Summary
本技术报告描述了经过改良的Bergström技术的变化，用于对前骨质纤维的活检，以限制纤维损伤。
Abstract
收缩骨骼纤维的机械性能是整体肌肉健康、功能和性能的关键指标。人类骨骼肌活检经常收集为这些努力。然而，除了常用的粘液后，活检程序的技术描述相对较少。虽然活检技术经常进行调整，以适应每个肌肉在研究的特点，很少有技术报告分享这些变化，以更大的社区。因此，当操作员重新发明车轮时，人类参与者的肌肉组织经常被浪费掉。从各种肌肉中扩展活检的可用材料可以减少活检失败的事件。本技术报告描述了改进后的 Bergström 技术在粘液头骨前的变化，该技术可限制纤维损坏并提供足够的纤维长度进行机械评估。手术是一个门诊手术，可以在一小时内完成。此程序的恢复期是立即为轻活动（即步行），最多三天恢复正常身体活动，约一个星期的伤口护理。提取的组织可用于机械力实验，我们在这里提供具有代表性的激活数据。该协议适用于大多数收集目的，可能适应其他骨骼肌，并可能通过修改收集针进行改进。
Introduction
为临床或研究目的研究人类肌肉生理学往往需要肌肉活检。例如，人类肌肉生理学和生物力学的一个主要挑战是区分和理解肌肉性能对运动的各种适应。性能适应不仅包括结构适应（例如，收缩蛋白的变化，肌肉结构），还包括神经适应1，这是很难，如果不是不可能，单独评估时，测试完好无损的原位人类肌肉。纤维级实验去除这些高阶成分，并允许更直接地评估肌肉收缩，并可通过活检技术收集。肌肉活检已经收集至少自1868年2。今天，收集肌肉活检的主要技术是修改的Bergström技术3,3，4，5，,5虽然其他技术可用，包括使用威尔-布莱克斯利孔胸6或所谓的细针7,7，8。所有这些技术都使用特殊的针状仪器，这些仪器被设计成进入肌肉并切割一块组织。具体来说，经过修改的Bergström技术使用大改性针头（此处为 5 mm 针头尺寸）;图1）有一个靠近针尖的窗户和一个较小的内部小刀，在针尖上和向下移动，在穿过针尖窗口时切割肌肉。在这个神圣的小车内是一个拉罗德，向上和向下移动的轴的特罗卡，并推动活检到针窗。要将肌肉拉入针窗，请连接一根吸气软管，吸出针头的空气，通过负压将肌肉拉入针窗。
肌肉活检通常是为了研究蛋白质含量、基因表达或疾病引起的形态变化，或对,运动计划,1、9、10、11,9的反应而获得的。10肌肉活检的另一个关键用途是机械实验，如测量纤维收缩力，肌肉纤维僵硬，和历史依赖肌肉属性12，13，14，15，16。12,13,14,15,16单光纤或光纤束力学通过将光纤连接在长度电机和力传感器之间，在控制光纤长度同时测量力的专用钻机上进行测量。通过渗透（如皮肤）纤维，肉瘤膜变得渗透到沐浴液中的化学物质，允许通过改变钙浓度进行活化控制。此外，通过将有关试剂添加到沐浴液中，可以很容易地评估收缩特性对化学品/药物/其他蛋白质的影响。然而，虽然这项技术在其他动物模型中被高度使用，但对人类肌肉活检17、18、19,的皮片纤维进行机械测试的研究明显较少。原因之一是活检工具和协议旨在去除尽可能多的肌肉组织，而较少考虑组织提取过程中遭受的结构损伤程度。事实上，最近的活检方案建议推动活检针进入肌肉，并收集2-4块肌肉3。这个过程本身对DNA或蛋白质物质的损害很小，但往往破坏纤维和沙康结构，使肌肉纤维的激活变得不稳定或不可能。此外，活检中纤维的相对长度通常很短（<2 mm），不容易用于机械测试。对于机械测试，理想的纤维长（3-5 毫米），且没有结构损坏。
更先进的组织提取技术可用于限制纤维损伤。例如，一组20 人利用了先前规划的前臂"开放手术"（例如骨折修复），其中肌肉完全暴露，外科医生能够可视化肌肉结构，并仔细解剖肌肉组织相对较大和结构上未损坏的样本（15毫米x5毫米x5毫米）。这种"开放活检"技术在参与者正在接受先前计划的程序时受到青睐，因此限制了潜在参与者的库，尤其是对健康成年人，否则不会进行手术。因此，许多为研究目的进行的活检都是作为门诊程序进行的，切口部位尽可能小，以限制感染风险、疤痕和愈合时间。因此，大多数活检 是盲目 收集的（即，操作者无法看到收集针头，因为它通过筋膜进入肌肉）。这意味着活检的质量几乎完全基于操作者的技能和经验。每个肌肉在收集组织时都有自己的困难，例如有违反神经和血管的风险，选择理想的收集深度和位置，并决定一个合适的身体位置，以保持肌肉尽可能松弛。不幸的是，大多数肌肉特异性技能集没有写下来，所以每个医生必须"重新发明车轮"时，执行活检的肌肉新到他们。这种缺乏经验通常导致几个收集低质量，直到医生确定对肌肉的活检的最佳做法。新手医生经常通过与经验更丰富的同事交谈来学习这种技能，但相对而言，有关这一问题的信息和同行评议文本相对较少，尤其是对于传统上不用于活检收集的肌肉。如果我们考虑上述信息，以及招募人类志愿者进行活检的困难，显然需要更多的教学信息，从而最大限度地提高每个参与者的成功机会。
因此，本文的目的是提出一种肌肉活检技术，为成功采集肌肉活检和长而未损坏的纤维片段进行机械测试提供了方案。人类肌肉活检通常是进行，和活检训练材料的大部分是，肌肉广大后。其相对较大的肌肉大小和表面位置相对于皮肤允许收集足够的肌肉组织，同时尽量减少病人的不适和身体创伤,1，21。然而，在纵向训练研究中使用广大后法存在一些局限性。例如，在包括培训计划的实验协议期间，学员必须在通常为期 2-6 个月的学习期间内避免在学习之外进行额外培训。对于运动员来说，这通常是不可能的，因为广大的后天运动员通常在典型的练习（如蹲下、跳跃）期间进行训练，或者通常用于这项运动（例如跑步、骑自行车）。这些远离研究目的的单独训练经验可能导致肌肉适应，改变肌肉机制、结构以及生理学，使难以或不可能知道研究的实验协议对肌肉特性的真正影响。对于这些类型的研究，最好选择目标肌肉，这往往不是训练团的重点。肌肉头骨前 （TA） 是满足上述要求的理想目标肌肉。此外，培训干预措施可以针对 TA 使用可控的方法，例如使用测功机。几乎没有与 TA 肌肉活检相关的训练材料。因此，我们开发了一个修改的协议，从TA收集相对未受损的肌肉活检。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：下面，我们概述了一个协议，从参加单独正在进行的研究的志愿者的 TA 中收获机械未损坏的纤维。该协议与Shanely等人描述的相似，他们描述了经过的《大法》中经过的改进的伯格斯特伦技术。此处提供的信息已被我们的研究小组改进，但可能并非适合所有实验室组或组织设置。我们只给出指南，强烈建议新进入活检收集的实验室在尝试任何人体试验之前咨询有经验的实验室小组。
本文的所有研究都通过了波鸿鲁尔大学体育科学学院伦理委员会的批准。参加者在参加研究之前提供免费的书面知情同意。
1. 实验准备
- 在学员咨询期间查看学员的详细病史时评估排除标准（见下文）。
- 如果参与者在活检前6周内目标肌肉受伤，则排除他们。确保参与者一般健康，没有肌肉或凝血障碍，目前没有服用导致血液变薄的药物（如阿司匹林）。
注意：在这里，我们选择了适度活跃的参与者，并指示他们至少在活检前3天不要进行密集或不习惯的腿部锻炼。但是，对于其他研究问题，这些标准可能会改变。
- 如果参与者在活检前6周内目标肌肉受伤，则排除他们。确保参与者一般健康，没有肌肉或凝血障碍，目前没有服用导致血液变薄的药物（如阿司匹林）。
- 坚持消毒和无菌技术，受德国法律和普通做法的规范，并由队医监督22，23。,23此程序通常可以作为"床边"程序或在门诊手术室进行。请咨询当地监管机构以寻求指导。
- 组成活检小组。我们建议活检小组包括4人。一名医生（或受过活检采集培训的个人）、一名与医生合作的医疗助理、一名监测和与参与者互动的助理以及一名在提取后立即处理肌肉活检的助理。有了这些数字，如果在手术过程中发生医疗紧急情况，可以进行快速的患者护理。如果对手术感到舒服，那么团队只能由两个人组成：医生和医疗助理，他们将同时承担病人护理和组织处理。
- 让学员与项目负责人/医生会面，审查、讨论和签署用户同意书。详细病史（过敏、损伤或下肢和 TA 手术），如果参与者符合任何排除标准，则将其排除在外。彻底讨论恢复和切口卫生。
- 向学员解释，他们会疼痛，但能够在手术后立即四处走动;走下山坡或楼梯往往不舒服，前48小时，与充分活动通常返回后72小时。最后，解释，为了限制感染和机械擦伤，切口部位应保持绷带至少1周，并保持清洁。
2. 使用 B 模式超声波可视化前蒂比利斯
- 指示学员在舒适的超前位置躺下，并尽可能放松腿部肌肉。使用定制设备（见下文），或让助手将脚踝保持稍微弯曲的位置，以模拟活检期间将完成的工作。
注意：重要的是，参与者有一个轻松的TA，以便它复制在过程中肌肉特征。在考试期间，请学员收缩和放松肌肉，以便注意到肌肉结构的变化。 - 使用超声波探针可视化 TA 的肤浅和深层隔间，测量肌肉结构并决定插入深度和攻击的针角（图 2A-B）。指示皮肤上的地标。
- 特别注意选择避免主要静脉、动脉或神经的目标区域。
- 评估肌肉的横截面，目的是确定 TA 肌肉腹部（大约 1/3 的腿，膝盖的异体，和 2 厘米的侧向的胸膜波峰）（图2B） 。记录中央动脉瘤的位置和深度（通常为 1.5-3 厘米），以便注意不要将收集（Bergström）针头开过这一点。
- 将超声波探针定位在目标位置的近近方向上，并可视化分粒笔和肌肉厚度（图2A）。使用此信息，以帮助成功地驱动（盲目）收集针进入肌肉腹部。将目标位置的图像保存在两个平面中，供将来在外科手术期间参考。
- 使用此信息，创建针向目标区域移动的计划。
- 计划使切口1-3厘米远出的目标活检区。针头进入肌肉后，将针头沿肢体的长轴旋转至皮肤 +45% 角，然后向活检区域近向驱动。如果针头被推得太硬，这种策略会限制将针头推入中央动脉瘤的机会。此外，针头可以分位或近位驱动，具体取决于针头操作员的手感。
3. 活检程序
- 指示学员在手术台上休息，放松腿部肌肉。确保参与者到活检地点的视线被窗帘阻挡。
- 将参与者的肢体放入将脚踝固定到稍微弯曲的位置（0-5°，从中性位置）中去除肌肉腹部的被动张力; 图3.询问患者是否还能放松肌肉，因为过度的肌肉可能使其难以放松。
注：我们发现，从多西灵活的脚收集活检，不超过5°的中性（即脚底垂直到刀柄）产生更一致和更大的活检比更多的植物弯曲的脚踝角度。保持脚踝扭伤的设备是定制的设备。但是，可以制造出任何数量（廉价）设备，这些设备仍会产生预期的结果。
- 将参与者的肢体放入将脚踝固定到稍微弯曲的位置（0-5°，从中性位置）中去除肌肉腹部的被动张力; 图3.询问患者是否还能放松肌肉，因为过度的肌肉可能使其难以放松。
- 根据标准做法24，剃须、清洁和消毒所选切口区域。
注：参与者的"清洁"区域约为20厘米近近和10厘米的中向，建议切口部位。但是，请始终就本主题咨询本机构的和/或国家法规（如果有）。消毒方案包括清洁皮肤，然后使用医用级消毒喷雾剂进行四次消毒。如果参与者因任何原因离开表，则必须重新启动消毒协议。 - 在活检部位用肾上腺素进行1.5 cc的2%Xylocitin的超面注射，该注射作为局部麻醉和血管收缩剂。等待分配的影响时间为 +20-30 分钟。
注意：这些药物是肌毒性的，因此绝不能注射到肌肉，只有皮下组织。作为对血管收缩的反应，注射部位的区域可能会变白（肤色较浅）或灰色（肤色较深）。 - 确认药物效果与皮肤间距和温柔的戳与无菌手术刀。
- 在先前标记的活检部位，用无菌手术刀切开皮肤和筋膜，露出肌肉腹部，进行1厘米近近的切口。小心完全切开筋膜，因为针头是钝的，不会通过筋膜。
- 将活检针推入与皮肤垂直的肌肉 0.5-1.0 厘米（图 2C，2E）。
注：操作员会感觉到驱动针头通过不同组织类型所需的张力发生变化。脂肪组织很容易，筋膜是最艰难的，肌肉之间（但可以是可变的，基于参与者）。 - 将针头定向到皮肤的 [45] 角位置，沿着腿部的长轴 （图2D， 2F）.将针头再推入肌肉 1-2 厘米，直到针尖位于肌肉内的目标位置。
注：医生应利用保存的超声波图像来考虑肌肉尺寸的个体变化。因为切口只足够大，可以插入针头，医生会盲目地将针头穿过皮肤。有一种"感觉"，活检操作者获得的经验。新手必须从训练有素的活检操作员那里学习技能（在讨论中将对此进行更多讨论）。 - 将 100 mL 注射器和软管连接到活检针上（图 1G）。将注射器的柱塞拉约 15-20 mL，在针头中产生负压，将肌肉组织吸进针窗，对 Bergström 针头施加吸力。然后，在针窗上快速推车，切除肌肉。
注：在吸气之前和吸气过程中，有时对针头窗口上方的皮肤施加轻压有助于将肌肉推入针头。 - 轻轻地从腿上取出针头，慢慢旋转。提取针头时应仅有耐光性。如果有更多的阻力，这可能表示部分活检切口。发生这种情况，将需求返回到目标位置，并重新尝试组织收集。
- 使用内部冲压杆将切除的组织推向针窗。
- 小心地从针头上取出样品。
注：将针头淹没到采集溶液中（参见纤维制备部分）通常会将活检从针头中分离。此外，注射器还可用于驱动空气通过针头并推出样品。这些技术消除了用钳子实际接触活检的用法，减少了损坏的可能性。如果工具、手（手套或不戴）或非无菌溶液与针头接触，则在手术过程中不能进一步使用针头。因此，如果需要进行第二次立即活检，则必须使用新的无菌针头。这种情况经常发生，因此最好保留多个无菌针头。 - 将组织识别为肌肉，而不是脂肪或结缔组织。肌肉组织很容易从其他组织识别，因为它的深红色（图4A）。有时，收集的组织不是肌肉，而是脂肪或结缔组织。
- 如果收集了足够数量的肌肉组织，请继续执行协议。如果没有足够的肌肉，再次尝试活检。
- 如果需要第二次活检，请仔细监测参与者，因为第二次针推偶尔会使参与者比第一次更不舒服。
- 立即在收集溶液中清洗肌肉样本，并准备进行单纤维实验（参见肌肉活检处理和存储）。
- 有一名经验丰富的助理检查样品质量（见下文），并评估是否需要进行第二次活检。单独的助理进行活检处理，而团队的其他成员继续与参与者。
- 关闭切口站点。
- 用无菌的白带胶带关闭切口伤口。使用一个或多个碎片将切口点的边缘与切口垂直于切口的长轴垂直，然后以星形图案中再铺下条带，以防止多向加载。
注：正确处理此步骤将减少疤痕。伤口的伤口可以做，但没有必要。其他选项包括伤口胶水。 - 将无菌伤口敷料（例如，Leucomed T plus）放在切口部位，以防止感染。
- 用有凝聚力的弹性绷带（例如 Unihaft）包裹腿部，以限制初始出血，防止外部机械冲击。
- 用丙烯酸压缩绷带包裹腿部，以防止出血，并防止较深的绷带松动或毁坏。
- 用无菌的白带胶带关闭切口伤口。使用一个或多个碎片将切口点的边缘与切口垂直于切口的长轴垂直，然后以星形图案中再铺下条带，以防止多向加载。
4. 活检后护理
- 请学员在程序后立即四处走动。会有局部的疼痛。指示学员尽可能正常地行走。
- 指示学员不要取下绷带或让水浸泡绷带。它们必须至少保持一天：丙烯酸绷带一天，有凝聚力弹性绷带三天，伤口敷料七天。通知学员，如果需要，可以重新带带。
- 根据个人的需求定制参与者的活检后护理。让训练有素的助理或医生对参与者进行评估，并制定适当的活检后护理计划。对于这个程序，我们建议进一步进行体内神经肌肉测试的TA至少与活检分开一周。
5. 肌肉活检处理和储存
- 组织提取后，立即将组织放入含有严格收集溶液的 5 mL 小瓶中（在 mM 中：Tris （50）、KCl （2）、NaCl （100）、MgCl2 （2）、EGTA （1）、蛋白酶抑制剂片剂 （1）、pH 7.0），轻轻摇动 4-6 分钟以洗血。
- 将Rigor溶液更换为新鲜严格，轻轻摇动4-6分钟，然后在4°C储存4-6小时，以允许蛋白酶抑制剂储存溶液和血液交换。
- 交换Rigor溶液过夜严格（在mM：Tris（50），KCl（2），NaCl（100），MgCl2 （2），EGTA（1），蛋白酶抑制剂片剂（1），50：50甘油，pH7.0），并在4°C储存12-18小时。
- 隔夜更换严格度为 50：50 收集严格：甘油，并在 -20 °C 中储存长达 3 个月，或在 -80°C 冰柜中储存一年。
注：这个过程渗透纤维膜，允许手动向细胞中和细胞外添加钙。这个过程需要时间，在不同的肌肉和物种之间可能会有所不同。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
参与者的整个时间承诺是大约1小时（10分钟会诊，10分钟超声波，20分钟的手术准备和麻醉剂，10分钟的手术和10分钟的恢复）。通常，参与者不自觉地激活他们的TA，需要一致的提醒，以保持肌肉尽可能放松。当活检针在肌肉内时，参与者通常会报告活检针周围区域有独特的"压力"感觉，偶尔会出现中度到剧烈的不适。一次，参与者的脚趾在手术过程中稍微抽筋，但在针头被取出后立即停止。活检大小通常为+50-100毫克（湿质量）。参与者对手术的反应往往是不可预知的。有时，参与者预计在手术过程中不会受到影响，但随后出现昏厥迹象，而其他人在手术过程中感到紧张，但完全不受影响。因此，我们发现让参与者忙于对话或让他们使用手机是一种好的做法，这样他们的注意力就不再集中在正在进行的程序上。与参与者交谈的助手也监测他们是否有痛苦、疼痛或昏厥的迹象。有时，活检只含有脂肪或结缔组织（由组织的浅白色颜色识别，图4A）。在这些情况下，立即进行第二次活检（经参与者批准后）。通常，一个成功的活检将产生>80%的肌肉组织（图4A）。
手术后，大多数参与者在手术持续了3-5天后感到不适。参与者报告说，TA酸痛与一天陡坡徒步旅行后的预期相似。切口现场至少5天不应施加机械压力，否则可以重新打开。参与者通常留下一个小疤痕，但我们没有观察到皮肤的凸起或其他异常变化。此外，没有参与者出现感染。
活检在甘油溶液（甘油1：1混合物：严格溶液）中渗透（即皮肤）6周，然后在实验当天准备进行机械测试。纤维的甘油渗透允许将沐浴液扩散到纤维中，这为研究人员提供了激活控制，也为肌肉接受药物或其他化学物质提供了一个途径。此外，甘油作为抗冻剂，使肌肉在低温下放置，长期储存，伤害有限。然而，需要一些时间，让甘油穿透样品，因此最初在4°C（最好是在摇盘上）过夜储存活检样品是谨慎的。肌肉只能储存这么久，才能破坏其功能。关于这个问题的一般指导是，肌肉将在-20°C冷冻机中保持其功能在甘油溶液中至少3个月，或在-80°C冷冻器中保持一年。
肌肉样本在解剖显微镜下可视化。一些肌肉碎片很小或损坏了（图4B），被移除了。接下来，评估纤维组的任何结构损伤（视觉破碎或粉碎的纤维肉瘤，图4C）。从这些束，较小的纤维束3-10纤维被解剖，并小心地放置在机械测试台的实验室（图4D）。结构上可用纤维长度通常为 3-5 mm 长。Bergström 针的收集窗口为 7 mm，因此活检只能最大地产生 ±7 mm 长的纤维。因此，我们收集的结构上可使用的纤维几乎尽可能长。通常，我们准备5-10纤维束每50毫克（收集）组织。这些程序的全部详情可于其他地方找到14、15、25。,15,25为了证明纤维的耐久性，我们展示了使用糖化TA纤维束的简单机械协议的代表数据（图5）。在激活溶液26（高[Ca2]，pCa< 4.2）中激活了10名参与者的40个纤维束，长度为2.7μm，持续60秒，稳定态活动应力测量为100.71×11 mNmm-2（均值+SEM）。
图1：伯格斯特伦针。本研究中使用的Bergström针头由针头本身（A-F）、吸管（G）和注射器（F）组成。Bergström针由一个靠近针尖的外针（A）和一个较小的空心内针（B）组成，该针在通过针窗时上下移动并割伤肌肉，以及一根杆（C），该针杆（C）在针尖上上下移动，以帮助从针尖上去除肌肉。这些碎片由垫圈 （D） 隔开， 使针气密， 和垫片 （E） 之间的杆和小车防止粉碎肌肉活检.最后，连接了吸管适配器。要将肌肉拉入针窗，吸管 （G） 附着在针头适配器和注射器上.这吸出针头的空气，通过负压将肌肉拉入针窗，从而允许采集样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：超声波成像和针头放置。TA 由由由蓬诺罗斯定义的表面和深层隔间组成。TA 以近近（A）和中向 （ B ） 视角为导向的超声波探头进行成像，以便识别 TA 的 3D 形状。理想的针深收集是水平虚线之间。针插入的卡通表示显示在面板 C 和 D 中。切口后，针首先定位垂直于肌肉，并推入肌肉，直到针窗在肌肉（C）中。然后，针沿腿部的长轴方向调整为 [45]角，并进一步推入肌肉，注意针头不会穿透深层动脉瘤（D）。现场图片 （E ， F） 在过程中参照卡通 （ C 、 D ）给出。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：参与者放置。学员在操作台上处于一个支持位置。头部可以升高以寻求舒适。右脚被放置在一个自定义设备，保持脚稍微多弯曲，减少肌肉紧张。在学员面前放置一个窗帘，以便他们无法观看程序。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：肌肉组织的代表图像。（A） 活检后立即，肌肉样本将与其他组织（包括脂肪组织和结缔组织）（在面板中标记）为较深的红色。（B） 用损伤/短（顶部）和可行的（下面）纤维束解剖样品。（C） 放大可行的纤维组，检查表面是否有损坏迹象。（D） 一个6纤维束被解剖远离这个纤维束（绑在末端与6-0缝合容易移动，并连接到机械装置。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：纤维束制备的代表性力输出。为了演示纤维的耐久性，我们展示了使用糖化 TA 纤维束（3 根纤维）的简单机械协议的代表应力数据。总共有10名参与者的活检中的40个纤维束从松弛拉伸到2.7μm沙康长度，并保持，以允许压力放松。接下来，在激活溶液26（ 阴影区域;高[Ca 2]，pCa< 4.2）中激活纤维，长度为2.7 μm，持续60秒，稳定状态活动应力测量为100.71×11 mNmm-2（ 均值=SEM）。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这份报告中，我们描述了一种从TA中对结构上未受损的肌肉组织进行活检的技术。我们发现，这个程序产生一个可接受的含量的可用肌肉纤维（5-10纤维束制剂每50毫克收集的组织）机械测试。此外，我们有足够的组织进行后续的机械、遗传和蛋白质遗传学实验。
有几个方法通常用于收集肌肉活,检3，4，6，27，28。4,6327,28所谓的开放活检20产生最高质量的纤维，因为外科医生完全暴露肌肉和解剖出样品。当然，开放手术是相当侵入性的程序，不是一个适当的程序，提交健康的参与者，无论研究问题，因为潜在的风险与开放手术有关。侵入性最小的活检方法是细针活检29，30，,30它使用相对较小的针头来收集组织。细针活检足以对纤维30、31的遗传/化学/蛋白质成分进行实验，但纤维质量往往很差，使得机械检测变得困难或不可能。Bergström 针针技术是上述两种程序之间的良好折衷方案，因为手术的侵入性低于开放活检，但仍收集比精细针头活检更大且（可能）结构完好无损的肌肉样本。早以前关于Bergström针头手术3，55的报告是那些学习这项技术，但只提供协议的广大后来者。我们的报告演示了 TA 的技术，该技术侧重于收集高产量的结构完好无损的纤维进行机械测试。
据我们所知，没有关于收集TA活检的详细出版物。然而，标准做法是让参与者保持休息，让他们尽可能放松腿部。在这个位置上放松的脚是自然植物弯曲的，从而延长TA，并把它放在紧张。我们发现，任何肌肉张力使得将肌肉驱动到活检针中更加困难，即使有负压，因此应尽可能将张力降到最低。为此，这里简单但主要的修改是使用定制的脚板，将脚踝保持在稍微多思性的位置（0 - 5°从中性），保持TA松弛和改善收集。临床医生应小心不要过度弯曲脚踝，因为 TA 将无法控制地激活，增加紧张，这当然与手术相反摆在首位。参与者通常能感觉到这种肌肉激活，所以沟通是关键。从协议中，TA只产生±25%的组织相比，更常用的远大后，+100毫克和+400毫克，分别。因此，重要的是要最大限度地提高组织收集大小，同时考虑TA组织样本是否足够大，以所需的研究项目。我们发现，在第一个样本后立即服用第二个样本不会为参与者造成任何额外的并发症或愈合时间。
虽然协议给其他肌肉活检一些指导， 肌肉选择将决定适当的程序.因此，我们强烈建议其他研究人员和临床医生全面公布他们的活检方法。从经验中，我们确定了一些重要的肌肉选择因素，除了研究问题。首先，我们建议考虑肌肉是肤浅的皮肤，有主要动脉/神经是深或容易避免。其次，由于参与者在手术过程中是清醒的，重要的是要考虑活检程序是否会对患者非常不舒服，或者因为患者的初始定位，或者因为活检针的压力，这也以不舒服的方式推动更深的肌肉。我们成功地与广大的后来者和胸科。其他潜在的选择是梯形，拉蒂西穆斯多西，和胃细胞（虽然高度血管化和容易出血）。腿筋肌肉是可能的，但对病人来说不舒服，而且很难，因为它们在收集活检时横向移动。
虽然Bergström针头可以从制造商购买，但一些实验室是自己定制的。小，但巧妙的，调整的设计可能会增加长和未损坏的肌肉纤维的产量。例如，此处使用的针头的收集窗口为 7 mm x 5 mm（长度 x 宽度）。这是适当的捕捉肌肉立方体。但是，如果目标是收集长纤维和未损坏的纤维（相同体积），则长度可以增加，宽度会降低（即 10 mm x 3.5 mm）。如果针是沿分节方向方向，那么很可能这个针将收集更长的纤维部分。
肌肉活检通常是在没有超声波图像指导的情况下安全收集的，尤其是对于像大肌肉这样的大肌肉。在这种情况下，一个经验适当的医生可以很容易地使肌肉，找到最好的切口部位。然而，当医生对目标肌肉经验不足，或需要额外的护理，以避免主要的神经或血管，超声波是一个伟大的，简单的应用工具。最后，借助超声波可以快速完成活检区域的手术后监测。
儿科活检当然是可能的，通常,进行32，33，34。,3334但是，通常对过程进行了几次更改。通常需要较小的测量针和有意识的打针，并且手术在医院环境中进行。一般来说，这种经历对孩子来说可能是创伤性的，想要包括健康儿科参与者的研究小组应该仔细权衡这一点与研究的潜在优点。
纤维束或未使用的材料可以在纤维力学之前或之后转移到其他实验中。例如，评估沙彗蛋白含量或对异构形式类型进行分类的技术可以进行35。然而，为了限制蛋白质降解和提高分析成功率，组织应在原提取后，立即进行机械评估后，或立即处理，进行蛋白质分析。纤维也可以为免疫组织化学或其他成像技术36准备 ，允许评估纤维内的蛋白质位置。在这种情况下，纤维可以放置在固定溶液中（例如，在pH 7的生理缓冲液中放置4%的甲醛/0.25%的谷胱甘肽;在免疫石质化学下没有谷氨酸），同时仍放在机械测试装置上，将沙康结构保持在所需的沙康长度。如果可能，可以收获一小块原始活检，在收集溶液中大力清洗10分钟，然后放入固定溶液中。许多团体喜欢立即在异丙烷中立即闪冻新鲜切除的样品，这限制了破坏性冰晶的形成，并提高了图像质量，用于视觉评估。这确实是闪光冻结的黄金标准;然而，我们发现，氮冻结造成的冰晶损伤只集中在外肌磷结构上。我们在样品中具有令人满意的沙康成分结构完整性，也冻结在液氮中，因此我们认为氮是有可能的，特别是如果它更容易获得，或者外科小组/当地化学当局不愿意使用异丙烷。准备样品查看的一个重要且经常未报告的问题是，沙状病毒通常收缩/短路，而沙彗带区域短或无法观测。为了克服这一困难，研究人员在固定之前必须手动拉伸纤维样品（通过测试装置或使用精细钳子）。一般来说，我们伸展到 ±3.2 μm 的沙康勒长度（通过激光衍射测量），或拉伸到 ±150% 的松弛长度，在低钙生理放松溶液中。最后，如果需要用于RNA表达分析的亚样本，闪冻结方法不影响结果，但样品在原始提取后立即冷冻并放入-80°C冷冻室，因为RNA非常不稳定。市场上有一些RNA保护储存解决方案，但我们发现使用这些解决方案的结果好坏参半，只有闪光冻结新鲜样品。
为了最大限度地增加在一次试验中收集的信息量，可以在进行机械测试时同时收集其他数据。例如，在机械测试期间，可以使用低角度X射线衍射成像进行沙彗结构的研究，就像在其他动物37，38,中一样。对于基因实验，必须立即为此目的处理切除的肌肉或闪冻结，因为DNA/RNA比蛋白质相对不稳定。
上面已经描述了一些限制。在这里，我们讨论程序本身。对于大多数群体来说，一个很大的限制是有一个在活检收集方面受过适当训练的团队成员。无论个人的职业（医生，医疗助理，技术员，或其他），这个程序是困难的，因为调查员盲目驾驶针头，必须依靠"感觉"3，28,28准确定位针窗。错误是不能容忍的，因为同意人类活检的参与者是稀疏的，一次活检比许多活检更可取，错误可能导致血管或神经损伤。因此，在进行人体活检之前，应完成任何培训可能性。例如，为了获得驾驶针头的"感觉"，可以从大多数杂货店购买与皮肤仍然附加的猪肉，并用作人类皮肤和肌肉的代理。另一个宝贵的经验是隐藏一个训练有素的研究小组。
我们更定性地评估参与者的疼痛/不适，依靠医生的经验和与参与者的对话来评估感知到的疼痛。然而，通过经过验证的疼痛/不适调查，对疼痛和活检后不适的评估可以更量化和可比。这些观点在文献中几乎没有受到什么影响。然而，最近的一项研究提出了一种方法，通过利用成熟的疼痛调查39，量化参与者疼痛/不适之前，期间和之后。我们注意到，本文使用广大后肌作为目标肌肉，因此需要后续研究来比较肌肉之间的疼痛评估。
无论提取方法如何，Bergström 技术都无法切除肌肉中纤维的总长度，因为纤维太长（TA40中的±6-8 厘米，在40的法中为 ±6.5-8 厘米）。因此，对于一长片收集的纤维，两端被活检技术破坏是不可避免的。通常，光纤的可用中心部分很小，因此很难进行机械测试。即使该技术提供相当长的中心区域（3-5 mm），调查人员在解剖过程中必须仔细检查纤维束的质量，因为使用损坏的光纤将改变被动或有源力输出。对成功活检的视觉观察将显示一部分纤维在活检过程中未受损。从传统的解剖光显微镜观察时，纤维表面看起来光滑，没有孔或撕裂（图4）。此外，纤维应看起来圆柱形，没有扁平区域。虽然不可见，肌肉本身会随着时间的推移而退化，因为自然产生的蛋白酶，开始分解肌肉蛋白质几乎立即提取。因此，在纤维使用的所有溶液中添加蛋白酶抑制剂至关重要。此外，我们还建议额外的活检洗涤，以去除尽可能多的血液。
即使经过精心准备，纤维损坏也可能发生，并导致纤维活化不良。纤维损坏的原因有很多，因为纤维对程序的几乎每个部分都非常敏感。例如，在活检期间，如果小车不够锋利，它可以在提取过程中推入肌肉组织，而不是切穿它，它可以伸展和破坏纤维。收集解决方案必须适当准备，因为纤维对渗透变化、pH值和温度敏感。处理纤维时，必须非常小心，以完全限制对纤维的压力。相反，应该用钳子来抓住活检的结缔组织。另一种选择是使用大小 0-7 丝缝合线包装活检的无法使用的一端，然后在处理时抓住此。最后，甘油起到两个作用：第一种是防止肌肉在-20°C时冻结，第二种是纤维的温和洗涤剂。也就是说，甘油将纤维渗透到外部溶液中，允许钙的流入（通过激活溶液）。对于大多数肌肉，这个过程需要10天。然而，根据胶原蛋白含量和样本大小，这可能需要长达6周的时间。纤维必须渗透，才能在机械实验中发生任何高钙活化。纤维通常至少可使用 3 个月。为了限制纤维浪费，建议对TA肌肉纤维延长渗透等待时间（4-6周）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢米夏拉·劳、莉娅-费迪亚·里斯曼、迈克尔·马什、贾尼娜-索菲·滕勒、基里安·金梅斯坎普和沃尔夫冈·林克协助该项目。该项目的资金由MERSUR基金会（ID：An-2016-0050）提供给卫生署。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe | B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany |
4606027V | Drug administration |
| 5mm Berstöm needle | homemade | N/A | Tissue collection. Similar to other Berstöm needles |
| Acrylastic | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
269700 | elastic compression bandage |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11836145001 | Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue. |
| Cutasept | PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany |
9805630 | Disenfectant spray for the skin |
| Leucomed T plus | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
7238201 | Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection |
| Leukostrip | Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain |
66002876 | wound closure |
| Surgical disposable scalpels | Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany |
BA200 series | Incision |
| Unihaft cohesive elastic bandage | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
4589600 | cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact |
| Xylocitin 2% with Epinephrin | Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany |
N/A | Controlled substance anesthesia, vasoconstriction |
References
- Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
- Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
- Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
- Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
- Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
- Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
- McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
- Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
- Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
- Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
- Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
- Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
- Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
- Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
- Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
- Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
- Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
- Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
- Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
- Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
- Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
- Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
- Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
- Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
- Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
- Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
- Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
- Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
- Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
- Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).
