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Biology

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.

Abstract

La maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC è un problema critico per la loro applicazione nella terapia rigenerativa, nel test farmacologico e nella modellazione della malattia. Nonostante lo sviluppo di più protocolli di differenziazione, la generazione di cardiomiociti iPSC simile a un fenotipo adulto rimane impegnativa. Un aspetto importante della maturazione dei cardiomiociti riguarda la formazione di una rete di sarcomi ben organizzata per garantire un'elevata capacità di contrazione. Qui, presentiamo un approccio basato sulla risoluzione super per l'analisi semi-quantitativa della α-actinin nei cardiomiociti. Utilizzando la microscopia di localizzazione fotoattivata è stato eseguito un confronto tra la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z dei cardiomiociti derivati da iPSC e delle cellule cardiache isolate dal tessuto neonatale. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di condizioni di imaging adeguate per ottenere dati affidabili. I nostri risultati mostrano che questo metodo è adatto a monitorare quantitativamente la maturità strutturale delle cellule cardiache con alta risoluzione spaziale, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche sottili dell'organizzazione dei sarcome.

Introduction

Le malattie cardiovascolari (CVD) come l'infarto miocardico o la cardiomiopatia rimangono la principale causa di morte nel mondo occidentale1. Poiché il cuore umano possiede solo una scarsa capacità rigenerativa, c'è bisogno di strategie per promuovere il recupero dalle CVD. Questo include terapie di sostituzione cellulare per ricostituire cardiomiociti persi (CM), così come lo sviluppo di nuovi farmaci anti-aritmici per un intervento farmaceutico efficiente e sicuro. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno dimostrato di essere una fonte di cellule promettente per la generazione illimitata di CM umano in vitro, adatta per terapie rigenerative, modellazione della malattia e per lo sviluppo di saggi di screening farmacologico2,3,4.

Sebbene esistano molti protocolli di differenziazione cardiaca diversi, il CM derivato da iPSC manca ancora di alcuni aspetti fenotipici e funzionali che ostacolano l'applicazione in vitro e in vivo5,6. Oltre ai cambiamenti elettrofisiologici, metabolici e molecolari, il processo di maturazione cardiaca coinvolge l'organizzazione strutturale dei sarcomere, che sono le unità fondamentali necessarie per la generazione di forza e la contrazionecellulare 7. Mentre le CCI adulte presentano un apparato contrattile ben organizzato, i CM derivati da iPSC dimostrano comunemente filamenti di sarcomero disarrangiati, associati a una ridotta capacità di contrazione e dinamiche di contrazionealterate 8,9. A differenza del CM maturo che mostra un modello di contrazione noniassiale, le strutture disorientate in CM immaturo si traduce in una contrazione radiale dell'intera cellula o promuovono la comparsa di punti focali di contrazione9,10.

Per migliorare la maturazione cardiaca, sono stati applicati diversi approcci, tra cui i metodi di coltura cellulare 3D, la stimolazione elettrica e meccanica, nonché l'uso di matrici extracellulari che imitano le condizioni di vivo11,12,13. Per valutare il successo e l'efficienza di queste diverse condizioni di coltura, sono necessarie tecniche per monitorare e stimare il grado di maturazione strutturale di iPSC CM, ad esempio con tecniche microscopiche. A differenza dell'imaging confocale convenzionale, la risoluzione in caso di microscopia fotoattivata di localizzazione (PALM) è di circa 10 volte superiore. Questa tecnica a sua volta consente un'analisi più accurata, rilevando anche sottili alterazioni delle strutture cellulari14. Considerando l'alta risoluzione dell'imaging basato su PALM, l'obiettivo generale di questo metodo era la valutazione microscopica della maturità del sarcomere nei CM derivati da iPSC mediante una determinazione precisa dello spessore z-Disco e della lunghezza del sarcomere. Negli studi precedenti, queste caratteristiche strutturali hanno dimostrato di essere parametri appropriati per valutare la maturità cardiaca15. Ad esempio, iPSC-CM a base di distrofina a lunghezza intera presentano una lunghezza del sarcomere e una larghezza della banda z ridotte rispetto alle celle di tiposelvaggio 16. Allo stesso modo, la lunghezza dei singoli sarcomere è stata misurata per studiare l'impatto dei segnali topografici sullo sviluppo cardiaco16. Quindi, abbiamo applicato questo approccio per valutare la maturazione strutturale della rete sarcomere in iPSC-CM misurando quantitativamente la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z.

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Protocol

Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali e adulti sono state eseguite secondo le linee guida etiche per la cura degli animali del Rostock University Medical Centre.

1. Coltivazione e dissociazione di cardiomiociti derivati da iPSC

  1. Differenziare i hiPSC-CM per 25 giorni utilizzando un metodo monostrato 2D come descritto in precedenza17.
  2. Dissociazione prebellico medio a 37 gradi centigradi e supporto a temperatura medio-ambiente.
  3. Lavare le celle due volte con PBS.
  4. Aggiungere il mezzo di dissociazione preriguero alle cellule e incubare per 12 min a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
  5. Aggiungere il supporto di supporto alle celle.
    NOTA: il volume del supporto aggiunto deve essere il doppio del volume del supporto di dissociazione utilizzato al punto 1.4.
  6. Spostare le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
  7. Cellule centrifughe a 200 x g per 5 min e risuspendere il pellet in 3 mL di coltura hiPSC-CM media17.
  8. Cellule di semi in 8 camere di fondo di vetro ben ad una densità cellulare di 75.000 cellule / bene e coltura per 3 giorni.

2. Isolamento cardiomiocato per adulti

  1. L'isolamento e la coltivazione di cardiomiociti adulti da topi NMRI è stato eseguito come riportato inprecedenza 18.
  2. Cellule di semi in 8 vetrate ben vetro e coltura per un giorno.

3. Isolamento e coltivazione di cardiomiociti neonatali

  1. La procedura di isolamento dei cardiomiociti neonatali, ottenuta dai topi NMRI, è stata eseguita come descritto inprecedenza 19.
  2. Seme isolato cella in 8 camera di vetro bene scivolare ad una densità cellulare di 75.000 cellule / bene e coltura per 3 giorni in coltura CM neonatalemedia 19.

4. Etichettatura dell'immunofluorescenza α-actinin

NOTA: Per ottenere risultati ottimali, le celle vengono colturate in 8 camere di fondo in vetro. L'etichettatura deve essere eseguita un giorno prima dell'imaging.

  1. Preguerra 4% PFA a 37 gradi centigradi.
  2. Fissare iPSC-CM aggiungendo il 4% di paraformaldeide direttamente nei supporti di coltura (diluizione 1:1) e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. La concentrazione finale di PFA per la fissazione è del 2%.
  3. Incubare le cellule fisse in 0,2% Tritone-X, diluite in PBS, per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule due volte con PBS, 5 min ciascuna.
  5. Aggiungere la soluzione 1% BSA (diluita in PBS) e incubare per 60 min a temperatura ambiente.
  6. Preparare 150 L della soluzione anticorpo primaria diluendo l'anticorpo α-actinin 1:100 in 1% BSA, contenente 0,05% Tritone-X. Aggiungere alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 60 min.
  7. Lavare le cellule due volte con una soluzione BSA dello 0,2%, 5 min ciascuna.
  8. Preparare 150 L della soluzione di anticorpi secondari diluendo l'anticorpo Alexa647 capra-anti-topo 1:100 in 1% BSA, contenente 0,05% Tritone-X. Aggiungere alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 40 min.
  9. Lavare le cellule due volte con una soluzione BSA dello 0,2%, 5 min ciascuna.
  10. Lavare le cellule due volte con PBS, 5 min ciascuna. Mantenere le cellule etichettate al buio a 4 gradi centigradi fino all'imaging PALM.

5. Preparazione del buffer di imaging PALM

NOTA: è fondamentale preparare di nuovo il buffer di imaging PALM per ogni esperimento.

  1. Preparare la soluzione del glucosio al 50% sciogliendo 25 g di glucosio in 50 mL di acqua distillata.
  2. Preparare tampone di base contenente 50 mM Tris-HCl, 10% glucosio e 10 mM di cloruro di sodio.
    1. Regolare il livello di pH a 8,0 usd utilizzando l'acido cloridrico.
  3. Preparare la soluzione di ossidazione piranosa sciogliendo 0,6 mg di ossidasi piranosa in 316 L di tampone di base.
  4. Preparare la soluzione catalasi sciogliendo 7 mg di catalasi in 500 L di tampone di base. Mescolare accuratamente e centrifugare a 10.000 x g per 3 min. Mantenere il supernatant per un ulteriore utilizzo. La soluzione catalasi può essere conservata a 4 gradi centigradi per diversi giorni.
  5. Preparare 500 L di buffer di imaging PALM mescolando 316 L di soluzione di ossidasi piranosa, 25 L di soluzione di catalasi, 100 L di soluzione di glucosio del 50%, 50 L di cisteamina, 5 l di cycloctatetraene e 3,5 L di β-Mercapoetanolo. L'attività catalitica finale dell'ossidasi e della catalasi dei piranosi deve essere rispettivamente di 7,5 U, 35.00U.
    NOTA: il buffer di imaging PALM fornisce condizioni di imaging ottimali per 3-5 h. Se la capacità lampeggiante del colorante fluorescente diminuisce, preparare un nuovo aliquot tampone.

6. Acquisizione di immagini PALM

  1. Accendere il microscopio almeno 3 h prima dell'uso e portare il campione a temperatura ambiente prima dell'imaging per consentire l'equilibrio termico. Se il microscopio è dotato di una camera di incubazione, regolare la temperatura a 30 gradi centigradi.
  2. Pulire l'obiettivo e il fondo del scivolo della camera utilizzando un solvente di pulizia appropriato.
  3. Aggiungere 300 L di buffer di imaging PALM in un pozzo di cellule etichettate e inserire il scorremento della camera nel supporto dello stadio del microscopio.
  4. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine PALM.
    1. Selezionare 1,57 N.A. 100x obiettivo di petrolio per l'acquisizione.
    2. Selezionare la modalità PALM e attivare le impostazioni TIRF.
    3. Regolare il numero di fotogrammi da acquisire. Di solito 5.000-10.000 fotogrammi sono sufficienti per ottenere risultati ottimali. Tuttavia, il numero di telai acquisiti dipende fortemente dall'efficienza di etichettatura e dalla capacità lampeggiante del colorante fluorescente e può essere regolato dall'utente.
    4. Impostare la potenza laser UV su 0,1% e 647 laser su 0,2%.
    5. Impostare il livello di guadagno su 50-100.
    6. Accendere l'illuminazione laser e selezionare una cella di destinazione. Il livello di guadagno può essere aumentato se l'intensità del segnale è bassa (a seconda dell'etichettatura di fluorescenza).
    7. Spegnere l'illuminazione laser
  5. Acquisizione di immagini PALM
    1. Ridurre il guadagno a 0 e aumentare la potenza del laser (ex 647) al 100%.
    2. Sbiancare la cella bersaglio per 5 s.
    3. Aumenta il guadagno a 50 e avvia l'acquisizione di immagini PALM.
      NOTA: il guadagno deve essere regolato per ottenere un'intensità del segnale sufficiente, mentre i pixel sovrasaturi devono essere evitati. Se l'intensità del segnale si riduce, aumentare il livello di guadagno.
  6. Facoltativamente, migliorare costantemente la potenza del laser UV (0,1%-10%) per aumentare l'intensità del segnale e per promuovere il lampeggiamento del fluoroforo.

7. Ricostruzione dei dati PALM

  1. Aprire il software Image J e importare i dati PALM.
  2. Aprire il plug-in Temporale e "Esegui analisi"
    1. Nel menu "Configurazione fotocamera" immettere le dimensioni in pixel e il guadagno EM.
      NOTA: quando si utilizzano obiettivi 100x e obiettivo di ingrandimento 1,6x, le dimensioni in pixel di 100 nm sono appropriate. Tuttavia, poiché la dimensione in pixel dipende dalle caratteristiche hardware del microscopio e della fotocamera utilizzate per l'imaging PALM, gli utenti devono controllare e adattare attentamente questo parametro. I valori di guadagno EM possono essere ottenuti dai metadati.
    2. Nel menu "Esegui analisi" impostare i parametri come segue: ordine B-spline: 3, scala B-spline: 2.0, soglia di intensità massima: stf(Wave.F1), raggio di adattamento: 3, sigma iniziale: 1.6, ingrandimento: 5.0, frequenza di aggiornamento: 50, spostamenti successivi: 2. Confermare facendo clic sul pulsante "OK".
  3. Post-elaborazione dell'immagine PALM ricostruita
    1. Nel menu "Istogramma distampa " selezionare ilparametro " Sigma".
    2. Utilizzare lo strumento"Rettangolo " per selezionare un ROI, escludendo i possibili artefatti e applicare il ROI al filtro. I valori del ROI verranno visualizzati nella casella di comando del filtro.
    3. Aggiungere "& incertezza <25" ai valori del ROI. Un possibile comando di filtro sarà simile al seguente: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incertezza < 25". Applicare i valori sigma selezionati.
    4. Nel menu"Rimuovi duplicati",immettere una soglia di distanza di "10 nm" e applicarlo.
    5. Nelmenu "Unione", impostarela distanza massima su "20", il numero massimo di fotogrammi per molecola su "0" e il numero massimo di fotogrammi su "1". Applicare le impostazioni.
    6. Nel menu "Correzione deriva", selezionare la correlazione incrociata e impostare " Numerodi collocazioni" su "5" e "Ingrandimento" su "5.0". Applicare le impostazioni di correzione della deriva.
    7. Salvare l'immagine PALM finale ed esportare i dati post elaborati, se lo si desidera.

8. Analisi dei filamenti di sarcomere

  1. Analisi della lunghezza del sarcomere
    1. Aprire il software Image J e importare l'immagine PALM ricostruita.
    2. Disegnare una linea tra le strutture sarcomere selezionate perpendicolari al disco z per misurare la distanza più breve tra i filamenti di actinino.
    3. Selezionare "Profilo distampa " nel menu" Analizza" e acquisire la lunghezza tra due picchi. Poiché la lunghezza del sarcomere può variare all'interno di una cella, un minimo di 20 sarcomere deve essere misurato in diverse aree della cellula bersaglio.
  2. Analisi dello spessore z-Disc
    1. Aprire il software Image J e importare l'immagine PALM ricostruita.
    2. Convertire l'immagine PALM ricostruita in un'immagine in modalità a 8 bit.
    3. Aprire il plugin di rilevamento della cresta e inserire i seguenti parametri: larghezza linea: 20, contrasto elevato: 230, contrasto basso: 10, sigma: 0,79, soglia inferiore: 25,84, lunghezza minima della linea: 20.
    4. Impostare "Stima larghezza ","Estendi riga" e " Visualizzarisultati".
    5. Fare clic su" OK" e utilizzare " Spessorelinea media" dalla tabella dei risultati per ulteriori analisi.

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Representative Results

Per stimare il grado di maturazione strutturale di CM, adulto neonatale, adulto completamente maturo, e iPSC CM sono stati inizialmente etichettati il CM con anticorpo α-actinin per visualizzare la rete di sarcomere. In seguito all'acquisizione di PALM, le immagini sono state ricostruite e lo spessore del disco z è stato misurato utilizzando un software di elaborazione delle immagini basato su plugin per il rilevamento automatico della larghezza dei singoli filamenti. La lunghezza del sarcomere è stata calcolata misurando la distanza tra due picchi di intensità adiacenti, corrispondenti ai filamenti vicini. La figura 1 mostra la valutazione dell'organizzazione sarcomere in CM derivato da iPSCs.

Come presentato nella Figura 2A, le cellule iPSC-CM e neonatali sono state trovate per esibire un modello α-actinin simile con strutture sarcomere irregolari e disarrangite. Allo stesso modo, la valutazione quantitativa ha dimostrato che la lunghezza e lo spessore dei filamenti α-actinina erano quasi identici, il che indica uno stato di sviluppo prematuro di iPSC CM. Più precisamente, la lunghezza media del sarcomere è stata di circa 1,83 m (adulto contro iPSC CM contro CM neonatale: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m contro 1,82±0,03 m, n-20 cellule), mentre lo spessore z-Disc era di circa 74 nm (adulto vs iPSC CM vs. CM neonatale: 71.30 ± 1,64 vs. 73.95 ± 0.86 nm vs. 74.08 ± 0.12 nm, n.20 celle) (Figura 2B). Al contrario, cm maturo adulto ha mostrato una rete di sarcomere regolare con una lunghezza di sarcomere leggermente aumentata e uno spessore z-Disc ridotto.

Il confronto tra l'imaging confocale convenzionale e la PALM non ha dimostrato alcuna differenza significativa di lunghezza del sarcomere (Figura2C) (confocale contro PALM: 1,75 ± 0,02 contro 1,70 ± 0,02, n.10 cellule). Tuttavia, è stato rilevato un profondo spessore z-Disc ridotto quando iPSC-CM sono stati sottoposti a imaging PALM (Figura 2C) (confocale vs PALM: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31, n.10 cellule). Le immagini rappresentative evidenziano il guadagno di risoluzione quando è stato applicato il PALM, supportato dai grafici di intensità corrispondenti (Figura 2D,E). Calcolato a larghezza intera a metà massima dell'intensità di fluorescenza ha rivelato che le strutture α-actinin sono più sottili di 3 volte nelle immagini PALM rispetto alla microscopia confocale standard (Figura 2E).

La microscopia di localizzazione di singole molecole, come PALM, consente il rilevamento di strutture intracellulari molto al di sotto del limite di diffrazione. Per garantire la massima risoluzione spaziale, sono necessarie condizioni di imaging appropriate per il rilevamento preciso della localizzazione di singole molecole. Il sistema di buffer di imaging utilizzato è fondamentale per questo processo di acquisizione in quanto influenza le proprietà fotofisiche del colorante fluorescente e, pertanto, ha un impatto significativo sulla risoluzione e precisione complessiva dell'immagine PALM finale. Il confronto tra buffer di alta qualità e buffer preparato un giorno prima dell'imaging ha rivelato una profonda differenza nello spessore del filamento (Figura 3A,B). Le strutture sarcomere acquisite con buffer di bassa qualità sembrano essere più spesse rispetto alle condizioni ottimali di imaging (Figura 3A). Infatti, la valutazione quantitativa ha mostrato che lo spessore dello z-Disc è stato aumentato del 65% (alta qualità rispetto alla bassa qualità: 73,87 ± 1,02 nm contro 113,9 ± 1,33 nm, n.155 filamenti)(Figura 3B). Questa mancanza di precisione dei dati è dovuta alla riduzione delle proprietà lampeggianti del fluoroforo che si traduce in fotoni meno rilevati per evento di localizzazione (alta e bassa qualità del buffer: 29689 fotoni/evento rispetto a 16422 fotoni/eventi) (Figura 3C). Inoltre, la precisione di localizzazione viene ridotta in condizioni di imaging deteriorate (alta qualità e bassa qualità: 14,25 ± 5,85 nm contro 19,56 ± 6,7 nm), che riduce la risoluzione complessiva dell'immagine PALM ricostruita (Figura 3C).

Inoltre, la deriva del campione, ad esempio, causata dall'instabilità termica, può influenzare la localizzazione precisa delle molecole fluorescenti e si traduce in immagini sfocate, come illustrato nella figura 3D. Mentre l'imaging PALM ottimale offre picchi di intensità chiari e ben definiti, un'eccessiva deriva del campione produce un modello di intensità irregolare che rende difficile determinare con precisione la distanza tra due filamenti adiacenti. Questi dati evidenziano l'importanza di condizioni di imaging strettamente controllate nella microscopia di localizzazione di singole molecole, poiché anche i cambiamenti sottili durante il processo di acquisizione possono ridurre drasticamente la qualità dell'immagine e la precisione dei dati.

Figure 1
Figura 1: valutazione dell'organizzazione sarcomere in CM derivato da iPSCs.
La rete di sarcomere è stata etichettata fluorescentemente con α anticorpo antia-actina, seguito dall'acquisizione di immagini PALM. La ricostruzione successiva porta all'immagine PALM finale utilizzata per l'analisi quantitativa. La lunghezza dei singoli sarcomere è stata determinata misurando la distanza tra due picchi di intensità corrispondenti ai filamenti di sarcomere vicini (1-5). Lo spessore del disco z è stato calcolato automaticamente da uno strumento di elaborazione delle immagini basato su plug-in. Barra della scala 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: confronto quantitativo dello spessore dello z-disco e della lunghezza del sarcomere in CM derivato da iPSC, tessuto cardiaco adulto e neonatale.
(A) Ricostruite le immagini PALM della α-actinin di iPSC e CM neonatale. (B) La valutazione quantitativa ha rivelato che tutte le misure neonatali e condividono un'elevata somiglianza nella lunghezza del sarcomere (adulto vs. iPSC CM vs. CM neonatale: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m contro 1,82±0,03 m) e spessore dei filamenti individuali (adulti vs. CM neonatale: 71,30 ± 1,64 contro 73,95 ± 0,86 nm contro 74,08 ± 0,12 nm), che indica il fenotipo prematuro di iPSC CM. (C) Confronto tra lunghezza sarcomere e spessore z-disc tra imaging confocale convenzionale e acquisizione di dati basati su PALM. Poiché la lunghezza del sarcomere è stata determinata misurando la distanza da picco a picco, l'impatto di una maggiore risoluzione sulla precisione dei dati è stato meno pronunciato (confocale contro PALM: 1,75 ± 0,02 contro 1,70 ± 0,02). Al contrario, è stato rilevato uno spessore z-Disc significativamente inferiore quando è stato applicato IL PALM (confocale contro PALM: 224,71 ± 4,31 contro 73,91 ± 1,31). (D) Immagini microscopiche rappresentative di iPSC-CM ottenute mediante imaging confocale e PALM. (E) Tracciati di intensità di fluorescenza corrispondenti alla linea rossa mostrata in (D). I valori rappresentano l'intera larghezza a metà dell'intensità massima della fluorescenza, indicando un profondo aumento della risoluzione nelle immagini PALM. I dati sono presentati come ± SEM, n 10-20 cellule, 20 sarcomere per cellula sono stati valutati. La significatività statistica è stata determinata utilizzando students t -Test.

Figure 3
Figura 3: Impatto della qualità del buffer e deriva del campione sull'accuratezza e l'affidabilità dei dati.
(A) Immagini PALM rappresentative di CM derivato da iPSC acquisite in diverse condizioni di imaging. I filamenti di sarcomere appaiono più spessi nei campioni che sono stati immagini con buffer di bassa qualità. Le linee rosse indicano la misurazione rappresentativa della lunghezza del sarcomere, mentre le strutture di filamento verde sono state incluse nell'analisi z-Disco. (B) La valutazione quantitativa ha confermato una differenza significativa nello spessore dello z-Disc tra buffer di bassa e alta qualità (alta e bassa qualità del buffer: 73,87 ± 1,02 nm rispetto. 113.9 ± 1,34 nm) (C) Questa differenza nella precisione dell'immagine si basava su una ridotta capacità di lampeggiamento del fluoroforo, che portava a un numero ridotto di fotoni rilevati per molecola (alta e bassa qualità del buffer: 29689 fotoni/eventi rispetto a 16422 fotoni/eventi). Allo stesso tempo, la precisione di localizzazione è diminuita, abbassando a sua volta la risoluzione complessiva (alta rispetto alla bassa qualità del buffer: 14,25 ± 5,85 rispetto a 19,56 ± 6,7) (D)Allo stesso modo, un'eccessiva deriva del campione può compromettere la qualità dell'immagine. Mentre una corretta acquisizione dell'immagine senza deriva del campione si traduce in picchi di intensità ben definiti di filamenti α-actinini, una maggiore deriva del campione provoca un modello di intensità irregolare, che influenza fortemente l'analisi accurata della lunghezza del sarcomere. I dati sono presentati come ± seM. La significatività statistica è stata determinata utilizzando gli studenti t-Test. Barra della scala 10m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La generazione di CM in vitro funzionale derivata da iPSC è importante per le terapie rigenerative, la modellazione delle malattie e lo sviluppo di piattaforme di screening farmacologico. Tuttavia, la maturità insufficiente di questi CM è un ostacolo importante nella ricerca cardiovascolare20. A questo proposito, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione che consentano il monitoraggio dello stato di maturazione strutturale del CM derivato da iPSC. Allo stesso tempo, la microscopia a super risoluzione può essere uno strumento prezioso per analizzare con precisione la funzione di proteine specifiche, necessarie per una corretta formazione di sarcomere come recentemente dimostrato per titina e troponina10,21,22.

Nell'attuale protocollo, presentiamo un approccio basato su PALM per valutare quantitativamente la maturazione strutturale di iPSC CM analizzando la rete di sarcomere α-actinin.

Rispetto alla microscopia leggera convenzionale, PALM consente la visualizzazione di strutture cellulari con una risoluzione di 20-50 nm23. Così, permette di rilevare anche sottili alterazioni della rete sarcome cardiaca che sono a malapena o nemmeno rilevabili da approcci di microscopia leggera classica. Applicando PALM, abbiamo misurato una lunghezza media del sarcomere di 1,84 m in iPSC e CM neonatale(Figura 2). Ciò è in linea con diversi rapporti precedenti che mostrano che la dimensione dei singoli sarcomere è di1,7-2,0 m 24,25,26. Rispetto alla lunghezza del sarcomere, una stima precisa dello spessore delle linee z è più complicata in quanto la sua dimensione è molto al di sotto del limite di risoluzione classica della microscopia leggera. Utilizzando la microscopia elettronica, studi precedenti hanno rivelato che lo spessore z-Disc varia da 50 a 80 nm in iPSC CM, che è simile al rilevamento basato su PALM di 73 nm (Figura 2).

Il confronto con la microscopia confocale standard ha dimostrato il drammatico aumento della risoluzione quando è stato applicato il PALM. Abbiamo trovato uno spessore z-Disc inferiore di 3 volte, dopo l'imaging PALM (Figura 2). Tuttavia, nessuna differenza significativa è stata misurata per la lunghezza del sarcomere. Poiché questo parametro viene misurato rilevando la distanza da picco a picco dei grafici di intensità, l'effetto di una maggiore risoluzione è meno pronunciato.

Per ottenere questa elevata risoluzione spaziale, PALM richiede condizioni di imaging ben definite che devono essere affrontate con attenzione dall'utente. Per una localizzazione accurata di singole molecole, sono necessari fluorofori che possiedono proprietà fotofisiche speciali, consentendo un rapido passaggio tra stato fluorescente e scuro, chiamatolampeggiante 27. Come dimostrato in precedenza, la selezione di fluorofori può influenzare fortemente la qualitàdell'immagine 28. Una profonda capacità lampeggiante è stata descritta per Alexa 647, uno dei coloranti migliori e ampiamente utilizzati per la microscopia di localizzazione di singole molecole29,30,31. Tuttavia, poiché sono disponibili numerosi fluorofori PALM, gli utenti avranno un'elevata flessibilità in termini di etichettaturacampione 27,28.

Oltre alla selezione di fluoroforo adatto, il sistema di buffer di imaging è un altro punto critico nell'imaging PALM in quanto detta le proprietà fotofisiche del colorante fluorescente. Abbiamo applicato l'ossidasi piranosa come sistema di scavenger di ossigeno che è superiore all'ossidasi del glucosio in quanto fornisce una maggiore stabilità del pH, quindi, consentendo l'imaging a lungo termine senza una significativa diminuzione del fluoroforo lampeggiante nel tempo32,33. Tuttavia, poiché la durata del buffer di imaging è limitata a diverse ore, deve essere preparata per ogni esperimento per garantire un'elevata riproducibilità. I nostri risultati dimostrano una drastica diminuzione della precisione dei dati dopo l'imaging PALM con buffer di bassa qualità, che porta a una capacità di lampeggiamento ridotta e a una minore precisione di localizzazione (Figura 3A-C).

Inoltre, la stabilità termica del sistema di imaging è obbligatoria per evitare una maggiore deriva del campione. Mentre la deriva moderata può essere corretta mediante l'analisi computazionale, un eccessivo movimento del campione porta a una localizzazione errata dei fluorofori rilevati e riduce la qualità dell'immagine e l'accuratezza dei dati. Questo può essere evitato utilizzando microscopi con camere di riscaldamento e sufficiente equilibrio termico del rispettivo campione prima di avviare l'imaging PALM. Inoltre, è necessario considerare l'etichettatura della densità e dell'efficienza, nonché l'uso di frammenti di anticorpi o nanocorpi per ottimizzare le condizioni di imaging34,35,36.

Il processo di acquisizione di grandi strutture cellulari può richiedere 10-30 min, a seconda dei parametri di imaging (campo di vista, sonda fluorescente, buffer di imaging ecc.). Questo lungo tempo di acquisizione è uno svantaggio di PALM che lo rende meno appropriato per l'imaging delle cellule vive. In genere, 5.000-10.000 fotogrammi vengono acquisiti per ottenere un numero adeguato di eventi lampeggianti con alta precisione di localizzazione. Inoltre, la profondità di imaging è di solito limitata a poche centinaia di nanometri, il che rende difficile studiare campioni più spessi. Tuttavia, una risoluzione avanzata nella direzione z può essere ottenuta con un setup 3D PALM37.

Abbiamo selezionato due parametri per caratterizzare la α-actinin di iPSC CM, tra cui la lunghezza del sarcomere e lo spessore z-Disc. Ulteriori funzionalità potrebbero essere raccolte per ottenere una visione più completa dello scaffold del sarcome, come l'orientamento del filamento. Allo stesso modo, 3D PALM può aiutare ad analizzare quantitativamente l'intera struttura del sarcomere stimando i nodi e le filiali presenti all'interno della rete.

Anche se PALM consente un'analisi molto dettagliata della struttura del sarcomere, questo metodo non consente l'acquisizione di parametri funzionali come la contrattilità cellulare, che è un'altra caratteristica importante per valutare la maturità cardiaca. Gli ex rapporti hanno dimostrato che la valutazione basata sulla microscopia della struttura del sarcomere può essere combinata con l'analisi video per ottenere datifunzionali 38,39. Tuttavia, poiché gli autori hanno utilizzato la microscopia a fluorescenza convenzionale ottenuta dati sulla struttura del sarcomere sono meno precisi se confrontati con PALM. Il nostro approccio offre anche la possibilità di correlare i dati PALM con le precedenti registrazioni time lapse e quindi consente l'acquisizione di misurazioni di contrazione.

In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo per valutare quantitativamente la maturazione strutturale della rete di sarcomere in CM. Utilizzando questo approccio basato sulla super risoluzione, è possibile stabilire strategie mirate a un miglioramento dello sviluppo cardiaco di CM derivato da iPSC per ottenere un fenotipo più adulto.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo strutturale dell'UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Inoltre, H.L. è supportato dal programma FORUN del Rostock University Medical Centre (889001 e 889003) e dalla Fondazione Josef e K'the Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. è supportato dal Programma Scienziato Cliniciano del Rostock University Medical Center. R.D è supportato dal DFG (DA1296/6-1), dalla fondazione DAMP, dalla German Heart Foundation (F/01/12) e dal BMBF (VIP 00240).

Ringraziamo Madeleine Bartsch per il suo supporto tecnico nella coltura cellulare iPSC e nella differenziazione cardiaca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

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References

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Biologia Numero 165 cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo cardiomiocito super risoluzione maturazione rete di sarcomere microscopia di localizzazione fotoattivata
Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola
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Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

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