I dette metodepapiret presenterer vi en screeningstrategi med høy gjennomstrømning for å identifisere kjemiske forbindelser, for eksempel osmolytter, som har en betydelig innvirkning på bakteriell utholdenhet.
Bakterielle persisters er definert som en liten subpopulation av fenotypiske varianter med evnen til å tolerere høye konsentrasjoner av antibiotika. De er et viktig helseproblem da de har vært forbundet med tilbakevendende kroniske infeksjoner. Selv om stokastisk og deterministisk dynamikk i stressrelaterte mekanismer er kjent for å spille en betydelig rolle i utholdenhet, er mekanismer som ligger til grunn for fenotypisk bytte til / fra utholdenhetstilstanden ikke helt forstått. Mens utholdenhetsfaktorer utløst av miljøsignaler (f.eks. uttømming av karbon-, nitrogen- og oksygenkilder) er grundig studert, er virkningene av osmolytter på utholdenhet ennå ikke bestemt. Ved hjelp av mikroarrays (dvs. 96 brønnplater som inneholder ulike kjemikalier), har vi designet en tilnærming for å belyse effekten av ulike osmolytter på Escherichia coli utholdenhet på en høy gjennomstrømning måte. Denne tilnærmingen er transformativ, da den lett kan tilpasses andre screeningmatriser, for eksempel stoffpaneler og genutslagsbiblioteker.
Bakteriekulturer inneholder en liten subpopulasjon av utholdenhetsceller som er midlertidig tolerante for uvanlig høye nivåer av antibiotika. Persisterceller er genetisk identiske med deres antibiotikafølsomme huder, og deres overlevelse har blitt tilskrevet forbigående veksthemming1. Persister celler ble først oppdaget av Gladys Hobby2, men begrepet ble først brukt av Joseph Bigger da han identifiserte dem i penicillin-behandlet Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminalstudie publisert av Balaban et al.4 oppdaget to utholdenhetstyper: type I-varianter som hovedsakelig dannes ved passasje gjennom den stasjonære fasen, og type II-varianter som kontinuerlig genereres under den eksponentielle veksten. Persisters oppdages av clonogenic overlevelsesanalyser, der kulturprøver tas med ulike intervaller under antibiotikabehandlinger, vasket og belagt på et typisk vekstmedium for å telle de overlevende cellene som kan kolonisere i fravær av antibiotika. Eksistensen av persisters i en cellekultur vurderes av en bifasisk drapskurve4,5 der det første eksponentielle forfallet indikerer død av antibiotikafølsomme celler. Imidlertid reduseres drapstrenden over tid, noe som til slutt fører til en platåregion som representerer de overlevende utholdenhetscellene.
Persisterceller har vært forbundet med ulike sykdommer som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinveisinfeksjoner9. Nesten alle mikroorganismer testet så langt ble funnet å generere persister fenotyper, inkludert svært patogen Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nyere studier gir også bevis på økningen av multidrug-resistente mutanter fra persister subpopulations11,12. Betydelig innsats på dette feltet har avdekket at utholdenhetsmekanismer er svært komplekse og mangfoldige; både stokastiske og deterministiske faktorer forbundet med SOS-responsen13,14, reaktive oksygenarter (ROS)15, toksin/antitoksin (TA) systemer16, autofagi eller selvfordøyelse17 og ppGpp-relatert streng respons18 er kjent for å lette utholdenhetsdannelse.
Til tross for betydelig fremgang i å forstå utholdenhet fenotypen, har effekten av osmolytter på bakteriell utholdenhet ikke blitt fullt ut forstått. Siden vedlikehold av optimalt osmotisk trykk er en nødvendighet for cellenes vekst, riktig funksjon og overlevelse, kan en grundig studie av osmolytter føre til potensielle mål for anti-persister strategier. Selv om arbeidskrevende, høy gjennomstrømning screening er en svært effektiv tilnærming for å identifisere metabolitter og andre kjemikalier som spiller en avgjørende rolle i utholdenhet fenotype19,20. I dette arbeidet vil vi diskutere vår publiserte metode19, hvor vi har brukt mikroarrays, det vil si 96 brønnplater som inneholder ulike osmolytter (f.eks. natriumklorid, urea, natriumnitritt, natriumnitrat, kaliumklorid), for å identifisere osmolytter som betydelig påvirker E. coli utholdenhet.
Den høye gjennomstrømningen vedvarer analysen beskrevet her ble utviklet for å belyse effekten av ulike kjemikalier på E. coli utholdenhet. I tillegg til kommersielle PM-plater kan mikroarrayer konstrueres manuelt som beskrevet i trinn 4.2. Dessuten er protokollen som presenteres her fleksibel og kan brukes til å screene andre mikroarrays, for eksempel narkotikapaneler og cellebiblioteker, som er i 96 brønnplateformater. De eksperimentelle forholdene, inkludert vekstfasen, inokulasjonsraten og mediet, kan …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke medlemmene av Orman Lab for deres verdifulle innspill i løpet av denne studien. Denne studien ble finansiert av NIH/NIAID K22AI125468 karriereovergangspris og et oppstartsstipend fra University of Houston.
14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |