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Biology

Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom para la biopsia del musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra.

Abstract

Las propiedades mecánicas de la contraer fibras esqueléticas son indicadores cruciales de la salud muscular general, función, y el rendimiento. Las biopsias de músculo esquelético humano a menudo se recogen para estos esfuerzos. Sin embargo, hay disponibles relativamente pocas descripciones técnicas de los procedimientos de biopsia, fuera del musculus vastus lateralis comúnmente utilizado. Aunque las técnicas de biopsia a menudo se ajustan para adaptarse a las características de cada músculo en estudio, pocos informes técnicos comparten estos cambios a la comunidad en general. Por lo tanto, el tejido muscular de los participantes humanos a menudo se desperdicia a medida que el operador reinventa la rueda. La ampliación del material disponible en biopsias de una variedad de músculos puede reducir el incidente de biopsias fallidas. Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom en el musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra y proporciona longitudes de fibra adecuadas para la evaluación mecánica. La cirugía es un procedimiento ambulatorio que se puede completar en una hora. El período de recuperación de este procedimiento es inmediato para la actividad ligera (es decir, caminar), hasta tres días para la reanudación de la actividad física normal, y aproximadamente una semana para el cuidado de heridas. El tejido extraído se puede utilizar para experimentos de fuerza mecánica y aquí presentamos datos representativos de activación. Este protocolo es apropiado para la mayoría de los propósitos de recolección, potencialmente adaptable a otros músculos esqueléticos, y puede mejorarse mediante modificaciones en la aguja de recolección.

Introduction

El estudio de la fisiología muscular humana con fines clínicos o de investigación a menudo requiere biopsias musculares. Por ejemplo, un desafío importante en la fisiología muscular humana y la biomecánica es distinguir y entender las diversas adaptaciones del rendimiento muscular al ejercicio. Las adaptaciones de rendimiento no sólo incluyen adaptaciones estructurales (por ejemplo, cambios en las proteínas contráctiles, arquitectura muscular) sino que también incluyen adaptaciones neuronales1,que son muy duras, si no imposibles, de evaluar por separado cuando se prueban intactos músculos humanos in situ. Los experimentos a nivel de fibra eliminan estos componentes de orden superior y permiten una evaluación más directa de la contracción muscular y se pueden recolectar mediante técnicas de biopsia. Las biopsias musculares se han recogido desde al menos 18682. Hoy en día, la técnica predominante para recoger biopsias musculares es la técnica modificada Bergstrom3,4,5, aunque hay otras técnicas disponibles incluyendo el uso de un conchotóma Weil-Blakesley6 o la llamada aguja fina7,8. Todas estas técnicas utilizan instrumentos especiales similares a agujas que están diseñados para pasar al músculo y cortar un pedazo de tejido. Específicamente, la técnica modificada de Bergstrom utiliza una aguja modificada grande (tamaño de aguja de 5 mm aquí; Figura 1) que tiene una ventana cerca de la punta de la aguja y un trocar interno más pequeño que se mueve hacia arriba y hacia abajo de la aguja, cortando el músculo al pasar por encima de la ventana de la aguja. Dentro de este trocar hallado hay una varilla que se mueve hacia arriba y hacia abajo en el eje del trocar y empuja la biopsia hacia la ventana de la aguja. Para tirar del músculo dentro de la ventana de la aguja, se une una manguera de succión, que succiona el aire de la aguja y tira del músculo hacia la ventana de la aguja a través de la presión negativa.

Las biopsias musculares a menudo se adquieren para estudiar los cambios en el contenido de proteínas, la expresión génica o la morfología causada por la enfermedad o en una respuesta a un programa deejercicios 1,9,10,11. Otro uso crítico para las biopsias musculares son experimentos mecánicos como la medición de la fuerza contráctil de fibra, rigidez de la fibra muscular y propiedades musculares dependientes de la historia12,,13,14,15,16. La mecánica de un solo haz de fibra o fibra se mide mediante la unión de fibras entre un motor de longitud y un transductor de fuerza en plataformas especializadas que controlan la longitud de la fibra mientras miden simultáneamente la fuerza. Al permeabilizar (por ejemplo, despellejar) las fibras, la membrana sarcolemma se vuelve permeable a los productos químicos en la solución de baño, lo que permite el control de activación al variar la concentración de calcio. Además, el efecto de las propiedades contráctiles en los productos químicos/farmacéuticos/otras proteínas se puede evaluar fácilmente añadiendo el reactivo en cuestión a la solución de baño. Sin embargo, mientras que esta técnica es muy utilizada en otros modelos animales, notablemente menos estudios realizaron pruebas mecánicas en fibras despellejadas de biopsias musculares humanas17,18,19. Una razón es que las herramientas y protocolos de biopsia están diseñados para eliminar tanto tejido muscular como sea posible con menos consideración por el nivel de daño estructural sufrido durante la extracción de tejido. De hecho, un protocolo de biopsia reciente sugiere conducir la aguja de la biopsia en el músculo y recoger 2-4 trozos de músculo3. El proceso en sí hace poco daño al ADN o al material proteico, pero a menudo destruye la fibra y las estructuras sarcoméricas de tal manera que la activación de las fibras musculares se vuelve inestable o imposible. Además, la longitud relativa de las fibras dentro de la biopsia son típicamente cortas (<2 mm) y no se manejan fácilmente para pruebas mecánicas. Para pruebas mecánicas, las fibras ideales son largas (3-5 mm) y no están estructuralmente dañadas.

Se pueden utilizar técnicas de extracción de tejido más avanzadas para limitar el daño de la fibra. Por ejemplo, un grupo20 se aprovechó de las "cirugías abiertas" previamente planificadas de antebrazos (por ejemplo, reparación de fracturas óseas), donde los músculos estaban completamente expuestos y un cirujano fue capaz de visualizar la estructura muscular y diseccionar cuidadosamente muestras relativamente grandes y estructuralmente intactas de tejido muscular (15 mm x 5 mm x 5 mm). Esta técnica de "biopsia abierta" se ve favorecida cuando los participantes se someten a un procedimiento previamente planeado, por lo que limita el grupo de participantes potenciales, especialmente para adultos sanos, donde de lo contrario no se realizarían cirugías. Por lo tanto, muchas biopsias realizadas con fines de investigación se realizan como un procedimiento ambulatorio y el sitio de incisión se mantiene lo más pequeño posible para limitar el riesgo de infección, cicatrices, y el tiempo de curación. Por lo tanto, la mayoría de las biopsias se recogen ciegamente (es decir, el operador no puede ver la aguja de recolección a medida que pasa a través de la fascia en el músculo). Esto implica que la calidad de la biopsia se basa casi en su totalidad en la habilidad y experiencia del operador. Cada músculo tiene sus propias dificultades al recolectar tejido, como los riesgos de violar los nervios y los vasos sanguíneos, la selección de una profundidad y ubicación de recolección ideal, y decidir una posición corporal adecuada para mantener el músculo lo más flojo posible. Desafortunadamente, la mayoría de los conjuntos de habilidades específicos del músculo no están escritos y por lo tanto cada médico debe "reinventar la rueda" al realizar biopsias en los músculos nuevos para ellos. Esta falta de experiencia generalmente conduce a varias colecciones con baja calidad hasta que el médico identifica las mejores prácticas para biopsias en ese músculo. Los médicos novatos a menudo aprenden la habilidad a través de conversaciones con sus colegas más experimentados, pero existen relativamente pocos textos informativos y revisados por pares sobre el asunto, especialmente para los músculos que no se utilizan tradicionalmente para la recolección de biopsias. Si consideramos la información anterior, junto con la dificultad de reclutar voluntarios humanos para biopsias, está claro que se necesita más información didáctica que maximice las posibilidades de éxito para cada participante.

Por lo tanto, el propósito de este artículo era presentar una técnica de biopsia muscular que proporciona protocolos para la recolección exitosa de biopsias musculares con fragmentos de fibra largos y no dañados para pruebas mecánicas. Las biopsias musculares humanas generalmente se llevan a cabo, y la mayor parte del material de entrenamiento de biopsia está en, el musculus vastus lateralis. Su tamaño muscular relativamente grande y su ubicación superficial en relación con la piel permite la acumulación de tejido muscular adecuado, minimizando al mismo tiempo el malestar del paciente y el trauma físico1,,21. Sin embargo, hay algunas limitaciones en el uso de los vastus lateralis para estudios de entrenamiento longitudinal. Por ejemplo, durante los protocolos experimentales que incluyen un programa de capacitación, los participantes deben abstenerse de una formación adicional fuera del estudio durante un período que a menudo abarca 2-6 meses. Para los atletas, esto a menudo no es posible, ya que el vastus lateralis se entrena generalmente durante los ejercicios típicos (por ejemplo, sentadillas, saltos), o se utiliza generalmente para el deporte (por ejemplo, correr, ciclismo). Estas experiencias de entrenamiento separadas lejos del objetivo del estudio pueden causar adaptaciones musculares que alteran la mecánica muscular, la arquitectura y la fisiología de tal manera que es difícil o imposible conocer el verdadero efecto del protocolo experimental del estudio sobre las propiedades musculares. Para este tipo de estudios, sería ideal seleccionar un músculo objetivo que a menudo no es el foco de los regimientos de entrenamiento. El musculus tibialis anterior (TA) es un músculo objetivo ideal que satisface los requisitos anteriores. Además, las intervenciones de entrenamiento se pueden orientar hacia la TA mediante enfoques controlables, como con el uso de un dinamómetro. Casi no hay material de entrenamiento relacionado con una biopsia muscular TA. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo modificado para recoger biopsias musculares relativamente indesadas de la TA.

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Protocol

NOTA: A continuación, delineamos un protocolo para cosechar fibras mecánicamente intactas de la TA de voluntarios que fueron inscritos en un estudio en curso separado. Este protocolo es similar al descrito por Shanely et al.3, que han descrito la técnica modificada de Bergstrom en vastus lateralis. La información presentada aquí ha sido refinada por nuestro grupo de investigación, pero puede no ser ideal para todos los grupos de laboratorio o configuraciones organizativas. Damos sólo pautas, y sugieremos encarecidamente que los laboratorios nuevos en la recolección de biopsias consulten grupos de laboratorio experimentados antes de realizar cualquier ensayo en humanos.

Todos los estudios realizados en este trabajo fueron aprobados por el Comité de ética de la Facultad de Ciencias del Deporte de la Universidad Ruhr de Bochum. Los participantes dieron su consentimiento fundamentado por escrito gratuito antes de participar en el estudio.

1. Preparación experimental

  1. Evalúe los criterios de exclusión mientras toma la historia clínica detallada del participante durante la consulta del participante (ver más abajo).
    1. Excluir a los participantes si sufrieron una lesión en el músculo objetivo durante las 6 semanas previas a la biopsia. Asegúrese de que los participantes estén generalmente sanos, conscientes de que no hay trastornos musculares o de coagulación, y no están actualmente en medicamentos que causan adelgazamiento de la sangre (por ejemplo, aspirina).
      NOTA: Aquí, seleccionamos a los participantes que estaban moderadamente activos y les instruimos que se abstuvieran de hacer ejercicios intensivos o no acostumbrados en las piernas al menos 3 días antes de la biopsia. Sin embargo, para otras preguntas de investigación, estos criterios pueden cambiar.
  2. Adherirse a la esterilización y técnicas asépticas, reguladas por la ley alemana y la práctica común y supervisadas por el médico del equipo22,,23. Este procedimiento a menudo se puede llevar a cabo como un procedimiento "junto a la cama" o en una suite quirúrgica ambulatoria. Consulte al organismo regulador local para obtener orientación.
  3. Componga al equipo de biopsia. Sugerimos que el equipo de biopsia incluya 4 personas. Un médico (o individuo capacitado en la recolección de biopsias), un asistente médico que trabaja con el médico, un asistente que monitorea e interactúa con el participante, y un asistente que maneja la biopsia muscular inmediatamente después de la extracción. Con estos números, se puede administrar atención rápida al paciente si se produce una emergencia médica durante el procedimiento. Si se siente cómodo con el procedimiento, entonces el equipo podría estar formado por sólo dos personas: el médico y el asistente médico, que juntos asumirían la atención del paciente y el procesamiento de tejidos simultáneamente.
  4. Pida al participante que se reúna con el jefe/médico del proyecto para revisar, discutir y firmar el formulario de consentimiento del usuario. Tome una historia clínica detallada (alergias, lesiones o cirugías en la extremidad inferior y TA) y excluya al participante si cumple con cualquiera de los criterios de exclusión. Discuta a fondo la recuperación y la higiene de las incisiones.
    1. Explique al participante que estarán doloridos pero podrán caminar inmediatamente después del procedimiento; caminar por las laderas o escaleras es a menudo incómodo durante las primeras 48 horas, con la actividad completa por lo general regresa después de 72 horas. Por último, explique que, para limitar la infección y las abrasiones mecánicas, el lugar de la incisión debe permanecer vendado durante al menos 1 semana y mantenerse limpio.

2. Visualice los Tibialis anteriores con ultrasonido en modo B

  1. Indique al participante que se acueste en una posición supina cómoda y relaje los músculos de sus piernas tanto como sea posible. Utilice un dispositivo hecho a medida (ver más abajo) o haga que el asistente sostenga el tobillo en una posición ligeramente dorsiflexed para imitar lo que se hará durante la biopsia.
    NOTA: Es importante que el participante tenga un TA relajado para que repliquen las características musculares durante el procedimiento. Durante el examen, pida al participante que contrate y relaje el músculo para que se puedan notar los cambios en la arquitectura muscular.
  2. Utilice una sonda de ultrasonido para visualizar los compartimentos superficiales y profundos de la TA, para examinar la arquitectura muscular y decidir sobre la profundidad de inserción y el ángulo de la aguja de ataque(Figura 2A-B). Indique puntos de referencia en la piel.
    1. Preste especial atención a la selección de un área objetivo que evite las venas, arterias o nervios principales.
    2. Evaluar la sección transversal del músculo, con el objetivo de identificar la aponeurosis central dentro del vientre muscular TA (aproximadamente 1/3 de la pierna, distal a la rodilla, y 2 cm lateral de la cresta tibial) (Figura 2B). Registre la ubicación y la profundidad de la aponeurosis central (generalmente 1,5-3 cm) para que se pueda tener cuidado de no conducir la aguja de la colección (Bergstrom) más allá de este punto.
    3. Coloque la sonda de ultrasonido en la orientación proximal-distal sobre la ubicación objetivo y visualice la escritura de la célula y el grosor muscular (Figura 2A). Utilice esta información para ayudar a conducir con éxito (ciegamente) la aguja de recolección en el vientre muscular. Guarde las imágenes del sitio objetivo en ambos planos para futuras referencias durante el procedimiento quirúrgico.
  3. Con esta información, cree un plan para el movimiento de la aguja hacia el área objetivo.
    1. Planee hacer la incisión 1-3 cm distal desde el área de la biopsia objetivo. Después de que la aguja se pasa al músculo, gire la aguja a un ángulo de 45% a la piel a lo largo del eje largo de la extremidad, y luego conducido proximally hacia el área de la biopsia. Esta estrategia limita la posibilidad de conducir la aguja hacia la aponeurosis central, si la aguja se empuja demasiado fuerte. Además, la aguja se puede conducir distal o proximally, dependiendo de la entrega del operador de la aguja.

3. Procedimiento de biopsia

  1. Indique al participante que se acueste en la mesa de operaciones y relaje los músculos de sus piernas. Asegúrese de que la línea de visión del participante hacia el sitio de la biopsia esté bloqueada por una cortina.
    1. Retire la tensión pasiva del vientre muscular colocando la extremidad del participante en un dispositivo que fija el tobillo en una posición ligeramente dorsiflexed (0-5o de neutral; Figura 3). Pregúntele al paciente si todavía puede relajar su músculo, ya que demasiada dorsiflexión puede dificultar el relajación.
      NOTA: Hemos encontrado que la recolección de biopsias de un pie dorsiflexed, no más de 5o de neutro (es decir, la planta del pie perpendicular al vástago) produce biopsias más consistentes y más grandes que los ángulos de tobillo más flexibles plantares. El dispositivo que mantiene el tobillo dorsiflexed es un dispositivo hecho a medida. Sin embargo, cualquier número de dispositivos (baratos) se puede fabricar que todavía producen el resultado deseado.
  2. Afeitar, limpiar y desinfectar el área de incisión seleccionada, según las prácticas estándar24.
    NOTA: El área "limpia" del participante es de unos 20 cm proximal-distal y 10 cm medial-lateral del sitio de incisión propuesto. Sin embargo, consulte siempre las regulaciones nacionales y/o de la institución (si las hay) sobre este tema. El protocolo de desinfección incluye limpiar la piel y luego desinfectar cuatro veces con el uso liberal de aerosol de desinfección de grado médico. Si el participante abandona la mesa por cualquier motivo, se debe reiniciar el protocolo de desinfección.
  3. Administrar una inyección suprafascial de 1,5 cc de xilocitina al 2% con epinefrina en el lugar de la biopsia, que funciona como anestésico y vasoconstrictor local. Espere el tiempo de afectación asignado de 20-30 min.
    NOTA: Estos medicamentos son mióxicos y por lo tanto nunca deben inyectarse en el músculo, sólo el tejido subcutáneo. Como reacción a la vasoconstricción, el área del lugar de inyección puede volverse blanca (en tonos de piel más claros) o gris (tonos de piel más oscuros).
  4. Confirme el efecto farmacológico con tonos de piel y golpes suaves con un bisturí estéril.
  5. En el sitio de la biopsia previamente marcada, haga una incisión proximal-distal de 1 cm con un bisturí estéril que corta a través de la piel y la fascia, exponiendo el vientre muscular. Tenga cuidado de cortar la fascia completamente porque la aguja es contundente y no pasará a través de la fascia.
  6. Empuje la aguja de la biopsia 0.5-1.0 cm en el músculo con una orientación perpendicular a la piel(Figura 2C, 2E).
    NOTA: El operador sentirá un cambio en la tensión necesaria para conducir la aguja a través de los diferentes tipos de tejido. El tejido graso es fácil, la fascia es la más dura, y el músculo está en el medio (pero puede ser variable, basado en el participante).
  7. Orientar la aguja a una posición de 45o de ángulo con respecto a la piel, a lo largo del eje largo de la pierna(Figura 2D, 2F). Empuje la aguja otros 1-2 cm en el músculo hasta que la punta de la aguja esté en la ubicación objetivo dentro del músculo.
    NOTA: El médico debe utilizar las imágenes de ultrasonido guardadas para tener en cuenta la variación individual de las dimensiones musculares. Debido a que la incisión es lo suficientemente grande como para insertar la aguja, el médico conduce la aguja ciegamente a través de la piel. Hay una "sensación" que el operador de la biopsia gana con experiencia. Un principiante debe aprender la habilidad de un operador de biopsia capacitado (más sobre esto en la discusión).
  8. Coloque la jeringa y la manguera de 100 ml en la aguja de la biopsia(Figura 1G). Aplique succión a la aguja Bergstrom tirando del émbolo de la jeringa unos 15-20 ml para producir una presión negativa en la aguja y succionando el tejido muscular en la ventana de la aguja. A continuación, excediendo el músculo por un empuje rápido del trocar sobre la ventana de la aguja.
    NOTA: Antes y durante la succión, a veces es útil poner una ligera presión sobre la piel inmediatamente por encima de la ventana de la aguja para ayudar a empujar el músculo dentro de la aguja.
  9. Retire suavemente la aguja de la pierna, girando lentamente. Sólo debe haber resistencia a la luz durante la extracción de la aguja. Si hay más resistencia, esto puede indicar un corte parcial de la biopsia. Esto ocurre, devuelve la necesidad a la ubicación de destino y vuelve a intentar la recolección de tejido.
  10. Empuje el tejido extirpado hacia la ventana de la aguja usando la varilla interna.
  11. Retire con cuidado la muestra de la aguja.
    NOTA: Sumergir la aguja en la solución de recolección (ver sección de preparación de fibra) a menudo desaloja la biopsia de la aguja. Además, la jeringa se puede utilizar para conducir el aire a través de la aguja y empujar la muestra. Estas técnicas eliminan la necesidad de tocar físicamente la biopsia con pinzas y reducen la posibilidad de daño. Si las herramientas, las manos (engujeadas o no) o las soluciones no estériles entran en contacto con la aguja, la aguja no se puede utilizar durante el procedimiento. Por lo tanto, si se necesita una segunda biopsia inmediata, entonces se debe utilizar una nueva aguja estéril. Esto ocurre a menudo, por lo que es una mejor práctica mantener varias agujas estériles en reserva.
  12. Identifique el tejido como músculo y no tejido adiposo o conectivo. El tejido muscular se identifica fácilmente desde otro tejido debido a su color rojo intenso(Figura 4A). A veces, el tejido recogido no es músculo, sino grasa o tejido conectivo.
    1. Si se recoge una cantidad adecuada de tejido muscular, continúe con el protocolo. Si no hay suficiente músculo, intente la biopsia de nuevo.
    2. Si se necesita una segunda biopsia, monitoree cuidadosamente al participante, ya que un segundo empuje de aguja ocasionalmente hace que el participante sea más incómodo que el primero.
  13. Lave las muestras musculares inmediatamente en una solución de recolección y prepárese para experimentos de fibra única (ver manejo y almacenamiento de biopsias musculares).
    1. Pida a un asistente experimentado que revise la calidad de la muestra (ver más abajo) y evalúe la necesidad de realizar una segunda biopsia. Un asistente separado toma la biopsia para su procesamiento, mientras que el resto del equipo continúa con el participante.
  14. Cierre el lugar de la incisión.
    1. Cierre la herida de incisión con cinta estéril de Leukostrip. Utilice una o más piezas para unir los bordes del sitio de la incisión poniéndolos perpendiculares al eje largo de la incisión, y luego colocar más tiras en un patrón en forma de estrella para proteger contra la carga multidireccional.
      NOTA: El manejo adecuado de este paso reducirá las cicatrices. Suturar la herida se puede hacer, pero no es necesario. Otras opciones incluyen pegamento para heridas.
    2. Coloque el apósito estéril de la herida (p. ej., Leucomed T plus) sobre el lugar de la incisión para protegerlo contra la infección.
    3. Envuelva la pierna con vendas elásticas cohesivas (por ejemplo, Unihaft) para limitar el sangrado inicial y proteger contra impactos mecánicos externos.
    4. Envuelva la pierna con vendas de compresión acrylastic para evitar el sangrado y proteger las vendas más profundas de la suelta o destrucción.

4. Atención post-biopsia

  1. Pida al participante que camine inmediatamente después del procedimiento. Habrá dolor localizado. Indique al participante que camine con la forma más normal posible.
  2. Indique al participante que no retire los vendajes ni deje que el agua empape los vendajes. Deben mantenerse durante al menos: un día para el vendaje acristo, tres días para el vendaje elástico cohesivo y siete días para el vendaje de la herida. Informe al participante que se pueden volver a disolver si es necesario.
    1. Adapte la atención post-biopsia de un participante a las necesidades de la persona. Pida a un asistente o médico capacitado que evalúe al participante y haga un plan de atención post-biopsia apropiado. Para este procedimiento, sugerimos que cualquier otra prueba neuromuscular in vivo de la TA se separe por lo menos una semana de la biopsia.

5. Manejo y almacenamiento de biopsias musculares

  1. Después de la extracción de tejido, coloque inmediatamente el tejido en un vial de 5 ml que contenga solución de recolección de rigor (en mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), comprimido inhibidor de la proteasa (1), pH 7.0) y agite ligeramente durante 4-6 minutos para lavar la sangre.
  2. Cambie la solución rigor por un rigor fresco, agite ligeramente durante 4-6 minutos y luego guárdelo a 4oC durante 4-6 h para permitir el intercambio de solución de almacenamiento de inhibidores de proteasa y sangre.
  3. Solución de rigor de cambio para rigor nocturno (en mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), comprimido inhibidor de la proteasa (1), glicerol 50:50, pH 7.0) y almacenar a 4 oC durante 12-18 h.
  4. Intercambie el rigor nocturno por 50:50 rigor de recogida:glicerol y se almacene a -20 oC durante un máximo de 3 meses, o un año en un congelador de -80 oC.
    NOTA: Este proceso impregna la membrana de fibra que permite la adición manual de calcio dentro y fuera de la célula. Este proceso lleva tiempo y podría ser diferente entre diferentes músculos y especies.

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Representative Results

El compromiso de tiempo completo para un participante fue de aproximadamente una hora (consulta de 10 minutos, ultrasonido de 10 min, preparación de cirugía de 20 minutos y administración anestésica, cirugía de 10 minutos y recuperación de 10 minutos). A menudo, los participantes activan inconscientemente su TA y necesitaron recordatorios consistentes para mantener el músculo lo más relajado posible. Cuando la aguja de la biopsia estaba dentro del músculo, los participantes generalmente reportaron una sensación única de "presión" en el área alrededor de la aguja de la biopsia, con períodos ocasionales de molestias moderadas a intensas. Una vez, los dedos de los dedos de los dientes de un participante se estrecharon ligeramente durante el procedimiento, pero se detuvo inmediatamente después de que se extrajo la aguja. Los tamaños de la biopsia eran generalmente de 50-100 mg (masa húmeda). Las reacciones de los participantes al procedimiento fueron a menudo impredecibles. A veces, el participante esperaba no verse afectado durante el procedimiento, pero luego mostró signos de desmayo, mientras que otros estaban nerviosos pero completamente desafiados durante el procedimiento. Por lo tanto, nos pareció que era una buena práctica mantener al participante ocupado con una conversación o permitirle usar su teléfono móvil, de modo que su atención completa no se centró en el procedimiento en curso. El asistente que habló con el participante también los vigiló en busca de signos de angustia, dolor o desmayo. A veces, una biopsia contenía sólo tejido adiposo o conectivo (identificado por un color blanco pálido del tejido, Figura 4A). En estos casos, se tomó inmediatamente una segunda biopsia (después de la aprobación fue dada por el participante). Por lo general, una biopsia exitosa producirá >80% tejido muscular(Figura 4A).

Después de la operación, la mayoría de los participantes sintieron molestias después del procedimiento que duró 3-5 días. Los participantes informaron que el dolor de TA era similar a lo que se esperaría después de un día de senderismo en pendientes pronunciadas. No se debe poner presión mecánica en el lugar de la incisión durante al menos 5 días, o podría reabrirse. Los participantes generalmente se quedaron con una pequeña cicatriz, pero no hemos observado cambios elevados o anormales en la piel. Además, ningún participante desarrolló infecciones.

Las biopsias se permeabilizaron (es decir, despellejaron) en una solución de glicerol (1:1 mezcla de glicerol: solución de rigor) durante 6 semanas y luego se prepararon para pruebas mecánicas el día de los experimentos. La permeabilización del glicerol de las fibras permite la difusión de la solución de baño en las fibras, lo que da al investigador el control de activación y también proporciona una vía para someter el músculo a productos farmacéuticos u otros productos químicos. Además, el glicerol funciona como un agente anticongelante, permitiendo que el músculo se coloque en temperaturas frías para el almacenamiento a largo plazo, con daños limitados. Sin embargo, se necesita algún tiempo para permitir que el glicerol penetre en las muestras, por lo que inicialmente almacenar muestras de biopsia durante la noche a 4 oC (idealmente en una placa de agitación) es prudente. Los músculos sólo se pueden almacenar durante tanto tiempo antes de que su función se vea comprometida. La orientación general sobre la materia es que los músculos mantendrán su función dentro de la solución de glicerol durante al menos 3 meses en un congelador de -20 oC, o un año en un congelador de -80 oC.

Las muestras musculares se visualizaron bajo un microscopio de disección. Algunas piezas musculares eran pequeñas o dañadas(Figura 4B)y fueron retiradas. A continuación, se evaluaron grupos de fibras para cualquier daño estructural (sarcolemma de fibra visualmente rota o triturada, Figura 4C). A partir de estos paquetes, paquetes de fibra más pequeños de 3-10 fibras fueron diseccionados y colocados cuidadosamente en la cámara experimental de la plataforma de pruebas mecánicas (Figura 4D). Las longitudes de fibra estructuralmente utilizables eran típicamente de 3-5 mm de largo. La aguja Bergstrom tenía una ventana de recolección de 7 mm, por lo que la biopsia sólo podía producir al máximo fibras de 7 mm de largo. Por lo tanto, las fibras estructuralmente utilizables que recogimos eran casi el mayor tiempo posible. Típicamente, preparamos 5-10 paquete de fibra por 50 mg de tejido (recogido). Los detalles completos de estos procedimientos se pueden encontrar en otroslugares 14,,15,,25. Para demostrar la durabilidad de las fibras, mostramos datos representativos de un protocolo mecánico simple utilizando haces de fibra TA glicados (Figura 5). En la solución de activación26 (alta [Ca2+],pCa < 4,2) se activaron 40 paquetes de fibra de las biopsias de 10 participantes y se midió la tensión activa de estado estacionario de 100,71 a 11 mmN-2 mm (media de SEM).

Figure 1
Figura 1: La aguja Bergstrom. La aguja Bergstrom utilizada en este estudio consiste en la propia aguja(A-F),la manguera de aspiración (G) y la jeringa (F). La aguja Bergstrom consiste en una aguja externa (A) que tiene una ventana cerca de la punta de la aguja, un trocar interno hueco más pequeño (B) que se mueve hacia arriba y hacia abajo de la aguja y corta el músculo al pasar sobre la ventana de la aguja, y una varilla (C) que se mueve hacia arriba y hacia abajo del trocánter para ayudar a eliminar el músculo de la aguja. Estas piezas están separadas por una arandela (D) que hace que la aguja sea hermética, y un espaciador (E) entre la varilla y el trocar protege contra el aplastamiento de la biopsia muscular. Por último, se conecta un adaptador de manguera de aspiración. Para tirar del músculo dentro de la ventana de la aguja, se une una manguera de aspiración (G) al adaptador de aguja y a la jeringa. Esto succiona el aire de la aguja y tira del músculo en la ventana de la aguja a través de la presión negativa, lo que permite la recolección de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes por ultrasonido y colocación de agujas. El TA se compone de compartimentos superficiales y profundos que se definen por aponeuroses. El TA se toma imágenes con la sonda de ultrasonido orientada en las perspectivas distal-proximal (A) y medial-lateral (B) para que se pueda reconocer la forma 3D del TA. La profundidad ideal de la aguja para la recolección se encuentra entre las líneas discontinuas horizontales. Una representación de dibujos animados de la inserción de la aguja se muestra en los paneles C y D. Después de hacer la incisión, la aguja se coloca primero perpendicular al músculo y se empuja en el músculo hasta que la ventana de la aguja está en el músculo (C). A continuación, la aguja se reorienta a un ángulo de 45o a lo largo del eje largo de la pierna, y se empuja más hacia el músculo, prestando especial atención a que la aguja no penetra en la aponeurosis profunda(D). Las imágenes en vivo (E, F) durante el procedimiento se dan en referencia a la caricatura (C, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Colocación del participante. El participante se encuentra en una posición supina en la mesa de operaciones. La cabeza se puede elevar para mayor comodidad. El pie derecho se coloca en un dispositivo personalizado que mantiene el pie ligeramente dorsiflexo, reduciendo la tensión muscular. Se coloca una cortina delante del participante para que no puedan ver el procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas del tejido muscular. (A) Inmediatamente después de la biopsia, la muestra muscular será de color rojo más oscuro que otros tejidos, incluyendo tejido adiposo y tejido conectivo (etiquetado en el panel). (B) Disección de muestras con daño/cortocircuito (superior) y paquetes de fibra viables (debajo). (C) Ampliación de una agrupación de fibra viable para inspeccionar la superficie en busca de signos de daño. (D) Un haz de 6 fibras fue diseccionado lejos de este haz de fibra (atado en los extremos con sutura 6-0 para facilitar el movimiento y unido al aparato mecánico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Salidas de fuerza representativas de una preparación de un haz de fibra. Para demostrar la durabilidad de las fibras, mostramos datos de tensión representativos de un protocolo mecánico simple utilizando un haz de fibra TA glicado (3 fibras). En total, 40 haces de fibra de las biopsias de 10 participantes se estiraron de la holgura a la longitud de los sarcomos de 2,7 m y se mantuvieron para permitir la relajación del estrés. A continuación, se activaron las fibras en la solución de activación26 (área sombreada; alta [Ca2+],pCa < 4.2) a una longitud de sarcomere de 2,7 m durante 60 segundos y la tensión activa de estado estacionario se midió a 100,71 a 11 mm1 mm-2 (media á SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este informe, describimos una técnica para la biopsia de tejido muscular estructuralmente intacto de TA. Encontramos que este procedimiento produce un contenido aceptable de fibras musculares utilizables (5-10 preparaciones de haz de fibra por 50 mg de tejido recogido) para pruebas mecánicas. Además, tuvimos suficiente tejido para experimentos mecánicos, genéticos y proteómicos de seguimiento.

Hay varios métodos típicamente utilizados para la recolección de biopsias musculares3,4,6,27,28. La llamada biopsia abierta20 produce fibras de la más alta calidad porque un cirujano expone completamente el músculo y disecciona la muestra. Por supuesto, la cirugía abierta es un procedimiento bastante invasivo y no es un procedimiento adecuado para someter a participantes sanos, independientemente de la pregunta de investigación, debido a los riesgos potenciales asociados con las cirugías abiertas. El método de biopsia menos invasiva es la biopsia de aguja fina29,30, que utiliza una aguja relativamente más pequeña para recoger el tejido. Las biopsias de aguja fina son suficientes para llevar a cabo experimentos sobre los componentes genéticos/químicos/proteicos de las fibras30,31, pero a menudo la calidad de la fibra es muy pobre, lo que hace que las pruebas mecánicas sean difíciles o imposibles. La técnica de aguja Bergstrom es un buen compromiso entre los dos procedimientos explicados anteriormente porque la cirugía es menos invasiva que la biopsia abierta, pero todavía recoge muestras musculares que son más grandes y (potencialmente) más intactas estructuralmente que las biopsias de aguja fina. Los informes previos del procedimiento de agujaBergstrom 3,5 son grandes recursos para aquellos que aprenden la técnica, pero sólo presentan protocolos para los vastus lateralis. Nuestro informe demuestra la técnica para la TA que se centra en la recolección de altos rendimientos de fibras estructuralmente intactas para pruebas mecánicas.

Hasta nuestro conocimiento no hay publicaciones detalladas sobre la recolección de biopsias TA. Sin embargo, la práctica estándar es poner al participante supino y hacer que relajen su pierna tanto como sea posible. El pie relajado en esta posición es naturalmente plantarflexed, que por lo tanto alarga el TA y lo pone en tensión. Encontramos que cualquier tensión muscular hace que sea más difícil conducir el músculo en la aguja de la biopsia, incluso con presión negativa, por lo que la tensión debe minimizarse tanto como sea posible. Para lograr esto, la simple pero principal modificación aquí fue utilizar una placa de pie hecha a medida que mantuvo el tobillo en una posición ligeramente dorsiflexed (0 - 5o de neutral), manteniendo la TA holgada y mejorando la colección. Los médicos deben tener cuidado de no dorsiflex el tobillo, ya que el TA se activará incontrolablemente, aumentando la tensión, que por supuesto es contrario al procedimiento en primer lugar. El participante normalmente puede sentir esta activación muscular, por lo que la comunicación es clave. A partir de los protocolos, el TA produce sólo un 25 % de tejido en comparación con el vastus lateralis más comúnmente utilizado, 100 mg y 400 mg, respectivamente. Por lo tanto, es importante maximizar el tamaño de la recolección de tejido mientras que también considerando si la muestra de tejido TA será lo suficientemente grande para los proyectos de investigación deseados. Hemos encontrado que tomar una segunda muestra inmediatamente después de la primera no causa ninguna complicación adicional o tiempo de curación para los participantes.

Aunque el protocolo da alguna orientación hacia otras biopsias musculares, la selección muscular dictará el procedimiento adecuado. Por lo tanto, sugerimos encarecidamente a otros investigadores y médicos que publiquen, en su totalidad, sus métodos de biopsia. A partir de la experiencia, identificamos algunos factores importantes para la selección muscular, fuera de la pregunta de investigación. En primer lugar, sugerimos considerar los músculos que son superficiales para la piel y tienen arterias/nervios principales que son profundos o fácilmente evitables. En segundo lugar, debido a que los participantes están despiertos durante el procedimiento, es importante considerar si el procedimiento de biopsia será muy incómodo para el paciente, ya sea debido al posicionamiento inicial del paciente, o debido a la presión de la aguja de la biopsia, que también empuja los músculos más profundos de una manera incómoda. Hemos tenido éxito con los vastus lateralis y pectoralis. Otras opciones potenciales son el trapecio, latissimus dorsi y gastrocnemius (aunque altamente vascularizado y propenso al sangrado). Los músculos isquiotibiales son posibles pero incómodos para el paciente, y difíciles porque se mueven lateralmente al recoger la biopsia.

A pesar de que las agujas Bergstrom se pueden comprar en los fabricantes, algunos laboratorios hacen su propia. Pequeños, pero inteligentes, ajustes en el diseño pueden aumentar el rendimiento de fibras musculares largas y sin daños. Por ejemplo, la ventana de recogida de la aguja utilizada aquí era de 7 mm x 5 mm (largo x ancho). Esto es apropiado para capturar un cubo de músculo. Sin embargo, si el objetivo es recoger fibras largas y no dañadas (del mismo volumen), entonces la longitud podría aumentarse, y el ancho disminuyó (es decir, 10 mm x 3,5 mm). Si la aguja está orientada a lo largo de la dirección del fascículo, entonces es probable que esta aguja recoja secciones de fibra más largas.

Las biopsias musculares a menudo se recogen de forma segura sin la guía de una imagen de ultrasonido, especialmente para músculos más grandes como el vastus lateralis. En esta situación, un médico debidamente experimentado puede palpar fácilmente el músculo para encontrar el mejor sitio de incisión. Sin embargo, cuando el médico tiene menos experiencia con el músculo objetivo, o se garantiza un cuidado adicional para evitar los nervios o vasos sanguíneos principales, el ultrasonido es una herramienta grande y simplemente aplicada. Por último, el monitoreo postoperatorio del área de la biopsia se puede lograr rápidamente con la ayuda de una ecografía.

Las biopsias pediátricas son ciertamente posibles y comúnmente se llevan a cabo32,,33,34. Sin embargo, normalmente se realizan varios cambios en el procedimiento. A menudo se requiere una aguja de calibre más pequeño y sedación consciente, y el procedimiento se lleva a cabo en un entorno hospitalario. En general, la experiencia podría ser traumática para un niño y los grupos de investigación que quieren incluir participantes pediátricos sanos deben sopesar cuidadosamente esto contra los posibles méritos del estudio.

Los haces de fibra o el material no utilizado se pueden transferir a otros experimentos antes o después de la mecánica de fibra. Por ejemplo, las técnicas que evalúan el contenido de proteína sarcomeric o clasifican el tipo de isóforma se pueden llevar a cabo35. Sin embargo, para limitar la degradación de las proteínas y mejorar el éxito del análisis, el tejido debe congelarse en nitrógeno líquido después de la extracción original, inmediatamente después de la evaluación mecánica, o procesarse inmediatamente para el análisis de proteínas. Las fibras también se pueden preparar para la inmunohistoquímica u otras técnicas de imagen36 que permiten la evaluación de la posición de la proteína dentro de la fibra. En este caso, las fibras se pueden colocar en una solución fijativa (por ejemplo, 4% de paraformaldehído/0,25% glutaraldehído en tampón fisiológico a pH 7; sin glutaraldehído para inmunohistoquímica) mientras todavía está en el aparato de prueba mecánica, preservando las estructuras sarcomericas a una longitud de sarco semería deseado. Si es posible, se puede cosechar una pequeña parte de la biopsia original, lavarse vigorosamente en la solución de recolección durante 10 minutos y luego colocarse en solución fijadora. Muchos grupos prefieren congelar inmediatamente muestras recién extirpadas en isopentano, lo que limita la formación de cristales de hielo dañinos y mejora la calidad de la imagen para evaluaciones visuales. Este es, de hecho, el estándar de oro para la congelación de flash; sin embargo, encontramos que el daño del cristal de hielo por congelación de nitrógeno sólo se centra en estructuras extra-miofibril. Tenemos una integridad estructural satisfactoria de los componentes sarcoméricos en muestras también congeladas en nitrógeno líquido, por lo que creemos que el nitrógeno es una posibilidad, especialmente si está más disponible, o el equipo quirúrgico / autoridad química local no está dispuesto a utilizar isopentano. Un problema importante y a menudo no reportado con la preparación de muestras para su visualización es que los sarcomeres a menudo se contraen/corto, con la región de la banda I del sarcomere corta o no observable. Para superar esto, el investigador debe estirar manualmente las muestras de fibra (por el aparato de prueba o a mano utilizando pinzas finas) antes de fijar. Como regla general, nos estiramos hasta la longitud de los sarcomos de 3,2 m (medidos a través de la difracción láser), o estiramos hasta el 150 % de la longitud floja, en una solución fisiológica relajante baja en calcio. Por último, si se desean submuestras para el análisis de la expresión de ARN, el método de congelación del flash no afecta a los resultados, pero las muestras deben congelarse inmediatamente después de la extracción original y colocarse en un congelador de -80 oC, ya que el ARN es muy inestable. Hay algunas soluciones de almacenamiento de protección contra ARN en el mercado, pero hemos encontrado resultados mixtos con su uso, y sólo muestras frescas de congelación de flash.

Para maximizar la cantidad de información recopilada durante un ensayo, se puede completar la recopilación simultánea de otros datos mientras se realizan pruebas mecánicas. Por ejemplo, el estudio de estructuras sarcoméricas se puede realizar durante las pruebas mecánicas mediante el uso de imágenes de difracción de rayos X de ángulo bajo, como se hace en otros animales37,,38. Para los experimentos genéticos, el músculo extirpado debe procesarse inmediatamente para ese propósito o congelarse porque el ADN/ARN son relativamente menos estables que las proteínas.

Algunas limitaciones ya se han descrito anteriormente. Aquí discutimos el procedimiento en sí. Una gran limitación para la mayoría de los grupos es tener un miembro del equipo que esté debidamente capacitado en la recolección de biopsias. Independientemente de la profesión de la persona (médico, asistente médico, técnico, o de otra manera), este procedimiento es difícil porque el investigador conduce la aguja a ciegas y debe confiar en "sentir"3,28 para localizar la ventana de la aguja con precisión. Los errores no son tolerables porque los participantes humanos consentidos para las biopsias son escasos, una biopsia es preferible a muchos y los errores podrían conducir a daño vascular o a los nervios. Por lo tanto, cualquier posibilidad de entrenamiento debe completarse antes de realizar una biopsia humana. Por ejemplo, para obtener una "sensación" para conducir la aguja, la carne de cerdo con la piel todavía unida se puede comprar en la mayoría de las tiendas de comestibles y se utiliza como un proxy para la piel humana y el músculo. Otra experiencia valiosa es hacer sombra a un grupo de investigación capacitado.

Evaluamos el dolor/incomodidad de los participantes de manera más cualitativa, confiando en la experiencia del médico y las conversaciones con el participante para evaluar el dolor percibido. Sin embargo, la evaluación del dolor y el malestar post-biopsia se puede cuantificar y ser comparable entre individuos y estudios a través del uso de encuestas validadas de dolor/incomodidad. Estos puntos tienen un tratamiento sorprendentemente poco en la literatura. Sin embargo, un estudio reciente presentó una manera de cuantificar el dolor/incomodidad de los participantes antes, durante y después de las biopsias, mediante la utilización de encuestas bien establecidas sobre el dolor39. Observamos que este artículo utilizó el vastus lateralis como el músculo objetivo, por lo que se necesitan estudios de seguimiento para comparar las evaluaciones del dolor entre los músculos.

Independientemente del método de extracción, la técnica de Bergstrom no puede excinger la longitud total de la fibra en el músculo porque las fibras son demasiado largas (6-8 cm en TA40, 6,5-8 cm en vastus lateralis40). Por lo tanto, es inevitable que durante una larga pieza de fibra recolectada, los extremos sean destruidos por la técnica de biopsia. A menudo, la porción central utilizable de una fibra es pequeña y por lo que es difícil de probar mecánicamente. A pesar de que la técnica proporciona regiones centrales razonablemente largas (3-5 mm), el investigador debe comprobar cuidadosamente la calidad de los haces de fibra durante la disección porque el uso de fibras dañadas alterará las salidas de fuerza pasivas o activas. La observación visual de biopsias exitosas mostrará una porción de fibras que no están dañadas por el procedimiento de biopsia. Cuando se ve desde un microscopio de luz de disección tradicional, la superficie de las fibras se verá lisa, sin agujeros ni desgarros (Figura 4). Además, las fibras deben parecer cilíndricas y no tener áreas aplanadas. Aunque no es visible, el músculo en sí se degradará con el tiempo debido a las proteasas naturales que comienzan a descomponer las proteínas musculares casi inmediatamente después de la extracción. Por lo tanto, es fundamental añadir inhibidores de la proteasa a todas las soluciones utilizadas con las fibras. Además, también sugerimos lavados adicionales de las biopsias para extraer la mayor cantidad de sangre posible.

Incluso con una preparación cuidadosa, el daño de la fibra puede ocurrir y conducir a activaciones de fibra deficientes. Hay muchas razones para el daño de la fibra porque las fibras son muy sensibles a casi todas las partes del procedimiento. Por ejemplo, durante la biopsia, si el trocar no es lo suficientemente afilado, puede empujar en el tejido muscular durante la extracción en lugar de cortar a través de él, que puede estirar y destruir las fibras. La solución de recolección debe prepararse adecuadamente porque las fibras son sensibles a los cambios osmóticos, el pH y la temperatura. Al manipular las fibras, se debe tener mucho cuidado para limitar completamente la presión sobre las fibras. En su lugar, las pinzas se deben utilizar para agarrar la biopsia por su tejido conectivo. Otra alternativa es usar una sutura de seda de tamaño 0-7 para envolver un extremo inutilizable de la biopsia y luego agarrar esto cuando se maneja. Por último, el glicerol cumple dos funciones: la primera es evitar que el músculo se congele mientras que a -20 oC y la segunda es ser un detergente suave a la fibra. Es decir, el glicerol impregna la fibra a soluciones externas, permitiendo la afluencia de calcio (a través de una solución de activación). Para la mayoría de los músculos, este proceso toma 10 días. Sin embargo, dependiendo de la cantidad de contenido de colágeno y el tamaño de la muestra, esto podría tomar hasta 6 semanas. Las fibras deben ser permeabilizadas para que cualquier activación de alto contenido de calcio se produzca durante los experimentos mecánicos. Las fibras son generalmente utilizables durante al menos 3 meses. Para limitar el desperdicio de fibra, se sugiere un tiempo de espera de permeabilización más largo (4-6 semanas) para las fibras musculares TA.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp y Wolfgang Linke por ayudar con el proyecto. La financiación de este proyecto fue proporcionada por la Fundación MERCUR (ID: An-2016-0050) a DH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

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Biología Número 163 Tibialis anterior biopsia muscular ultrasonido mecánica de fibra humana biomecánica técnica modificada de Bergstrom
Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica
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Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

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