Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

Published: July 28, 2020 doi: 10.3791/61604

Summary

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

Abstract

אפיתל Mucociliary מספק את קו ההגנה הראשון על ידי הסרת חלקיקים זרים באמצעות הפעולה של ייצור ריר וסיווג סיווג סיליה-מתווכת. פגמים רבים רלוונטיים קלינית באפיתל mucociliary הם להסיק כפי שהם מתרחשים עמוק בתוך הגוף. כאן, אנו מציגים מודל תלת-מימדי נשלף לאפיתל ריקוצילי המופק מנביאים רב-תכליתיים שהיו מבודדים מיקרוכירורגית מעוברי קסנופוס לאבי. אורגנואידים אפיתל mucociliary מכוסים אפיתל שנוצר לאחרונה מתאי ectoderm עמוקים ומאוחר יותר מעוטרים בתאים מרובי דפוס שונים, תאי הפרשה, ותאי גביע ייצור ריר כי הם לא ניתן להבחין בין האפידרמיס היליד בתוך 24 שעות. הרצפים המלאים של מעברי תאים דינמיים מ mesenchymal לאפיתל כי להגיח על פני השטח apical של אורגנואידים ניתן לעקוב על ידי הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה. אלה במבחנה, ארגון עצמי אורגנואידים אפיתל mucociliary מציעים יתרונות ברורים בלימוד הביולוגיה של אפיתל mucociliary עם יעילות גבוהה בדור, תנאי תרבות מוגדרים, שליטה על מספר וגודל, וגישה ישירה להדמיה חיה במהלך התחדשות האפיתל המבדיל.

Introduction

פציעה, זיהום, ומחלה של אפיתל רימוני קשורים ייצור לקוי ואישור של ריר אשר נמצא לעתים קרובות בהפרעות ריאתיות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, אסטמה, סיסטיק פיברוזיס, bronchiectasis, ו dyskinesia ciliaryהראשי 1,2,3,4. התקדמות לאחרונה בטכנולוגיית אורגנואיד, למשל, התא בסיס נגזר אורגנואיד ריאות הנקרא tracheosphere המהסכם את ההתחדשות של אפיתל mucociliary להתעורר כמודל מבטיח עם פוטנציאל טיפולי1,5,6. עם זאת, השימוש בו מוגבל כיום, בין השאר בשל היעדר תנאי התרבות המוגדרים ויעילות נמוכה בהפקות אורגנואידים. אפיתל Mucociliary באפידרמיס דרכי הנשימה והצפרדע האנושי דומים להפליא מורפולוגיה רקמות, הרכב התא,ואת הפונקציה שלה 7,8,9,10,11,12. בשני האורגניזמים, אפיתל mucociliary מספק הגנה קו ראשון על ידי הפרשת ריר וחומרים מיקרוביאליים ומנקה חלקיקים מזיקים ופתוגנים באמצעות הפעולה המסונכרנת של cilia.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור אורגנואידים אפיתל mucociliary באמצעות האבות הרב-תכליתיים של עוברי Xenopus laevis 13,14. בעבר, דיווחנו14 כי בהיעדר גורמי גדילה אקסוגניים והמטריצה החוץ תאית, תאים עמוקים מבודדים מיקרוכירורגית מן ectoderm שלב gastrula מוקדם באופן ספונטני להרכיב לתוך אגרגטים, לחדש את האפיתל על פני השטח שלה, ולהבשיל לתוך אפיתל mucociliary על ידי intercalating רב תאים אביזר אחרים בתוך 24 שעות. בנוסף להתפתחות המהירה, פרוטוקול זה מציע הזדמנות ברורה לגישה ישירה למעברים של תאים ectoderm עמוק רבפוטנטי לתוך אבות תאי גביע אפיתל המשנים את צעדי ההתחדשות של אפיתלמשובש 14 אשר אינם זמינים עוברים שלמים ectoderm (המכונה גם כובע בעליחיים) 15,16,17. המספר והגודל של האורבנואידים המיוצרים ניתנים להרחבה ביעילות גבוהה על ידי שליטה בחומרים ההתחלתיים של עוברי קסנופוס. אורגנואידים בתרבות צפה ניתן למיין בקלות ומועבר בשלב הרצוי לניתוחים נוספים, כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה, בדיקות מכניות, טיפול תרופתי, אפיוןגנטי 14. זה ספונטני, מכניקת רקמות מונעת התחדשות של האפיתל על פני השטח של אגרגטים תא עוברי תוצאות אורגנואידים אפיתל mucociliary ולספק מודל תלת מימדי רומן (3D) כדי ללמוד את הביולוגיה של האפיתל mucociliary.

Protocol

שימוש בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המכון למדע בסיסי (IBS 18-01) והמכון המתקדם של קוריאה למדע וטכנולוגיה (KA2017-22).

1. עוברים

  1. השג את העוברים X. laevis באמצעות הליך סטנדרטי: לאסוף באופן ידני ביצים מצפרדעים מגורה נקבה ולבצע הפריהחוץ גופית 18,19.
  2. De-jelly העוברים מופרות עם תסיסה עדינה במשך כ 5 דקות ב 2% ציסטאין ב 1/3x שונה תמיסת מלח של בארת (MBS; ראה את המתכון 1X MBS להלן) ב pH 819.
  3. שלב אופציונלי להדמיה חיה: לתייג באופן פלורסנטי חלבונים ספציפיים ולהתבונן בדינמיקה שלהם באורגנואיד, המשך לסעיף 5.
  4. (אופציונלי) כדי ל כדי לפקח על זיהום של תאי ectoderm שטחיים בתוך אורגנואידים, לתייג את פני השטח apical של העוברים עם NHS-rhodamine בשלב 914. לדגור עוברים 1 מ"ג/ מ"ל NHS-Rhodamine ב 1/3x MBS (pH 9.0) במשך 30 דקות עם אגוז עדין. לשטוף עוברים שלוש פעמים על ידי העברה לצלחת פטרי מלא 1/3x MBS במשך 15 דקות.
  5. תרבות העובר ב 1/3x MBS בטמפרטורה המועדפת (14-26 ° C) עד הסימנים הראשונים של שלב 10 מזוהים (כלומר, המראה של תאים פיגמנטיים כהים סביב blastopore בתצוגה הצמחית).

2. הכנת כלים מיקרוכירורגיים, פתרונות וכלי תרבות

  1. להכין את הכלים הדרושים כולל זוג ממחטות כיתה כירורגית וכלים שיער (לולאת שיער וסכין שיער) עבור microsurgery20.
  2. הכן את מדיה התרבות הבאה לעוברים: 1/3X MBS, כאשר 1X MBS מיוצר עם NaCl (88 מ"מ), KCl (1 מ"מ), NaHCO3 (2.4 מ"מ), MgSO4 (0.82 מ"מ), Ca(NO3)2 (0.33 מ', CaCl2 (0.41 מ"ר) ו-HEPES (10 מ"ר). כוונן את ה-pH ל- 7.4 עם 10 M NaOH.
    הערה: אופציונלי: הוסף טיפות של פנול אדום כדי לציין pH.
  3. להכין את התקשורת התרבות הבאה עבור רקמות עובריות organoids: Danilchik של לאיימי (DFA)21 בתוספת עם טרי 1% אנטיביוטיקה ופתרון אנטי מיקוטי. הכן DFA עם NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), אשלגן גלוקונאט (4.5 mM), נתרן גלוקונאט (32 mM), CaCl2 (1 mM) ו MgSO4 (1 mM). כוונן את ה-pH ל-8.3 עם בין פרטני. סינון DFA (מסנן בקבוק 0.2 μm), aliquot ולאחסן אותו ב -20 °C.
  4. הכן DFA ללא סידן ומגנזיום להפרדת תאים עמוקים מectoderm באמצעות המתכון לעיל והשמטת CaCl2 ו MgSO4. Aliquot ולאחסן ב-20 °C.
  5. הכן צינורות PCR לא דביקים עבור צבירת תאים עובריים.
    1. כדי לגרום צבירה ספונטנית של תאים עובריים מבודדים, להכין צינורות PCR שאינם דביקים על ידי ציפוי צינורות PCR עגולים עם 200 μL של 1% BSA (1 גרם של BSA ב 100 מ"ל של מים מזוקקים) לילה ב 4 ° C או עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. כל צינור ישמש להרכבת אורגנואיד אחד.
    2. לשטוף צינורות PCR מצופה BSA עם DFA שלוש פעמים כדי להסיר כל BSA שיורית.
    3. למלא צינורות PCR עם 200 μL של DFA.

3. בידוד של תאי ectoderm עמוקים

  1. בחר ולאסוף עוברים כפי שהם מגיעים בשלב מוקדם 10 באמצעות כלי שיער תחת סטריאוסקופ.
  2. באמצעות פיפטה העברה חד פעמית, להעביר את העוברים שנבחרו לתוך צלחת פטרי מלא DFA.
  3. הסר את קרום vitelline של העוברים באמצעות מפסים חדים מהצד הצמחי מבלי לשבש את הצד החייתי של העובר.
    הערה: הקפד להימנע מחשיפת עוברים לאוויר. החדרת בועות אוויר לתוך הפתרון או הבאת עוברים אל פני השטח תגרום לעובר להתפוצץ.
  4. כדי לבודד את כובע החיה, מקם את הצד החי של העובר למעלה.
  5. מבחינה ויזואלית להעריך את היקף כובע בעלי החיים להיות לחוץ ו לעשות את החתך הראשון לאורך קצה כובע בעלי החיים עם סכין שיער. משוך את סכין השיער כלפי חוץ כדי לעשות חתך.
  6. חזור על שלב 3.5 כדי ליצור שרשרת של חתכים קטנים כדי לתוסס את כובע בעלי החיים.
  7. חותכים את הקצה העבה של כובע החיה באמצעות סכין שיער כדי למנוע הכללה של מבשרי mesoderm.
    הערה: כדי למנוע ריפוי וצבירה של כובעי בעלי חיים מבודדים, המשך לשלב הבא בתוך 10 דקות. בדרך כלל, אנו מבודדים 5-10 כובעי בעלי חיים בכל פעם כדי להרכיב אורגנואידים מרובים.
  8. כדי להפריד תאים עמוקים מכובע בעלי החיים, להעביר את כובעי בעלי החיים שנפלט לצלחת פטרי מלאה סידן- ומגנזיום חינם DFA עם פיפטה העברה חד פעמית. היזהר לא להציג בועות אוויר במהלך ההעברה.
  9. כדי לשמור על מספיק מקום לצעדים הבאים, באמצעות כלי השיער, מקם את כובעי בעלי החיים כדי להתמודד עם הצד החיתי למעלה ולשמור על מרחק נדיב מהסברים אחרים.
  10. המתן 5-10 דקות ולאחר מכן לפקח על explants תחת סטריאוסקופ. לאחר תאים עמוקים משוחררים נמצאו מקצה השכבה השטחית כהה פיגמנט, להתחיל להרים את השכבה השטחית הרחק התאים ectoderm עמוק בצבע בהיר באמצעות סכין שיער מתחת סטריאוסקופ.
  11. נתק בזהירות (פילינג) את השכבה השטחית עם סכין שיער, החל מהקצה.
  12. לאסוף את התאים ectoderm עמוק עם שאיפה מינימלית (10\u201215 μL) כדי להגביל את כמות סידן- ומגנזיום חינם DFA המועבר למדיה צבירה בשלב הבא.
    הערה: ניתן להסיר תאים שטחיים מנותקים מהמדיה כדי למנוע זיהום תאי הקטודורם העמוקים הנותרים.

4. דור אורגנואידים אפיתל mucociliary

  1. להעביר תאים ectoderm עמוקים לצינור PCR לא דביק המכיל 200 μL של DFA. בעדינות פיפטה את המדיה (2\u20123 פעמים) כדי לפזר תאים שהועברו בצינור PCR.
    הערה: התזמון המוגדר כצובר שעות לאחר (hpa) מתחיל בשלב זה. הגודל של אורגנואידים וכתוצאה מכך נשלט על ידי מספר תאי ectoderm עמוקים שנוספו לצינור PCR. ניתן להשתמש בתאי ectoderm עמוקים מכובעי בעלי חיים אחד או יותר, בהתאם לגודל הרצוי של האורגן.
  2. סגור את צינור PCR. שמור על צינורות PCR זקוף כדי לגרום צבירה ספונטנית בתחתית.
  3. נטר את תהליך הצבירה תחת סטריאוסקופ. תאים בדרך כלל מתאספים בתחתית צינור PCR בתוך שעה ולהרכיב לתוך אגרגטים כדוריים בתוך 2-3 שעות, בהתאם לגודל.
  4. כדי לבצע הדמיה חיה או בדיקות סמים במהלך הפיתוח של אורגנואידים אפיתל mucociliary, לאסוף אגרגטים ב 2 hpa באמצעות 200 μL פיפטה מצויד טיפים מוגדלים (לחתוך עם מספריים מעוקר) כדי למנוע גרימת נזק לאגרגטים במהלך האיסוף.
  5. כדי לאפשר לאגרגטים להתפתח לתוך אורגנואיד אפיתל רירית בתרבות, לאסוף אגרגטים כדוריים מצינור PCR ב 5 hpa ולהעביר אותם לצלחת פטרי מלא DFA.
  6. מקם את הצבירות הרחק מאחרים כדי למנוע מהם להתיך. בתוך 24 שעות של תרבות בטמפרטורת החדר ללא כל גורמים נוספים, אורגנואידים אפיתל mucociliary בוגר ניתן לצפות להיות מסתובב עם הפעולה של להכות cilia מכסה את פני השטח של אפיתל מובחן

5. (אופציונלי) הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של פיתוח אורגנואידים

  1. הכן את ה-MRNA למיקרו-צורך.
    1. כדי לדמיין את האפיתל המתרחש בשלב הראשוני של היווצרות אורגנואיד, להכין mRNA עבור zonula ספציפי לאפיתל occludens חלבון-1 (ZO-1) ועל התוויית קרום התא על ידי הגביר את pCS2-ZO1-RFP ו pCS2-mem-GFP plasmids (מתנה מלאנס דוידסון).
    2. לחלץ ולליניאריזציה של ה-DNA פלסמיד, ולאחר מכן לתמלל את mRNA כתר באמצעות SP6 / T7 במבחנה ערכת שעתוק.
    3. אליקוט MRNA מתעתק ולאחסן אותו ב -80 °C.
  2. מיקרו-תחוט את ה-mRNA לעובר מופרית
    1. מקם עוברים מופרות ב-3% פיקול ב-1 MBS.
    2. טען 3-4 μL של mRNA באמצעות קצה מיקרו-מטעין לתוך מחט זכוכית משך (קצה מחט מחודד ארוך ופיין עם קוטר פנימי של 10\u201230 μm).
    3. חבר את המחט למזרק זעיר והתאים את הזמן והלחץ כדי לספק נפח קבוע של mRNA עבור microinjection.
    4. להזריק את mRNA ממש מתחת לפני השטח apical של עמוד בעלי החיים. תיקון עגול בצבע חיוור מובהק הנגרמת על ידי הרחבת קליפת המוח נראה בזמן microinjection.
    5. להעביר את העוברים המוזרקים 1/3X MBS ותרבויות אותם לשלב 9.5.
    6. אסוף את העוברים המסווים בתווית פלורסנטית תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי (הגדרות ריזור/פליטה עבור GFP (488/510) ו- RFP (532/588)).
    7. המשך לשלב 1.3.
  3. להרכיב ולתרגם את האורגניואיד (סעיפים 3 ו-4) עד לשלב הרצוי של הפיתוח.
  4. בצע הדמיה חיה.
    1. הכן תא הדמיה עם תחתית זכוכית על-ידי התזת כיסוי לתא אקריליק טחינה אישית באמצעות גריז סיליקון.
      הערה: אטמו היטב את התא כדי למנוע דליפה של אמצעי התקשורת של התרבות.
    2. מלא את תא ההדמיה ב-DFA.
    3. בחר רשת מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM) אחת של שידור משושה (75 רשת) ממכל באמצעות מקצות ולהחיל כמות זעירה של גריז על קצה הרשת.
      הערה: גודל הרשת צריך להיות קטן יותר מהקוטר של הצבירה כך שהצבירה תהיה ברשת.
    4. לחץ למטה בקלילות כדי לאבטח את רשת TEM לתחתית תא ההדמיה.
    5. העבר את הצבירות לתא ההדמיה ומקם אותן בתוך הרשת.
      הערה: הימנע ממקם את הצבירות לצד הגריז. במהלך הניסוי, הצבירות צריכות לשבת על רשת TEM מבלי ליצור קשר עם תחתית התא כדי למנוע דחיסה פיזית.
    6. מלאו את תא ההדמיה ב-DFA ואוטמים אותו בזכוכית כיסוי ובשומן.
      הערה: התא צריך להיות אטום ללא בועות אוויר כדי למנוע מערבולות או תנועה במהלך ההדמיה.
    7. כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות אורגנואיד אפיתל mucociliary, לאסוף תמונות z-stack זמן לשגות של אגרגטים (מ 2 hpa) באמצעות מיקרוסקופ confocal.
      הערה: אנו אוספים בדרך כלל כ-120 ערימות z-stacks בעובי μm כל 15 דקות באמצעות מטרה של 20X כדי לעקוב אחר התנהגויות התא הדינמי, אך מפרטים אלה צריכים להיות ממוטבים למטרת הניסויים.

6. (אופציונלי) הדמיה פיתוח אורגנואידים על ידי קיבעון וחיסונים

  1. לתקן אורגנואידים בשלב הרצוי של פיתוח על ידי העברתם בקבוקון זכוכית מלא בתמיסה קיבעון.
    הערה: הוסף אמצעי אחסון של פתרון קיבעון שהוא >פי 20 מזה של הדגימות כדי להבטיח קיבעון מלא. בצע את התהליכים הבאים על מאכל אלא אם צוין אחרת. באופן כללי, אורגנואידים קבועים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS. עם זאת, ייתכן שיידרשו חומרים שונים כדי לזהות חלבונים ספציפיים. לדוגמה, השתמשנו 4% PFA עם 0.25% גלוטראלדהייד ב PBS כדי לזהות F-actin ו אצטילאט טובלין. כדי לזהות אינטלקטין (ITLN) ו ZO-1, אורגנואידים קבועים עם הפתרון של דנט קר כקרח (4:1 מתנול:dimethyl sulfoxide) ללילה ב -20 °C. יש ליבש באופן סדרתי את האורגניואידים הקבועים של דנט לפני השטיפה (שלב 6.3). ניתן לייעל את משך הדגירה והשטיפה של נוגדנים לצרכים ספציפיים.
  2. לתקן אורגנואידים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או לילה ב 4 °C.
  3. לשטוף 3 פעמים עם PBST (PBS עם 0.1% Triton X-100) במשך 15 דקות ב RT.
  4. חסום כריכה לא ספציפית עם סרום עזים של 10% ב- PBST (PBSGT) למשך שעה אחת ב- RT.
  5. דגירה עם נוגדן ראשוני (1:200) ב PBSGT לילה ב 4 ° C.
  6. לשטוף 3 פעמים עם PBST במשך 15 דקות ב RT.
  7. דגירה עם נוגדן משני (1:200) ב PBSGT לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. לשטוף 3 פעמים עם PBST במשך 15 דקות ב RT.
  9. מעבירים את האורגנואידים הקבועים והמחוסמים לתא הדמיה והמשיכו בהדמיה קונפוקלית.

Representative Results

פרוטוקול מתוקננים זה יוצר אורגנואיד אפיתל ריקולרי מקרבות רב-תכליתיים המבודדים מהשלב המוקדם של גסטרולה X. laevis עוברים בתוך 24 שעות שלטיפוח 14. נאסף תאים ectoderm עמוק להרכיב את עצמו כדי ליצור צבירה בצינור PCR שאינו דביק ולעבור אפיתל פני השטח בידול תאים גביע. המשטח האפיתל החדש של אגרגטים מספק מצע דומה אפיתל היליד נמצא vivo עבור תאים פנימיים intercalating (למשל, multiciliated ותאי עזר אחרים) ומתפתח כדי ליצור אורגנואידים אפיתלריקוצילי(איור 1,B). בתוך 24 שעות לאחר הצבירה, אורגנואידים אפיתל שרירים מאורגנים עצמית לחדש אפידרמיס בוגר כי הוא בלתי ניתן להבחין בין האפידרמיס של ראשן. organoids כוללים אפיתל מופרש באופן מלא (קרטין), תאי גביע הפרשת ריר (ITLN), תאים מרובי (טובולין אצטילאט), ותאי הפרשה קטנים (בוטנים אגלוטין, PNA)(איור 1C).

בנוסף לאישור הפיתוח של סוגי תאים שונים עם immunostaining, הדינמיקה של התפתחות אורגנואיד יכול להיות מלווה הדמיה חיה (איור 2A). כדי לבחון את האפיתל שעולה בשלב מוקדם של היווצרות אורגנואיד(איור 1B), תייגנועוברים על ידי הבעת חלבוני צומת הדוקים מתויגים פלורסנט (ZO-1-RFP) וחלבונים ללוקליזציה של קרום (mem-GFP). עם תיוג כפול, ניתן לסמן את השלבים היקצים של ZO-1-חיובי בצומת הדוקה וניתח אותם באופן כמותי במהלך האפיתל (איור 2). לדוגמה, עבור תאים(איור 2B, בצבע ירוק) בשלבים שונים של אפיתל (ב- 0 דקות), אזורים מסוימים של הדבקת תא-תא פיזרו פיסוק של ZO-1(איור 2B, חצים ירוקים). לעומת זאת, אזורים אחרים הרכיבו באופן מלא, ביטוי ZO-1 רציף(איור 2B, חצים צהובים). עם הזמן, הפאנקטה מתמזגת ומתחברת כדי ליצורצמתים הדוקים רציפים (איור 2B, חצים ירוקים), וצמתים הדוקים רציפים שומרים על המורפולוגיה שלהם גם במהלך חלוקתהתאים (איור 2B, חצים צהובים). ככל שהצומתים ההדוקים מתבגרים, התאים נעים באופן דינמי פנימה והחוצה מפני השטח לאורך המישורים האפיתיים של האורגניואידים(איור 2ג', ד). יתר על כן, על ידי מעקב אחר תאים spatiotemporally על פני השטח של אורגנואידיםמבדילים (איור 2B,תאים מקודדים בצבע), ניתוח בקנה מידה רב אפשרי, החל מporncta בודדים צמתים הדוקים רציפים, גבולות תא תא, ותת קבוצות של אוכלוסיות תאים בתוך אורגנואידים.

Figure 1
איור 1: דור של אורגנואידים אפיתל mucociliary.
(א)סכמטי המציג את הפרוטוקול להרכבת אגרגטים ectoderm עמוק מעוברי X. laevis. (ב)תרשים למודל של היווצרות אורגנואיד אפיתל ריקוצילי שמקורו בתאים ectoderm עמוק רבפוטנטי (תצוגה חוצה חתך). תאים ממוקמים על פני השטח לעבור לתאי אפיתל ולהבדיל לתאי גביע. ההבחנה תאים ciliated, תאים הפרשה, וionocytes באופן רדיאלי להיכנס אל פני השטח ולחדש אפידרמיס בוגר. (ג)הקרנת z מרבית של אפיתל mucociliary immunostained עבור ITLN (תאי גביע ייצור ריר), טובולין אצטילאט (תאים צובעים), PNA (תאים הפרשה קטנים), וקרטין (תאי אפיתל) באורגניטים ב 24 hpa (פאנל עליון) ואפידרמיס ראשן (פאנל תחתון). סרגל קנה מידה = 30 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה חיה של פיתוח אורגנואידים.
(א)תרשים של תא ההדמיה עבור אורגנואידים חיים (לא בקנה מידה). (ב)רצפי זמן-לשגות של ערימות confocal שנאספו מתוך אגרגטים עמוקים של תאים ectoderm לבטא ZO-1-RFP ו mem-GFP מ 2.5 hpa. סרגל קנה מידה = 20 μm. תאים הם בצבע מדומה למעקב לאורך זמן. לתא בצבע ירוק יש מצבי הידבקות תאים שונים, כולל הידבקות חיובית ZO-1 המתפתחת בהדרגה (חצים ירוקים) ואחד ששומר על הדבקה חיובית רציפה של ZO-1 (חצים צהובים) לאורך זמן. (ג,ד) מה אתה עושה? תמונות קונפוקליות של ZO-1-RFP המביעים צבירות תאים ectoderm עמוקים להראות את התאים intercalating רדיאלי נע אל פני השטח (C, כוכב צהוב) ו נע בתוך אגרגטים (D, כוכב כחול). קנה מידה של פסים = 10 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

אורגנואידים אפיתל Mucociliary המופק מתאי ectoderm עמוקים של העובר X. laevis הם כלי רב עוצמה כדי ללמוד את האפיתל והבידול של נביאים רב עוצמה במבחנה. בניגוד למאגר כובע בעליחיים מאומץ נרחב 16 המשמש במבחנה organogenesis13 ופיתוח אפיתליה mucociliary15,17,22 המנצלים את ectoderm שלם, אורגנואידים נגזר ectoderm עמוק המוצג בפרוטוקול זה מציעים הזדמנות ברורה לפקח על שלבי התחדשות מונחה מכניקת רקמות של אפיתלפני השטח 14. בסביבות 2 hpa, החדש שנוצר ZO-1 תאי אפיתלחיוביים (איור 2)מתחילים להופיע על פני השטח apical של אורגנואידים ולהגדיל את האוכלוסייה שלהם כדי לכסות את האורגניואיד כולו כמו הרקמה להתגבש או מפחית אתהתאימות 14. ההתחדשות של האפיתל ומפרטי תוחם הבאים עבור תאי גביע ייצור ריר להמשיך באופן ספונטני בתקשורת תרבות המוגדרת כימית בתוך יום. אורגנואידים אפיתל mucociliary המתפתחים במהירות לספק פלטפורמה לבחון התנהגויות תאים דינמיים בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה, במהלך צעדים מתקדמים של התחדשות אפיתל. הם גם מאפשרים חקירה של שאלות בסיסיות המתעוררות במהלך פיתוח אפיתל mucociliary, הומוסטאזיס,ומחלות קשורות 2,9,23. בפרט, הרגישות המכנית של תאי אב רבי עמוק במהלך המעבר מבשרי תא גביע אפיתל שזוהו באורגנואידים14 עשוי לשמש לקשר מחלות נשימה הקשורות בידול בסיס חריג שבו תאי גביע הפרשת ריר הם מעל- או מתחת מיוצר23.

בעוד פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה כדי ליצור אורגנואידים אלה, ישנם מספר צעדים קריטיים להצלחה בניסויים. כדי למנוע זיהום של תאים אפיתל שטחיים במהלך הבידוד של תאים ectoderm עמוקים מכובע בעלי החיים, יש לפקח על כובע בעלי החיים להציב בסידן- ומגנזיום ללא DFA תחת סטריאוסקופ ולזהות את הזמן הנכון ליזום את ההפרדה של שכבה שטחית כהה פיגמנט של כובע בעלי החיים. אם הרקמה נשמרת ב- DFA ללא סידן ומגנזיום במשך זמן רב מדי, הרקמה כולה תנתק ותבדיל בין תאים עמוקים וחלניים יהיה בלתי אפשרי עבור אגרגטים ectoderm עמוק. כדי לאשר את היעדרם של תאים שטחיים בצרפיectoderm עמוקים, אנו ממליצים באופן פלורסנטי תיוג פני השטח apical של העובר עם NHS-rhodamine (שלב1.4 14)לפני מיקרוכירורגיה; זה יאפשר זיהוי קל של תאי פני השטח אם הם קיימים באורגן שנוצר. מאז התחדשות אפיתל מוסדר על ידימכניקת רקמות 14, זה חיוני כדי למנוע ייצור כוח לא מכוון עבור אורגנואידים ארגון עצמי. בפרט, אנו מציעים להימנע ממגע עם תחתית הזכוכית של תא ההדמיה במהלך הדמיה חיה על-ידי הצבת אגרגטים בקצוות רשתות TEM כפי שזה מאפשר מגע חופשי עם חלון ההדמיה של אגרגטים חיים (שלב 5.1.2.). זה במבחנה-תרבותי, מודל 3D מאורגן עצמית עבור אפיתל mucociliary ישמש ככלי לגרירה כדי לענות על השאלות הבסיסיות המתעוררות במהלך התחדשות של אפיתל מפרט תולדות של תאי גביע.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת קים ולאנס דוידסון על הערותיהם ותמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מדען צעיר HYK מהמכון למדע בסיסי (IBS-R0250Y1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dual-stage Glass Micropipette Puller Narishige PC-100
Picoliter microinjector Warner Instruments PLI-100A
Confocal Laser Microscope
Stereoscope
Tools
Forcep Dumont Dumont #5
Hair knife Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
Hair loop Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)
hCG injection
human chorionic gonadotropin Sigma cg10-10vl
MBS solution
10M Sodium hydroxide Sigma 72068
Calcium chloride Sigma C3881
Calcium nitrate Sigma C1396
HEPES Sigma H4034
Magnesium sulfate Sigma 230391
Phenol-red Sigma P0290
Potassium chloride Sigma 7447-40-7
Sodium bicarbonate Sigma S6014
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g Sigma 655104
dejellying solution
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
Sodium hydroxide 10M Sigma 72068
Ficoll solution
Ficoll Sigma F4375
DFA solution
Sodium chloride Sigma S9625
0.22mm Filter Millipore S2GPT05RE
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955
Bicine Sigma B3876
Calcium chloride Sigma C3881
Magnesium sulfate Sigma 230391
Potassium gluconate Sigma G4500
Sodium carbonate Sigma 222321
Sodium gluconate Sigma G9005
mRNA in vitro transcription
SP6/T7 in vitro transcription kit Invitrogen AM1340
mRNA microinjection
Borosilicate glass capillary tubes Harvard Apparatus GC100-10
Eppendorf microloader pipette tips ThermoFisher A25547
Mineral oil Sigma M5904
PCR tube coating
BSA Thermofisher 26140079
PCR tubes SSI SSI-3245-00
Imaging
Custom-milled acrylic chamber
Coverglass 24mmX50mm Duran B01_001650
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) SPI 275HGN-XA
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) SPI 2775GN-XA
Silicone grease Shinetsu HIVAC-G
Fixation
20ml screw top-cap vial Wheaton WH.986580
2ml screw top-cap vial
Benzyl alcohol Sigma 305197
Benzyl benzoate Sigma B6630
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sgima D4540
Glutaraldehyde 10% EM GRADE Electron Microscopy Sciences 16120
Goat serum Jackson 005-000-121
Methanol Sigma 322415
Paraforlamdehyde Sigma P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) LPS Solution CBP007B
Triton X-100 Sigma T8787
Primary antibody (1:200)
acetylated tubulin Sigma clone 6-11B-1
Itln1 Proteintech 11770-1-AP
Keratin Developmental Studies Hybridoma Bank 1h5
ZO1 Invitrogen 402200
Vectors
pCS2-mem-GFP Gift from Dr. Lance Davidson
pCS2-ZO1-RFP Gift from Dr. Lance Davidson

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  2. Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).
  3. Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Cilia dysfunction in lung disease. Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).
  4. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
  5. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  6. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  7. Dubaissi, E., et al. A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis. Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).
  8. Hayes, J. M., et al. Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development. Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).
  9. Walentek, P., Quigley, I. K. What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia. Genesis. 55 (1-2), (2017).
  10. Werner, M. E., Mitchell, B. J. Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus. Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).
  11. Dubaissi, E., Papalopulu, N. Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).
  12. Walentek, P., et al. A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles. Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).
  13. Asashima, M., et al. In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus. Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).
  14. Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates. Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).
  15. Haas, M., et al. DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia. Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).
  16. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. Guille, M. , Humana Press. 1-13 (1999).
  17. Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development. Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).
  18. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  19. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  20. Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).
  21. Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos. Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).
  22. Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo. Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).
  23. Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 161 ספרואיד צבירה מעבר מזן לאפיתל תא גביע תא רב-תכליתי מכניקת רקמות
אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, H. J., Kim, H. Y. MucociliaryMore

Kang, H. J., Kim, H. Y. Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging. J. Vis. Exp. (161), e61604, doi:10.3791/61604 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter