Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جمع خزعات العضلات الهيكل العظمى من المقصورة العليا من الإنسان Musculus Tibialis الأمامي للتقييم الميكانيكي

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

يصف هذا التقرير الفني الاختلاف في تقنية Bergström المعدلة لخزعة من العضلة المُوسة في الزولو الأمامي الذي يحد من تلف الألياف.

Abstract

الخصائص الميكانيكية للألياف الهيكل العظمي التعاقد هي مؤشرات حاسمة من صحة العضلات العامة, وظيفة, والأداء. غالبًا ما يتم جمع خزعات العضلات الهيكلية البشرية لهذه المساعي. ومع ذلك، هناك عدد قليل نسبيا من الأوصاف التقنية لإجراءات خزعة، خارج العضلات الأكثر استخداما vastus lateralis، وتتوفر. على الرغم من أن تقنيات الخزعة غالبا ما يتم تعديلها لاستيعاب خصائص كل عضلة قيد الدراسة، إلا أن القليل من التقارير الفنية تشارك هذه التغييرات في المجتمع الأكبر. وهكذا، غالبا ما يضيع الأنسجة العضلية من المشاركين الإنسان كما المشغل إعادة اختراع العجلة. توسيع المواد المتاحة على الخزعات من مجموعة متنوعة من العضلات يمكن أن تقلل من حادث الخزعات الفاشلة. يصف هذا التقرير الفني اختلافًا في تقنية Bergström المعدلة على الـ musculus tibialis الأمامي الذي يحد من تلف الألياف ويوفر أطوال الألياف الكافية للتقييم الميكانيكي. الجراحة هي عملية خارجية يمكن الانتهاء منها في غضون ساعة. فترة الشفاء من هذا الإجراء فورية للنشاط الخفيف (أي المشي)، تصل إلى ثلاثة أيام لاستئناف النشاط البدني العادي، وحوالي أسبوع واحد لرعاية الجروح. يمكن استخدام الأنسجة المستخرجة لتجارب القوة الميكانيكية وهنا نقدم بيانات التنشيط التمثيلية. هذا البروتوكول هو مناسبة لمعظم أغراض جمع، يحتمل أن تتكيف مع العضلات الهيكلية الأخرى، ويمكن تحسينها عن طريق إدخال تعديلات على إبرة جمع.

Introduction

دراسة فسيولوجيا العضلات البشرية لأغراض سريرية أو بحثية غالبا ما يتطلب خزعات العضلات. على سبيل المثال، أحد التحديات الرئيسية في علم وظائف الأعضاء في العضلات البشرية والميكانيكا الحيوية هو التمييز بين وفهم مختلف التعديلات من أداء العضلات لممارسة الرياضة. لا تشمل تعديلات الأداء فقط التعديلات الهيكلية (على سبيل المثال، التغيرات في البروتينات المتقلصة، والهندسة العضلية) ولكنها تشمل أيضًا التعديلات العصبية1، والتي يصعب جدًا ، إن لم يكن من المستحيل ، تقييمها بشكل منفصل عند اختبار عضلات الإنسان سليمة في الموقع. تجارب على مستوى الألياف إزالة هذه المكونات أعلى من أجل وتسمح لتقييم أكثر مباشرة من تقلص العضلات ويمكن جمعها عن طريق تقنيات خزعة. وقد تم جمع خزعات العضلات منذ ما لا يقل عن 18682. اليوم، تقنية السائدة لجمع خزعات العضلات هو تعديل تقنية Bergström3،4،5، على الرغم من أن التقنيات الأخرى المتاحة بما في ذلك استخدام conchotome ويل- بليكسلي6 أو ما يسمى غرامة إبرة7،8. كل هذه التقنيات استخدام أدوات خاصة مثل إبرة التي تم تصميمها لتمرير في العضلات وقطع قطعة من الأنسجة. على وجه التحديد، تستخدم تقنية Bergström المعدلة إبرة كبيرة معدلة (حجم إبرة 5 مم هنا؛ الشكل 1) التي لديها نافذة قريبة من طرف إبرة وtrocar الداخلية أصغر التي تتحرك صعودا وهبوطا الإبرة، وقطع العضلات عند تمرير عبر نافذة إبرة. داخل هذا trocar هالو هو ramrod الذي يتحرك صعودا وهبوطا في رمح trocar ويدفع خزعة نحو نافذة إبرة. لسحب العضلات في نافذة إبرة، يتم إرفاق خرطوم شفط، الذي تمتص الهواء من الإبرة ويسحب العضلات في نافذة إبرة عن طريق الضغط السلبي.

غالبًا ما يتم الحصول على خزعات العضلات لدراسة التغيرات في محتوى البروتين أو التعبير الجيني أو المورفولوجيا الناجمة عن المرض أو في استجابة لبرنامج ممارسة1،9،10،11. آخر الاستخدام الحرج للخزعات العضلات هو التجارب الميكانيكية مثل قياس قوة الألياف المتقلصة، وتصلب الألياف العضلية، وخصائص العضلات التي تعتمد على التاريخ12،13،14،15،16. يتم قياس الألياف واحدة أو الألياف الميكانيكا حزمة من خلال ربط الألياف بين محرك طول وقوة محول على الحفارات المتخصصة التي تتحكم في طول الألياف في حين قياس القوة في وقت واحد. من خلال الألياف التميزيم (على سبيل المثال، سلخ) الألياف، يصبح غشاء ساركلوما نفاذية للمواد الكيميائية في محلول الحمام، مما يسمح للتحكم في التنشيط عن طريق تركيز الكالسيوم متفاوتة. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة تقييم تأثير خصائص التقلص على المواد الكيميائية/ المستحضرات الصيدلانية/البروتينات الأخرى عن طريق إضافة الكاشف المعني إلى محلول الحمام. ومع ذلك، في حين أن هذه التقنية تستخدم بشكل كبير في نماذج حيوانية أخرى، فقد أجريت دراسات أقل بشكل ملحوظ اختبارات ميكانيكية على الألياف الجلدية من خزعات العضلات البشرية17،18،19. أحد الأسباب هو أن أدوات الخزعة والبروتوكولات مصممة لإزالة الأنسجة العضلية قدر الإمكان مع مراعاة أقل لمستوى الضرر الهيكلي الذي لحقت به أثناء استخراج الأنسجة. في الواقع، يشير بروتوكول خزعة الأخيرة لدفع إبرة الخزعة في العضلات وجمع 2-4 قطع من العضلات3. العملية نفسها لا تضر كثيراً بالحمض النووي أو مادة البروتين، ولكنها غالباً ما تدمر الألياف والهياكل الساركية بطريقة يصبح فيها تنشيط ألياف العضلات غير مستقر أو مستحيلاً. وعلاوة على ذلك، الطول النسبي للألياف داخل خزعة عادة قصيرة (<2 مم) وليس من السهل التعامل معها للاختبارات الميكانيكية. بالنسبة للاختبارات الميكانيكية، تكون الألياف المثالية طويلة (3-5 مم) وليست تالفة هيكلياً.

ويمكن استخدام تقنيات استخراج الأنسجة أكثر تقدما للحد من تلف الألياف. فعلى سبيل المثال، استفادت إحدى المجموعات20 من "العمليات الجراحية المفتوحة" المخطط لها من قبل للساعدين (مثل إصلاح كسر العظام)، حيث تعرضت العضلات بالكامل وتمكن الجراح من تصور بنية العضلات وتشريح العينات الكبيرة نسبياً وغير التالفة هيكلياً (15 مم × 5 مم × 5 مم). ويفضل هذا الأسلوب "خزعة مفتوحة" عندما يخضع المشاركون لإجراء المخطط له سابقا، وبالتالي يحد من مجموعة من المشاركين المحتملين، وخاصة بالنسبة للبالغين الأصحاء، حيث لا تجري عمليات جراحية خلاف ذلك. وهكذا، يتم إجراء العديد من الخزعات لأغراض البحث كإجراء خارجي ويتم الاحتفاظ بموقع الشق الصغير قدر الإمكان للحد من خطر العدوى، والندوب، ووقت الشفاء. لذلك ، يتم جمع معظم الخزعات بشكل أعمى (أي ، المشغل غير قادر على رؤية إبرة التجميع أثناء مرورها من خلال اللفافة في العضلات). وهذا يعني أن نوعية الخزعة تعتمد بشكل كامل تقريبا على مهارة وخبرة المشغل. كل عضلة لها صعوباتها الخاصة عند جمع الأنسجة، مثل مخاطر انتهاك الأعصاب والأوعية الدموية، واختيار عمق المجموعة المثالي والموقع، واتخاذ قرار بشأن موقف الجسم المناسب للحفاظ على العضلات كما الركود ممكن. لسوء الحظ، لا يتم كتابة معظم skillsets العضلات محددة أسفل وهكذا يجب على كل طبيب "إعادة اختراع العجلة" عند إجراء الخزعات على العضلات الجديدة لهم. هذا النقص في الخبرة يؤدي عادة إلى عدة مجموعات ذات جودة منخفضة حتى يحدد الطبيب أفضل الممارسات للخزعات على تلك العضلات. غالبًا ما يتعلم الأطباء المبتدئون المهارة من خلال المحادثات مع زملائهم الأكثر خبرة ، ولكن هناك عدد قليل نسبيًا من النصوص المفيدة والمراجعة من الأقران حول هذه المسألة ، خاصة بالنسبة للعضلات التي لا تستخدم تقليديًا لجمع الخزعة. وإذا نظرنا إلى المعلومات المذكورة أعلاه، إلى جانب صعوبة توظيف متطوعين بشريين من أجل الخزعات، فمن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من المعلومات التعليمية التي تزيد من فرص النجاح لكل مشارك.

وهكذا، كان الغرض من هذه الورقة لتقديم تقنية خزعة العضلات التي توفر بروتوكولات لجمع ناجحة من خزعات العضلات مع طويلة، شظايا الألياف التالفة للاختبارات الميكانيكية. وعادة ما يتم إجراء خزعات العضلات البشرية على, والجزء الأكبر من مواد التدريب خزعة على, وsulus vastus lateralis. حجمها العضلي الكبير نسبيا وموقع سطحي بالنسبة للبشرة يسمح لجمع الأنسجة العضلية الكافية، مع تقليل عدم الراحة المريض والصدمات الجسدية1،21. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على استخدام lateralis vastus لدراسات التدريب الطولي. على سبيل المثال، خلال البروتوكولات التجريبية التي تتضمن برنامجًا تدريبيًا، يجب على المشاركين الامتناع عن التدريب الإضافي خارج الدراسة لفترة تمتد في كثير من الأحيان من شهرين إلى ستة أشهر. للرياضيين، وهذا غالبا ما يكون غير ممكن، كما يتم تدريب عادة في لالييس vastus خلال التمارين النموذجية (على سبيل المثال، القرفصاء، يقفز)، أو يستخدم عموما لهذه الرياضة (على سبيل المثال، الجري، وركوب الدراجات). يمكن أن تسبب هذه التجارب التدريبية المنفصلة بعيدًا عن هدف الدراسة تعديلات عضلية تغير ميكانيكا العضلات والهندسة المعمارية وعلم وظائف الأعضاء بطريقة يصعب أو يستحيل معها معرفة التأثير الحقيقي للبروتوكول التجريبي للدراسة على خصائص العضلات. لهذه الأنواع من الدراسات، سيكون من المثالي لتحديد العضلات المستهدفة التي غالبا ما تكون ليست محور أفواج التدريب. وmusculus tibialis الأمامي (TA) هو العضلات الهدف المثالي الذي يلبي المتطلبات المذكورة أعلاه. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن توجيه التدخلات التدريبية نحو المساعدة الفنية باستخدام نُهج يمكن التحكم فيها، مثل استخدام مقياس دينامومتر. هناك تقريبا أي مواد تدريبية تتعلق خزعة العضلات TA. لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول معدل لجمع خزعات العضلات غير التالفة نسبيا من TA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: فيما يلي، نحدد بروتوكولًا لحصاد الألياف غير التالفة ميكانيكيًا من TA من المتطوعين الذين تم تسجيلهم في دراسة مستمرة منفصلة. هذا البروتوكول مشابه لذلك الذي وصفه Shanely وآخرون3، الذين وصفوا تقنية Bergström المعدلة في vastus lateralis. تم صقل المعلومات المقدمة هنا من قبل مجموعتنا البحثية ولكن قد لا تكون مثالية لجميع مجموعات المختبرات أو الاجهزة التنظيمية. نحن نعطي فقط المبادئ التوجيهية، ويقترح بقوة أن المختبرات الجديدة لجمع خزعة استشارة مجموعات المختبرات ذوي الخبرة قبل محاولة أي تجارب الإنسان.

وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية العلوم الرياضية في جامعة الرور بوخوم على جميع الدراسات التي أجريت في هذه الورقة. وقد أعطى المشاركون موافقة خطية مستنيرة مجانية قبل المشاركة في الدراسة.

1- الإعداد التجريبي

  1. تقييم معايير الاستبعاد مع أخذ التاريخ الطبي المفصل للمشارك أثناء استشارة المشاركين (انظر أدناه).
    1. استبعاد المشاركين إذا عانوا من إصابة في العضلات المستهدفة خلال الأسابيع ال 6 التي تسبق الخزعة. تأكد من أن المشاركين يتمتعون بصحة جيدة بشكل عام، ولا يدركون أي اضطرابات في العضلات أو التخثر، ولا يتناولوا حالياً الأدوية التي تسبب ترقق الدم (مثل الأسبرين).
      ملاحظة: هنا، اخترنا المشاركين الذين كانوا نشطين بشكل معتدل وأصدرنا لهم تعليمات بالامتناع عن تمارين الساق المكثفة أو غير المُعَدَّة قبل 3 أيام على الأقل من إجراء الخزعة. ومع ذلك، بالنسبة لمسائل البحث الأخرى، قد تتغير هذه المعايير.
  2. الالتزام بالتعقيم والتقنيات المطهرة، كما ينظمها القانون الألماني والممارسة الشائعة ويشرف عليها طبيب الفريق22،23. يمكن إجراء هذا الإجراء في كثير من الأحيان كإجراء "السرير" أو في جناح جراحية للمرضى الخارجيين. استشر الهيئة التنظيمية المحلية للحصول على التوجيه.
  3. تشكيل فريق الخزعة. نقترح أن فريق الخزعة يضم 4 أشخاص. طبيب (أو فرد مدرب على جمع خزعة)، مساعد طبي واحد يعمل مع الطبيب، مساعد واحد يراقب ويتفاعل مع المشارك، ومساعد واحد الذي يعالج خزعة العضلات مباشرة بعد الاستخراج. مع هذه الأرقام، يمكن إعطاء الرعاية السريعة للمرضى إذا حدث طارئ طبي أثناء الإجراء. إذا كان مرتاحا مع الإجراء، ثم يمكن أن يتكون الفريق من شخصين فقط: الطبيب والمساعد الطبي، الذين سوف تأخذ معا على رعاية المريض وتجهيز الأنسجة في وقت واحد.
  4. واعرض على المشارك مقابلة مع رئيس/طبيب المشروع لمراجعة ومناقشة وتوقيع نموذج موافقة المستخدم. خذ تاريخًا طبيًا مفصلًا (الحساسية أو الإصابات أو العمليات الجراحية في الطرف السفلي وTA) واستبعاد المشارك إذا كان يفي بأي من معايير الاستبعاد. مناقشة شاملة الانتعاش والشق النظافة.
    1. شرح للمشارك أنها سوف تكون قرحة ولكن قادرة على المشي حولها مباشرة بعد العملية; المشي على المنحدرات أو السلالم غير مريح في كثير من الأحيان لأول 48 ساعة ، مع النشاط الكامل عادة ما يعود بعد 72 ساعة. وأخيرا، اشرح أنه للحد من العدوى والسحجات الميكانيكية، يجب أن يبقى موقع الشق مضمد لمدة أسبوع على الأقل وأبقى نظيفة.

2. تصور Tibialis الأمامية مع ب وضع الموجات فوق الصوتية

  1. إرشاد المشارك إلى الاستلقاء في وضعية مريحة ولاسترخاء عضلات الساق قدر الإمكان. استخدام جهاز مخصص (انظر أدناه) أو أن يكون مساعد عقد الكاحل في موقف dorsiflexed قليلا لتقليد ذلك الذي سيتم القيام به أثناء الخزعة.
    ملاحظة: من المهم أن يكون المشارك قد TA استرخاء بحيث أنه يكرر خصائص العضلات أثناء الإجراء. خلال الامتحان، اطلب من المشارك التعاقد والاسترخاء في العضلات بحيث يمكن ملاحظة التغيرات في بنية العضلات.
  2. استخدام مسبار الموجات فوق الصوتية لتصور المقصورات السطحية والعميقة من TA، لمسح بنية العضلات وتقرر على عمق إدخال وإبر زاوية الهجوم(الشكل 2A-B). تشير إلى المعالم على الجلد.
    1. إيلاء اهتمام خاص لاختيار منطقة الهدف الذي يتجنب الأوردة الرئيسية, الشرايين, أو الأعصاب.
    2. تقييم المقطع المقطع عرضية من العضلات، بهدف تحديد aponeurosis المركزية داخل البطن العضلات TA (حوالي 1/3 من الساق، وشطة للركبة، و 2 سم من قمة التيبالي) (الشكل 2B). سجل موقع وعمق من aponeurosis المركزية (عادة 1.5-3 سم) بحيث يمكن اتخاذ الحذر لعدم قيادة جمع (Bergström) إبرة الماضي هذه النقطة.
    3. ضع مسبار الموجات فوق الصوتية في الاتجاه القريب - القاصي على الموقع المستهدف وتصور بينة الكروسكل وسمك العضلات (الشكل 2A). استخدم هذه المعلومات للمساعدة في القيادة بنجاح (بشكل أعمى) إبرة التجميع في بطن العضلات. حفظ صور للموقع المستهدف في كلا ال planes للرجوع إليها في المستقبل أثناء العملية الجراحية.
  3. مع هذه المعلومات، إنشاء خطة لحركة إبرة نحو المنطقة المستهدفة.
    1. خطة لجعل شق 1-3 سم من منطقة خزعة الهدف. بعد تمرير الإبرة في العضلات ، قم بتدوير الإبرة إلى زاوية تبلغ 45٪ تقريبًا إلى الجلد على طول المحور الطويل للأطراف ، ثم دفعتها بشكل وكيل نحو منطقة الخزعة. هذه الاستراتيجية يحد من فرصة قيادة الإبرة في aponeurosis المركزية، إذا تم دفع الإبرة من الصعب جدا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الدافع الإبرة distally أو proximally، اعتمادا على اليد من المشغل إبرة.

3. إجراء الخزعة

  1. إرشاد المشارك لوضع سوبين على طاولة العمليات والاسترخاء عضلات الساق. تأكد من أن خط البصر الخاص بالمشارك في موقع الخزعة مسدود بواسطة ستارة.
    1. إزالة التوتر السلبي من البطن العضلي عن طريق وضع الطرف المشارك في جهاز أن إصلاح الكاحل في موقف dorsiflexed قليلا (0-5 ° من محايدة; الشكل 3). اسأل المريض إذا كان لا يزال بإمكانه الاسترخاء في عضلاته ، حيث أن الكثير من dorsiflexion قد يجعل من الصعب الاسترخاء.
      ملاحظة: لقد وجدنا أن جمع الخزعات من قدم dorsiflexed، لا يزيد عن 5 درجة محايدة (أي، وحيد عمودي القدم على الساق) تنتج خزعات أكثر اتساقا وأكبر من زوايا الكاحل أكثر مرونة من اللوح. الجهاز الذي يحافظ على الكاحل dorsiflexed هو جهاز مخصص الصنع. ومع ذلك، يمكن أن يكون ملفقة أي عدد من الأجهزة (رخيصة) التي لا تزال تنتج النتيجة المرجوة.
  2. حلاقة وتنظيف وتطهير منطقة الشق المحدد، وفقا للممارسات القياسية24.
    ملاحظة: مساحة المشارك "النظيفة" حوالي 20 سم قريبة- فصيف و 10 سم من موقع الشق المقترح. ومع ذلك، يرجى الرجوع دائماً إلى اللوائح الوطنية للمؤسسة و/أو (إن وجدت) بشأن هذا الموضوع. بروتوكول التطهير يشمل تنظيف الجلد وتنظيف ثم تطهير أربع مرات مع الاستخدام الليبرالي لرذاذ التطهير من الدرجة الطبية. إذا غادر المشارك الجدول لأي سبب من الأسباب، يجب إعادة تشغيل بروتوكول التطهير.
  3. إدارة حقن فوق الفاتسائي من 1.5 سم مكعب من 2٪ Xylocitin مع الادرينالين في موقع خزعة, الذي يعمل كمخدر الموضعية والأوعية الدموية. انتظر الوقت المخصص تؤثر على ~ 20-30 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الأدوية هي سماني، وبالتالي يجب أبدا أن يتم حقنها في العضلات، إلا الأنسجة تحت الجلد. كرد فعل على أوعية الأوعية، قد تتحول منطقة موقع الحقن إلى اللون الأبيض (على لون البشرة الأخف) أو الرمادي (لون البشرة الداكنة).
  4. تأكيد تأثير المخدرات مع ملاعب الجلد وكزات لطيف مع مشرط معقمة.
  5. في موقع الخزعة الذي تم تمييزه سابقًا ، قم بعمل شق قريب 1 سم مع مشرط معقمة تخترق الجلد والفصالة ، مما يعرض بطن العضلات. الحرص على قطع اللفافة تماما لأن الإبرة هي حادة، وسوف لا تمر من خلال اللفافة.
  6. دفع إبرة خزعة 0.5-1.0 سم في العضلات مع اتجاه عمودي على الجلد (الشكل 2C, 2E).
    ملاحظة: سوف يشعر المشغل تغير في التوتر اللازم لدفع الإبرة من خلال أنواع الأنسجة المختلفة. الأنسجة الدهنية سهلة، اللفافة هي الأصعب، والعضلات بين (ولكن يمكن أن تكون متغيرة، استنادا إلى المشارك).
  7. توجيه الإبرة إلى موضع ~ 45 درجة زاوية إلى الجلد، على طول محور طويل من الساق(الشكل 2D، 2F). دفع الإبرة آخر 1-2 سم في العضلات حتى تلميح إبرة في الموقع المستهدف داخل العضلات.
    ملاحظة: يجب على الطبيب الاستفادة من الصور المحفوظة بالموجات فوق الصوتية لحساب الاختلاف الفردية لأبعاد العضلات. لأن شق هو فقط كبيرة بما يكفي لإدخال إبرة، يدفع الطبيب الإبرة بشكل أعمى من خلال الجلد. هناك "شعور" أن عامل الخزعة مكاسب مع الخبرة. يجب على المبتدئ تعلم المهارة من عامل خزعة مدرب (المزيد عن هذا في المناقشة).
  8. إرفاق حقنة 100 مل و خرطوم لإبرة الخزعة (الشكل 1G). تطبيق شفط لإبرة Bergström عن طريق سحب المكبس من حقنة بنحو 15-20 مل لإنتاج ضغط سلبي في الإبرة وامتصاص الأنسجة العضلية في نافذة إبرة. ثم، مكوس العضلات عن طريق دفع سريع (es) من trocar على نافذة إبرة.
    ملاحظة: قبل وأثناء الشفط، من المفيد أحيانًا وضع ضغط خفيف على الجلد فوق نافذة الإبرة مباشرة للمساعدة في دفع العضلات إلى الإبرة.
  9. قم بإزالة الإبرة من الساق برفق، وتناوب ببطء. يجب أن يكون هناك فقط مقاومة الضوء أثناء استخراج الإبرة. إذا كان هناك المزيد من المقاومة، وهذا قد يشير إلى قطع خزعة جزئية. يحدث هذا، والعودة إلى الحاجة إلى الموقع المستهدف، وإعادة جمع الأنسجة.
  10. دفع الأنسجة المُخَلَّّة نحو نافذة الإبرة باستخدام الرّرود الداخلي.
  11. إزالة العينة بعناية من الإبرة.
    ملاحظة: غمر الإبرة في محلول الجمع (انظر قسم إعداد الألياف) غالباً ما يزيح الخزعة من الإبرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الحقنة لدفع الهواء من خلال الإبرة ودفع عينة. هذه التقنيات إزالة الحاجة إلى لمس خزعة جسديا مع ملاقط ويقلل من احتمال الضرر. إذا كانت الأدوات أو اليدين (قفاز أم لا) أو حلول غير معقمة تأتي في اتصال مع الإبرة، لا يمكن استخدام الإبرة زيادة خلال الإجراء. وهكذا ، إذا كان هناك حاجة إلى خزعة فورية ثانية ، فيجب استخدام إبرة معقمة جديدة. يحدث هذا في كثير من الأحيان ، لذلك هو أفضل ممارسة للحفاظ على العديد من الإبر العقيمة في الاحتياطي.
  12. تحديد الأنسجة كعضلات وليس الأنسجة الدهنية أو الضام. يتم التعرف بسهولة على أنسجة العضلات من الأنسجة الأخرى بسبب لونها الأحمر العميق (الشكل 4A). في بعض الأحيان، والأنسجة التي تم جمعها ليست العضلات، ولكن الدهون أو النسيج الضام.
    1. إذا تم جمع كمية كافية من الأنسجة العضلية، تابع البروتوكول. إذا لم يكن هناك ما يكفي من العضلات، حاول خزعة مرة أخرى.
    2. إذا كانت هناك حاجة إلى خزعة ثانية، فراقب المشارك بعناية، حيث أن عملية دفع إبرة ثانية تجعل المشارك غير مرتاح أكثر من الأول.
  13. غسل عينات العضلات فورا في حل جمع والاستعداد لتجارب الألياف واحدة (انظر معالجة خزعة العضلات والتخزين).
    1. يكون مساعد من ذوي الخبرة التحقق من نوعية العينة (انظر أدناه) وتقييم الحاجة إلى إجراء خزعة ثانية. مساعد منفصل يأخذ الخزعة للمعالجة، في حين أن بقية الفريق يستمر مع المشارك.
  14. أغلق موقع الشق.
    1. إغلاق الجرح الشق مع الشريط Leukostrip العقيمة. استخدم قطعة واحدة أو أكثر للانضمام إلى حواف موقع الشق عن طريق وضعها عموديًا على المحور الطويل للشق ، ثم وضع شرائح أخرى في نمط نجمي للحماية من التحميل متعدد الاتجاهات.
      ملاحظة: سوف معالجة مناسبة من هذه الخطوة تقليل تندب. يمكن أن يتم خياطة الجرح ولكن ليس من الضروري. وتشمل الخيارات الأخرى الغراء الجرح.
    2. وضع معقمة الجروح خلع الملابس (على سبيل المثال، Leucomed T زائد) على موقع شق للحماية من العدوى.
    3. لف الساق بضمادات مرنة متماسكة (مثل Unihaft) للحد من النزيف الأولي والحماية من التأثير الميكانيكي الخارجي.
    4. لف الساق بضمادات ضغط أكريلاسميك لمنع النزيف وحماية الضمادات الأعمق من أن تصبح فضفاضة أو مدمرة.

4. الرعاية بعد الخزعة

  1. اطلب من المشارك أن يتجول مباشرة بعد العملية. سيكون هناك وجع موضعي. إرشاد المشارك إلى المشي بشكل طبيعي قدر الإمكان.
  2. إرشاد المشارك إلى عدم إزالة الضمادات أو السماح للماء بتنقع الضمادات. يجب أن تبقى على على ما لا يقل عن: يوم واحد لضمادة الاكريبلاستيك، ثلاثة أيام لضمادة مرنة متماسكة، وسبعة أيام لخلع الملابس الجرح. إبلاغ المشارك أنه يمكن إعادة ربطها إذا لزم الأمر.
    1. تخصيص الرعاية بعد خزعة المشارك لاحتياجات الفرد. أن يكون لديك مساعد مدرب أو طبيب تقييم المشارك ووضع خطة الرعاية المناسبة بعد الخزعة. لهذا الإجراء، نقترح أن يتم فصل أي في اختبار عصبي عضلي في الجسم الحي من TA لمدة أسبوع على الأقل من الخزعة.

5. خزعة العضلات التعامل مع وتخزين

  1. بعد استخراج الأنسجة، ضع الأنسجة على الفور في قارورة 5 مل تحتوي على محلول جمع الصرامة (في mM: Tris (50)، KCl (2)، NaCl (100)، MgCl2 (2)، EGTA (1)، قرص مثبطات البروتياز (1)، pH 7.0) ويهز بخفة لمدة 4-6 دقائق لغسل الدم.
  2. تبادل الحل Rigor لصرامة جديدة، يهز طفيفة لمدة 4-6 دقيقة، ومن ثم تخزين في 4 درجة مئوية لمدة 4-6 ح للسماح لتبادل محلول تخزين مثبطات البروتياز والدم.
  3. استبدال الحل ريجور للصرامة بين عشية وضحاها (في mM: تريس (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), حبوب مثبطات البرونتياز (1), 50:50 الجلسرين, درجة ال H 7.0), وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 12-18 ساعة.
  4. تبادل الصرامة بين عشية وضحاها ل 50:50 صرامة جمع: الجلسرين وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر، أو سنة واحدة في -80 درجة مئوية الفريزر.
    ملاحظة: هذه العملية permeabilizes الغشاء الألياف التي تسمح لإضافة يدوية من الكالسيوم داخل وخارج الخلية. تستغرق هذه العملية وقتًا وقد تختلف بين العضلات والأنواع المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الالتزام كامل الوقت للمشارك حوالي ساعة واحدة (10 دقيقة التشاور، 10 دقيقة الموجات فوق الصوتية، 20 دقيقة إعداد عملية جراحية وإدارة التخدير، 10 دقيقة الجراحة، و 10 دقيقة الانتعاش). في كثير من الأحيان ، قام المشاركون بتنشيط TA دون وعي ويحتاجون إلى تذكيرات متسقة للحفاظ على العضلات مريحة قدر الإمكان. عندما كانت إبرة الخزعة داخل العضلات، عادة ما أبلغ المشاركون عن إحساس "ضغط" فريد في المنطقة المحيطة بإبرة الخزعة، مع فترات عرضية من الانزعاج المعتدل إلى الشديد. مرة واحدة، أصابع المشارك ضيقة قليلا خلال العملية، ولكن توقفت على الفور بعد إزالة الإبرة. وكانت أحجام خزعة عادة ~ 50-100 ملغ (كتلة رطبة). ردود فعل المشاركين على هذا الإجراء غالبا ما لا يمكن التنبؤ بها. في بعض الأحيان، توقع المشارك أن لا يتأثر أثناء العملية ولكن بعد ذلك ظهرت عليه علامات الإغماء، في حين كان آخرون متوترين ولكن غير منزعجين تمامًا أثناء العملية. وهكذا، وجدنا أنه من الممارسات الجيدة إبقاء المشارك مشغولاً بمحادثة أو السماح لهم باستخدام هواتفهم المحمولة، بحيث لم يكن اهتمامهم الكامل منصباً على الإجراء الجاري. كما قام المساعد الذي تحدث مع المشارك بمراقبة علامات الضيق أو الألم أو الإغماء. في بعض الأحيان، تحتوي خزعة الأنسجة الدهنية أو الضام فقط (التي تم تحديدها من قبل لون شاحب أبيض من الأنسجة، الشكل 4A). في هذه الحالات، تم أخذ خزعة ثانية على الفور (بعد الموافقة من قبل المشارك). عادة، سوف خزعة ناجحة تسفر > 80٪ أنسجة العضلات(الشكل 4A).

بعد العملية الجراحية، شعر معظم المشاركين بعدم الراحة بعد الإجراء الذي استمر 3-5 أيام. وأفاد المشاركون أن وجع TA مشابه لما هو متوقع بعد يوم من المشي لمسافات طويلة المنحدرات الحادة. لا ينبغي وضع أي ضغط ميكانيكي على موقع شق لمدة 5 أيام على الأقل، أو أنه يمكن إعادة فتح. وعادة ما ترك المشاركون مع ندبة صغيرة، ولكننا لم نلاحظ أثار أو غير طبيعية التغيرات في الجلد. أيضا، لم يكن هناك أي مشارك إصابة بالعدوى.

كانت permeabilized الخزعات (أي، سلخ) في محلول الجلسرين (1:1 خليط من الجلسرين: محلول الصرامة) لمدة 6 أسابيع ثم أعد للاختبار الميكانيكية في يوم التجارب. التحلل من الألياف يسمح لنشر محلول الحمام في الألياف، مما يعطي الباحث التحكم في التنشيط ويوفر أيضا وسيلة لإخضاع العضلات للمستحضرات الصيدلانية أو غيرها من المواد الكيميائية. وعلاوة على ذلك, الجلسرين وظائف كعامل لمكافحة التجمد, السماح للعضلات أن يكون مكان في درجات الحرارة الباردة للتخزين على المدى الطويل, مع أضرار محدودة. ومع ذلك، هناك حاجة إلى بعض الوقت للسماح للجليسرول لاختراق العينات، وذلك في البداية تخزين عينات خزعة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (من الناحية المثالية على لوحة هزة) هو الحكمة. يمكن فقط تخزين العضلات لفترة طويلة جدا قبل أن يتم اختراق وظيفتها. الإرشادات العامة حول هذه المسألة هو أن العضلات سوف تحافظ على وظيفتها داخل محلول الجلسرين لمدة 3 أشهر على الأقل في -20 درجة مئوية الفريزر، أو سنة واحدة في -80 درجة مئوية الفريزر.

تم تصور عينات العضلات تحت مجهر تشريح. وكانت بعض القطع العضلية صغيرة أو التالفة(الشكل 4B)وتمت إزالتها. بعد ذلك ، تم تقييم مجموعات من الألياف لأي ضرر هيكلي (كسر بصريًا أو سحق الألياف ساركلما ، الشكل 4C). من هذه الحزم، تم تشريح حزم أصغر من الألياف من 3-10 بعيدا وضعت بعناية في غرفة تجريبية من تلاعب اختبار الميكانيكية(الشكل 4D). أطوال الألياف القابلة للاستخدام هيكليا كانت عادة 3-5 مم طويلة. وكان إبرة Bergström نافذة جمع من 7 ملم، وبالتالي فإن الخزعة يمكن أن تسفر فقط أقصى ~ 7 ملم ألياف طويلة. وهكذا، كانت الألياف القابلة للاستخدام هيكليا التي جمعناها تقريبا أطول فترة ممكنة. عادة، ونحن إعداد حزمة الألياف 5-10 لكل 50 ملغ من الأنسجة (التي تم جمعها). ويمكن الاطلاع على التفاصيل الكاملة لهذه الإجراءات في أماكن أخرى14,15,25. لإثبات متانة الألياف، نعرض بيانات تمثيلية لبروتوكول ميكانيكي بسيط باستخدام حزم ألياف TA الجليكية (الشكل 5). تم تنشيط 40 حزمة من الألياف من خزعات 10 مشاركين في محلول التنشيط26 (ارتفاع [Ca2+] ، pCa < 4.2) في طول ساركومير 2.7 ميكرومتر لمدة 60 ثانية وتم قياس الإجهاد النشط ثابت الحالة كما 100.71 ± 11 mN mm-2 (متوسط ± SEM).

Figure 1
الشكل 1: إبرة بيرغستروم. إبرة Bergström المستخدمة في هذه الدراسة تتكون من إبرة نفسها (A-F) ، خرطوم شفط (G) ، وحقنة (F). إبرة Bergström يتكون من إبرة الخارجي (أ) التي لديها نافذة قريبة من طرف إبرة، وأصغر جوفاء التروكر الداخلية (B) التي تتحرك صعودا وهبوطا الإبرة ويقطع العضلات عند تمريرها فوق نافذة إبرة، وقضيب (C) التي تتحرك صعودا وهبوطا trochanter للمساعدة في إزالة العضلات من الإبرة. يتم فصل هذه القطع بواسطة غسالة (D) التي تجعل من إبرة محكم ، وفواصل (E) بين قضيب و trocar يحمي ضد سحق خزعة العضلات. وأخيرا، يتم إرفاق محول خرطوم شفط. لسحب العضلات في نافذة الإبرة ، يتم إرفاق خرطوم الشفط (G) بمحول الإبرة والمحاقن. هذا تمتص الهواء من الإبرة ويسحب العضلات في نافذة إبرة عن طريق الضغط السلبي، والسماح لجمع عينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير بالموجات فوق الصوتية ووضع إبرة. وتتألف TA من مقصورات سطحية وعميقة التي يتم تعريفها من قبل aponeuroses. يتم تصوير TA مع مسبار الموجات فوق الصوتية الموجهة في البعيدة -بروكسي (A) و -الجانبي الوسيط (B) وجهات النظر بحيث يمكن التعرف على شكل 3D من TA. عمق إبرة مثالية لجمع بين خطوط متقطعة الأفقي. يتم عرض تمثيل الرسوم المتحركة من إدخال إبرة في لوحات C و D. بعد إجراء الشق ، يتم وضع الإبرة أولاً عموديًا على العضلات وتدفع إلى العضلات حتى تكون نافذة الإبرة في العضلة (C). ثم يتم إعادة توجيه الإبرة إلى زاوية ~ 45 درجة على طول المحور الطويل للساق ، ودفعها إلى العضلات أكثر ، مع إيلاء اهتمام دقيق بأن الإبرة لا تخترق aponeurosis العميق (D). صور حية (E, F) أثناء الإجراء تعطى في إشارة إلى الرسوم المتحركة (C, D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: وضع المشارك. يضع المشارك في موضع غير هدّاد على طاولة العملية. يمكن رفع الرأس للراحة. يتم وضع القدم اليمنى في جهاز مخصص يحافظ على القدم dorsiflexed قليلا، والحد من التوتر العضلي. يتم وضع ستارة أمام المشارك بحيث لا يتمكنوا من مشاهدة الإجراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور تمثيلية للأنسجة العضلية. ( أ) مباشرة بعد الخزعة، عينة العضلات ستكون حمراء أغمق من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة (المسمى في لوحة). (B) تشريح العينات مع الضرر / قصيرة (أعلى) وقابلة للحياة (أدناه) حزم الألياف. (C) التكبير من تجميع الألياف قابلة للحياة لفحص السطح لعلامات الضرر. (D) تم تشريح حزمة 6-fiber بعيدا عن هذه الحزمة الألياف (تعادل على نهايات مع خياطة 6-0 لسهولة الحركة وتعلق على الجهاز الميكانيكي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إخراج القوة التمثيلية لإعداد حزمة الألياف. لإثبات متانة الألياف، نعرض بيانات الإجهاد التمثيلية لبروتوكول ميكانيكي بسيط باستخدام حزمة ألياف TA الغليبسية (3 ألياف). في المجموع، تم تمديد 40 حزمة من الألياف من خزعات 10 مشاركين من الركود إلى 2.7 ميكرومتر ساركومير طول وعقدت للسماح للإجهاد والاسترخاء. بعد ذلك، تم تنشيط الألياف في محلول التنشيط26 (المنطقة المظللة؛ عالية [كاليفورنيا2+] ، pCa < 4.2) في 2.7 ميكرومتر ساركومير طول لمدة 60 ثانية والضغط النشط ثابت الدولة تم قياسه عند 100.71 ± 11 mN مم-2 (متوسط ± SEM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا التقرير، وصفنا تقنية لخزعة الأنسجة العضلية غير التالفة هيكليا من TA. وجدنا أن هذا الإجراء ينتج محتوى مقبول من ألياف العضلات القابلة للاستخدام (5-10 الألياف حزمة الاستعدادات لكل 50 ملغ من الأنسجة التي تم جمعها) للاختبار الميكانيكية. علاوة على ذلك، كان لدينا ما يكفي من الأنسجة لمتابعة التجارب الميكانيكية والوراثية والبروتيومية.

هناك عدة طرق تستخدم عادة لجمع خزعات العضلات3،4،6،27،28. ما يسمى خزعة مفتوحة20 تنتج ألياف أعلى جودة لأن الجراح يكشف تماما العضلات وتشريح خارج العينة. بالطبع، الجراحة المفتوحة هي إجراء جراحي تماماً وليست إجراءً مناسباً لتقديم المشاركين الأصحاء إليها، بغض النظر عن السؤال البحثي، بسبب المخاطر المحتملة المرتبطة بالعمليات الجراحية المفتوحة. طريقة الخزعة الأقل توغلاً هي خزعة الإبرة الدقيقة29،30، والتي تستخدم إبرة أصغر نسبيًا لجمع الأنسجة. الخزعات إبرة دقيقة كافية لإجراء تجارب على مكونات الوراثية / الكيميائية / البروتين من الألياف30،31، ولكن في كثير من الأحيان نوعية الألياف سيئة للغاية ، مما يجعل الاختبار الميكانيكية صعبة أو مستحيلة. تقنية إبرة Bergström هو حل وسط جيد بين الإجراءين المذكورة أعلاه لأن الجراحة أقل توغلا من الخزعة المفتوحة ولكن لا يزال يجمع عينات العضلات التي هي أكبر و (يحتمل) أكثر سليمة هيكليا من الخزعات إبرة غرامة. التقارير السابقة من الإجراء الإبرة برغستروم3,5 هي موارد كبيرة لأولئك الذين يتعلمون هذه التقنية ولكن البروتوكولات الحالية فقط لالبر vastus. تقريرنا يوضح تقنية لTA التي تركز على جمع غلة عالية من الألياف سليمة هيكليا للاختبارات الميكانيكية.

على حد علمنا لا توجد منشورات مفصلة عن جمع خزعات TA. ومع ذلك، فإن الممارسة المعتادة هي وضع المشارك في وضع وبساح ويكون لهم الاسترخاء ساقهم قدر الإمكان. القدم استرخاء في هذا الموقف هو بطبيعة الحال plantarflexed، الذي يطيل بالتالي TA ويضعها في التوتر. نجد أن أي توتر العضلات يجعل من الصعب دفع العضلات إلى إبرة الخزعة، حتى مع الضغط السلبي، وينبغي لذلك أن يقلل من التوتر قدر الإمكان. لتحقيق ذلك ، كان التعديل البسيط ولكن الرئيسي هنا هو استخدام لوحة قدم مبنية خصيصًا تحافظ على الكاحل في وضعية موضعية قليلاً (0 - 5 درجة من محايدة) ، مع الحفاظ على الركود TA وتحسين المجموعة. يجب على الأطباء أن يكونوا حذرين من الإفراط في dorsiflex الكاحل ، حيث سيتم تنشيط TA بشكل لا يمكن السيطرة عليه ، مما يزيد من التوتر ، وهو بالطبع يتعارض مع الإجراء في المقام الأول. يمكن أن يشعر المشارك عادة هذا التنشيط العضلات، لذلك التواصل هو المفتاح. من البروتوكولات، وTA الغلة فقط ~ 25٪ الأنسجة بالمقارنة مع أكثر شيوعاً في االستالي، ~ 100 ملغ و 400 ملغ تقريبا، على التوالي. وهكذا، من المهم تعظيم حجم جمع الأنسجة مع النظر أيضا إذا كانت عينة الأنسجة TA سوف تكون كبيرة بما يكفي لمشروع البحث المطلوب (ق). لقد وجدنا أن أخذ عينة ثانية مباشرة بعد الأول لا يسبب أي مضاعفات إضافية أو وقت الشفاء للمشاركين.

على الرغم من أن البروتوكول يعطي بعض التوجيه نحو خزعات العضلات الأخرى، واختيار العضلات سوف تملي الإجراء المناسب. وهكذا، نقترح بشدة على الباحثين والأطباء الآخرين نشر، بالكامل، أساليب الخزعة الخاصة بهم. من الخبرة، ونحن تحديد بعض العوامل الهامة لاختيار العضلات، خارج السؤال البحثي. أولاً، نقترح النظر في العضلات التي تكون سطحية على الجلد ولها الشرايين الرئيسية / الأعصاب التي هي إما عميقة أو يمكن تجنبها بسهولة. ثانياً، لأن المشاركين مستيقظون أثناء العملية، من المهم النظر في ما إذا كان إجراء الخزعة سيكون غير مريح للمريض، إما بسبب تحديد المواقع الأولية للمريض، أو بسبب ضغط إبرة الخزعة، التي تدفع أيضًا على العضلات العميقة بطريقة غير مريحة. لقد كان لدينا النجاح مع vastus lateralis وحصة الصدر. الخيارات المحتملة الأخرى هي ترابيزيوس، latissimus دورسي، و gastrocnemius (على الرغم من الأوعية الدموية العالية وعرضة للنزيف). عضلات أوتار الركبة ممكنة ولكن غير مريحة للمريض، وصعبة لأنها تتحرك بشكلٍ لاحق عند جمع الخزعة.

على الرغم من أن الإبر Bergström يمكن شراؤها من المصنوعات، وبعض المختبرات مخصصة لجعل الخاصة بهم. صغيرة, بعد ذكي, قد التعديلات على تصميم زيادة العائد من ألياف العضلات طويلة وغير التالفة. على سبيل المثال، كانت نافذة جمع الإبرة المستخدمة هنا 7 مم × 5 مم (الطول × العرض). هذا هو المناسب لالتقاط مكعب من العضلات. ومع ذلك، إذا كان الهدف هو جمع الألياف الطويلة وغير التالفة (من نفس الحجم)، ثم يمكن زيادة الطول، وانخفاض العرض (أي، 10 مم × 3.5 ملم). إذا كانت الإبرة موجهة على طول اتجاه الكروسكل ، فمن المرجح أن هذه الإبرة سوف تجمع أقسام الألياف الأطول.

غالبًا ما يتم جمع خزعات العضلات بأمان دون توجيه صورة الموجات فوق الصوتية ، خاصة بالنسبة للعضلات الكبيرة مثل vastus lateralis. في هذه الحالة، يمكن للطبيب من ذوي الخبرة بشكل صحيح بسهولة الخفقان العضلات للعثور على أفضل موقع شق. ومع ذلك، عندما يكون الطبيب أقل خبرة مع العضلات المستهدفة، أو هناك ما يبرر الرعاية الإضافية لتجنب الأعصاب الرئيسية أو الأوعية الدموية، والموجات فوق الصوتية هو أداة كبيرة وتطبيق ببساطة. وأخيرا، يمكن إجراء مراقبة ما بعد العملية لمنطقة الخزعة بسرعة بمساعدة الموجات فوق الصوتية.

خزعات الأطفال هي بالتأكيد ممكنة ونفذت عادة32،33،34. ومع ذلك، عادةً ما تكون هناك عدة تغييرات أجريت على الإجراء. غالبًا ما تكون هناك حاجة إلى إبرة قياس أصغر وتخدير واعية ، ويتم إجراء الإجراء في بيئة المستشفى. بشكل عام، يمكن أن تكون التجربة مؤلمة للطفل ويجب على المجموعات البحثية التي ترغب في تضمين المشاركين الأصحاء للأطفال أن تزن ذلك بعناية مقابل المزايا المحتملة للدراسة.

يمكن نقل حزم الألياف أو المواد غير المستخدمة إلى تجارب أخرى قبل أو بعد ميكانيكا الألياف. على سبيل المثال، يمكن إجراء التقنيات التي تقيّم محتوى البروتين الساركميري أو تصنيف نوع الأيزوفورم35. ومع ذلك، للحد من تدهور البروتين وتحسين نجاح التحليل، ينبغي أن تكون وميض المجمدة في النيتروجين السائل إما بعد استخراج الأصلي، مباشرة بعد التقييم الميكانيكي، أو معالجتها على الفور لتحليل البروتين. يمكن أيضا أن تكون مستعدة للألياف للكيمياء المناعية أو غيرها من تقنيات التصوير36 التي تسمح لتقييم موقف البروتين داخل الألياف. في هذه الحالة، يمكن وضع الألياف في محلول تثبيتي (على سبيل المثال، 4٪ شبه شكلي/0.25٪ جلثارالدهيد في عازلة فسيولوجية في الرقم الH 7؛ لا الجلوتارالديهيد للكيمياء المناعية) في حين لا يزال على جهاز الاختبار الميكانيكي، والحفاظ على الهياكل الساركوميرية في طول ساركوميري المطلوب. إذا كان ذلك ممكنا، يمكن حصاد قطعة صغيرة من خزعة الأصلي، وغسلها بقوة في حل جمع لمدة 10 دقيقة ومن ثم وضعها في حل المثبت. تفضل العديد من المجموعات تجميد عينات وميض على الفور في إيسوبينتان ، مما يحد من تكوين بلورات الثلج الضارة ، ويحسن جودة الصورة للتقييمات البصرية. هذا هو في الواقع الذهب القياسية لتجميد فلاش; ومع ذلك، نجد أن تلف الكريستال الجليد من النيتروجين تجميد يركز فقط على خارج myofibril الهياكل. لدينا السلامة الهيكلية مرضية من المكونات الساركية في العينات المجمدة أيضا في النيتروجين السائل، ولذا فإننا نعتقد أن النيتروجين هو احتمال، وخاصة إذا كان أكثر سهولة المتاحة، أو الفريق الجراحي / السلطة الكيميائية المحلية ليست على استعداد لاستخدام ال isopentane. مشكلة هامة وغالبا ما لا يتم الإبلاغ عنها مع إعداد العينات للعرض هو أن يتم التعاقد في كثير من الأحيان ساركوميريات / قصيرة، مع منطقة I-النطاق من ساركومير قصيرة أو غير مُشاهدة. للتغلب على هذا، يجب على الباحث تمديد عينات الألياف يدويا (عن طريق جهاز الاختبار أو باليد باستخدام ملاقط غرامة) قبل تحديد. كقاعدة عامة، ونحن تمتد إلى ~ 3.2 μm طول الساركومير (تقاس عن طريق الحيود بالليزر)، أو تمتد إلى ~ 150٪ من طول الركود، في حل الاسترخاء الفسيولوجية منخفضة الكالسيوم. وأخيراً، إذا كانت العيّنات الفرعية مطلوبة لتحليل التعبير الريبي الريبي، فإن طريقة التجميد الفلاشي لا تؤثر على النتائج، ولكن يجب تجميد العينات مباشرة بعد الاستخراج الأصلي ووضعها في ثلاجة -80 درجة مئوية، حيث أن RNA غير مستقر للغاية. هناك بعض حلول تخزين RNA- حماية في السوق، ولكن وجدنا نتائج مختلطة مع استخدامها، وفقط فلاش تجميد عينات جديدة.

لزيادة كمية المعلومات التي تم جمعها خلال تجربة واحدة إلى أقصى حد، يمكن إكمال جمع البيانات الأخرى في وقت واحد أثناء إجراء الاختبارات الميكانيكية. على سبيل المثال، يمكن إجراء دراسة الهياكل الساركية خلال الاختبارات الميكانيكية باستخدام التصوير الانحراج بالأشعة السينية منخفضة الزاوية، كما هو الحال في الحيوانات الأخرى37،38. بالنسبة للتجارب الجينية، يجب معالجة العضلات المُقاصة على الفور لهذا الغرض أو تجميد الفلاش لأن الحمض النووي الريبي /الحمض النووي الريبي أقل استقرارًا نسبيًا من البروتينات.

بعض القيود سبق وصفها أعلاه. هنا نناقش الإجراء نفسه. وهناك قيد كبير بالنسبة لمعظم المجموعات هو وجود عضو في الفريق الذي يتم تدريب مناسب في جمع خزعة. بغض النظر عن مهنة الشخص (طبيب، مساعد طبي، فني، أو غير ذلك)، هذا الإجراء صعب لأن المحقق يدفع الإبرة بشكل أعمى ويجب أن تعتمد على "يشعر"3،28 لتحديد موقع نافذة إبرة بدقة. الأخطاء ليست مقبولة لأن المشاركين في قبول الإنسان للخزعات متناثرة، خزعة واحدة أفضل من العديد، والأخطاء يمكن أن تؤدي إلى تلف الأوعية الدموية أو الأعصاب. لذلك، ينبغي أن تكتمل أي إمكانيات التدريب قبل إجراء خزعة بشرية. على سبيل المثال، للحصول على "يشعر" لقيادة الإبرة، لحم الخنزير مع الجلد لا تزال تعلق يمكن شراؤها من معظم محلات البقالة وتستخدم كوكيل للبشرة البشرية والعضلات. تجربة أخرى قيمة هي أن تظلم مجموعة بحثية مدربة.

قمنا بتقييم ألم المشاركين/ عدم الراحة بشكل أكثر نوعية، معتمدين على تجربة الطبيب والمحادثات مع المشارك لتقييم الألم المتصور. ومع ذلك، يمكن تقييم الألم والانزعاج بعد الخزعة يكون أكثر كميا وقابلة للمقارنة عبر الأفراد والدراسات من خلال استخدام مسوحات الألم /عدم الراحة التحقق من صحتها. يتلقّى هذا نقطات بشكل مفاجىء معالجة صغيرة في الأدب. ومع ذلك، قدمت إحدى الدراسات الحديثة طريقة لقياس الألم/عدم الراحة لدى المشاركين قبل، وأثناء، وبعد الخزعات، من خلال استخدام مسوحات ثابتة للألم39. نلاحظ أن هذه الورقة تستخدم في vastus lateralis كالعضلات المستهدفة، وبالتالي هناك حاجة إلى دراسات المتابعة لمقارنة تقييمات الألم بين العضلات.

بغض النظر عن طريقة الاستخراج، لا يمكن لتقنية Bergström أن تستخرج الطول الإجمالي للألياف في العضلات لأن الألياف طويلة جدًا (~ 6-8 سم في TA40، ~ 6.5-8 سم في vastus lateralis40). لذلك ، لا مفر من أن قطعة طويلة من الألياف التي تم جمعها ، يتم تدميرها من قبل تقنية الخزعة. في كثير من الأحيان ، فإن الجزء المركزي القابل للاستخدام من الألياف صغير ، وبالتالي فمن الصعب اختبار ميكانيكيا. على الرغم من أن هذه التقنية توفر مناطق مركزية طويلة بشكل معقول (3-5 مم) ، يجب على المحقق التحقق بعناية من جودة حزم الألياف أثناء التشريح لأن استخدام الألياف التالفة سيغير مخرجات القوة السلبية أو النشطة. الملاحظة البصرية للخزعات الناجحة سوف تظهر جزءا من الألياف التي لم تتضرر من إجراء الخزعة. عندما ينظر إليها من المجهر الضوء التشريح التقليدية، سطح الألياف تبدو على نحو سلس، مع عدم وجود ثقوب أو الدموع (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، يجب أن تبدو الألياف أسطواني وليس لها مناطق بالارض. على الرغم من عدم رؤية العضلات، إلا أنها ستتحلل بمرور الوقت بسبب البروتيازات التي تحدث بشكل طبيعي وتبدأ في تحطيم بروتينات العضلات مباشرة بعد الاستخراج. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لإضافة مثبطات البروتياز لجميع الحلول المستخدمة مع الألياف. وعلاوة على ذلك، نقترح أيضا يغسل إضافية من الخزعات لإزالة أكبر قدر ممكن من الدم.

حتى مع إعداد دقيق، يمكن أن يحدث تلف الألياف ويؤدي إلى ضعف تنشيط الألياف. هناك العديد من الأسباب لتلف الألياف لأن الألياف حساسة جداً تقريباً كل جزء من الإجراء. على سبيل المثال ، أثناء الخزعة ، إذا لم يكن trocar حادًا بما فيه الكفاية ، فيمكنه الدفع إلى أنسجة العضلات أثناء الاستخراج بدلاً من قطعه ، والذي يمكن أن يمتد ويدمر الألياف. يجب أن يكون حل جمع أعدت بشكل مناسب لأن الألياف حساسة للتغيرات التناضحة، ودرجة الحرارة، ودرجة الحرارة. عند التعامل مع الألياف، يجب توخي الحذر الشديد للحد تماما من الضغط على الألياف. بدلا من ذلك، يجب استخدام ملاقط للاستيلاء على خزعة من نسيجها الضام. بديل آخر هو استخدام خياطة حريرية مقاس 0-7 لتغليف نهاية غير صالحة للاستعمال من الخزعة ثم الاستيلاء على هذا عند التعامل معها. وأخيرا، فإن الجلسرين يخدم دورين: الأول هو الحفاظ على العضلات من التجمد في حين في -20 درجة مئوية والثاني هو أن يكون المنظفات خفيفة إلى الألياف. وهذا هو، الجلسرين permeabilizes الألياف إلى حلول خارجية، مما يسمح لتدفق الكالسيوم (عن طريق حل التنشيط). بالنسبة لمعظم العضلات، تستغرق هذه العملية 10 أيام. ومع ذلك، اعتمادا على كمية محتوى الكولاجين وحجم العينة، وهذا يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 6 أسابيع. يجب أن تكون الألياف permeabilized أي تنشيط عالية الكالسيوم تحدث أثناء التجارب الميكانيكية. الألياف عموما قابلة للاستخدام لمدة 3 أشهر على الأقل. للحد من النفايات الألياف، ويقترح أطول طول فترة الانتظار permeabilization (4-6 أسابيع) لألياف العضلات TA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر ميكايلا راو، وليا فيديا ريسمان، ومايكل مارش، وجانينا- صوفي تينلر، وكيليان كيميكامب، وفولفغانغ لينكه على مساعدتهم في المشروع. تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة ميركور (ID: An-2016-0050) إلى DH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
  2. Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
  3. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
  4. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  5. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
  6. Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
  7. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  8. Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
  9. Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
  10. Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
  11. McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
  12. Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
  13. Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
  14. Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
  15. Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
  16. Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
  17. Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
  18. Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
  19. Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
  20. Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
  21. Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
  22. Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
  23. Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
  24. Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
  25. Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
  26. Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
  27. Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
  28. Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
  29. Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
  30. Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
  31. Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
  32. Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
  33. Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
  34. Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
  35. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  36. Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
  37. Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  38. Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
  39. Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
  40. Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).

Tags

علم الأحياء، العدد 163، تيبياليس الأمامي، خزعة العضلات، الموجات فوق الصوتية، ميكانيكا الألياف البشرية، الميكانيكا الحيوية، تقنية Bergström المعدلة
جمع خزعات العضلات الهيكل العظمى من المقصورة العليا من الإنسان Musculus Tibialis الأمامي للتقييم الميكانيكي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hessel, A. L., Hahn, D., de… More

Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter