Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Aktivering af real-time kompensation i hurtige fotokemiske oxidationer af proteiner til bestemmelse af Protein Topografi Ændringer

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61580
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner er en ny teknik til strukturel karakterisering af proteiner. Forskellige opløsningsmiddeltilsætningsstoffer og ligands har varieret hydroxyl radikale skyllevæske egenskaber. For at sammenligne proteinstrukturen under forskellige forhold kræves der en real-time kompensation af hydroxyl radikaler genereret i reaktionen for at normalisere reaktionsbetingelserne.

Abstract

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en massespektrometribaseret strukturel biologiteknik, der sonderer proteiners opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal. Denne teknik er afhængig af reaktionen fra aminosyre sidekæder med hydroxyl radikaler frit sprede i opløsning. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse af hydrogenperoxid, hvilket skaber en byge af hydroxyl radikaler, der er opbrugt på bestilling af et mikrosekund. Når disse hydroxyl radikaler reagerer med en opløsningsmiddel-tilgængelig aminosyre sidekæde, reaktionsprodukterne udviser en masse skift, der kan måles og kvantificeres ved massespektrometri. Da en aminosyres reaktionshastighed til dels afhænger af den gennemsnitlige tilgængelige opløsningsmiddeloverflade af den pågældende aminosyre, kan målte ændringer i mængden af oxidation af et givet proteinområde være direkte korreleret med ændringer i opløsningsmiddeltilgængeligheden i den pågældende region mellem forskellige konformeringer (f.eks. ligandbundet versus ligandfri, monomer vs. aggregat osv.) FPOP er blevet anvendt i en række problemer i biologi, herunder protein-protein interaktioner, protein kropslige ændringer, og protein-ligand bindende. Da den tilgængelige koncentration af hydroxyl radikaler varierer baseret på mange eksperimentelle betingelser i FPOP eksperiment, er det vigtigt at overvåge den effektive radikale dosis, som proteinanalyt er udsat for. Denne overvågning opnås effektivt ved at indarbejde et inline dosimeter til måling af signalet fra FPOP-reaktionen, med laserfluence justeret i realtid for at opnå den ønskede mængde oxidation. Med denne kompensation kan ændringer i proteintopografi, der afspejler konformationelle ændringer, ligandbindende overflader og/eller proteinproteininteraktionsgrænseflader, bestemmes i heterogene prøver ved hjælp af relativt lave prøvemængder.

Introduction

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en ny teknik til bestemmelse af proteintopografiske ændringer ved ultrahurtig kovaent ændring af proteiners opløsningsmiddeludsynlige overfladeareal efterfulgt af påvisning af LC-MS1. FPOP genererer en høj koncentration af hydroxyl radikaler in situ ved UV laser flash fotolyse af hydrogenperoxid. Disse hydroxyl radikaler er meget reaktive og kortvarig, forbruges på nogenlunde en microsecond tidsskala under FPOP betingelser2. Disse hydroxyl radikaler diffus gennem vand og oxidere forskellige organiske komponenter i opløsning ved kinetiske satser generelt spænder fra hurtig (~ 106 M-1 s-1) til diffusion-kontrollerede3. Når hydroxyl radikal støder på et protein overflade, den radikale vil oxidere aminosyren sidekæder på proteinoverfladen, hvilket resulterer i en masse skift af denne aminosyre (oftest netto tilsætning af en ilt atom)4. Oxidationsreaktionen ved enhver aminosyre afhænger af to faktorer: den iboende reaktivitet af denne aminosyre (som afhænger af sidekæden og sekvenskonteksten)4,5 ogtilgængeligheden af denne sidekæde til den spredende hydroxylrifrielle, som korrelerer tæt til det gennemsnitlige opløsningsmiddel, der er tilgængeligtoverfladeareal6,7. Alle standard aminosyrer undtagen glycin er blevet observeret som mærket af disse meget reaktive hydroxyl radikaler i FPOP eksperimenter, om end ved vidt forskellige udbytter; i praksis ses Ser, Thr, Asn og Ala sjældent som oxideret i de fleste prøver undtagen under høje radikale doser og identificeres ved omhyggelig og følsom målrettet MÅLRETTET ETD-fragmentering8,9. Efter oxidation slukkes prøverne for at fjerne hydrogenperoxid og sekundære oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider osv.) De slukkete prøver fordøjes derefter proteolytisk for at generere blandinger af oxiderede peptider, hvor de strukturelle oplysninger fryses som et kemisk "øjebliksbillede" i mønstrene for oxidationsprodukter af de forskellige peptider (figur 1). Flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) anvendes til at måle mængden af oxidation af aminosyrer i et givet proteolytisk peptid baseret på de relative intensiteter af de oxiderede og ikke-oxiderede versioner af det pågældende peptid. Ved at sammenligne dette oxidative fodaftryk af det samme protein, der er fremstillet under forskellige konformationsforhold (f.eks. ligandbundet versus ligandfri), kan forskelle i mængden af oxidation af et givet område af proteinet korreleres direkte med forskelle i det opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal i den pågældende region6,7. Evnen til at give protein topografisk information gør FPOP en attraktiv teknologi til højere orden struktur bestemmelse af proteiner, herunder i protein terapeutisk opdagelse og udvikling10,11.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over FPOP. Overfladen af proteinet er kovalent modificeret af meget reaktive hydroxyl radikaler. Hydroxyl radikaler vil reagere med aminosyre sidekæder af proteinet med en hastighed, der er stærkt påvirket af opløsningsmiddel tilgængelighed af sidekæden. Topografiske ændringer (f.eks. på grund af bindingen af en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i interaktionsregionen mod at reagere med hydroxyl radikaler, hvilket resulterer i et fald i intensiteten af modificeret peptid i LC-MS signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Forskellige bestanddele, der findes i FPOP-opløsningen (f.eks. ligander, hjælpestoffer, buffere), har forskellige skylleaktivitet i forhold til hydroxyldriberne, der genereres på laserfotolyse af hydrogenperoxid3. Tilsvarende kan en lille ændring i peroxid koncentration, laser fluence, og buffer sammensætning ændre den effektive radikale dosis, hvilket gør reproduktion af FPOP data udfordrende på tværs af prøverne og mellem forskellige laboratorier. Det er derfor vigtigt at kunne sammenligne den hydroxylriske dosis, der er tilrådighed,til at reagere med protein i hver prøve ved hjælp af et af flere tilgængelige hydroxylrekromiske dosimeterer12,13,14,15,16. Hydroxyl radikale dosimetre handle ved at konkurrere med analysand (og med alle skyllevæsker i opløsning) for puljen af hydroxyl radikaler; den effektive dosis af hydroxyl radikaler måles ved at måle mængden af oxidation af dosimeteret. Bemærk, at "effektiv hydroxyl radikal dosis" er en funktion af både den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale genereret og halveringstid af den radikale. Disse to parametre er delvist afhængige af hinanden, hvilket gør den teoretiske kinetiske modellering noget kompleks (figur 2). To prøver kunne have vildt forskellige indledende radikale halveringsliv og samtidig opretholde den samme effektive radikale dosis ved at ændre den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale dannet; de vil stadig generere identiske fodspor17. Adenin13 og Tris12 er praktisk hydroxyl radikale dosimeterer, fordi deres niveau af oxidation kan måles ved UV spektroskopi i realtid, giver mulighed for forskere til hurtigt at identificere, når der er et problem med effektiv hydroxyl radikal dosis og til fejlfinding af deres problem. For at løse dette problem er et inline dosimeter placeret i flowsystemet umiddelbart efter bestrålingsstedet, der kan overvåge signalet fra adeninabsorbanceændringer i realtid, vigtigt. Dette hjælper med at udføre FPOP-forsøg i buffere eller andre hjælpestoffer med vidt forskellige niveauer af hydroxylremmelig skyllekapacitet17. Denne radikale dosering kompensation kan udføres i realtid, giver statistisk skelnes resultater for den samme konforme ved at justere den effektive radikale dosis.

I denne protokol, Vi har detaljerede procedurer for at udføre en typisk FPOP eksperiment med radikale dosering kompensation ved hjælp af adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metode gør det muligt for efterforskere at sammenligne fodspor på tværs af FPOP-forhold, der har forskellige skyllekapacitet ved at udføre kompensation i realtid.

Figure 2
Figur 2: Kinetisk simulering af dosimetribaseret kompensation. 1 mM adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozym analysand med en 1 mM indledende hydroxyl radikal koncentration (▪OH t1/2=53 ns), og indstilles som et mål dosimeter respons (sort). Ved tilsætning af 1 mM af scavenger excipient histidin, dosimeter respons (blå) falder sammen med mængden af protein oxidation i en proportional måde (cyan). Halveringstiden for hydroxyl radikalen falder også (▪OH t1/2=39 ns). Når mængden af hydroxyl radikal genereret øges for at give et tilsvarende udbytte af oxideret dosimeter i prøven med 1 mM histidine skyllevæske som opnået med 1 mM hydroxyl radikal i mangel af sca (rød), mængden af proteinoxidation, der opstår på samme måde bliver identisk (magenta), mens hydroxyl radikale halveringstid falder endnu mere (▪OH t1 / 2=29 ns). Tilpasset med tilladelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered den optiske bænk og kapillær til FPOP

FORSIGTIG: KrF excimer lasere er ekstreme øjenfarer, og direkte eller reflekteret lys kan forårsage permanent øjenskade. Bær altid passende øjenbeskyttelse, undgå tilstedeværelsen af reflekterende genstande i nærheden af strålevejen, når det er muligt, og brug tekniske kontroller til at forhindre uautoriseret adgang til en aktiv laser og til at begrænse eventuelle omstrejfende refleksioner.

  1. Forbered den optiske FPOP-bænk.
    1. Tænd for laseren for at varme op. Indstil laseren til ekstern udløser, konstant energi, ingen gasudskiftning. Indstil laserenergien pr. puls (typisk mellem 80-120 mJ/puls).
    2. Opsæt den optiske bænk med planokonvekslinsen (30 mm Dia. x 120 mm FL ubestrøget) direkte i laserstrålens bane og en ikke-reflekterende bagstopper for at absorbere lyset som vist i figur 3A.

Figure 3
Figur 3: Optisk bænk til FPOP-eksperimentet. AA) Prøven blandes med H2O2, adenin radikale dosimeter, og glutamin skyllevæske og læsses i sprøjten. Prøven skubbes gennem den sammensmeltede silicakapillary gennem den fokuserede strålesti på en KrF excimer UV-laser. UV-lys fotolyser H2O2 i hydroxyl radikaler, som oxiderer protein og adenin dosimeter. Sprøjtestrømmen skubber den oplyste prøve ud af laserens bane før den næste laserpuls med en ubelyst udelukkelsesvolumen mellem oplyste områder. Umiddelbart efter oxidationen passerer prøven gennem et inline UV-spektrofotometer, som måler adenins UV-absorbans ved 265 nm. Prøven anbringes derefter i en dæmpningsbuffer for at fjerne de resterende H2O2 og sekundære oxidanter. (B) Spotstørrelsen måles efter bestråling af en farvet sticky note anbragt bag kapillæren med laseren ved 248 nm. Bredden af stedet bruges til beregning af prøven strømningshastighed, og silhuetten af kapillær i midten af stedet bruges til at justere den optiske bænk. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Skær en passende længde af den sammensmeltede silicakapillær (360 μm ydre diameter og 100 μm indre diameter) og ved hjælp af et ærme, tilslut til den gastætte sprøjte ved hjælp af en lav død volumen stik.
  2. Brænd forsigtigt kapillærens polyimidbelægning med en butanbrænder på det sted, hvor det inline dosimeter aflæser absorbanssignalet ved 265 nm efter lasereksponering af prøverne. Tør snavs på kapillær forsigtigt ved hjælp af methanol på en fnugfri tørre. Den polyimid belægning på det sted, laser incidens kan enten være tilsvarende brændt af med butan fakkel eller brændt af med excimer laser fyring ved lav effekt.
    BEMÆRK: Vent på, at kapillæren afkøles, da det er en brandfare at bruge methanolen på den varme kapillær.
  3. Placer denne kapillær gennem strålevejen af laseren og ind i inline dosimeter.
    1. Tryk på håndtaget på toppen af det indbyggede dosimeter for at åbne hængslet. Fjern magnetholderne. Anlæg kapillæren i den bearbejdede rille på det inline dosimeter ved hjælp af de magnetiske holdere til at holde kapillæren på plads. Luk dosimeterhængslet over kapillæren og tryk på det, indtil håndtaget låses på plads.
  4. Brug dosimetri software, skal du klikke på Start Flash-knappen for at begynde at affyre excimer laser. Indstil den forudindstillede lasereffekt mellem 50-100 mJ/pulse på selve laserstyringssoftwaren, og indstil den forudindstillede gentagelseshastighed mellem 10-20 Hz under fanen Indstillinger i dosimetrisoftwaren.
    1. Fokuser laserstrålen ved hjælp af en plano konveks linse monteret på en lineær motoriseret scene. Laserlyspunktets bredde og højde måles på kapillærens position på en klistretsedlen, der nøjagtigt anvender en kaliber til at beregne hændelsesfluence (mJ/mm2) som vist i figur 3B.
  5. Placer en uigennemsigtig blænde i nærheden af kapillæren for at sikre en ensartet oplyst bredde af kapillæren uanset ændringer i bjælkens størrelse på grund af linsens bevægelse eller ændring af laserens energi pr. puls18.
    1. Med laser fyring, flytte den motoriserede fase gennem sin vifte af bevægelse. Sørg for, at strålen forbliver centreret på blænden og silhuetten af kapillær kan observeres hele vejen igennem. Blændens diameter skal være mindre end bredden af den impinging fokuserede stråle på hvert punkt i området af den motoriserede fase.
  6. Vand gennem kapillæren ved 20 μL/min i mindst et minut for at vaske kapillæren.
    1. Klik på knappen Start data + AutoZero på dosimetersoftwaren for at nulstille dosimeteret til vand og begynde dataindsamlingen.
      BEMÆRK: Hvis buffersystemet for FPOP har en betydelig UV-absorbans ved 265 nm, skal FPOP-systemet nulstilles på bufferen, ikke vand.
  7. Indstil den beregnede strømningshastighed på sprøjtepumpen.
    1. Proteinprøvens strømningshastighed afhænger af det bestrålede volumen pr. skud (VIrr), antallet af laserskud pr. sekund (R) og den ønskede ubestrålede eksklusionsvolumenfraktion (FEx) for at korrigere for laminarfloweffekter og prøvediffusion (0,15-0,30 anbefales)2,19,20. V VIrr (i μL) beregnes på grundlag af kapillærens indvendige diameter i mm (d) og bredden af den laserplacering, der påtager kapillæren (dvs. blændens bredde) i mm (w) ved hjælp af følgende ligning:
      VIrr = π(d/2)2w
    2. Den ønskede strømningshastighed (i μL/min.) beregnes ud fra følgende ligning:
      Flow = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. Fremstilling af proteinopløsningen til FPOP

  1. Proteinet klargøres under de to eller flere forskellige forhold, der skal sammenlignes (f.eks. ligandbundet og ligandfrit; aggregat og monomer, alene og med en proteinproteinbindingspartner osv.) til påvisning af kropsbygningsændringerne.
  2. Angiv den samlede mængde, der bruges til FPOP, så den passer til eksperimentets behov. Minimumsgrænsen afhænger normalt af omfanget af bestrålingskapillæren og det materiale, der er nødvendigt for robust detektion og relativ kvantificering, og vil variere i vid udstrækning afhængigt af det anvendte LC-MS/MS-system og prøveforarbejdningsmetoden efter mærkningen. Den samlede volumen for FPOP-opløsninger, der almindeligvis anvendes i vores gruppe, er 20 μL efter tilsætning af hydrogenperoxid. Den endelige koncentration af proteinet er almindeligvis 1-10 μM, med 17 mM glutamin (for at begrænse levetiden for hydroxyl radikal), 1 mM adenin (til at fungere som en radikal dosimeter)13,,17 og 10 mM fosfat buffer (en buffer, der er en dårlig skyllevæske af hydroxyl radikaler). Prøver fremstilles generelt med flere replikater for at muliggøre statistisk modellering af resultater.
    1. Til de fleste generelle formål, forberede prøver i tre eksemplarer i begge stater, plus mindst én prøve til brug som en no-laser kontrol til at måle baggrund oxidation. Der klargør 18 μL af denne FPOP-opløsningsblanding.
      BEMÆRK: Mange buffere og tilsætningsstoffer, der almindeligvis anvendes i biokemi, er hydroxylremmende skyllevæsker. Disse tilsætningsstoffer og buffere kan anvendes; reduktioner i oxidation på grund af hydroxyl radikal scavenging af bufferen kan forekomme. Generelt skal alle tilsætningsstoffer holde sig på det minimum, der kræves af det biologiske system for at maksimere proteinoxidationsudbyttet. Dimethylsulfoxid bør undgås på grund af tilbøjelighed til at generere sekundære radikaler; dimethylformamid har været et nyttigt alternativ i vores hænder. Når du bruger buffere, der er stærke hydroxyl radikale skyllevæsker, glutamin kan ofte udelukkes fra FPOP opløsning mix.
  3. Der klargør 1 M hydrogenperoxid umiddelbart før FPOP-eksperimentet.
    BEMÆRK: 30% hydrogenperoxid som almindeligvis sælges af leverandører omfatter en stabilisator, hvilket øger holdbarheden. Når fortyndet, hydrogenperoxid bør anvendes hurtigt, helt sikkert inden for samme dag. Hydrogenperoxid bør også regelmæssigt testes for nedbrydning af FPOP ved hjælp af et hydroxylromrikadsimometer.
  4. Der forbered mikrocentrifugerør indeholdende 25 μL dæmpningsopløsning af 0,5 μg/μL methionin amid og 0,5 μg/μL katalase. Hvis der anvendes et prøvevolumen på over 20 μL til FPOP, skal dæmpopløsningsvolumen øges proportionalt.

3. Udfør FPOP-eksperimentet

  1. Der tilsættes 2 μL hydrogenperoxid i 18 μL af FPOP-opløsningsblandingen. Bland indholdet forsigtigt med en pipette og drej hurtigt opløsningen ned til bunden af mikrocentrifugerørene. Opsaml straks med en gastæt sprøjte og læg den i sprøjtepumpen.
  2. Start strømmen på sprøjtepumpen med strømningshastigheden som bestemt i trin 1.8.1 (typisk mellem 8-16 μL/min) ved at klikke på knappen Startpumpe på dosimetersoftwaren.
  3. Overvåg adeninaflæsning i realtid ved hjælp af det indbyggede dosimeter (se materialetabel),og prøven opsamls i affald. Vent på, at Abs265-signalet stabiliseres.
  4. Klik på Start Flash-knappen i dosimeter-softwaren for at begynde at affyre laseren med den forudindstillede gentagelseshastighed og energi.
  5. Overvåg adeninaflæsning i realtid ved hjælp af et inline dosimeter (se Materialetabel); forskellen i Abs265 med laseren slukket og laseren på er ΔAbs265 læsning.
    BEMÆRK: Fremkomsten af meget ustabile Abs265 aflæsninger ved affyring af laseren i nærvær af hydrogenperoxid skyldes generering af bobler i opløsning. Reducer laserens fluence og/eller koncentrationen af hydrogenperoxid for at fjerne boblerne.

4. Udfør kompensation

BEMÆRK: Forskellige ligands, buffere osv. Det er vigtigt at sikre, at sammenlignelige effektive hydroxyl radikale doser er tilgængelige til at reagere med protein på tværs af forskellige prøver. Dette opnås ved at sikre lige hydroxyl radikale dosimeter respons mellem prøverne. Ved hjælp af adenindosimetri afspejler ændringen i UV-absorbans ved 265 nm (ΔAbs265) den effektive hydroxylriske dosis; jo større ΔAbs265, jo højere er den effektive hydroxylriske dosis.

  1. ΔAbs265-aflæsningen sammenlignes med det indbyggede dosimeter med den ønskede ΔAbs265-aflæsning opnået ved tidligere forsøg eller kontroller. En ΔAbs265-aflæsning, der er lavere end den ønskede aflæsning, indikerer en utilstrækkelig effektiv dosis hydroxyl radikaler; en ΔAbs265-aflæsning indikerer en effektiv radikal dosis, der er for høj. Hvis ΔAbs265-aflæsningen er på det ønskede niveau, udtages prøven umiddelbart efter laserbestråling i dæmpningsbufferen17.
  2. Kompensere den effektive radikale dosis for at udligne ΔAbs265. Denne kompensation kan udføres på tre måder: ændre hydrogenperoxid koncentration, øge laser fluence ved at ændre laser energi per puls, eller øge laser fluence ved at ændre brændplanet af fokuslinsen.
    1. For at foretage en stor ændring (>10 mAU) i ΔAbs265-aflæsning skal prøven omformes med mere eller mindre brintoverilte og prøven køres igen i henhold til afsnit 3.
    2. For at foretage en lille ændring i ΔAbs265-aflæsning i realtid justeres hændelsesstrålens brændplan ved at justere fokuslinsens position ved hjælp af den 50 mm motoriserede scene. Bringe fokaleplanet tættere på kapillærens position vil øge ΔAbs265-aflæsningen; at bringe fokaleplanet længere væk fra kapillærens position vil reducere ΔAbs265-aflæsningen.
  3. Adenine ΔAbs265 overvåges for at måle den effektive mængde hydroxylradikale, der er til stede i prøven efter laserbestråling13. Overvågning i realtid med en indbygget UV-kapillær detektor giver mulighed for real-time kompensation som beskrevet i 4.2.2; justere linsepositionen ved hjælp af den motoriserede fase, indtil ΔAbs265-aflæsningen er lig med den ønskede aflæsning. Post-eksperimentelle absorbansmålinger med et UV-spektrofotometer er også nøjagtige, men kræver, at der anvendes nye prøver til hver effektiv radikal dosis.

5. Fordøje proteinprøverne

BEMÆRK: Trypsin er mest almindeligt anvendt til at fordøje proteinprøver for FPOP, og er den protease, der anvendes i denne protokol. Det er en pålidelig protease, der genererer peptider med grundlæggende steder både på N- og C-terminus, fremme multiplicere opkrævet peptid ioner i MS. Desuden kløver det efter lysin og arginin, to aminosyrer, der kun er moderat reaktive til hydroxyl radikaler; Derfor er ændringer i fordøjelsesmønsteret på grund af analysandoxidation sjældne. Andre proteaser er blevet anvendt med succes med FPOP21, men der bør sørges for at sikre fordøjelsesmønstre er sammenlignelige mellem uoxiderede og oxiderede prøver.

  1. Mål det endelige volumen af slukket FPOP-prøve. Der tilsættes 500 mM Tris, pH 8,0 med 10 mM CaCl2 indeholdende 50 mM dithiothreitol (DTT) til proteinopløsningen efter dæmpning til en endelig koncentration på 50 mM Tris, 1 mM CaCl2 og 5 mM DTT.
  2. Proteinprøven opvarmes ved 95 °C i 15 minutter.
  3. Straks afkøles prøven på is i 2 min.
  4. Tilsæt 1:20 trypsin/protein vægtforhold til prøverne.
  5. Fordøje proteinet natten over ved 37 °C med blanding.
  6. Fordøjelsesreaktionen standses ved tilsætning af 0,1 % myresyre og/eller opvarmning af prøven til 95 °C i 10 min.
  7. Der tilsættes 2 mM DTT til prøverne og opvarmes ved 60 °C i 15 minutter umiddelbart før LC-MS/MS.
    BEMÆRK: Mens andre grupper har rapporteret alkylation af thioler i FPOP eksperimenter, i vores hænder har vi bemærket sideprodukter ved alkylation af oxiderede proteiner (muligvis på grund af reaktion med nukleofile carbonyler dannet som en mindre oxidation produkt). Derfor vælger vi at undgå alkylering af thioler, når det er muligt.

6. Udfør flydende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)

  1. Den mobile fase A, der består af vand indeholdende 0,1% myresyre og mobil fase B bestående af acetonitrile med 0,1% myresyre.
  2. Prøven anbringes først på en C18-fældekolonne (300 μm ID x 5 mm 100 Å porestørrelse, 5 μm partikelstørrelse) og vaskes med 2% opløsningsmiddel B i 3 minutter ved en strømningshastighed på 5,0 μL/min. for at fjerne salte og hydrofile små molekyler.
  3. Derefter adskilles peptiderne på C18 nanokolon (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikelstørrelse, 100 Å porestørrelse) med en strømningshastighed på 300 nL/min. Gradienten består af en lineær stigning fra 2 til 35% opløsningsmiddel B over 22 min, ramped til 95% opløsningsmiddel B over 5 min og holdes i 3 min for at vaske kolonnen, og vendte derefter tilbage til 2% B over 3 min og holdes i 9 min for at re-equilibrate kolonnen.
    BEMÆRK: Denne gradient er tilstrækkelig til LC-MS/MS af de fleste en- og toprotein-FPOP-blandinger, der søger at kvantificere peptidniveau. Det kan være nødvendigt at ændre procentdelen af opløsningsmiddel B for at øge peptidopløsningen i sjældne tilfælde, hvor peptider forstyrrer hinanden på grund af lignende retentionstider og m/z-værdier. Proteome-skala FPOP22 eller eksperimentelle design, der søger at adskille peptid oxidation produkt isomerer1,23,24,25 kan kræve længere LC gradienter og er uden for rammerne af denne rapport.
  4. Eluter peptiderne direkte ind i nanospraykilden til et massespektrometer med høj opløsning ved hjælp af en ledende nanosprayudleder.
  5. Hent dataene i positiv iontilstand. Ionoverførselsrørets sprøjtespænding til 2400 V og temperaturen på ionoverførselsrøret indstilles til 300 °C.
  6. Erhverve den fulde MS scanninger fra m / z 250 til 2000 ved en nominel opløsning ved m/ z 200 af 60.000 efterfulgt af otte efterfølgende data-afhængige lineær ion fælde MS / MS scanninger på de otte mest rigelige peptidioner ved hjælp af kollision-induceret dissociation på 35% normaliseret energi til at identificere peptider. Fragmenter peptiderne op til fem gange inden for 30 s og derefter overføre til en udelukkelse liste for 60 s.

7. Databehandling og beregning af gennemsnitlig oxidation af peptider

  1. Bestemme sekvensdækningen af proteinet, m/z-værdierne og retentionstiderne for ikke-oxiderede peptider ved hjælp af søgemaskinen MS/MS proteomics.
  2. Indstil prækursor masse tolerance til 10 ppm og tillade op til to ubesvarede spaltning steder for trypsin fordøjet prøver, ved hjælp af standard trypsin spaltning specificitet.
  3. Indstil peptidmassefragmentets massetolerance til 0,4 Daltons.
  4. På grundlag af m/z-forholdet mellem de umodificerede peptider, der påvises, og de kendte masseskift for de vigtigste oxidationsprodukter beregnes m/z for de forskellige teoretiske oxidationsprodukter for hvert peptid4,26,27,28,29.
  5. Identificer det ekstraherede ionkromatogram af disse m/z-værdier ved hjælp af software for at få vist massespektrometrisk kørsel (Figur 4). Identificer peptidoxidationsprodukterne baseret på deres m/z,deres opladningstilstand og ligheden i elutionstid med det uændrede peptid. I vores hænder, peptid oxidation produkter elutere mellem 240 sekunder før til 180 sekunder efter den uændrede peptid ved hjælp af LC gradient ovenfor. Da oxidation ofte vil resultere i flere isomiske oxidationsprodukter, er det almindeligt at observere flere delvist forsøgte toppe i peptidoxidationsprodukternes ekstraherede ionkromatogrammer, som vist i figur 4. Peptidoxidationsprodukter kvantificeres på grundlag af arealet af toppen(erne) i de ekstraherede ionkromatogrammer.

Figure 4
Figur 4: Ekstraheret ionkromatogram af et peptid og dets oxidationsprodukter efter FPOP. Peptidoxidationsprodukternes m/z beregnes på grundlag af m/z for det ikke-oxiderede peptid og de kendte oxidationsprodukter. og områderne for disse peptidsprodukter bestemmes. Arealet af peptidsprodukterne anvendes derefter til beregning af de gennemsnitlige oxidationshændelser pr. peptid. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Den gennemsnitlige oxidation af peptiderne beregnes ved hjælp af følgende ligning.

Equation 1

hvor P betegner det gennemsnitlige antal oxidationshændelser pr. peptidmolekyle, og jeg repræsenterer det maksimale område af det ikke-oxiderede peptid (Uunoxideret)og peptidet med n oxidationshændelser. Bemærk, at jeg (singly oxideret) vil omfatte ikke kun tilsætninger af en enkelt ilt atom, men også andre mindre almindelige enkelt oxidation begivenheder, at investigator kan vælge at måle (f.eks oxidativ decarboxylation, carbonyl dannelse, osv.) 4,26,27,28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligning af adalimumab-bioimilæres tunge kædepeptryk i fosfatbufferen og ved opvarmning ved 55 °C i 1 time viser interessante resultater. Studerendes t-test bruges til identifikation af peptider, der er væsentligt ændret i disse to betingelser (p ≤ 0,05). Peptiderne 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 og 414-420 udviser betydelig beskyttelse mod opløsningsmiddel, når proteinet opvarmes til aggregater (Figur 5)30. Dette eksperiment identificerede de peptidregioner, der oplever topografiske ændringer ved opvarmning og sammenlægning.

Figure 5
Figur 5: Peptid niveau fodaftryk af den tunge kæde af adalimumab. Peptidgennemsnittet oxidation af adalimumab (blå) ved stuetemperatur og (orange) efter adalimumab opvarmes ved 55 °C i 1 time og afkøles derefter til stuetemperatur. Fejllinjerne repræsenterer én standardafvigelse for tre eksemplarer. Stjernen repræsenterer de peptider, der er væsentligt ændret i de to betingelser (p ≤ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

FPOP-eksperimentet myoglobin blev udført i nærværelse af 10 mM fosfat og 10 mM 2-(N-morfoolino)ethansulfonsyre (MES) buffer. MES buffer fungerer som en god skyllevæske af hydroxyl radikaler genereret på fotolyse af hydrogenperoxid efter prøven er udsat for laser bestråling. Forskellen i absorbans af adenin overvåges ved hjælp af en inline dosimometer i realtid. Laserfluencen justeres på en sådan måde , at der er en sammenlignelig ændring i adeninabsorberende niveau i MES-bufferen sammenlignet med fosfatbufferen (figur 6)17. Den gennemsnitlige oxidation af peptider var lavere ved tilstedeværelse af MES-buffer sammenlignet med fosfatbufferen. Da laserfluencen imidlertid blev øget for at have et ligeværdigt dosimetrirespons, var de gennemsnitlige peptidoxidationsværdier ikke signifikant forskellige efter FPOP i MES-buffer og fosfatbuffer (Figur 7)17. Dette eksperiment viser vigtigheden af kompensation af signalet for at kunne sammenligne fodaftryk med to FPOP betingelser, der har forskellige skyllekapacitet. Lignende forsøg har med succes anvendt adeninbaseret kompensation til at sonde strukturelle ændringer af almindelige hjælpestoffer i adalimumabpræparater30.

Figure 6
Figur 6: Kompensation for adenin dosimetriaflæsninger. Adeninaflæsningen før og efter laserbestrålingen blev registreret for FPOP i fosfatbuffer ved 265 nm med inline dosimeter. Da MES er en god skyllevæske af hydroxyl radikaler, forskellen i adenin aflæsninger var lavere. Øget laser fluence af FPOP løsning med MES buffer til at "kompensere" og overvinde effekten af MES buffer at have lignende adenin læsning som fosfat buffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Real-time kompensation for myoglobin oxidation ved inline adenin dosimetri. Myoglobin oxideret i (blå) 10 mM fosfat buffer og (orange) 10 mM MES buffer (orange). Som nævnt er oxidationen af peptiderne lavere i MES-bufferen. Da laserfluencen øges, for at prøverne i MES-bufferen har et næsten lignende adenindsimetriniveau sammenlignet med fosfatbufferen (grå), svarer peptidniveauet oxidation også til oxidationsniveauet set i prøver med fosfatbuffer. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Analytical Chemistry 2018, 90, 21, 12625-12630. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Massespektrometri-baserede strukturelle teknikker, herunder hydrogen-deuterium udveksling, kemiske krydsbinding, kovalent mærkning, og indfødte spray massespektrometri og ion mobilitet har været hastigt voksende i popularitet på grund af deres fleksibilitet, følsomhed og evne til at håndtere komplekse blandinger. FPOP kan prale af flere fordele, der har øget sin popularitet inden for massespektrometri-baserede strukturelle teknikker. Ligesom de fleste kovalente mærkning strategier, giver det en stabil kemisk øjebliksbillede af protein topografi, der er kompatibel med de fleste post-mærkning processer (f.eks trypsin fordøjelse, deglycosylation, osv.), undgå spørgsmål om back-udveksling og scrambling, der hindrer hydrogen-deuterium udveksling. Men i modsætning til traditionelle kovalente mærkning teknologier, der er målrettet specifikke aminosyrer, FPOP er i stand til at mærke en bred vifte af aminosyrer i et enkelt eksperiment. Desuden er FPOP i stand til at fuldføre den primære hydroxyl radikale-protein reaktion hurtigere end proteinerne er i stand til at udfolde sig for at fryse et kemisk øjebliksbillede af den indfødte kropsbygning14, selv om nogle sekundære reaktioner kan forekomme på en langsommeretidsskala 20,31,32. I modsætning til tidligere forsøg med hydroxyl radikale protein fodaftryk ved hjælp af røntgensynkrone strålelinjer, FPOP giver mulighed for denne ultra-hurtig mærkning i en benchtop format33,34. De største forhindringer i FPOP står over for den typiske protein masse spektrometri lab er erfaring i håndtering af prøver til FPOP, laser-baseret oxidation, og dataanalyse. Målet med denne rapport er at hjælpe nye efterforskere med at overvinde disse hindringer for at skabe værdifulde og reproducerbare resultater.

Proteiner kan gennemgå baggrundoxidation, der fejlagtigt kan give omfanget af oxidation på de identificerede peptider. For bedre at forstå dette fremstilles en kontrolprøve i replikater sammen med FPOP-prøver, hvor alle trin udføres, bortset fra at laseren ikke udløses (trin 3.4). Niveauet af oxidation i no-laser kontrol afslører niveauet af baggrundoxidation. In-source oxidation af peptider kan bidrage til den observerede peptid oxidation, og kan let bestemmes af LC elution profil af det uændrede peptid og modifikationen produkt. Hvis elution-profilerne overlapper hinanden, skyldes oxidationsproduktet næsten helt sikkert oxidation efter kolonnen. Oxidation ved kilden kan normalt reduceres ved at sænke ioniseringsspændingen og/eller øge afstanden mellem emitteren og ionoverførselsrøret. Anden baggrundoxidation kan enten være til stede i proteinet før FPOP-behandling, eller det kan induceres ved udsættelse for hydrogenperoxid. Sidstnævnte kan minimeres ved at reducere koncentrationen af hydrogenperoxid, der anvendes, og/eller reducere den tid, proteinet er i brintoverilte før dæmpning.

Et centralt problem, der ofte opstår af eksperimentatorer, der forsøger FPOP for første gang, er høj baggrundsoxidation. Denne høje baggrund oxidation skyldes normalt tilsætning af hydrogenperoxid til prøven før analyse. Mens to-elektron oxidation af hydrogenperoxid er meget langsommere end en-elektron oxidation af hydroxyl radikaler, hydrogenperoxid er stadig let i stand til at oxidere visse aminosyrer (især methionin og cystein) på en tidsskala minutter. Mens de øvrige komponenter i FPOP-blandingen er meget mere stabile, bør hydrogenperoxid tilsættes direkte før oxidation af FPOP. Som tommelfingerregel skal tiden mellem tilsætning af hydrogenperoxid og fuldstændig aflejring af prøven i dæmpningsopløsningen holdes på under fem minutter. Det er afgørende altid at indsamle en no-laser kontrol (hvor proteinet håndteres som normalt for FPOP, men laseren er ikke fyret) til at opdage eventuelle problemer med prøve oxidation, enten på grund af langvarig peroxid eksponering eller på grund af protein rensning og opbevaring. I tilfælde, hvor proteinet er særligt følsomt over for hydrogenperoxid, kan onlineblanding med hydrogenperoxid før bestråling med excimerlaseren begrænse eksponeringen tilsekunder eller mindre 31,35. Men for de fleste proteiner, online blanding er unødvendig.

Den næste vanskelige hurdle for mange nybegyndere FPOP eksperimentatorer er opsætningen af den optiske vej. Det er vigtigt, at laseren indkarer helt og holdent på kapillær for at få god fotolyse af brintoverilte. Mens UV laserlys er usynlig, vil det forårsage mange farvestoffer til stede i farvet papir til fluorescere i det synlige område. Derfor ved hjælp af et stykke farvet byggeri papir på bagstopperen kan hjælpe i tilpasningen af linsen og kapillær. Papiret kan bruges til at sikre, at laseren er helt og holdent slående midten af fokuslinsen, og derefter et stykke farvet papir på laser bagstopperen kan hjælpe med at fortælle, når kapillær er korrekt placeret i midten af den fokuserede stråle, som diffraktion af kapillær vil forårsage en silhuet i strålen profil(Figur 3B).

Det er også ofte ikke værdsat af nybegyndere efterforskere, at strålen tværsnitsareal ændringer baseret på puls energi. Derfor, hvis en investigator beregner sprøjten pumpens strømningshastighed baseret på en laser energi på 100 mJ / puls, og derefter øger laser energi til 120 mJ / puls, vil bredden af laserstrålen tilsvarende øge forårsager beregningerne at være forkert. For at forhindre dette problem anbefales det at bruge en uigennemsigtig blændeåbning. For kommercielle excimer lasere vi har arbejdet med, når laser energi per puls er øget den største ændring er i tværsnit af strålen, ikke laser fluence. Da koncentrationen af hydroxyl radikaler er delvist baseret på fluence af hændelsen UV-lys, blot at ændre laser energi per puls er ofte ineffektiv til at øge effektiv hydroxyl radikal dosering.

Reproducerbarhed er en anden fælles hurdle for nybegyndere efterforskere at overvinde. Mest almindeligt, en mangel på reproducerbarhed er forårsaget af en manglende generere tilsvarende hydroxyl radikale doser på tværs af forskellige replikater. Dette kan skyldes forkert optisk bænk justering, uforvarende brug af forskellige niveauer af hydroxyl radikale skyllemidler, eller brugen af alderen hydrogenperoxid. I alle tilfælde giver brugen af et internt dosimeter mulighed for hurtig identifikation af problemer med effektiv hydroxylrdikedosis. Hydroxyl radikale dosimetre handle ved at konkurrere med analysand (og med alle skyllevæsker i opløsning) for puljen af hydroxyl radikaler; den effektive dosis af hydroxyl radikaler måles ved at måle mængden af oxidation af dosimeteret. Bemærk, at "effektiv hydroxyl radikal dosis" er en funktion af både den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale genereret, og halveringstid af den radikale. Disse to parametre er delvist afhængige af hinanden, hvilket gør den teoretiske kinetiske modellering noget kompleks (figur 2). To prøver kunne have vildt forskellige indledende radikale halveringsliv og samtidig opretholde den samme effektive radikale dosis ved at ændre den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale dannet; de vil stadig generere identiske fodspor17. Adenin13 og Tris12 er praktisk hydroxyl radikale dosimeterer, fordi deres niveau af oxidation kan måles ved UV spektroskopi i realtid, giver mulighed for forskere til hurtigt at identificere, når der er et problem med effektiv hydroxyl radikal dosis og til fejlfinding af deres problem.

Dataanalyse er fortsat den mest tidskrævende del af ethvert FPOP-eksperiment. Mens der findes rapporter ved hjælp af kommercielle pakker til at kvantificere oxidation produkter, disse kvantificering algoritmer har svært ved korrekt at definere peak områder i delvist løst, asymmetriske toppe genereret fra grupper af oxidation isomerer21. I vores hænder, mens nuværende tilgængelige automatiserede softwarepakker normalt korrekt kan identificere ændringer i oxidation, de ofte ikke korrekt kvantificere omfanget af disse ændringer (ikke-offentliggjorte data), der kræver post-analyse revision og korrektion. I betragtning af de vanskeligheder, der er forbundet med FPOP-data, er den aktuelle status for den tilgængelige dataanalysesoftware, der overhovedet er i stand til at håndtere FPOP-kvantificering, bemærkelsesværdig. Fortsat softwareudvikling vil dog gavne feltet med øget nøjagtighed og pålidelighed.

Den protokol, der er beskrevet her, genererer en rumlig opløsning på peptidniveau af hydroxylrikande proteinfodaftryk. Det er muligt at generere rumlig opløsning op til aminosyren niveau; Der er dog stadig uenighed på området om den absolutte nøjagtighed af forskellige metoder til generering af disse FPOP-data med høj opløsning. En nylig undersøgelse, der sammenlignede hydrogen-deuterium udveksling og FPOP fandt, at FPOP data kan sonde opløsningsmiddel tilgængelighed på sub-aminosyreniveau 36. En metode bruger HPLC til at løse oxidations-isomerer så meget som muligt og derefter kvantificere hver isomer eftertopområde 1,23,24,25. Men når en simpel blanding af syntetisk peptidoxidation isomerer blev kvantificeret ved denne metode, fejl blev fundet i den absolutte kvantificering og tidligere rapporter har vist, at kollision-induceret dissociation MS / MS kan fejlidentificere steder af oxidation37,38. Kvantificering ved elektronoverførselsslydation (ETD) har vist sig at være nøjagtig med på syntetiske standarder og proteiner, men direkte anvendelse af denne metode kræver co-elution af alle oxiderede peptid isomerer, som ikke kan opnås ved hjælp af omvendt fase HPLC og generelt kræver størrelse udelukkelse kromatografi eller HILIC7,39,40,41; Ellers skal der anvendes komplicerede og tidskrævende målrettede ETD-analyser7,8,9. Den nuværende konsensus på området synes at være, at LC peak område-baserede aminosyre niveau kvantificering synes at i det mindste korrekt identificere steder af oxidation, der ændrer sig og korrekt identificere den relative mængde af ændringer (dvs. oxidation af aminosyre X falder med Y% i kropsbygning A i forhold til kropsbygning B), men nøjagtigheden af kvantificering af mængden af oxidation (dvs. syre amino X er Y% oxideret) forbliver i tvisten.

Styrken af FPOP som en fleksibel benchtop metode til sondering protein topografi på mange steder i et enkelt eksperiment driver fortsat interesse i denne teknologi, på trods af de nuværende forhindringer for den uerfarne investigator. Kommercielle muligheder for at udføre FPOP er lige begyndt at komme på markedet; Men det er stadig meget muligt for den interesserede investigator til at udvikle deres egen FPOP optisk bænk og udføre eksperimenter ved hjælp af almindeligt tilgængelige dataanalyse software. Efterhånden som feltet vokser, og forbedringerne af de tilgængelige værktøjer fortsætter, vil den lette adgang til FPOP-teknologi stige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Joshua S. Sharp afslører en betydelig økonomisk interesse i GenNext Technologies, Inc., en lille virksomhed, der søger at kommercialisere teknologier til protein højere orden struktur analyse, herunder hydroxyl radikale protein fodaftryk.

Acknowledgments

Vi anerkender forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences tilskud R43GM125420-01for at støtte kommerciel udvikling af en benchtop FPOP enhed og R01GM127267 til udvikling af standardisering og dosimetri protokoller for høj-energi FPOP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochemistry. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochemistry. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Tags

Biokemi Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) proteinfodertryk biosimilære kompensation flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS)
Aktivering af real-time kompensation i hurtige fotokemiske oxidationer af proteiner til bestemmelse af Protein Topografi Ændringer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling… More

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter