för 1 h visar intressanta resultat. Studentens t-test används för identifiering av peptider som väsentligt ändras i dessa två tillstånd (p ≤ 0,05). Peptiderna 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413, och 414-420 uppvisar ett betydande skydd mot lösningsmedel när proteinet upphettas till formaggregat (figur 5)30. Detta experiment identifierade peptid regioner som upplever topografiska förändringar vid uppvärmning och aggregering.
Figur 5: Peptidnivåavtryck av den tunga kedjan av adalimumab. Peptiden genomsnittliga oxidation av adalimumab (blå) vid rumstemperatur, och (orange) efter adalimumab värms vid 55 °C för 1 timme, sedan kyls till rumstemperatur. Felstaplarna representerar en standardavvikelse för trelika mätningar. Asterisken representerar de peptider som väsentligt ändras i de två villkoren (p ≤ 0,05). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
FPOP experiment av myoglobin utfördes i närvaro av 10 mM fosfat och 10 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonic syra (MES) buffert. MES-buffert fungerar som en bra asätare av de hydroxylradikaler som genereras vid fotolysen av väteperoxiden efter att provet exponerats för laserbestrålningen. Skillnaden i adenins absorbans övervakas med hjälp av en inline-dosimeter i realtid. Laserfluensen justeras på ett sätt för att få en jämförbar förändring av adeninabsorbansnivån i MES-buffert jämfört med fosfatbufferten (figur 6)17. Den genomsnittliga oxidationen av peptider var lägre i närvaro av MES-buffert jämfört med fosfatbufferten. Eftersom laserfluensen ökades för att ha ett lika adenin dosimetri svar, var de genomsnittliga värdena peptid oxidation inte signifikant annorlunda efter FPOP i MES buffert och fosfat buffert (Figur 7)17. Det här experimentet visar vikten av kompensation av signalen för att kunna jämföra fotavtrycket med två FPOP-villkor som har olika rensningskapacitet. Liknande experiment har framgångsrikt använt adeninbaserad ersättning för att undersöka strukturella förändringar av vanliga hjälpämnen i adalimumabpreparat30.
Bild 6: Ersättning av adenin dosimetri avläsningar. Adeninavläsningen före och efter laserbestrålning registrerades för FPOP i fosfatbuffert vid 265 nm med användning av inline-dosimeter. Eftersom MES är en bra asätare av hydroxylradikaler, var skillnaden i adenin avläsningar lägre. Ökade laser fluence av FPOP lösning med MES buffert för att "kompensera" och övervinna effekten av MES buffert att ha liknande adenin läsning som fosfat buffert. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Ersättning i realtid av myoglobinoxidation genom inline adenindosimetri. Myoglobin oxiderat i (blå) 10 mM fosfatbuffert och (orange) 10 mM MES buffert (orange). Som noterat är oxidationen av peptiderna lägre i MES-bufferten. Eftersom laserfluensen ökas för att proverna i MES-bufferten ska ha nästan liknande adenindosimetrinivå jämfört med fosfatbuffert (grå) liknar peptidnivån oxidation också den oxidationsnivå som ses i prover med fosfatbuffert. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Analytisk kemi 2018, 90, 21, 12625-12630. Upphovsrätt 2018 American Chemical Society. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Masspektrometribaserade strukturella tekniker, inklusive väte-deuteriumutbyte, kemisk tvärbindning, kovalent märkning och infödda spraymasspektrometri och jonrörlighet har snabbt ökat i popularitet på grund av deras flexibilitet, känslighet och förmåga att hantera komplexa blandningar. FPOP ståtar med flera fördelar som har ökat sin popularitet inom området masspektrometri-baserade strukturella tekniker. Liksom de flesta kovalenta märkning strategier, ger det en stabil kemisk ögonblicksbild av protein topografi som är kompatibel med de flesta post-märkning processer (t.ex. trypsin matsmältning, deglycosylation, etc.), undvika frågor om back-exchange och förvrängning som hindrar väte-deuterium utbyte. Men till skillnad från traditionella kovalenta märkning teknik som riktar sig till specifika aminosyror, FPOP kan märka ett brett spektrum av aminosyror i ett enda experiment. Dessutom är FPOP kunna slutföra den primära hydroxyl radikal-proteinreaktion snabbare än de proteiner som kan utvecklas för att frysa en kemisk ögonblicksbild av den inhemska konformation14, även om vissa sekundära reaktioner kan uppstå på en långsammare tidsskala20,31,32. Till skillnad från tidigare experiment i hydroxyl radikalt proteinfotavtryck med hjälp av röntgensynkrotron beamlines, FPOP möjliggör denna ultra-snabb märkning i en bänkskiva format33,34. De stora hindren i FPOP inför den typiska proteinet masspektrometri lab är erfarenhet av att hantera prover för FPOP, laserbaserad oxidation, och dataanalys. Målet med denna rapport är att hjälpa nya utredare övervinna dessa hinder för att generera värdefulla och reproducerbara resultat.
Proteiner kan genomgå bakgrundsoxidation som felaktigt kan ge oxidationens omfattning på de identifierade peptiderna. För att bättre förstå detta bereds ett kontrollprov i replikat tillsammans med FPOP-prov där alla steg utförs utom lasern inte utlöses (steg 3.4). Oxidationsnivån i kontrollen utan laser avslöjar nivån på bakgrundsoxidationen. In-source oxidation av peptider kan bidra till den observerade peptid oxidation, och kan lätt bestämmas av LC elution profilen av den omodifierade peptiden och modifieringsprodukten. Om elutionsprofilerna överlappar varandra identiskt beror oxidationsprodukten nästan säkert på oxidation av postkolumnen. In-source oxidation kan vanligen minskas genom att joniseringsspänningen sänks och/eller avståndet mellan emittern och jonöverföringsröret ökas. Annan oxidation i bakgrunden kan antingen finnas i proteinet före FPOP-behandlingen, eller så kan den framkallas genom exponering för väteperoxid. Det senare kan minimeras genom att minska koncentrationen av använd väteperoxid och/eller minska den tid proteinet är i väteperoxiden före släckning.
Ett nyckelproblem som ofta stöter på försökspersoner försök FPOP för första gången är hög bakgrund oxidation. Denna höga bakgrundsoxidation beror vanligtvis på att väteperoxid tillstås i provet före analysen. Medan två-elektronoxidation genom väteperoxid är mycket långsammare än en-elektron oxidation av hydroxylradikaler, väteperoxid är fortfarande lätt kunna oxidera vissa aminosyror (framför allt metionin och cystein) på en tidsskala av minuter. Medan de andra komponenterna i FPOP-blandningen är mycket mer stabila, bör väteperoxid läggas direkt före oxidation av FPOP. Som tumregel bör tiden mellan tillsats av väteperoxid och fullständigt nedfall av provet i släckningslösningen hållas till under fem minuter. Det är avgörande att alltid samla in en no-laser kontroll (där proteinet hanteras som vanligt för FPOP men lasern inte eldas) för att upptäcka eventuella problem med prov oxidation, antingen på grund av långvarig peroxid exponering eller på grund av protein rening och lagring. För de fall där proteinet är särskilt känsligt för väteperoxid kan on-line blandning med väteperoxid före bestrålning med excimerlasern begränsa exponeringen för sekunder ellermindre 31,35. Men för de flesta proteiner, online blandning är onödigt.
Nästa svåra hinder för många nybörjare FPOP experimentörer är installationen av den optiska vägen. Det är viktigt att lasern impinges rakt på kapillären för att få bra photolysis av väteperoxiden. Medan UV-laser ljuset är osynlig, kommer det att orsaka många färgämnen som finns i färgat papper att fluorescerera i det synliga intervallet. Därför, med hjälp av en bit av färgat konstruktionspapper på backstop kan hjälpa till i anpassningen av linsen och kapillären. Papperet kan användas för att säkerställa att lasern är rakt slående centrum av fokuseringslinsen, och sedan en bit av färgat papper på lasern backstop kan hjälpa till att berätta när kapillären är framgångsrikt placerad i mitten av den fokuserade strålen, som diffraction av kapillären kommer att orsaka en silhuett i strålen profilen (Figur 3B).
Det uppskattas inte heller ofta av nybörjare utredare att balken tvärsnittsytan ändras baserat på pulsenergin. Om en prövare beräknar sprutpumpens flödeshastighet baserat på en laserenergi på 100 mJ/puls, och sedan ökar laserenergin till 120 mJ/puls, kommer bredden på laserstrålen därför att öka vilket gör att beräkningarna blir felaktiga. För att förhindra denna fråga rekommenderas användning av en ogenomskinlig bländare. För kommersiella excimer lasrar vi har arbetat med, när laserenergin per puls ökas den största förändringen är i tvärsnittet av strålen, inte lasern fluence. Eftersom koncentrationen av hydroxylradikaler bygger delvis på flunsen av infallande UV-ljus, bara ändra laserenergin per puls är ofta ineffektivt att öka effektiv hydroxylradikala dosering.
Reproducerbarhet är ett annat vanligt hinder för nybörjare utredare att övervinna. Vanligast, en brist på reproducerbarhet orsakas av en underlåtenhet att generera motsvarande hydroxylradikala doser över olika replikat. Detta kan bero på felaktig optisk bänk anpassning, ovetande användning av olika nivåer av hydroxylradikala rensning agenter, eller användning av åldern väteperoxid. För alla fall möjliggör användningen av en intern dosimeter för snabb identifiering av problem med effektiv hydroxylradikala dos. Hydroxylradikala dosimeters agera, genom att konkurrera med analyten (och med alla asätare i lösning) för slå samman av hydroxylradikaler; den effektiva dosen av hydroxylradikaler mäts genom mätning av mängden oxidation av dosimetern. Observera att "effektiv hydroxylradikala dos" är en funktion av både den initiala koncentrationen av hydroxylradikala genereras, och halveringstiden för den radikala. Dessa två parametrar är delvis beroende av varandra, vilket gör den teoretiska kinetiska modelleringen något komplex (Figur 2). Två prover kunde ha vilt olika inledande radikala halveringstid samtidigt som samma effektiva radikal dos genom att ändra den ursprungliga koncentrationen av hydroxylradikala bildas; de kommer fortfarande att generera identiska fotavtryck17. Adenin13 och Tris12 är bekväma hydroxylradikala dosimeter eftersom deras oxidationsnivå kan mätas med UV-spektroskopi i realtid, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt identifiera när det finns ett problem med effektiv hydroxylradikala dos och att felsöka deras problem.
Dataanalys är fortfarande den mest tidsintensiva delen av alla FPOP-experiment. Medan rapporter finns med hjälp av kommersiella paket för att kvantifiera oxidationsprodukter, dessa kvantifiering algoritmer har svårigheter att korrekt definiera toppområden i delvis löst, asymmetriska toppar som genereras från grupper av oxidation isomerer21. I våra händer, medan nuvarande tillgängliga automatiserade programpaket kan oftast korrekt identifiera förändringar i oxidation, de ofta inte korrekt kvantifiera omfattningen av dessa förändringar (opublicerade data), kräver efter analys revision och korrigering. Med tanke på de svårigheter som FPOP-data uppvisar är den aktuella statusen för tillgänglig dataanalysprogramvara som över och nu kan hantera FPOP-kvantifiering anmärkningsvärd; kommer dock fortsatt mjukvaruutveckling att gynna fältet med ökad noggrannhet och tillförlitlighet.
Det protokoll som beskrivs här genererar en peptid-nivå rumslig upplösning av hydroxyl radikala protein fotspår. Det är möjligt att generera rumslig upplösning upp till aminosyran nivå; dock, meningsskiljaktigheter på området kvar avseende den absoluta noggrannheten av olika metoder för att generera denna högupplösta FPOP data. En nyligen genomförd studie där man jämförde väte-deuteriumutbyte och FPOP fann att FPOP-data kan sondera lösningsmedelstillgänglighet på sub-aminosyranivå36. En metod använder HPLC för att lösa oxidations-isomerer så mycket som möjligt, och sedan för att kvantifiera varje isomer genom toppområde1,23,24,25. Men när en enkel blandning av syntetisk peptidoxidations-isomerer kvantifierades med denna metod, konstaterades fel i den absoluta kvantifieringen och tidigare rapporter har indikerat att kollisionsinducerad dissociation MS/MS kan felidentifiera oxidationsställen37,38. Kvantifiering genom elektronöverföringsdesociation (ETD) har visat sig vara korrekt på syntetiska standarder och proteiner, men direkt tillämpning av denna metod kräver co-elution av alla oxiderade peptid-isomerer som inte kan åstadkommas med hjälp av omvänd fas HPLC och kräver i allmänhet storleksuteslutande kromatografi eller HILIC7,39,40,41; annars måste komplicerade och tidskrävande riktade ETD-analyser användas7,8,9. Den nuvarande konsensus på området verkar vara att LC topp area-baserade aminosyra nivå kvantifiering verkar åtminstone korrekt identifiera platser för oxidation som förändras och korrekt identifiera den relativa mängden förändring (dvs. oxidation av aminosyra X minskar med Y% i konformation A jämfört med konformation B), men noggrannheten i kvantifiering av mängden av oxidation (dvs. aminosyra X är Y% oxiderad) förblir i tvist.
Styrkorna i FPOP som en flexibel bänkskiva metod för sondering protein topografi på många platser i ett enda experiment driver fortsatt intresse för denna teknik, trots de nuvarande hindren för nybörjare utredare. Kommersiella alternativ för att utföra FPOP har precis börjat komma ut på marknaden; dock, Det är fortfarande fullt möjligt för intresserade utredaren att utveckla sin egen FPOP optisk bänk och utföra experiment med hjälp av allmänt tillgängliga dataanalys programvara. När fältet växer och förbättringar av de tillgängliga verktygen fortsätter kommer den enkla tillgången till FPOP-tekniken att öka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Joshua S. Sharp avslöjar ett betydande ekonomiskt intresse i GenNext Technologies, Inc., ett litet företag som vill kommersialisera teknik för protein högre orderstruktur analys inklusive hydroxyl radikalt protein fotavtryck.
Acknowledgments
Vi erkänner forskningsfinansiering från National Institute of General Medical Sciences bevilja R43GM125420-01att stödja kommersiell utveckling av en bänkskiva FPOP enhet och R01GM127267 för utveckling av standardisering och dosimetri protokoll för hög energi FPOP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
| Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
| Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
| Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
| COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
| Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
| Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
| Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
| Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
| Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
| LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
| Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
| Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
| Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
| MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
| Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
| Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
| Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
| Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
| Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
| Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
| Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
| Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
| Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
| Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
| Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
| UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |
References
- Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
- Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
- Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
- Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
- Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochemistry. 56 (7), 957-970 (2017).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
- Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
- Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
- Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
- Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
- Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
- Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
- Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
- Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
- Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
- Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochemistry. 41 (6), 1906-1914 (2002).
- Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
- Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
- Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
- Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
- Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
- Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
- Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
- Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).
