Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61580
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner er en fremvoksende teknikk for strukturell karakterisering av proteiner. Ulike løsemiddeltilsetningsstoffer og ligandes har varierte hydroksylradikale scavenging egenskaper. For å sammenligne proteinstrukturen under forskjellige forhold, er sanntidskompensasjon av hydroksylradikaler generert i reaksjonen nødvendig for å normalisere reaksjonsforholdene.

Abstract

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en massespektrometribasert strukturbiologiteknikk som sonderer det løsemiddeltilfredse overflatearealet av proteiner. Denne teknikken er avhengig av reaksjonen av aminosyre sidekjeder med hydroksylradikaler fritt diffusering i løsningen. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse av hydrogenperoksid, og skaper et utbrudd av hydroksylradikaler som er utarmet i rekkefølgen av et mikrosekund. Når disse hydroksylradikale reagerer med en løsningsmiddeltil hjelp tilgjengelig aminosyre sidekjede, viser reaksjonsproduktene et masseskifte som kan måles og kvantifiseres ved massespektrometri. Siden reaksjonshastigheten av en aminosyre avhenger delvis av den gjennomsnittlige løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av aminosyren, kan målte endringer i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert til endringer i oppløsningsvæsketilgjengeligheten i den regionen mellom forskjellige konformasjoner (f.eks ligand-bundet versus ligand-fri, monomer vs. aggregert, etc.) FPOP har blitt brukt i en rekke problemer i biologi, inkludert protein-protein interaksjoner, protein konformasjonsendringer, og protein-ligand binding. Etter hvert som den tilgjengelige konsentrasjonen av hydroksylradikaler varierer basert på mange eksperimentelle forhold i FPOP-eksperimentet, er det viktig å overvåke den effektive radikale dosen som proteinanalyttet eksponeres for. Denne overvåkingen oppnås effektivt ved å innlemme en inline dosimeter for å måle signalet fra FPOP-reaksjonen, med laserflyt justert i sanntid for å oppnå ønsket mengde oksidasjon. Med denne kompensasjonen kan endringer i proteintopografi som gjenspeiler konformasjonsendringer, ligandbindende overflater og/eller proteininteraksjonsgrensesnitt bestemmes i heterogene prøver ved hjelp av relativt lave prøvemengder.

Introduction

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en fremvoksende teknikk for bestemmelse av proteintografiske endringer ved ultrarask kovalent modifisering av det løsemiddelutsatte overflatearealet av proteiner etterfulgt av deteksjon av LC-MS1. FPOP genererer en høy konsentrasjon av hydroksylradikaler in situ ved UV laser flash fotolyse av hydrogenperoksid. Disse hydroksylradikale er svært reaktive og kortvarige, forbrukes på omtrent et mikrosekund tidsskala under FPOP forhold2. Disse hydroksylradikale diffuse gjennom vann og oksiderer ulike organiske komponenter i oppløsning ved kinetiske priser generelt fra rask (~ 106 M-1 s-1) til diffusjonskontrollert3. Når hydroksylradikale møter en proteinoverflate, vil radikaleren oksidere aminosyresidekjedene på proteinoverflaten, noe som resulterer i et masseskifte av den aminosyren (oftest nettotillegget av ett oksygenatom)4. Frekvensen av oksidasjonsreaksjonen ved en hvilken som helst aminosyre avhenger av to faktorer: den iboende reaktiviteten til aminosyren (som avhenger av sidekjeden og sekvenskonteksten)4,5 og tilgjengeligheten til sidekjeden til den diffuse hydroksylradikale, som nøye korrelerer til gjennomsnittlig løsningsmiddel tilgjengelig overflate6,,7. Alle standard aminosyrer unntatt glycin har blitt observert som merket av disse svært reaktive hydroksylradikale i FPOP eksperimenter, om enn ved vidt forskjellige utbytter; I praksis blir Ser, Thr, Asn og Ala sjelden sett på som oksidert i de fleste prøver unntatt under høye radikale doser og identifisert ved forsiktig og følsom målrettet ETD fragmentering8,9. Etter oksidasjon slukkes prøvene for å fjerne hydrogenperoksid og sekundære oksidanter (superoksid, enkeltoksygen, peptidyhydroperoksider osv.) De slukkede prøvene blir deretter proteolytisk fordøyd for å generere blandinger av oksidert peptider, hvor den strukturelle informasjonen er frosset som et kjemisk "øyeblikksbilde" i mønstrene til oksidasjonsprodukter av de ulike peptidene (figur 1). Flytende kromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS) brukes til å måle mengden oksidasjon av aminosyrer i et gitt proteolytisk peptid basert på de relative intensitetene i de oksiderte og ukoksidiserte versjonene av dette peptidet. Ved å sammenligne dette oksidative fotavtrykket av det samme proteinet oppnådd under forskjellige konformasjonsforhold (f.eks. ligand-bundet versus ligand-fri), kan forskjeller i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert med forskjeller i det løsemiddeltilfredse overflatearealet i den regionen6,7. Evnen til å gi protein topografisk informasjon gjør FPOP til en attraktiv teknologi for høyere rekkefølge struktur bestemmelse av proteiner, inkludert i protein terapeutisk oppdagelse og utvikling10,11.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over FPOP. Overflaten av proteinet er kovalent modifisert av svært reaktive hydroksylradikaler. Hydroksylradikale vil reagere med aminosyre sidekjeder av proteinet i en hastighet som er sterkt påvirket av løsemiddel tilgjengeligheten av sidekjeden. Topografiske endringer (for eksempel på grunn av bindingen av en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i samhandlingsområdet fra å reagere med hydroksylradikale, noe som resulterer i en reduksjon i intensiteten av modifisert peptid i LC-MS-signalet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ulike bestanddeler som finnes i FPOP-løsningen (f.eks. ligands, hjelpestoffer, buffere) har forskjellig scavenging aktivitet mot hydroksylradikale generert på laserfotolyse av hydrogenperoksid3. På samme måte kan en liten endring i peroksidkonsentrasjon, laserflyt og buffersammensetning endre den effektive radikale dosen, noe som gjør reproduksjonen av FPOP-data utfordrende på tvers av prøvene og mellom forskjellige laboratorier. Derfor er det viktig å kunne sammenligne hydroksylradikal dose tilgjengelig for å reagere med protein i hver prøve ved hjelp av en av flere tilgjengelige hydroksylradikale dosimeters12,13,,14,,15,,16. Hydroxylradikale dosimeters handle ved å konkurrere med analytten (og med alle scavengers i løsning) for bassenget av hydroksylradikale; den effektive dosen av hydroksylradikaler måles ved å måle mengden oksidasjon av dosimeteret. Legg merke til at "effektiv hydroksylradikal dose" er en funksjon av både den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikal generert og radikalens halveringstid. Disse to parametrene er delvis avhengige av hverandre, noe som gjør den teoretiske kinetiske modelleringen noe kompleks (figur 2). To prøver kan ha svært forskjellige innledende radikale halveringsliv samtidig som den opprettholder den samme effektive radikale dosen ved å endre den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikale dannet; de vil fortsatt generere identiske fotavtrykk17. Adenine13 og Tris12 er praktiske hydroksylradikale dosimeters fordi deres oksidasjonsnivå kan måles ved UV-spektroskopi i sanntid, slik at forskerne raskt kan identifisere når det er et problem med effektiv hydroksylradikal dose og for å feilsøke problemet. For å løse dette problemet er det viktig å finne en innebygd dosimeter i strømningssystemet rett etter bestrålingsstedet som kan overvåke signalet fra adeninabsorbansendringer i sanntid. Dette bidrar til å utføre FPOP eksperimenter i buffere eller andre hjelpestoffer med vidt forskjellige nivåer av hydroxyl radikal scavenging kapasitet17. Denne radikale doseringskompensasjonen kan utføres i sanntid, noe som gir statistisk umulige resultater for samme samsvar ved å justere den effektive radikale dosen.

I denne protokollen har vi detaljerte prosedyrer for å utføre et typisk FPOP-eksperiment med radikal doseringskompensasjon ved hjelp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metoden gjør det mulig for etterforskere å sammenligne fotavtrykk på tvers av FPOP-forhold som har forskjellig scavenging kapasitet ved å utføre kompensasjon i sanntid.

Figure 2
Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetrybasert kompensasjon. 1 m Adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozymanalytt med en 1 mM innledende hydroksylradikal konsentrasjon (▪OH t1/2=53 ns), og satt som en måldoserrespons (svart). Ved tilsetning av 1 mM av scavenger hjelpende histidin, dosimeter respons (blå) reduseres sammen med mengden protein oksidasjon på en proporsjonal måte (cyan). Halveringstiden til hydroksylradikalen reduseres også (▪OH t1/2=39 ns). Når mengden hydroksylradikal generert økes for å gi et tilsvarende utbytte av oksidert dosimeter i prøven med 1 mM histidin scavenger som oppnås med 1 mM hydroksylradikal i fravær av scaveng (rød), mengden proteinoksidasjon som oppstår på samme måte blir identisk (magenta), mens hydroksylradikal halveringstid reduseres ytterligere (▪OH t1/2=29 ns). Tilpasset med tillatelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjør den optiske benken og kapillæren for FPOP

FORSIKTIG: KrF excimer lasere er ekstreme øyefarer, og direkte eller reflektert lys kan forårsake permanent øyeskade. Bruk alltid passende øyebeskyttelse, unngå tilstedeværelse av reflekterende gjenstander i nærheten av strålebanen når det er mulig, og bruk tekniske kontroller for å forhindre uautorisert tilgang til en aktiv laser og for å begrense eventuelle bortkommen refleksjoner.

  1. Klargjør den optiske FPOP-benken.
    1. Slå på laseren for å varme opp. Sett laseren til ekstern utløser, konstant energi, ingen gasserstatning. Still inn laserenergien per puls (vanligvis mellom 80-120 mJ/puls).
    2. Sett opp den optiske benken med plano-konveks linse (30 mm Dia. x 120 mm FL ubestrøket) direkte i banen til laserstrålen og en ikke-reflekterende backstop for å absorbere lyset som vist i figur 3A.

Figure 3
Figur 3: Optisk benk for FPOP-eksperimentet. Prøvenblandes med H2O2, adeninradikal dosimeter og glutamin scavenger og lastet inn i sprøyten. Prøven skyves gjennom den smeltede silikakapillæren gjennom den fokuserte strålebanen til en KrF-excimer UV-laser. UV-lyset fotolyser H2O2 til hydroksylradikaler, som oksiderer proteinet og adenin dosimeter. Sprøytestrømmen skyver den opplyste prøven ut av laserens bane før neste laserpuls, med et ubesudlet ekskluderingsvolum mellom opplyste områder. Umiddelbart etter oksidasjon sendes prøven gjennom et inline UV-spektrofotometer, som måler UV-absorbansen av adenin ved 265 nm. Prøven deponeres deretter i en slukkebuffer for å eliminere de resterende H2O2 og sekundære oksidantene. (B) Spotstørrelsen måles etter bestråling av en farget klebrig notat festet bak kapillæren med laseren på 248 nm. Bredden på stedet brukes til å beregne prøvestrømningshastigheten, og silhuetten av kapillæren i midten av stedet brukes til å justere den optiske benken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Skjær en passende lengde på den smeltede silikakapillæren (360 μm ytre diameter og 100 μm indre diameter) og bruk en hylse, koble til den gasstette sprøyten ved hjelp av en lav dødvolumkontakt.
  2. Brenn forsiktig polyimidbelegget på kapillæren med en butanfakkel på stedet der den innebygde dosimeteren leser absorbanssignalet ved 265 nm etter lasereksponering av prøvene. Tørk av ruskene på kapillæren forsiktig ved hjelp av metanol på en lofri tørk. Polyimid belegget på stedet av laser forekomst kan enten være tilsvarende brent av med butan fakkelen eller brent av med excimer laser avfyring ved lav effekt.
    MERK: Vent til kapillæren avkjøles, da det er brannfare å bruke metanol på det varme kapillæret.
  3. Plasser denne kapillæren gjennom strålebanen til laseren og inn i den innebygde dosimeteren.
    1. Trykk spaken på toppen av den innebygde dosimeteren for å åpne hengslet. Fjern magnetholderne. Plasser kapillæren i det besjeede sporet på den innebygde dosimeteren, ved hjelp av magnetholderne for å holde kapillæren på plass. Lukk dosimeterhengslet over kapillæren, og trykk den til spaken låses på plass.
  4. Ved hjelp av dosimetry programvare, klikk på Start Flash-knappen for å begynne å skyte excimer laser. Still inn den forhåndsinnstilte lasereffekten mellom 50-100 mJ/puls på selve laserkontrollprogramvaren, og angi den forhåndsinnstilte repetisjonshastigheten mellom 10-20 Hz i kategorien Innstillinger i dosimetryprogramvaren.
    1. Fokuser laserstrålen ved hjelp av en plano konveks linse montert på et lineært motorisert stadium. Mål bredden og høyden på laserpunktet i kapillærens posisjon på en klebrig notat nøyaktig ved hjelp av en kalipper for å beregne hendelsesfløyt (mJ/mm2) som vist i figur 3B.
  5. Plasser en ugjennomsiktig blenderåpning i nærheten av kapillæren for å sikre konsekvent opplyst bredde på kapillæren uavhengig av endringer i strålestørrelsen på grunn av bevegelse av linsen eller endre energien per puls pålaseren 18.
    1. Med laseravfyring, flytt det motoriserte stadiet gjennom bevegelsesområdet. Sørg for at strålen forblir sentrert på blenderåpningen og silhuetten av kapillæren kan observeres gjennom. Blenderåpningens diameter må være mindre enn bredden på den impinging fokuserte strålen på hvert punkt i området av det motoriserte stadiet.
  6. Kjør vann gjennom kapillæren ved 20 μL/min i minst ett minutt for å vaske kapillæren.
    1. Klikk på Start Data + AutoZero -knappen på dosimeterprogramvaren for å nulle dosimeteren til vann og starte datainnsamling.
      MERK: Hvis buffersystemet for FPOP har betydelig UV-absorbans ved 265 nm, bør FPOP-systemet nulles på bufferen, ikke vann.
  7. Still inn den beregnede strømningshastigheten på sprøytepumpen.
    1. Strømningshastigheten til proteinprøven avhenger av bestrålt volum per skudd (VIrr), antall laserskudd per sekund (R), og ønsket uutstrålt eksklusjonsvolumfraksjon (FEx) for å korrigere for laminær strømningseffekter og prøvediffusjon (0,15-0,30 anbefales)2,,19,,20. Beregn VIrr (i μL) basert på kapillærens indre diameter i mm (d) og bredden på laserpunktet impinging på kapillæren (det vil si bredden på blenderåpningen) i mm (w) ved hjelp av følgende ligning:
      VIrr = π(d/2)2w
    2. Beregn ønsket strømningshastighet (i μL/min) basert på følgende ligning:
      Flow = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. Tilberedning av proteinoppløsningen for FPOP

  1. Forbered proteinet i de to eller flere forskjellige forholdene som skal sammenlignes (f.eks. ligand-bundet og ligand-fri, aggregert og monomer; alene og med en proteinbindingspartner; etc.) for å oppdage konformasjonsendringene.
  2. Angi det totale volumet som brukes for FPOP, slik at det passer til behovene til eksperimentet. Minimumsgrensen avhenger vanligvis av volumet av bestrålingskapillæren og materialet som kreves for robust deteksjon og relativ kvantifisering, og vil variere i stor grad avhengig av LC-MS / MS-systemet som brukes og ettermerkingsprøvebehandlingsmetoden. Det totale volumet for FPOP-løsninger som vanligvis brukes i vår gruppe er 20 μL etter tilsetning av hydrogenperoksid. Den endelige konsentrasjonen av proteinet er vanligvis 1-10 μM, med 17 mM glutamin (for å begrense levetiden til hydroksylradikale), 1 mM adenin (for å fungere som en radikal dosimeter)13,,17 og 10 mM fosfatbuffer (en buffer som er en dårlig scavenger av hydroksylradikale). Eksempler er vanligvis utarbeidet med flere replikere for å tillate statistisk modellering av resultater.
    1. For de fleste generelle formål, forberede prøver i triplicate i begge stater, pluss minst en prøve å bruke som en no-laser kontroll for å måle bakgrunnsoksidasjon. Forbered 18 μL av denne FPOP-løsningsblandingen.
      MERK: Mange buffere og tilsetningsstoffer som vanligvis brukes i biokjemi er hydroksylradikale scavengers. Disse tilsetningsstoffer og buffere kan brukes; Reduksjoner i oksidasjon på grunn av hydroksylradikal scavenging av bufferen kan imidlertid forekomme. Generelt, hold alle tilsetningsstoffer til det minste som kreves av det biologiske systemet for å maksimere proteinoksidasjonsutbyttet. Dimetylsulfoksid bør unngås på grunn av tilbøyelighet til å generere sekundære radikaler; dimetylformamid har vært et nyttig alternativ i våre hender. Ved bruk av buffere som er sterke hydroksylradikale scavengers, kan glutamin ofte utelukkes fra FPOP-løsningsblandingen.
  3. Forbered 1 M hydrogenperoksid umiddelbart før FPOP-eksperimentet.
    MERK: 30% hydrogenperoksid som vanligvis selges av leverandører inkluderer en stabilisator, noe som øker holdbarheten. Når fortynnet, hydrogenperoksid bør brukes raskt, definitivt innen samme dag. Hydrogenperoksid bør også regelmessig testes for nedbrytning av FPOP ved hjelp av en hydroksylradikal dosimeter.
  4. Forbered mikrocentrifugerør som inneholder 25 μL slukkeløsning på 0,5 μg/μL metionin midt og 0,5 μg/μL katalase. Hvis et prøvevolum som er større enn 20 μL brukes til FPOP, øker du volumet av slukkingsløsningen proporsjonalt.

3. Utfør FPOP-eksperimentet

  1. Tilsett 2 μL hydrogenperoksid i 18 μL av FPOP-løsningsblandingen. Bland innholdet forsiktig med en pipette og spinn raskt ned løsningen til bunnen av mikrocentrifugerørene. Oppsamling umiddelbart med en gasstett sprøyte og last inn i sprøytepumpen.
  2. Start strømmen på sprøytepumpen med strømningshastigheten som fastsatt i trinn 1.8.1 (vanligvis mellom 8-16 μL/min) ved å klikke startpumpeknappen på dosimeterprogramvaren.
  3. Overvåk den innebygde ladeninavlesningen i sanntid ved hjelp av den innebygde dosimeteren (se Materialsekk) og samle prøven i avfall. Vent til Abs265-signalet stabiliserer seg.
  4. Klikk på Start Flash-knappen i dosimeterprogramvaren for å starte avfyringen av laseren med forhåndsinnstilt repetisjonshastighet og energi.
  5. Overvåk den sanntids adeninlesning ved hjelp av en innebygd dosimeter (se Materialse tabell); forskjellen i Abs265 med laseren av og laseren på er ΔAbs265 lesing.
    MERK: Utseendet til svært ustabile Abs265 avlesninger ved avfyring av laseren i nærvær av hydrogenperoksid skyldes generering av bobler i løsningen. Reduser flyten av laseren og / eller konsentrasjonen av hydrogenperoksid for å eliminere boblene.

4. Utfør kompensasjon

MERK: Ulike ligande, buffere osv., kan ha forskjellig scavenging kapasitet mot hydroksylradikale. Det er viktig å sikre at sammenlignbare effektive hydroksylradikale doser er tilgjengelige for å reagere med protein på tvers av ulike prøver. Dette oppnås ved å sikre lik hydroksylradikal dosimeterrespons mellom prøvene. Ved hjelp av adenin dosimetry, endringen i UV absorbans ved 265 nm (ΔAbs265) gjenspeiler effektiv hydroksyl radikal dose; jo større ΔAbs265, jo høyere effektiv hydroksylradikal dose.

  1. Sammenlign ΔAbs265-avlesningen som er oppnådd med den innebygde dosimeteren med ønsket ΔAbs265-avlesning oppnådd ved tidligere eksperimenter eller kontroller. En ΔAbs265-avlesning lavere enn ønsket avlesning indikerer en utilstrekkelig effektiv dose hydroksylradikaler; en ΔAbs265-avlesning indikerer en effektiv radikal dose som er for høy. Hvis ΔAbs265-avlesningen er på ønsket nivå, må du samle prøven umiddelbart etter laser bestråling i den slukkebufferen 17.
  2. Kompenser den effektive radikale dosen for å utjevne ΔAbs265. Denne kompensasjonen kan utføres på tre måter: endre hydrogenperoksidkonsentrasjon, øke laserfløyten ved å endre laserenergien per puls, eller øke laserfløyten ved å endre fokusplanet til fokuslinsen.
    1. For å gjøre en stor endring (> 10 mAU) i ΔAbs265 lesing, remake prøven med mer eller mindre hydrogenperoksid og kjøre prøven i henhold til avsnitt 3.
    2. For å gjøre en liten endring i ΔAbs265-lesing i sanntid, juster fokusplanet til hendelsesstrålen ved å justere posisjonen til fokuslinsen ved hjelp av 50 mm Motorisert Stage. Å bringe fokalplanet nærmere kapillærens posisjon vil øke ΔAbs265-avlesningen; å bringe fokalplanet lenger fra kapillærens posisjon, vil redusere ΔAbs265-avlesningen.
  3. Overvåk adeninen ΔAbs265 for å måle den effektive mengden hydroksylradikale som finnes i prøven etter laserbestråling13. Sanntidsovervåking med en innebygd UV-kapillærdetektor gir mulighet for sanntidskompensasjon som beskrevet i 4.2.2; objektivposisjonen ved hjelp av det motoriserte trinnet til ΔAbs265-avlesningen er lik ønsket avlesning. Post-eksperimentelle absorbansmålinger med et UV-spektrofotometer er også nøyaktige, men krever nye prøver som skal brukes for hver effektive radikale dose.

5. Fordøy proteinprøvene

MERK: Trypsin brukes oftest til å fordøye proteinprøver for FPOP, og er protease som brukes i denne protokollen. Det er en pålitelig protease som genererer peptider med grunnleggende nettsteder både på N- og C-terminus, fremme multiplisere ladede peptid ioner i MS. Videre cleaves det etter lysin og arginin, to aminosyrer som bare er moderat reaktive til hydroksylradikaler; Derfor er endringer i fordøyelsesmønsteret på grunn av analyseoksidasjon sjelden. Andre proteaser har blitt brukt med FPOP21, men det bør tas hensyn til å sikre at fordøyelsesmønstrene kan sammenlignes mellom ukoksidiserte og oksiderte prøver.

  1. Mål det endelige volumet av den kvantede FPOP-prøven. Tilsett 500 mM Tris, pH 8.0 med 10 mM CaCl2 som inneholder 50 mM dithiothreitol (DTT) til proteinoppløsningen etter slukking til en endelig konsentrasjon på 50 mM Tris, 1 mM CaCl2 og 5 mM DTT.
  2. Varm proteinprøven ved 95 °C i 15 minutter.
  3. Avkjøl prøven umiddelbart på is i 2 min.
  4. Tilsett 1:20 trypsin / protein vekt forholdet til prøvene.
  5. Fordøy proteinet over natten ved 37 °C med blanding.
  6. Stopp fordøyelsesreaksjonen ved tilsetning av 0,1% maursyre og/ eller oppvarming av prøven til 95 °C i 10 min.
  7. Tilsett 2 mM DTT i prøvene og varme ved 60 °C i 15 min umiddelbart før LC-MS/MS.
    MERK: Mens andre grupper har rapportert alkylasjon av tioler i FPOP-eksperimenter, har vi i våre hender notert sideprodukter ved alkylering av oksiderte proteiner (muligens på grunn av reaksjon med nukleofile karbonyler dannet som et mindre oksidasjonsprodukt). Derfor velger vi å unngå alkylasjon av tioler når det er mulig.

6. Utfør flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)

  1. Forbered den mobile fase A bestående av vann som inneholder 0,1% maursyre og mobil fase B bestående av acetonitril med 0,1% maursyre.
  2. Legg prøven først på en C18 fellekolonne (300 μm ID x 5 mm 100 Å porestørrelse, 5 μm partikkelstørrelse) fangstpatron og vask med 2 % oppløsningsvæske B i 3 minutter med en strømningshastighet på 5,0 μL/min for å fjerne salter og hydrofile små molekyler.
  3. Deretter skiller du peptidene på C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikkelstørrelse, 100 Å porestørrelse) med en strømningshastighet på 300 nL/min. Gradienten består av en lineær økning fra 2 til 35% løsningsmiddel B over 22 min, rampet til 95% løsningsmiddel B over 5 min og holdt i 3 min for å vaske kolonnen, og deretter tilbake til 2% B over 3 min og holdt i 9 min for å re-likevekt kolonnen.
    MERK: Denne gradienten er tilstrekkelig for LC-MS/MS av de fleste en- og to-protein FPOP-blandinger som søker å gjøre peptid-nivå kvantifisering. Prosentandelen av løsningsmiddel B må kanskje endres for å øke peptidoppløsningen i sjeldne tilfeller der peptider forstyrrer hverandre på grunn av lignende oppbevaringstider og m/z-verdier. Proteome-skala FPOP22 eller eksperimentelle design som søker å skille peptid oksidasjon produkt isomers1,,23,,24,,25 kan kreve lengre LC gradienter og er utenfor omfanget av denne rapporten.
  4. Elute peptidene direkte inn i nanospraykilden til et høyoppløselig massespektrometer ved hjelp av en ledende nanosprayemitter.
  5. Hent dataene i positiv ion-modus. Sett sprøytespenningen til 2400 V, og temperaturen på irasjonsoverføringsrøret til 300 °C.
  6. Få alle MS-skanninger fra m/z 250 til 2000 med nominell oppløsning ved m/z 200 av 60 000 etterfulgt av åtte påfølgende dataavhengige lineære iionfelle MS/MS-skanninger på de åtte rikeste peptidionene ved hjelp av kollisjonsindusert dissosiasjon ved 35 % normalisert energi for å identifisere peptidene. Fragmenter peptidene opptil fem ganger innen 30 s og overfør deretter til en ekskluderingsliste for 60 s.

7. Databehandling og beregning av gjennomsnittlig oksidasjon av peptider

  1. Bestem sekvensdekningen av protein-, m/z-verdiene og oppbevaringstidene for usoksidiserte peptider ved hjelp av MS/MS-proteomics-søkemotoren.
  2. Sett forløpermassetoleransen til 10 ppm og la opptil to tapte spaltingssteder for trypsin-fordøyde prøver, ved hjelp av standard trypsin cleavage spesifisitet.
  3. Sett peptid masse fragment massetoleranse til 0,4 Daltons.
  4. Basert på m / z forholdet mellom de umodifiserte peptider oppdaget og de kjente masseskiftene av de store oksidasjonsproduktene, beregne m / z av de ulike teoretiske oksidasjonsprodukter av hver peptid4,26,27,28,29.
  5. Identifiser det ekstraherte ionkromatrammet for disse m/z-verdiene ved hjelp av programvare for å vise massespektrometrisk kjøring (figur 4). Identifiser peptidoksidasjonsproduktene basert på deres m / z,deres ladetilstand og likheten i elution tid til det umodifiserte peptidet. I våre hender, peptid oksidasjonsprodukter elute mellom 240 sekunder før til 180 sekunder etter umodifisert peptid ved hjelp av LC gradient ovenfor. Siden oksidasjon ofte vil resultere i flere inoeiske oksidasjonsprodukter, er det vanlig å observere flere delvis løste topper i de ekstraherte isjonskromogrammene av peptidoksidasjonsprodukter, som vist i figur 4. Peptidoksidasjonsprodukter kvantifiseres basert på området av toppen(e) i de ekstraherte ionkromatrammene.

Figure 4
Figur 4: Ekstrahert ionkromatogram av et peptid og dets oksidasjonsprodukter etter FPOP. M/z av peptidoksidasjonsproduktene beregnes basert på m/z av det usoksidiserte peptidet og de kjente oksidasjonsproduktene; og områdene av disse peptidproduktene bestemmes. Området av peptidproduktene brukes deretter til beregning av de gjennomsnittlige oksidasjonshendelsene per peptid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Beregn gjennomsnittlig oksidasjon av peptidene ved hjelp av følgende ligning.

Equation 1

der P betegner gjennomsnittlig antall oksidasjonshendelser per peptidmolekyl, og jeg representerer toppområdet til det ukoksidiserte peptidet (Iunoxidized) og peptidet med n oksidasjonshendelser. Merk at jeg (enkeltoksidert) ikke bare vil omfatte tillegg av et enkelt oksygenatom, men også andre mindre vanlige enkeltoksidasjonshendelser som utprøveren kan velge å måle (f.eks. oksidativ dekarboksylering, karbonyldannelse, etc.) 4,26,27,28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligning av det tunge kjedepeptidavtrykket til adalimumab biosimilar i fosfatbufferen og ved oppvarming ved 55 °C i 1 time viser interessante resultater. Studentens t-test brukes til identifisering av peptider som er betydelig endret under disse to forholdene (p ≤ 0,05). Peptidene 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 og 414-420 viser betydelig beskyttelse mot løsemiddel når proteinet varmes opp for å danne aggregater (figur 5)30. Dette eksperimentet identifiserte peptidområdene som opplever topografiske endringer ved oppvarming og aggregering.

Figure 5
Figur 5: Peptidnivåfotavtrykk av den tunge kjeden av adalimumab. Dengjennomsnittlige peptidoksidasjonen av adalimumab (blå) ved romtemperatur, og (oransje) etter at adalimumab varmes opp ved 55 °C i 1 time, og deretter avkjølt til romtemperatur. Feilfeltene representerer ett standardavvik for triplikatemålinger. Stjernen representerer peptidene som endres betydelig under de to forholdene (p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

FPOP-eksperiment av myoglobin ble utført i nærvær av 10 mM fosfat og 10 mM 2-(N-morpholino)amosulfonsyre (MES) buffer. MES buffer fungerer som en god scavenger av hydroksylradikale generert på fotolyse av hydrogenperoksid etter at prøven er utsatt for laserbestråling. Forskjellen i absorbansen av adenin overvåkes ved hjelp av en innebygd dosimeter i sanntid. Laserfluensen justeres på en måte for å få en sammenlignbar endring i adeninabsorpsjonsnivået i MES-bufferen sammenlignet med fosfatbufferen (figur 6)17. Gjennomsnittlig oksidasjon av peptider var lavere i nærvær av MES-buffer sammenlignet med fosfatbufferen. Men etter hvert som laserfluensen ble økt til å ha en lik adenin dosimetry respons, var de gjennomsnittlige peptidoksidasjonsverdiene ikke signifikant forskjellige etter FPOP i MES-buffer og fosfatbuffer (figur 7)17. Dette eksperimentet viser viktigheten av kompensasjon av signalet for å kunne sammenligne fotavtrykket med to FPOP-forhold som har forskjellig scavenging kapasitet. Lignende eksperimenter har med hell brukt adeninbasert kompensasjon for å undersøke strukturelle endringer av vanlige hjelpestoffer i adalimumabpreparater30.

Figure 6
Figur 6: Kompensasjon av adenin dosimetry målinger. Adeninavlesningen før og etter laser bestråling ble registrert for FPOP i fosfatbuffer ved 265 nm ved bruk av inline dosimeter. Siden MES er en god scavenger av hydroksylradikale, var forskjellen i adeninavlesninger lavere. Økt laserfluens av FPOP-løsning med MES-buffer for å "kompensere" og overvinne effekten av MES-buffer for å ha lignende adeninlesning som fosfatbuffer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sanntidskompensasjon av myoglobinoksidasjon ved inline adenin dosimetry. Myoglobin oksidert i (blå) 10 mM fosfatbuffer og (oransje) 10 mM MES-buffer (oransje). Som nevnt er oksidasjonen av peptidene lavere i MES-bufferen. Etter hvert som laserfluensen økes for at prøvene i MES-bufferen har nesten tilsvarende adenin dosimetrynivå sammenlignet med fosfatbuffer (grå), er peptidnivåoksidasjonen også lik oksidasjonsnivået sett i prøver med fosfatbuffer. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Analytisk kjemi 2018, 90, 21, 12625-12630. Opphavsrett 2018 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Massespektrometribaserte strukturelle teknikker, inkludert hydrogendeuteriumutveksling, kjemisk krysskobling, kovalent merking og innfødt spraymassespektrometri og ionmobilitet har vokst raskt i popularitet på grunn av deres fleksibilitet, følsomhet og evne til å håndtere komplekse blandinger. FPOP har flere fordeler som har økt sin popularitet i området massespektrometribaserte strukturelle teknikker. Som de fleste kovalente merkingsstrategier gir det et stabilt kjemisk øyeblikksbilde av proteintopografi som er kompatibel med de fleste postmerkingsprosesser (f.eks. trypsinfordøyelse, deglykosylering, etc.), unngå problemer med tilbakebytte og scrambling som hindrer hydrogen-deuteriumutveksling. Men i motsetning til tradisjonelle kovalente merking teknologier som målrettes spesifikke aminosyrer, FPOP er i stand til å merke et bredt spekter av aminosyrer i et enkelt eksperiment. Videre er FPOP i stand til å fullføre den primære hydroksylradikale proteinreaksjonen raskere enn proteinene er i stand til å utfolde seg for å fryse et kjemisk øyeblikksbilde av den opprinneligekonformasjonen 14,selv om noen sekundære reaksjoner kan oppstå på en langsommere tidsskala20,31,,32. I motsetning til tidligere eksperimenter i hydroksylradikal proteinavtrykk ved hjelp av røntgensynkronronstrålelinjer, tillater FPOP denne ultraraske merkingen i et benkeplateformat33,,34. De store hindringene i FPOP som den typiske proteinmassespektrometrilaboratoriet står overfor, er erfaring med å håndtere prøver for FPOP, laserbasert oksidasjon og dataanalyse. Målet med denne rapporten er å hjelpe nye etterforskere med å overvinne disse hindringene for å generere verdifulle og reproduserbare resultater.

Proteiner kan gjennomgå bakgrunnsoksidasjon som feilaktig kan gi omfanget av oksidasjon på de identifiserte peptidene. For bedre å forstå dette, er en kontrollprøve utarbeidet i replikerer sammen med FPOP-prøver der alle trinnene utføres, bortsett fra at laseren ikke utløses (trinn 3.4). Nivået av oksidasjon i no-laser-kontrollen avslører nivået av bakgrunnsoksidasjon. In-source oksidasjon av peptider kan bidra til observert peptid oksidasjon, og kan lett bestemmes av LC elution profilen av umodifisert peptid og modifikasjon produktet. Hvis elutionprofilene overlapper identisk, er oksidasjonsproduktet nesten helt sikkert på grunn av oksidasjon etter kolonne i kilde. Oksidasjon i kilden kan vanligvis reduseres ved å senke ioniseringsspenningen og/eller øke avstanden mellom emitteren og igreringsrøret. Andre bakgrunnsoksidasjon kan enten være til stede i proteinet før FPOP behandling, eller det kan induseres ved eksponering for hydrogenperoksid. Sistnevnte kan minimeres ved å redusere konsentrasjonen av hydrogenperoksid som brukes og/eller redusere tiden proteinet er i hydrogenperoksid før slukking.

Et viktig problem som ofte oppstår av eksperimenterere som prøver FPOP for første gang, er høy bakgrunnsoksidasjon. Denne høye bakgrunnsoksidasjonen skyldes vanligvis tilsetning av hydrogenperoksid til prøven før analyse. Mens to-elektron oksidasjon av hydrogenperoksid er mye tregere enn en-elektron oksidasjon av hydroksylradikaler, hydrogenperoksid er fortsatt lett i stand til å oksidere visse aminosyrer (spesielt metionin og cystein) på en tidsskala av minutter. Mens de andre komponentene i FPOP-blandingen er mye mer stabile, bør hydrogenperoksid tilsettes direkte før oksidasjon av FPOP. Som en tommelfingerregel bør tiden mellom tilsetning av hydrogenperoksid og fullstendig avsetning av prøven i den slukkende løsningen holdes til under fem minutter. Det er viktig å alltid samle en no-laser kontroll (hvor proteinet håndteres som normalt for FPOP, men laseren er ikke avfyrt) for å oppdage eventuelle problemer med prøve oksidasjon, enten på grunn av langvarig peroksid eksponering eller på grunn av protein rensing og lagring. For tilfeller der proteinet er spesielt følsomt for hydrogenperoksid, kan on-line blanding med hydrogenperoksid før bestråling med excimer laser begrense eksponering for sekunder eller mindre31,35. Men for de fleste proteiner er online blanding unødvendig.

Det neste vanskelige hinderet for mange nybegynnere FPOP eksperimenterere er oppsettet av den optiske banen. Det er viktig at laseren impinges rett på kapillær for å få god fotolyse av hydrogenperoksid. Mens UV-laserlyset er usynlig, vil det føre til at mange fargestoffer tilstede i farget papir fluorescerer i det synlige området. Derfor kan bruk av et stykke farget byggepapir på baksiden hjelpe i justeringen av linsen og kapillæren. Papiret kan brukes til å sikre at laseren er firkantet treffer midten av fokuslinsen, og deretter et stykke farget papir på laser backstop kan bidra til å fortelle når kapillæren er vellykket plassert i midten av den fokuserte strålen, som diffraksjon av kapillæren vil føre til en silhuett i stråleprofilen (Figur 3B).

Det er heller ikke ofte verdsatt av nybegynnere etterforskere at strålen tverrsnittsområdet endres basert på pulsenergien. Derfor, hvis en utprøver beregner sprøytepumpestrømningshastigheten basert på en laserenergi på 100 mJ/puls, og deretter øker laserenergien til 120 mJ/puls, vil bredden på laserstrålen på samme måte øke årsaken til at beregningene er feil. For å forhindre dette problemet anbefales bruk av en ugjennomsiktig blenderåpning. For kommersielle excimer lasere vi har jobbet med, når laserenergien per puls økes, er den største endringen i tverrsnittet av strålen, ikke laserfløyten. Siden konsentrasjonen av hydroksylradikale er delvis basert på flyten av hendelsen UV-lys, bare endre laserenergi per puls er ofte ineffektiv til å øke effektiv hydroksyl radikal dosering.

Reproduserbarhet er et annet vanlig hinder for nybegynnere å overvinne. Oftest er mangel på reproduserbarhet forårsaket av en unnlatelse av å generere tilsvarende hydroksylradikale doser på tvers av forskjellige repliker. Dette kan skyldes feil optisk benkjustering, uforvarende bruk av ulike nivåer av hydroksylradikale scavenging agenter, eller bruk av alderen hydrogenperoksid. For alle tilfellene tillater bruk av en intern dosimeter rask identifisering av problemer med effektiv hydroksylradikal dose. Hydroxylradikale dosimeters handle ved å konkurrere med analytten (og med alle scavengers i løsning) for bassenget av hydroksylradikale; den effektive dosen av hydroksylradikaler måles ved å måle mengden oksidasjon av dosimeteret. Legg merke til at "effektiv hydroksylradikal dose" er en funksjon av både den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikal generert, og radikalens halveringstid. Disse to parametrene er delvis avhengige av hverandre, noe som gjør den teoretiske kinetiske modelleringen noe kompleks (figur 2). To prøver kan ha svært forskjellige innledende radikale halveringsliv samtidig som den opprettholder den samme effektive radikale dosen ved å endre den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikale dannet; de vil fortsatt generere identiske fotavtrykk17. Adenine13 og Tris12 er praktiske hydroksylradikale dosimeters fordi deres oksidasjonsnivå kan måles ved UV-spektroskopi i sanntid, slik at forskerne raskt kan identifisere når det er et problem med effektiv hydroksylradikal dose og for å feilsøke problemet.

Dataanalyse er fortsatt den mest tidskrevende delen av ethvert FPOP-eksperiment. Mens rapporter eksisterer ved hjelp av kommersielle pakker for å kvantifisere oksidasjonsprodukter, har disse kvantifiseringsalgoritmene vanskeligheter med å definere toppområder i de delvis løste, asymmetriske toppene generert fra grupper av oksidasjonsisomers21. I våre hender, mens nåværende tilgjengelige automatiserte programvarepakker vanligvis kan korrekt identifisere endringer i oksidasjon, kvantifiserer de ofte ikke riktig omfanget av disse endringene (upubliserte data), som krever revisjon og korrigering etter analyse. Gitt vanskelighetene presentert av FPOP-data, er den nåværende statusen til tilgjengelig dataanalyseprogramvare som er i stand til å håndtere FPOP-kvantifisering i det hele tatt bemerkelsesverdig; Fortsatt programvareutvikling vil imidlertid være til nytte for feltet med økninger i nøyaktighet og pålitelighet.

Protokollen som er beskrevet her genererer en peptid-nivå romlig oppløsning av hydroksylradikale proteinfotavtrykk. Det er mulig å generere romlig oppløsning opp til aminosyrenivået; Uenigheter i feltet er imidlertid fortsatt om den absolutte nøyaktigheten av ulike metoder for å generere disse høyoppløsnings FPOP-dataene. En fersk studie som sammenligner hydrogen-deuteriumutveksling og FPOP fant at FPOP-data kan undersøke løsningsmiddeltilgjengelighet på sub-aminosyrenivå36. En metode bruker HPLC til å løse oksidasjonsisomere så mye som mulig, og deretter å kvantifisere hver isomer etter toppområde1,,23,,24,,25. Men når en enkel blanding av syntetisk peptidoksidasjon isomers ble kvantifisert ved denne metoden, ble det funnet feil i den absolutte kvantifiseringen, og tidligere rapporter har indikert at kollisjonsindusert dissosiasjon MS / MS kan feilidentifisereoksidasjonssteder 37,38. Kvantifisering ved elektronoverføring dissosiasjon (ETD) har vist seg å være nøyaktig på syntetiske standarder og proteiner, men direkte anvendelse av denne metoden krever co-elution av alle oksidert peptid isomers som ikke kan oppnås ved hjelp av reversert fase HPLC og generelt krever størrelse eksklusjon kromatografi eller HILIC7,,39,,40,41; Ellers må kompliserte og tidkrevende målrettede ETD-analyser brukes7,,8,,9. Den nåværende konsensus i feltet synes å være at LC peak områdebasert aminosyrenivå kvantifisering synes å i det minste korrekt identifisere oksidasjonssteder som endres og korrekt identifisere den relative mengden endring (det vil si, oksidasjon av aminosyre X reduseres med Y% i konformasjon A sammenlignet med konformasjon B), men nøyaktigheten av kvantifisering av mengden oksidasjon (det vil si at aminosyre X er Y% oksidert) forblir i tvist.

Styrkene til FPOP som en fleksibel benkeplate metode for sondering protein topografi på mange steder i et enkelt eksperiment driver fortsatt interesse for denne teknologien, til tross for dagens hindringer for nybegynner etterforsker. Kommersielle alternativer for å utføre FPOP er bare begynt å komme på markedet; Det er imidlertid fortsatt fullt mulig for den interesserte undersøkeren å utvikle sin egen FPOP optiske benk og utføre eksperimenter ved hjelp av allment tilgjengelig dataanalyseprogramvare. Etter hvert som feltet vokser og forbedringer av de tilgjengelige verktøyene fortsetter, vil enkel tilgang til FPOP-teknologi øke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Joshua S. Sharp avslører en betydelig økonomisk interesse i GenNext Technologies, Inc., et lite selskap som søker å kommersialisere teknologier for proteinanalyse av høyere ordrestruktur, inkludert hydroksylradikal proteinfotavtrykk.

Acknowledgments

Vi anerkjenner forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences stipend R43GM125420-01for å støtte kommersiell utvikling av en benkeplate FPOP enhet og R01GM127267 for utvikling av standardisering og dosimetry protokoller for høyenergi FPOP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochemistry. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochemistry. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Tags

Biokjemi Utgave 163 Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) proteinfotavtrykk biotilsvarende kompensasjon flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS)
Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling… More

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter