Summary
この技術報告書は、繊維損傷を制限する筋液脛節前部の生検のための修正されたベルクストローム技術のバリエーションを説明している。
Abstract
骨格繊維の収縮の機械的特性は、全体的な筋肉の健康、機能、および性能の重要な指標です。ヒト骨格筋生検は、これらの努力のためにしばしば収集される。しかし、生検手順の技術的な記述は比較的少なく、一般的に使用される筋肉性の外側の外側の外側の、利用可能である。生検技術は、多くの場合、研究中の各筋肉の特性に対応するように調整されますが, いくつかの技術的なレポートは、より大きなコミュニティにこれらの変化を共有しています.したがって、オペレータが車輪を再発明するにつれて、ヒト参加者からの筋肉組織はしばしば無駄になる。様々な筋肉から生検に利用可能な材料を拡大すると、失敗した生検の事件を減らすことができます。この技術レポートでは、繊維損傷を制限し、機械的評価に十分な繊維長を提供する筋学脛節前部に対する修正されたBergström技術のバリエーションについて説明します。手術は1時間で完了できる外来処置です。この処置の回復期間は、光活動(すなわち、歩行)、正常身体活動再開のために最大3日間、創傷ケアのために約1週間即時である。抽出された組織は機械的な力の実験に使用することができ、ここで我々は代表的な活性化データを提示する。このプロトコルは、ほとんどの収集目的に適しており、他の骨格筋に適応可能であり、収集針の変更によって改善される可能性がある。
Introduction
臨床や研究目的のための人間の筋肉生理学の研究は、多くの場合、筋肉の生検を必要とします.例えば、ヒトの筋肉生理学とバイオメカニクスにおける大きな課題は、運動する筋肉の性能の様々な適応を区別し、理解することです。パフォーマンスの適応には、構造的適応(例えば、収縮タンパク質の変化、筋肉アーキテクチャ)だけでなく、神経適応1も含まれており、それは不可能ではないにしても、その人の筋肉でそのままテストするときに別々に評価するのが非常に難しい。繊維レベルの実験は、これらの高次成分を除去し、筋肉収縮のより直接的な評価を可能にし、生検技術を介して収集することができる。筋肉生検は、少なくとも18682以来収集されている。今日、筋肉生検を収集する主な技術は、修正されたベルクストローム技術33、4、5ですが、4,5ワイル・ブレイクスリー・コンコトーム6またはいわゆるファインニードル77、88の使用を含む他の技術が利用可能である。これらの技術はすべて、筋肉に渡し、組織の一部を切断するように設計された特別な針のような楽器を使用しています。具体的には、変更されたベルクストローム技術は、大きな変更された針(ここでは5ミリメートルの針のサイズ)を使用しています。図 1)針先に近い窓と針の上下に移動する小さな内部トロカールがあり、針の窓の上を通過するときに筋肉を切断します。このハロートロカールの中には、トロカールのシャフトを上下に移動し、生検を針の窓に向かって押すラムロッドがあります。針の窓に筋肉を引っ張るために、吸引ホースが取り付けられ、針から空気を吸い出し、負圧で筋肉を針の窓に引き込みます。
筋肉生検は、多くの場合、疾患によって引き起こされるタンパク質含有量、遺伝子発現、または形態の変化を研究するために、または運動プログラム11、9、10、119,10,11に応答して取得される。筋肉生検のもう一つの重要な用途は、繊維収縮力の測定、筋線維の剛性、および歴史依存性の筋肉特性12、13、14、15、1613,14,15,16などの機械的実験である。12単繊維または繊維束の力学は、長さのモーターと力のトランスデューサの間に繊維を取り付けることによって、同時に力を測定しながら繊維長を制御する特殊なリグに測定される。繊維を透過(例えば、スキニング)することにより、サルコレンマ膜は、浴液中の化学物質に透過性となり、カルシウム濃度を変化させることによって活性化制御を可能にする。さらに、化学物質/医薬品/他のタンパク質に対する収縮特性の効果は、問題の試薬を浴液に添加することで容易に評価することができます。しかし、この技術は他の動物モデルで非常に使用されているが、著しく少ない研究は、ヒト筋肉生検17、18、1918から皮膚繊維の機械的試験を19行った。17その理由の1つは、生検ツールとプロトコルが、組織抽出中に持続する構造的損傷のレベルをあまり考慮していない限り多くの筋肉組織を除去するように設計されているからです。確かに、最近の生検プロトコルは、生検針を筋肉に駆動し、筋肉3の2〜4個の塊を収集することを示唆している。このプロセス自体はDNAやタンパク質材料にほとんどダメージを与えませんが、筋線維の活性化が不安定になったり不可能になるような方法で繊維や肉体の構造を破壊することがよくあります。さらに、バイオプシー内の繊維の相対的な長さは、通常、短い(<2 mm)、機械的なテストのために容易に処理されません。機械的試験のために、理想的な繊維は長く(3-5 mm)、構造的に損傷を受けていない。
より高度な組織抽出技術は、繊維損傷を制限するために使用することができる。例えば、あるグループ20 は、以前に計画されていた前腕の「開いた手術」(例えば、骨折修復)を利用して、筋肉が完全に露出し、外科医が筋肉構造を可視化し、筋肉組織の比較的大きく構造的に損傷のないサンプル(15mm x 5mm x 5mm)を慎重に解剖することができた。この「オープンバイオプシー」技術は、参加者が以前に計画された手順を受けているときに好まれるので、特に手術が行われない健康な成人のために、潜在的な参加者のプールを制限します。したがって、研究目的で行われる多くの生検は外来処置として行われ、切開部位は感染リスク、瘢痕化、治癒時間を制限するために可能な限り小さく保たれる。したがって、ほとんどの生検は 盲目的に 収集されます(すなわち、オペレータは筋膜を通って筋肉に入る収集針を見ることができません)。これは、生検の質がオペレータのスキルと経験にほぼ完全に基づいていることを意味します。すべての筋肉は、神経や血管を侵すリスク、理想的な採取深度と位置の選択、筋肉を可能な限り緩く保つための適切な身体位置の決定など、組織を収集する際に独自の困難を抱えています。残念ながら、筋肉特有のスキルセットのほとんどは書き留められていないので、各医師は新しい筋肉の生検を行う際に「車輪を再発明する」必要があります。経験のこの欠如は、医師がその筋肉の生検のためのベストプラクティスを識別するまで、通常、低品質でいくつかのコレクションにつながります.初心者の医師は、多くの場合、彼らの経験豊富な同僚との会話を通じてスキルを学びますが、特に生検コレクションに伝統的に使用されていない筋肉のために、この問題に関しては比較的有益で査読されたテキストが存在します。上記の情報を考慮すると、生検のための人間のボランティアを募集することの難しさと共に、すべての参加者の成功の可能性を最大化するより多くの教育情報が必要であることは明らかです。
したがって、本論文の目的は、機械的検査のために長く損傷を受けていない線維片を有する筋肉生検の収集を成功させるためのプロトコルを提供する筋肉生検技術を提示することであった。ヒトの筋肉生検は通常行われ、生検の訓練材料の大部分が上にあり、筋肉スの広大な側面が上にある。皮膚に対する比較的大きな筋肉サイズと表面的な位置は、患者の不快感と身体的外傷を最小化しながら、十分な筋肉組織の収集を可能にする1、21。しかし、縦方向のトレーニング研究のために広大な横方向の分析を使用することにはいくつかの制限があります。例えば、トレーニングプログラムを含む実験的なプロトコルの間、参加者はしばしば2〜6ヶ月に及ぶ期間、研究外の追加のトレーニングを控えなければなりません。アスリートにとって、広大なラテラリスは通常、典型的な運動(例えば、スクワット、ジャンプ)中に訓練されるか、または一般的にスポーツ(例えば、ランニング、サイクリング)のために使用されるので、これはしばしば不可能である。研究の目的から離れたこれらの別々のトレーニング経験は、筋肉の特性に対する研究の実験プロトコルの真の影響を知ることは困難または不可能であるような方法で筋肉の力学、アーキテクチャ、および生理学を変える筋肉の適応を引き起こす可能性があります。これらのタイプの研究では、多くの場合、訓練連隊の焦点ではないターゲット筋肉を選択するのが理想的であろう。筋力脛筋(TA)は、上記の要件を満たす理想的なターゲット筋肉です。さらに、ダイナモメーターを使用するなど、制御可能なアプローチを使用してTAに向けてトレーニング介入を行うことができます。TA筋肉生検に関するトレーニング資料はほとんどありません。そこで、TAから比較的損傷のない筋肉生検を収集する改質プロトコルを開発しました。
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Protocol
注:以下では、別の進行中の研究に登録されたボランティアのTAから機械的に損傷のない繊維を収穫するためのプロトコルを概説します。このプロトコルは、シャネリーら3によって記述されたものと似ていますが、その中で、変性されたベルクストローム法を広大なラテラリスで説明しています。ここに示す情報は、研究グループによって洗練されていますが、すべてのラボ グループや組織のセットアップに適しているわけではありません。私たちはガイドラインのみを与え、生検コレクションに新しい研究室は、人間の試験を試みる前に経験豊富な実験室グループに相談することを強く示唆しています。
本論文で実施された全ての研究は、ルール大学ボーフムのスポーツ科学部倫理委員会によって承認された。参加者は、研究に参加する前に、無料の書面によるインフォームド・コンセントを与えました。
1. 実験準備
- 参加者相談中に参加者の詳細な病歴を取りながら除外基準を評価します(下記参照)。
- 生検に至るまでの6週間の間に標的筋に損傷を負った場合は、参加者を除外する。参加者は一般的に健康であり、筋肉や凝固障害を認識しておらず、現在血液の間引き(例えばアスピリン)を引き起こす薬を服用していないことを確認してください。
注:ここでは、適度に活動的な参加者を選び、生検の少なくとも3日前に集中的または慣れない脚の運動を控えるように指示しました。しかし、他の研究問題については、これらの基準が変更される場合があります。
- 生検に至るまでの6週間の間に標的筋に損傷を負った場合は、参加者を除外する。参加者は一般的に健康であり、筋肉や凝固障害を認識しておらず、現在血液の間引き(例えばアスピリン)を引き起こす薬を服用していないことを確認してください。
- ドイツの法律と一般的な慣行によって規制され、チームの医師22、23によって監督されるように、殺菌と無菌技術に従います。この手順は、多くの場合、「ベッドサイド」手順として、または外来外科スイートで行うことができます。ガイダンスについては、現地の規制機関に相談してください。
- 生検チームを構成します。生検チームには4人が含まれていることを提案します。医師(または生検コレクションの訓練を受けた個人)、医師と協力する1人の医療アシスタント、参加者を監視して対話する1人のアシスタント、抽出直後に筋肉生検を扱う1人のアシスタント。これらの数字を使用すると、処置中に医療緊急事態が発生した場合、迅速な患者ケアを行うことができます。手順に慣れていれば、チームは医師と医療アシスタントの2人だけで作られ、同時に患者ケアと組織処理を同時に受け入れます。
- 参加者がプロジェクトの主任/医師と会い、ユーザーの同意書を確認、議論、署名してもらいます。詳細な病歴(下肢とTAへのアレルギー、怪我または手術)を取り、除外基準のいずれかを満たしている場合は参加者を除外します。回復と切開衛生について徹底的に議論する。
- 参加者は、痛いが、手順の直後に歩き回ることができることを説明する。斜面や階段を下りることは、最初の48時間は不快であることが多く、通常は72時間後に完全な活動が戻ります。最後に、感染および機械的擦過傷を制限するために、切開部位は少なくとも1週間包帯されたままで、清潔に保たれるべきであることを説明する。
2. Bモード超音波で前脛表を可視化
- 参加者に、快適な仰向けの位置に横になって、足の筋肉をできるだけリラックスするように指示します。カスタムメイドのデバイス(下記参照)を使用するか、助手に少し反射した位置で足首を保持して、生検中に行われるものを模倣します。
注:参加者は、処置中に筋肉の特性を複製するようにリラックスしたTAを持っていることを重要です。試験中、筋肉アーキテクチャの変化に注意できるように、参加者に筋肉を収縮させ、リラックスしてもらいます。 - 超音波プローブを使用して、TAの表面的および深いコンパートメントを視覚化し、筋肉アーキテクチャを調査し、挿入の深さおよび針の攻撃角度を決定する(図2A-B)。皮膚のランドマークを示します。
- 主要な静脈、動脈、または神経を避けるターゲット領域の選択に特に注意を払う。
- TA筋腹内の中心アポンユーロシス(脚の約1/3、膝への遠位、脛堤の2cm横方向)を同定することを目的として、筋肉の断面を評価する(図2B)。中央アポンユーロシス(通常1.5〜3cm)の位置と深さを記録して、この時点を過ぎてコレクション(Bergström)針を駆動しないように注意してください。
- ターゲットの位置上の近位遠位方向に超音波プローブを配置し、筋膜のペニングと筋肉の厚さを視覚化します(図2A)。この情報を使用して、コレクションの針を筋肉の腹にうまく(盲目的に)駆動するのに役立ちます。手術中に将来の参照のために、ターゲット部位の画像を両方の平面に保存します。
- この情報を使用して、ターゲット領域に向かって針の動きの計画を作成します。
- 切開を標的の生検領域から1〜3cm遠位にする計画を立てる。針が筋肉に渡された後、針を四肢の長い軸に沿って皮膚に対して〜45%の角度に回転させ、次いで生検領域に向かって近位的に駆動する。この戦略は、針があまりにも強く押された場合、中央アポンユーロシスに針を駆動する可能性を制限します。さらに、針は、針オペレータの手渡しに応じて、遠位または近位に駆動することができる。
3. 生検の手順
- 手術台の上に仰向けに寝かせ、足の筋肉をリラックスするように参加者に指示します。生検部位への参加者の視線がカーテンで塞がっていることを確認します。
- 少し伸び反射位置に足首を固定するデバイスに参加者の手足を置くことによって筋肉の腹から受動的な緊張を取り除く(ニュートラルから0〜5°; 図 3.あまりにも多くの過性反射が潜在的にリラックスするのを困難にすることができるので、彼らはまだ彼らの筋肉をリラックスできるかどうかを患者に尋ねます。
注:私たちは、後ろ反射足から生検を収集し、中性の5°以下(すなわち、シャンクに垂直な足の裏)は、より多くの足底屈曲足首角度よりも一貫した、より大きな生検を生成することを発見しました。足首の反射を維持するデバイスは、カスタムメイドのデバイスです。しかし、任意の数の(安価な)デバイスを製造することができ、それでも望ましい結果を生み出すことができます。
- 少し伸び反射位置に足首を固定するデバイスに参加者の手足を置くことによって筋肉の腹から受動的な緊張を取り除く(ニュートラルから0〜5°; 図 3.あまりにも多くの過性反射が潜在的にリラックスするのを困難にすることができるので、彼らはまだ彼らの筋肉をリラックスできるかどうかを患者に尋ねます。
- 標準的な慣行24に従って、選択された切開部を剃り、きれいにし、消毒する。
注:参加者の「きれいな」領域は、提案された切開部位の約20cm近位遠位および10cm内側側面である。ただし、このトピックについては、必ず機関の規制や国の規制(もし存在する場合)に相談してください。消毒プロトコルには、皮膚をきれいにごしごし洗い、医療グレードの消毒スプレーを自由に使用して4回消毒することが含まれます。何らかの理由で参加者がテーブルから離れた場合は、消毒プロトコルを再起動する必要があります。 - 生検部位でエピネフリンを用いた2%キシロシチンの1.5ccの上頭膜注射を投与し、局所麻酔薬および血管収縮剤として機能する。~20~30分の割り当てられた影響時間を待ちます。
注:これらの薬物は筋毒性であり、したがって、皮下組織のみ、筋肉に注入されてはならない。血管収縮に対する反応として、注射部位の領域は白(明るい肌のトーンで)または灰色(暗い肌のトーン)に変わる可能性があります。 - 無菌メスで肌のピッチと穏やかな突きで薬物効果を確認してください。
- 以前にマークされた生検部位で、皮膚と筋膜を切断し、筋肉の腹を露出させる無菌メスで1cmの近位遠位切開を行う。針が鈍く、筋膜を通過しないので、鼻隠しを完全にカットするように注意してください。
- 生検針0.5~1.0cmを皮膚に垂直な向きで筋肉に押し込む(図2C、2E)。
注:オペレータは異なったティッシュタイプを通して針を動かすために必要な緊張の変化を感じるでしょう。脂肪組織は簡単で、筋膜は最も丈夫で、筋肉は間にあります(しかし、参加者に基づいて可変することができます)。 - 針を、脚の長い軸に沿って、皮膚に対して〜45°の角度の位置に向けます(図2D,2F)。針先が筋肉内のターゲット位置になるまで、針を別の1〜2cm筋肉に押し込みます。
注:医師は、筋肉の寸法の個々の変動を考慮するために保存された超音波画像を利用する必要があります。切開は針を挿入するのに十分な大きさだけなので、医師は皮膚を通して盲目的に針を駆動します。生検オペレーターが経験を得る「感触」があります。初心者は、訓練を受けた生検オペレーターからスキルを学ばなければなりません(これについては議論の中で詳しく説明しています)。 - 100 mLの注射器とホースをバイオプシー針に取り付けます(図1G)。約15-20 mLでシリンジのプランジャーを引っ張って針に負圧を生じ、針の窓に筋肉組織を吸い込んで、Bergström針に吸引を適用します。その後、針窓の上にトロカーの素早いプッシュ(es)で筋肉を物品切りします。
注:吸引の前と中に、針の窓のすぐ上の皮膚に軽い圧力を置いて、筋肉を針に押し込むのを助けるのが役立つ場合があります。 - 脚から針をそっと取り出し、ゆっくりと回転させる。針を抽出しながら、唯一の光抵抗があるはずです.より多くの抵抗がある場合、これは部分的な生検の切り傷を示し得る。これは、これが起こり、標的の場所に必要性を戻し、そして組織採取を再試行する。
- 内部ラムロッドを使用して、切除された組織を針の窓に向かって押します。
- 針から慎重にサンプルを取り出します。
注:針を回収液に沈める(繊維準備セクションを参照)、しばしば針から生検を取り除きます。さらに、注射器は針を通して空気を駆動し、サンプルを押し出すために使用することができる。これらの技術は、ピンセットで生検に物理的に触れる必要性を除去し、損傷の可能性を低減する。ツール、手(手袋をはめたかどうか)または非無菌溶液が針に接触した場合、針は処置の間に進んで使用することができない。したがって、2番目の即時生検が必要な場合は、新しい滅菌針を使用する必要があります。これはしばしば起こるので、いくつかの無菌針を予備に維持することがベストプラクティスです。 - 脂肪や結合組織ではなく、筋肉として組織を識別します。筋肉組織は、その深い赤色のために他の組織から容易に同定される(図4A)。時には、収集された組織は筋肉ではなく、脂肪または結合組織である。
- 十分な量の筋肉組織が収集された場合は、プロトコルを継続します。十分な筋肉がない場合は、再び生検を試みる。
- 2回目の生検が必要な場合は、2回目の針のプッシュが参加者を最初のものよりも不快にさせるため、参加者を注意深く監視します。
- 筋肉サンプルを回収液ですぐに洗浄し、単繊維実験の準備をします(筋肉生検の取り扱いと保管を参照)。
- 経験豊富なアシスタントにサンプルの品質を確認してもらい(下記参照)、2回目の生検を行う必要性を評価してください。別のアシスタントが処理のために生検を受け、チームの残りの部分は参加者と一緒に進みます。
- 切開部位を閉じます。
- 滅菌ロイコストリップテープで切開傷を閉じます。1つ以上の部分を使用して、切開部位の端を結合し、切開の長い軸に垂直に配置し、多方向荷重から保護するために星型パターンでさらにストリップを敷設します。
注:このステップを適切に処理すると瘢痕が減少します。創傷を縫合することは可能であるが、必要ではない。その他のオプションには、傷の接着剤が含まれます。 - 感染から保護するために切開部位の上に無菌創傷包帯(例えば、ロイコメッドTプラス)を置く。
- 脚を粘り合う弾性包帯(Unihaftなど)で包み込んで、初期出血を制限し、外部の機械的衝撃から保護します。
- 出血を防ぎ、より深い包帯が緩んだり破壊されたりするのを防ぐために、アクリル圧縮包帯で脚を包みます。
- 滅菌ロイコストリップテープで切開傷を閉じます。1つ以上の部分を使用して、切開部位の端を結合し、切開の長い軸に垂直に配置し、多方向荷重から保護するために星型パターンでさらにストリップを敷設します。
4. 生検後のケア
- 参加者に,処置の直後に歩き回るように頼みます。局所的な痛みがあります。できるだけ普通に歩くように参加者に指示します。
- 包帯を外したり、包帯に水を浸したりしないように参加者に指示します。彼らは少なくとも続けなければならない:アクリル形成包帯のための1日、まとまりのある弾性包帯のための3日間、および創傷包帯のための7日間。必要に応じて再バンドを組み替えることができることを参加者に伝えます。
- 参加者の生検後のケアを個人のニーズに合わせて調整します。訓練を受けたアシスタントまたは医師に参加者を評価してもらい、適切な生検後ケア計画を立てるようにしてください。この手順では、TAの脳神経筋検査をさらに生検から少なくとも1週間分離することを示唆する。
5. 筋肉生検の取り扱いと保管
- 組織抽出後、すぐに組織を5mLバイアルに入れ、リゴール回収液(mM:Tris(50)、KCl(2)、NaCl(100)、MgCl2(2)、EGTA(1)、プロテアーゼ阻害剤錠剤(1)、pH7.0)を軽く振って血液を洗い流す。2
- リゴール溶液を新鮮な厳しさと交換し、4〜6分間軽く振り、4〜6時間4°Cで保存し、プロテアーゼ阻害剤の貯蔵溶液と血液の交換を可能にします。
- 一晩の厳格な交換用リゴール溶液(mM:トリス(50)、KCl(2)、NaCl(100)、MgCl 2(2)、EGTA(1)、プロテアーゼ阻害剤錠剤(1)、50:50グリセロール、pH 7.0、4°Cで12〜18時間保存する。2
- 50:50コレクションの厳格なグリセロールのための一晩の厳しさを交換し、3ヶ月まで、または-80 °Cの冷凍庫で1年間-20 °Cで保存されます。
注:このプロセスは、細胞の中にカルシウムを手動で加えることを可能にする繊維膜を透過させます。このプロセスは時間がかかり、異なる筋肉や種の間で異なる可能性があります。
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Representative Results
参加者の全時間のコミットメントは約1時間(10分の相談、10分超音波、20分手術準備と麻酔投与、10分手術、10分の回復)でした。多くの場合、参加者は無意識のうちにTAを活性化し、筋肉を可能な限りリラックスさせるために一貫したリマインダーを必要としました。生検針が筋肉の中にあったとき、参加者は通常、中等度から激しい不快感の時折期間で、生検針の周りの領域でユニークな「圧力」感覚を報告しました。一度,参加者のつま先は処置中にわずかに窮屈であったが,針を取り除いた直後に止まった。生検サイズは通常〜50〜100mg(湿潤質量)であった。手順に対する参加者の反応はしばしば予測不可能であった。時には、参加者は処置中に影響を受けないと予想されたが、その後失神の兆候を示したが、他の人は緊張していたが、処置中に完全に気に入らなかった。そのため、参加者が会話を忙しくしたり、携帯電話を使用させたりして、進行中の手順に注意を払わないのが良い習慣であることがわかりました。参加者と話をしたアシスタントも、苦痛、痛み、失神の兆候を監視しました。時には、生検には脂肪または結合組織のみが含まれていた(組織の淡白色で識別される、図4A)。これらの場合、2回目の生検を直ちに受け取った(承認後参加者が承認した)。通常、成功した生検は80%の筋肉組織を得る(図4A)。
ポストオペ, ほとんどの参加者は、3-5日間続いた手順の後に不快感を感じました.参加者は、TAの痛みが急な斜面をハイキングした後に予想されるものと似ていると報告しました。少なくとも5日間は、切開部位に機械的圧力を加えてはならない、または再び開く可能性があります。参加者は通常、小さな傷跡を残していましたが、皮膚の隆起やその他の異常な変化は観察されていません。また、感染を発症した参加者はいなかった。
生検は、グリセロール溶液(グリセロール:リゴール溶液の1:1混合物)で6週間透過(すなわち皮をむいた)を行い、実験の日に機械的検査のために準備した。繊維のグリセロール透過性は、研究者の活性化制御を与え、また、医薬品や他の化学物質に筋肉を施すために道を提供する繊維への浴液の拡散を可能にします。さらに、グリセロールは凍結防止剤として機能し、筋肉を長期保存のために低温に置くことを可能にし、損傷が限定される。しかし、グリセロールがサンプルを貫通できるようにするためにいくらかの時間が必要であるため、最初は4°C(理想的にはシェイクプレート)で一晩生検サンプルを保存することは賢明である。筋肉は、その機能が損なわれる前に非常に長い間保存することができます。問題に関する一般的なガイダンスは、筋肉が-20°C冷凍庫で少なくとも3ヶ月間、または-80°C冷凍庫で1年間グリセロール溶液内で機能を維持することです。
筋試料を解剖顕微鏡で可視化した。いくつかの筋肉片は小さいか損傷していた (図 4B)そして取り除かれた。次に、繊維群を構造的損傷について評価した(目視的に壊れた、または破砕された繊維サルコレンマ、図4C)。これらの束から、3~10繊維の小さな繊維束を解剖し、機械試験装置の実験室に慎重に配置した(図4D)。構造的に使用できる繊維長は、典型的には3〜5mmの長さであった。ベルクストローム針は7mmの回収窓を持っていたので、生検は最大降伏が7mmの長繊維しか得られなかった。このように、私たちが収集した構造的に使用可能な繊維は、できるだけ長く使われました。通常、50mgの(採取された)組織ごとに5〜10本の繊維束を調製する。これらの手順の詳細については、14、15、25,15の他の場所で見つけることができます。繊維の耐久性を実証するために、我々は、Glycated TA繊維束を用いた単純な機械プロトコルの代表的なデータを示す(図5)。10人の参加者の生検から40個の繊維束を活性化溶液26(高[Ca2+]、pCa<4.2)で2.7μmのサルコメア長さで60秒間活性化し、定常活性応力は100.71±11mN2+mm-2(平均±SEM)として測定した。
図1:ベルクストローム針。この研究で使用されるベルクストローム針は、針自体(A-F)、吸引ホース(G)、シリンジ(F)から構成されています。Bergström針は、針先に近い窓を持つ外針(A)、針の上下に移動して針の窓を通過するときに筋肉を切る小さな中空の内部トロカール(B)、および針から筋肉を取り除くためにトロシャンターを上下に動かす棒(C)で構成されています。これらの部分は針を気密にするワッシャー(D)で分離され、棒とトロカールの間のスペーサー(E)は筋肉生検の破砕から保護します。最後に、吸引ホースアダプターが取り付けられています。針窓に筋肉を引っ張るために、吸引ホース(G)が針アダプタと注射器に取り付けられています。これは、針から空気を吸い出し、負圧を介して針の窓に筋肉を引っ張り、サンプル採取を可能にする。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:超音波画像と針の配置。TAは、アポンユーロによって定義される表面的および深いコンパートメントで構成される。TAは、TAの3D形状を認識できるように、遠位近位(A)および内側横方向(B)の視点で指向する超音波プローブで画像化される。収集のための理想的な針の深さは、水平破線の間にあります。針の挿入の漫画の表現は、パネルCとDに示されています。切開が行われた後、針はまず筋肉に垂直に配置され、針の窓が筋肉に入るまで筋肉に押し込まれる(C)。針は、脚の長い軸に沿って〜45°の角度に向き直し、さらに筋肉に押し込まれ、針が深いアポンユーロシス(D)に浸透しないことを注意深く注意して押し込みます。ライブ写真(E, F) の処理中に、漫画を参照して与えられます (C, D). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:参加者の配置参加者は操作テーブルの仰向けの位置に横たわる。頭部は慰めのために高めることができる。右足は、足をわずかに伸縮させ、筋肉の緊張を低下させるカスタムデバイスに配置されます。参加者の前にカーテンを置き、手順を見ることができません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:筋肉組織の代表的な画像。(A) 生検直後、筋肉サンプルは脂肪組織や結合組織(パネルに標識)を含む他の組織よりも暗い赤色になる。(B)損傷/短い(上)と実行可能な(下)繊維束を有するサンプルの解剖。(C) 損傷の兆候を表面を検査するために、生き生きとした繊維のグループ化の拡大。(D) この繊維束から解剖された(6-0縫合糸で結ばれて、動きやすくし、機械装置に取り付けた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:繊維束調製の代表的な力出力。繊維の耐久性を実証するために、糖化TA繊維束(3繊維)を用いた単純な機械プロトコルの代表的な応力データを示す。10名の参加者の生検から40個の繊維束を緩みから2.7μmのサルコメア長さに引き伸ばし、ストレスリラクセーションを可能にしました。次に、繊維を活性化溶液26(シェーディング領域;高[Ca2+]、pCa<4.2)で2.7μmのサルコメア長で60秒間活性化し、定常活性応力を100.71±11mN2+mm-2(平均±SEM)で測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本報告では、TAから構造的に損傷を受けていない筋組織の生検の手法について述べた。この手順は、機械的検査のために使用可能な筋線維(収集された組織の50mgあたり5〜10繊維束調製物)の許容可能な含有量を生み出すことがわかった。さらに、我々は、フォローアップ機械的、遺伝的、およびプロテオーム実験のための十分な組織を持っていました。
筋肉生検,,,3、4、6、27、284の収集に一般的に使用されるいくつかの方法があります。362728いわゆる開いた生検20は、外科医が筋肉を完全に露出し、サンプルを解剖するので、最高品質の繊維を産生する。もちろん、開き手術は非常に侵襲的な処置であり、開かれた手術に関連する潜在的なリスクのために、研究の質問に関係なく、健康な参加者を提出するための適切な手順ではありません。最も侵襲性の低い生検法は、組織を収集するために比較的小さい針を使用する細かい針生検29、30,30である。細かい針の生検は繊維30、31の遺伝子/化学/タンパク質成分の実験を行うのに十分ですが、31多くの場合、繊維の品質は非常に悪く、機械的検査が困難または不可能になります。Bergströmニードル法は、手術は開いた生検よりも侵襲性が低いが、細かい針生検よりも大きく(潜在的に)構造的に無傷の筋肉サンプルを収集するため、上記で説明した2つの手順の間で良い妥協点である。ベルクストローム針手順33、55の以前の報告は、技術を学ぶ人のための素晴らしいリソースですが、広大な側面のためのプロトコルのみを提示します。我々の報告書は、機械的試験のための構造的に無傷の繊維の高収量の収集に焦点を当てたTAの技術を示している。
私たちの知る限りでは、TA生検の収集に関する詳細な出版物はありません。それにもかかわらず、標準的な練習は、参加者の仰向けを置き、できるだけ足をリラックスさせることです。この位置のリラックスした足は自然に足元屈折し、その結果TAを長くし、緊張に置きます。筋肉の緊張は、負圧であっても生検針に筋肉を追い込むのが難しくなるので、緊張はできるだけ最小限に抑える必要があることがわかります。これを達成するために、ここでの簡単だが大きな変更は、TAの緩みを維持し、コレクションを改善し、わずかに変形した位置(0 - 5°)に足首を維持するカスタムメイドのフットプレートを使用することであった。臨床医は、TAが制御不能に活性化され、緊張が高まるため、足首を過度に調節しないように注意する必要があります。参加者は通常、この筋肉の活性化を感じることができるので、コミュニケーションが重要です。プロトコルから、TAは、より一般的に使用される広大な外側皮、〜100mgおよび〜400mgと比較して、それぞれ〜25%の組織しか得られない。したがって、TA組織サンプルが所望の研究プロジェクトに十分な大きさであるかどうかも考慮しながら、組織採取サイズを最大化することが重要です。最初のサンプルの直後に2番目のサンプルを採取しても、参加者に余分な合併症や治癒時間を生じさせることはないことを発見しました。
プロトコルは、他の筋肉の生検に向けていくつかのガイダンスを与えるが、, 筋肉の選択は、適切な手順を指示します.したがって、我々は、他の研究者や臨床医に、生検法を完全に公表することを強く提案する。経験から、我々は研究の質問の外で、筋肉の選択にいくつかの重要な要因を特定します。まず、皮膚に対して表面的で、深い、または容易に避けられない主要な動脈/神経を持つ筋肉を考慮することをお勧めします。第二に、参加者は処置中に目を覚ましているので、生検手順が患者の最初の位置合わせのために、または生検針の圧力のために患者に非常に不快になるかどうかを考慮することが重要です。私たちは、広大な側索と胸部で成功を収めています。他の潜在的な選択肢は、トラペジウス、ラティシムス・ドリシ、胃腸血症(血管性が高く出血しやすいが)である。ハムストリングの筋肉は患者にとって可能であるが不快であり、生検を収集するときに横に動くので困難である。
ベルクストローム針は製造から購入できますが、一部の研究所は独自に独自に作ります。小さくても巧妙な設計の調整は、長くて損傷のない筋線維の収率を高める可能性があります。例えば、ここで使用した針の採取窓は7mm x 5mm(長さx幅)であった。これは筋肉の立方体をキャプチャするのに適しています。しかし、(同じ体積の)長く損傷のない繊維を収集することが目標であれば、長さを増やすことができると、幅が減少します(すなわち、10 mm x 3.5 mm)。針が魅惑方向に沿って向いている場合、この針はより長い繊維セクションを収集する可能性があります。
筋肉生検は、多くの場合、特に広大な側面のような大きな筋肉のために、超音波画像の指導なしに安全に収集されます。この状況では、適切な経験を持つ医師が簡単に最高の切開部位を見つけるために筋肉を触診することができます。しかし、医師が標的筋肉の経験が少ない場合、または主要な神経または血管を避けるために余分なケアが保証されている場合、超音波は素晴らしい、単に適用されるツールです。最後に、生検領域の後のモニタリングは、超音波の助けを借りてすぐに達成することができる。
小児生検は確かに可能であり、一般的に32、33、34を行う。32,33,34ただし、通常、プロシージャにはいくつかの変更が加えられた場合があります。より小さいゲージの針および意識的な沈下がしばしば要求され、処置は病院環境で行われる。一般的に、健康な小児参加者を含めたい子供や研究グループにとって、この経験は、研究の潜在的なメリットと慎重に比較検討する必要があります。
繊維束または未使用の材料は、繊維力学の前後に他の実験に移すことができる。例えば、肉体タンパク質の含有量を評価する技術やアイソフォーム型を分類する技術は、35.しかし、タンパク質の分解を制限し、分析の成功を改善するために、組織は、元の抽出後、機械的評価の直後に、またはタンパク質分析のために直ちに処理された液体窒素中でフラッシュ凍結する必要があります。繊維はまた、繊維内のタンパク質位置の評価を可能にする免疫体化学または他の画像化技術36 のために調製することができる。この場合、繊維は固定溶液(例えば、pH 7の生理学的緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド/0.25%グルタルアルデヒド、免疫組織化学のためのグルタルアルデヒドなし)に置くことができるが、機械的試験装置に残っている間、所望のサルコメア構造を所望のサルコメアの長さで維持する。可能であれば、元の生検の小片を収穫し、10分間回収液で精力的に洗浄し、その後固定溶液に入れることができます。多くのグループは、有害な氷の結晶の形成を制限し、視覚的評価のための画質を向上させるイポペンタンで、切除された新しいサンプルを直ちにフラッシュフリーズすることを好みます。これは確かにフラッシュの凍結のためのゴールドスタンダードです。しかし、窒素凍結による氷結晶の損傷は、除氷体構造のみに焦点を当てていることがわかります。液体窒素で凍結したサンプル中の肉体成分の構造的完全性も満足しているので、特に容易に入手できる場合、または外科チーム/地元の化学当局がイソペンタンを使用する意思がない場合は、窒素が可能性があると考えています。観察用のサンプルを準備する上でしばしば報告されない重要な問題は、サルコメアがしばしば収縮/短く、サルコメアのIバンド領域が短いか観察不能であるということです。これを克服するために、研究者は、固定する前に、(試験装置によって、または細かいピンセットを使用して)手動で繊維サンプルを伸ばす必要があります。原則として、我々は、低カルシウム生理学的リラックス液で、〜3.2μmのサルコメア長さ(レーザー回折で測定)、または緩み長さの〜150%まで伸ばします。最後に、RNA発現解析にサブサンプルが必要な場合、フラッシュ冷凍法は結果に影響を与えませんが、RNAが非常に不安定であるため、サンプルは元の抽出直後に凍結して-80°Cの冷凍庫に入れなければなりません。市場にはRNA保護ストレージソリューションがいくつかありますが、その使用と混合結果が見つかり、新鮮なサンプルをフラッシュフリーズするだけです。
1回の試行で収集される情報量を最大化するために、機械的なテストを行いながら、他のデータの同時収集を完了することができます。例えば、肉体構造の研究は、他の動物37、38,38で行われているように、低角X線回折画像を用いて機械的試験中に行うことができる。遺伝子実験では、DNA/RNAはタンパク質よりも比較的安定性が低いため、切除された筋肉をその目的のために直ちに処理するか、フラッシュ凍結する必要があります。
いくつかの制限は、既に上記に記載されています。ここでは、手順自体について説明します。ほとんどのグループにとって大きな制限は、生検コレクションで適切な訓練を受けたチームメンバーを持つことです。医師、医療助手、技術者、またはその他の職業に関係なく、研究者が盲目的に針を駆動し、針の窓を正確に見つけるために「感じる」3、28に依存しなければならないので、28この手順は困難です。バイオプシーに同意する人間の参加者はまばらであり、1つの生検が多く好ましく、間違いは血管や神経の損傷につながる可能性があるため、間違いは許容されません。したがって、人間の生検が行われる前に、あらゆる訓練の可能性を完了する必要があります。例えば、針を運転するための「感触」を得るために、皮膚がまだ付いている豚肉は、ほとんどの食料品店から購入し、人間の皮膚と筋肉の代理として使用することができます。もう一つの貴重な経験は、訓練を受けた研究グループに影を落とす経験です。
私たちは、知覚された痛みを評価するために、医師の経験と参加者との会話に頼って、参加者の痛み/不快感をより質的に評価しました。しかし、痛みおよび生検後の不快感の評価は、検証された痛み/不快感調査の使用を通じて、個人全体および研究全体でより定量化され、比較することができる。これらの点は、文献で驚くほど少ない治療法を持っています。しかし、ある最近の研究では、十分に確立された疼痛調査を利用して、生検の前、中、後の参加者の痛み/不快感を定量化する方法が提示された。この論文では、対象筋肉として広大な外側が使用されるため、筋肉間の疼痛評価を比較するにはフォローアップ研究が必要であることに注意してください。
抽出方法にかかわらず、Bergström技術は、繊維が長すぎるため、筋肉中の繊維の全長を切除することができない(TA40では〜6〜8cm、カルスラタリス40では〜6.5-8cm)。したがって、収集繊維の長い部分のために、その末端が生検技術によって破壊されることを避けることができない。多くの場合、繊維の使用できる中央部分は小さいので、機械的にテストするのは難しいです。この技術は、かなり長い中央領域(3~5mm)を提供するが、損傷した繊維の使用は受動または活動的な力の出力を変えるので、解剖の間に繊維束の質を注意深くチェックしなければならない。成功した生検の視覚的観察は、生検手順から損傷を受けていない繊維の一部を示す。従来の解剖用光顕微鏡から見ると、繊維の表面は穴や涙がなく、滑らかに見えます(図4)。さらに、繊維は円筒形に見え、平坦な領域を持たない必要があります。目に見えないが、筋肉自体は、抽出後ほぼすぐに筋肉タンパク質を分解し始める天然のプロテアーゼのために、時間の経過とともに分解する。したがって、繊維で使用されるすべての溶液にプロテアーゼ阻害剤を添加することが重要です。さらに、できるだけ多くの血液を除去するために、生検の余分な打ち込みも提案します。
慎重な準備をしても、繊維の損傷が発生し、繊維の活性化不良につながる可能性があります。繊維は手順のほぼすべての部分に非常に敏感であるため、繊維損傷の多くの理由があります。例えば、生検中、トロカールが十分に鋭くない場合、抽出中に筋肉組織に押し込む代わりに、それを切断し、繊維を伸ばして破壊することができる。繊維は浸透性変化、pH、および温度に敏感であるため、収集溶液は適切に準備する必要があります。繊維を取り扱う際には、繊維への圧力を完全に制限するよう細心の注意を払う必要があります。代わりに、ピンセットは、その結合組織によって生検をつかむために使用されるべきです。別の別の方法は、サイズ0-7シルク縫合糸を使用して生検の使用不能な端を包み、取り扱うときにこれをつかむことです。最後に、グリセロールは2つの役割を果たします:第1は-20°Cで筋肉を凍結から保つことであり、第二は繊維に中性洗剤になることです。すなわち、グリセロールは繊維を外部溶液に透過させ、カルシウムの流入を可能にする(活性化溶液を介して)。ほとんどの筋肉では、このプロセスは約10日かかります。しかし、コラーゲン含有量とサンプルのサイズによっては、最大6週間かかることがあります。高カルシウムの活性化が機械的実験中に起こるためには、繊維を透過化する必要があります。繊維は一般的に少なくとも3ヶ月間使用できます。繊維の無駄を制限するために、TA筋線維に対して、より長い透過化待ち時間(4-6週間)が示唆される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
マイケラ・ラウ、リー・フェディア・リスマン、マイケル・マーシュ、ジャニナ=ソフィー・テンラー、キリアン・キンメスカンプ、ヴォルフガング・リンケのプロジェクト支援に感謝します。このプロジェクトの資金は、MERCUR財団(ID:AN-2016-0050)によってDHに提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe | B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany |
4606027V | Drug administration |
| 5mm Berstöm needle | homemade | N/A | Tissue collection. Similar to other Berstöm needles |
| Acrylastic | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
269700 | elastic compression bandage |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11836145001 | Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue. |
| Cutasept | PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany |
9805630 | Disenfectant spray for the skin |
| Leucomed T plus | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
7238201 | Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection |
| Leukostrip | Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain |
66002876 | wound closure |
| Surgical disposable scalpels | Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany |
BA200 series | Incision |
| Unihaft cohesive elastic bandage | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
4589600 | cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact |
| Xylocitin 2% with Epinephrin | Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany |
N/A | Controlled substance anesthesia, vasoconstriction |
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