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Biology

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

La formation d’un réseau de sarcomère approprié est importante pour la maturation des cardiomyocytes dérivés d’iPSC. Nous présentons une approche super résolution qui permet l’évaluation quantitative de la maturation structurelle des cardiomyocytes dérivés de cellules souches, afin d’améliorer les conditions de culture favorisant le développement cardiaque.

Abstract

La maturation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC est un problème critique pour leur application dans la thérapie régénérative, le dépistage des drogues et la modélisation de la maladie. Malgré le développement de multiples protocoles de différenciation, la génération de cardiomyocytes iPSC ressemblant à un phénotype semblable à un adulte demeure difficile. Un aspect majeur de la maturation des cardiomyocytes implique la formation d’un réseau sarcomère bien organisé pour assurer une grande capacité de contraction. Ici, nous présentons une approche super résolution-basée pour l’analyse semi-quantitative du réseau de α-actinine dans les cardiomyocytes. À l’aide d’une microscopie de localisation photoactivée, une comparaison de la longueur du sarcomère et de l’épaisseur du disque z des cardiomyocytes et des cellules cardiaques dérivés de l’iPSC, isolées du tissu néonatal, a été effectuée. En même temps, nous démontrons l’importance de conditions d’imagerie appropriées pour obtenir des données fiables. Nos résultats montrent que cette méthode est appropriée pour surveiller quantitativement la maturité structurelle des cellules cardiaques à haute résolution spatiale, permettant la détection de changements même subtils de l’organisation du sarcomere.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MALADIES cardiovasculaires) telles que l’infarctus du myocarde ou la cardiomyopathie demeurent la principale cause de décès dans le monde occidental1. Comme le cœur humain ne possède qu’une faible capacité de régénération, il est nécessaire de stratégies pour promouvoir la récupération des maladies cardiovasculaires. Cela comprend les thérapies de remplacement cellulaire pour reconstituer les cardiomyocytes perdus (CM), ainsi que le développement de nouveaux médicaments anti-arythmiques pour une intervention pharmaceutique efficace et sûre. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) se sont avérées être une source de cellules prometteuses pour la génération illimitée de CM humain in vitro, adaptée aux thérapies régénératrices, à la modélisation de la maladie, et au développement d’essais de dépistage des médicaments2,3,4.

Bien qu’il existe de nombreux protocoles de différenciation cardiaque différents, cm dérivé de l’iPSC manquent encore certains aspects phénotypiques et fonctionnels qui entravent l’application in vitro et in vivo5,6. À côté des changements électrophysiologiques, métaboliques et moléculaires, le processus de maturation cardiaque implique l’organisation structurelle des sarcomeres, qui sont les unités fondamentales requises pour la génération de force et la contraction cellulaire7. Alors que les CM adultes présentent un appareil contractile bien organisé, les CM dérivés d’iPSC démontrent généralement des filaments de sarcomères désarrangés, associés à une capacité de contraction réduite et à une dynamique de contraction altérée8,9. Contrairement à cm mature qui montrent le modèle de contraction uniaxiale, les structures désorientées dans cm immatures a comme conséquence une contraction radiale de la cellule entière ou favorisent l’apparition des points focaux de contraction9,10.

Pour améliorer la maturation cardiaque, de multiples approches ont été appliquées, y compris les méthodes de culture cellulaire 3D, la stimulation électrique et mécanique, ainsi que l’utilisation de matrices extracellulaires imitant les conditions in vivo11,12,13. Pour évaluer le succès et l’efficacité de ces différentes conditions culturelles, des techniques sont nécessaires pour surveiller et estimer le degré de maturation structurelle de l’iPSC CM, par exemple, par des techniques microscopiques. Contrairement à l’imagerie confocale conventionnelle, la résolution en cas de microscopie de localisation photoactivée (PALM) est environ 10x plus élevée. Cette technique permet à son tour une analyse plus précise, détectant même des altérations subtiles des structures cellulaires14. Compte tenu de la haute résolution de l’imagerie basée sur PALM, l’objectif global de cette méthode était l’évaluation microscopique de la maturité sarcomère dans les CM dérivés d’iPSC par une détermination précise de l’épaisseur du z-Disc et de la longueur du sarcomère. Dans des études antérieures, ces caractéristiques structurelles se sont avérées être des paramètres appropriés pour évaluer la maturité cardiaque15. Par exemple, iPSC-CM malade manquant de dystrophine pleine longueur présentent une longueur de sarcomère réduite et la largeur de la bande z par rapport aux cellules de type sauvage16. De même, la longueur des sarcomeres individuels a été mesurée pour étudier l’impact des signaux topographiques sur le développement cardiaque16. Par conséquent, nous avons appliqué cette approche pour évaluer la maturation structurelle du réseau sarcomère dans iPSC-CM en mesurant quantitativement la longueur du sarcomère et l’épaisseur du disque z.

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Protocol

Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales et adultes ont été effectuées conformément aux lignes directrices éthiques pour les soins aux animaux du Centre médical de l’Université Rostock.

1. Culture et dissociation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC

  1. Différenciez hiPSC-CM pendant 25 jours à l’aide d’une méthode de monocouche 2D comme décrit précédemment17.
  2. Préwarm dissociation moyenne à 37 °C et soutenir la température moyenne à la température ambiante.
  3. Laver les cellules deux fois avec PBS.
  4. Ajouter le milieu de dissociation préguerre aux cellules et incuber pendant 12 min à 37 °C et 5 % de CO2.
  5. Ajoutez un support aux cellules.
    REMARQUE : Le volume du support supplémentaire doit être deux fois plus élevé que le volume de milieu de dissociation utilisé à l’étape 1.4.
  6. Déloger les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
  7. Cellules de centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et resuspendent le granulé dans 3 mL de milieu de culture hiPSC-CM17.
  8. Cellules de semence dans 8 chambres de fond de verre de puits à une densité cellulaire de 75.000 cellules/puits et culture pendant 3 jours.

2. Isolement cardiomyocyte adulte

  1. L’isolement et la culture des cardiomyocytes adultes de souris NMRI ont été exécutés comme rapporté précédemment18.
  2. Cellules de graines dans 8 toboggan de chambre de verre de puits et la culture pendant une journée.

3. Isolement et culture des cardiomyocytes néonatals

  1. La procédure d’isolement des cardiomyocytes néonatals, obtenus de souris de NMRI, a été exécutée comme décrit précédemment19.
  2. Cellules isolées de graine dans la glissière de chambre de verre de 8 puits à une densité cellulaire de 75.000 cellules/puits et la culture pendant 3 jours dans le milieu néonatal de culture de CM19.

4. Étiquetage de l’immunofluorescence du réseau α-actinine

REMARQUE : Pour des résultats optimaux, les cellules sont cultivées dans 8 chambres de fond de verre de puits. L’étiquetage doit être effectué un jour avant l’imagerie.

  1. Préguerre 4% PFA à 37 °C.
  2. Fixer iPSC-CM en ajoutant 4% de paraformaldéhyde directement dans le milieu de culture (dilution 1:1) et incuber à 37 °C pendant 15 min. La concentration finale de PFA pour la fixation est de 2%.
  3. Incuber les cellules fixes dans 0,2% Triton-X, diluées en PBS, pendant 5 min à température ambiante.
  4. Laver les cellules deux fois avec pbs, 5 min chacun.
  5. Ajouter 1% de solution BSA (diluée en PBS) et incuber pendant 60 min à température ambiante.
  6. Préparer 150 μL de solution d’anticorps primaires en diluant α-actinine anticorps 1:100 dans 1% BSA, contenant 0,05% Triton-X. Ajouter aux cellules et incuber à température ambiante pendant 60 min.
  7. Laver les cellules deux fois avec 0,2% de solution BSA, 5 min chacune.
  8. Préparer 150 μL de solution d’anticorps secondaires en diluant l’anticorps Alexa647 de chèvre-souris 1:100 dans 1% BSA, contenant 0.05% Triton-X. Ajouter aux cellules et incuber à température ambiante pendant 40 min.
  9. Laver les cellules deux fois avec 0,2% de solution BSA, 5 min chacune.
  10. Laver les cellules deux fois avec pbs, 5 min chacun. Gardez les cellules étiquetées dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’imagerie PALM.

5. Préparation de la mémoire tampon d’imagerie PALM

REMARQUE : Il est essentiel de préparer fraîchement la mémoire tampon d’imagerie PALM pour chaque expérience.

  1. Préparer une solution de glucose à 50 % en dissolvant 25 g de glucose dans 50 mL d’eau distillée.
  2. Préparer un tampon de base contenant 50 mM Tris-HCl, 10% de glucose et 10 mM de chlorure de sodium.
    1. Ajuster le niveau de pH à ~8.0 à l’aide d’acide chlorhydrique.
  3. Préparer la solution de pyranose oxydase en dissolvant 0,6 mg de pyranose oxydase dans 316 μL de tampon de base.
  4. Préparer la solution de catalase en dissolvant 7 mg de catalase dans 500 μL de tampon de base. Bien mélanger et centrifuger à 10 000 x g pendant 3 min. Gardez le supernatant pour une utilisation ultérieure. La solution Catalase peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs jours.
  5. Préparer 500 μL de tampon d’imagerie PALM en mélangeant 316 μL de solution de pyranose oxidase, 25 μL de solution de catalase, 100 μL de solution de glucose de 50%, 50 μL de cystéamine, 5 μL de cyclooctatetraène et 3,5 μL de β-Mercaptoethanol. L’activité catalytique finale de la pyranose oxidase et de la catalase doit être de 7,5 U, 35,00U respectivement.
    REMARQUE : La mémoire tampon d’imagerie PALM fournit des conditions d’imagerie optimales pour 3-5 h. Si la capacité de clignotement du colorant fluorescent diminue, préparez un nouvel aliquot tampon.

6. Acquisition d’image PALM

  1. Allumez le microscope au moins 3 h avant l’utilisation et apportez l’échantillon à la température ambiante avant l’imagerie pour permettre l’équilibre thermique. Si le microscope est équipé d’une chambre d’incubation, ajuster la température à 30 °C.
  2. Nettoyez l’objectif et le fond de la glissière de chambre à l’aide d’un solvant de nettoyage approprié.
  3. Ajoutez 300 μL de tampon d’imagerie PALM dans un puits de cellules étiquetées et insérez la lame de chambre dans le support de scène du microscope.
  4. Définissez les paramètres d’acquisition d’images PALM.
    1. Sélectionnez l’objectif d’exploitation de l’huile 1.57 N.A. 100x pour l’acquisition.
    2. Sélectionnez le mode PALM et activez les paramètres TIRF.
    3. Ajuster le nombre d’images à acquérir. Habituellement 5 000-10 000 images sont suffisantes pour obtenir des résultats optimaux. Toutefois, le nombre de cadres acquis dépend fortement de l’efficacité de l’étiquetage et de la capacité de clignotement du colorant fluorescent et peut être ajusté par l’utilisateur.
    4. Réglez la puissance du laser UV à 0,1 % et 647 laser à 0,2 %.
    5. Réglez le niveau de gain à 50-100.
    6. Allumez l’éclairage laser et sélectionnez une cellule cible. Le niveau de gain peut être augmenté si l’intensité du signal est faible (selon l’étiquetage de fluorescence).
    7. Éteindre l’éclairage laser
  5. Acquisition d’images PALM
    1. Réduire le gain à 0 et augmenter la puissance laser (ex 647) à 100%.
    2. Blanchir la cellule cible pour ~5 s.
    3. Augmentez le gain à 50 et commencez l’acquisition d’image PALM.
      REMARQUE : Le gain doit être ajusté pour obtenir une intensité de signal suffisante, tandis que les pixels sursaturés doivent être évités. Si l’intensité du signal diminue, augmentez le niveau de gain.
  6. En option, augmenter progressivement la puissance du laser UV (0,1%-10%) pour augmenter l’intensité du signal et pour favoriser le clignotement du fluorophore.

7. Reconstruction des données PALM

  1. Ouvrez le logiciel Image J et importez des données PALM.
  2. Open Thunderstorm Plugin et "Run analysis»
    1. Dans le menu «Configuration de l’appareil photo», entrez la taille des pixels et le gain EM.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez des objectifs 100x et une lentille de grossissement de 1,6 x, la taille de 100 nm est appropriée. Toutefois, comme la taille du pixel dépend des caractéristiques matérielles du microscope et de la caméra utilisées pour l’imagerie PALM, les utilisateurs doivent vérifier et adapter soigneusement ce paramètre. Les valeurs de gain EM peuvent être obtenues à partir des métadonnées.
    2. Dans le menu "Exécuter l’analyse" définir les paramètres comme suit: B-spline ordre: 3, échelle B-spline: 2.0, seuil d’intensité de pointe: stf(Wave.F1), rayon d’ajustement: 3, sigma initial: 1.6, grossissement: 5.0, fréquence de mise à jour: 50, décalages latéraux: 2. Confirmer en cliquant sur le bouton "Ok« .
  3. Post-traitement de l’image PALM reconstruite
    1. Dans le menu "Plot histogramme« , sélectionnez le paramètre "Sigma« .
    2. Utilisez l’outil «Rectangle» pour sélectionner un retour sur investissement, à l’exclusion des artefacts possibles et appliquer le retour sur investissement sur le filtre. Les valeurs de retour sur investissement s’affichent dans la zone de commande du filtre.
    3. Ajoutez "& incertitude <25" aux valeurs de retour sur investissement. Une commande de filtre possible ressemblera à ceci : « sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incertitude <25 « . Appliquez des valeurs sigma sélectionnées.
    4. Dans le menu «Supprimer les doublons», entrez un seuil de distance de « 10 nm » et appliquez.
    5. Dans le menu "Fusion « ,définissez la distance maximale à " 20 « , les cadres maximum par molécule à " 0 " et le maximum des cadres à " 1 « . Appliquez les paramètres.
    6. Dans le menu "Correction dedérive « , sélectionnez corrélation croisée et définissez " Nombre debacs" sur " 5 " et "Grossissement" sur " 5.0 « . Appliquez des paramètres de correction de dérive.
    7. Enregistrez l’image PALM finale et exportez les données traitées après l’exportation si vous le souhaitez.

8. Analyse des filaments de sarcomère

  1. Analyse de la longueur du sarcomère
    1. Ouvrez le logiciel Image J et importez l’image PALM reconstruite.
    2. Tracer une ligne entre les structures de sarcomère sélectionnées perpendiculaires au disque z pour mesurer la distance la plus courte entre les filaments d’actinine.
    3. Sélectionnez "Plot profile" dans le menu "Analyser" et acquérir la longueur entre deux pics. Comme la longueur du sarcomère peut varier au sein d’une cellule, un minimum de 20 sarcomeres doit être mesuré dans différentes zones de la cellule cible.
  2. Analyse de l’épaisseur du disque z
    1. Ouvrez le logiciel Image J et importez l’image PALM reconstruite.
    2. Convertissez l’image PALM reconstruite en image en mode 8 bits.
    3. Ouvrez le plugin de détection de crête et entrez les paramètres suivants : largeur de ligne : 20, contraste élevé : 230, contraste bas : 10, sigma : 0,79, seuil inférieur : 25,84, longueur minimale de ligne : 20.
    4. Définir "Estimation largeur« , "Extend line" et " Displayresults« .
    5. Cliquez sur "Ok" et utilisez "Largeur moyennede ligne " à partir du tableau des résultats pour d’autres analyses.

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Representative Results

Pour estimer le degré de maturation structurelle de CM, néonatal, adulte pleinement mature, et iPSC CM ont été initialement étiquetés le CM avec α-actinine anticorps pour visualiser le réseau sarcomère. Après l’acquisition de PALM, les images ont été reconstruites, et l’épaisseur du disque z a été mesurée à l’aide d’un logiciel de traitement d’image à base de plugins pour la détection automatique de la largeur des filaments individuels. La longueur du sarcomère a été calculée en mesurant la distance entre deux pics d’intensité adjacents, correspondant aux filaments voisins. La figure 1 montre l’évaluation de l’organisation sarcomère dans les CM dérivés d’iPSC.

Comme présenté dans la figure 2A, iPSC-CM et les cellules néonatales se sont avérées présenter un modèle similaire de α-actinine avec des structures irrégulières et désarrangées de sarcomere. De même, l’évaluation quantitative a démontré que la longueur et l’épaisseur des filaments d’actinine α étaient presque identiques, ce qui indique un état de développement prématuré de la CM iPSC. Plus précisément, la longueur moyenne du sarcomere était d’environ 1,83 μm (adulte vs iPSC CM vs CM néonatal : 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm contre 1,82±0,03 μm, n=20 cellules), tandis que l’épaisseur du disque z était d’environ 74 nm (adulte vs iPSC CM vs CM néonatal : 71,30 ± 1,64 contre 73,95 ± 0,86 nm contre 74,08 ± 0,12 nm, n=20 cellules) (Figure 2B). En revanche, cm adulte mature a montré un réseau régulier de sarcomere avec la longueur légèrement accrue de sarcomere et l’épaisseur réduite de z-Disque.

La comparaison de l’imagerie confocale conventionnelle et de PALM n’a démontré aucune différence significative de longueur de sarcomère (figure 2C) (confocale vs PALM : 1,75 ± 0,02 vs 1,70 ± 0,02, n=10 cellules). Cependant, une épaisseur réduite profonde de z-Disc a été détectée lorsque l’iPSC-CM a été soumise à l’imagerie PALM (Figure 2C) (confocale vs PALM : 224,71 ± 4,31 vs 73,91 ± 1,31, n=10 cellules). Les images représentatives mettent en évidence le gain de résolution lors de l’application de PALM, soutenue par des parcellesd’intensitécorrespondantes ( Figure 2D,E). La largeur totale calculée à un demi-maximum de l’intensité de fluorescence a révélé que les structures α-actinine sont ~3 fois plus minces dans les images PALM si on la compare à la microscopie confocale standard (figure 2E).

La microscopie de localisation à molécule unique, comme PALM, permet de détecter des structures intracellulaires bien en dessous de la limite de diffraction. Pour assurer une résolution spatiale maximale, des conditions d’imagerie appropriées sont nécessaires pour la détection précise de la localisation des molécules uniques. Le système tampon d’imagerie utilisé est essentiel pour ce processus d’acquisition car il influence les propriétés photophysiques du colorant fluorescent et, par conséquent, a un impact significatif sur la résolution globale et la précision de l’image finale PALM. La comparaison entre le tampon de haute qualité et le tampon préparé un jour avant l’imagerie a révélé une différence profonde dansl’épaisseurdu filament ( figure 3A,B). Les structures sarcomères acquises avec tampon de faible qualité semblent être plus épaisses par rapport aux conditions d’imagerie optimales (figure 3A). En effet, l’évaluation quantitative a montré que l’épaisseur du disque z a été augmentée d’environ 65 % (haute qualité par rapport à une faible qualité : 73,87 ± 1,02 nm contre 113,9 ± 1,33 nm, n=155 filaments) (figure 3B). Ce manque de précision des données est dû à la réduction des propriétés clignotantes du fluorophore qui se traduit par des photons moins détectés par événement de localisation (haute par rapport à la faible qualité tampon : 29689 photons/événement vs 16422 photons/événements) (Figure 3C). De plus, la précision de localisation est diminuée dans des conditions d’imagerie détériorées (haute qualité par rapport à une faible qualité : 14,25 ± 5,85 nm contre 19,56 ± 6,7 nm), ce qui réduit la résolution globale de l’image PALM reconstruite (figure 3C).

En outre, la dérive de l’échantillon, par exemple, causée par l’instabilité thermique, peut affecter la localisation précise des molécules fluorescentes et entraîner des images floues, comme présenté à la figure 3D. Bien que l’imagerie PALM optimale donne des pics d’intensité clairs et bien définis, la dérive excessive de l’échantillon produit un modèle d’intensité irrégulière qui rend difficile de déterminer avec précision la distance entre deux filaments adjacents. Ces données soulignent l’importance des conditions d’imagerie étroitement contrôlées dans la microscopie de localisation d’une seule molécule, car même des changements subtils au cours du processus d’acquisition peuvent diminuer considérablement la qualité de l’image et la précision des données.

Figure 1
Figure 1 : Évaluation de l’organisation sarcomère dans les CM dérivés des IPSC.
Le réseau sarcomère a été étiqueté fluorescent avec un anticorps α-actinine, suivi de l’acquisition d’image PALM. La reconstruction ultérieure conduit à l’image finale palm qui a été utilisée pour l’analyse quantitative. La longueur des sarcomeres individuels a été déterminée en mesurant la distance entre deux pics d’intensité correspondant aux filaments voisins de sarcomere (1-5). L’épaisseur du disque Z a été automatiquement calculée par un outil de traitement d’image basé sur le plugin. Barre d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison quantitative de l’épaisseur du disque z et de la longueur du sarcomère en CM dérivée des iPSC, des tissus cardiaques adultes et néonatals.
(A) Images PALM reconstruites du réseau α-actinine d’iPSC et de CM néonatal. (B) L’évaluation quantitative a révélé que toutes les caractéristiques néonatales et partagent une forte similitude dans la longueur du sarcomere (adulte vs iPSC CM vs CM néonatal : 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm contre 1,82±0,03 μm) et l’épaisseur des filaments individuels (vs adulte iPSC VS CM vs. CM néonatal : 71,30 ± 1,64 vs 73,95 ± 0,86 nm contre 74,08 ± 0,12 nm), indiquant le phénotype prématuré de l’iPSC CM. (C) Comparaison de la longueur du sarcomère et de l’épaisseur du disque conventionnel entre l’imagerie confocale et l’acquisition de données basées sur PALM. Comme la longueur du sarcomere a été déterminée en mesurant la distance de pointe au sommet, l’impact d’une résolution accrue sur la précision des données a été moins prononcé (confocal vs PALM : 1,75 ± 0,02 contre 1,70 ± 0,02). En revanche, une épaisseur significativement plus faible de z-Disc a été détectée lors de l’application de PALM (confocale vs PALM : 224,71 ± 4,31 contre 73,91 ± 1,31). (D) Images microscopiques représentatives d’iPSC-CM obtenues par l’imagerie confocale et PALM. (E) Parcelles d’intensité de fluorescence correspondant à la ligne rouge indiquée dans (D). Les valeurs représentent la largeur totale à la moitié maximum de l’intensité de fluorescence, ce qui indique une augmentation profonde de la résolution dans les images PALM. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM, n=10-20 cellules, 20 sarcomeres par cellule ont été évaluées. La signification statistique a été déterminée à l’aide des élèves t-Test. **p<0.005, Barre d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Incidence de la qualité des tampons et de la dérive des échantillons sur la précision et la fiabilité des données.
(A) Images PALM représentatives de CM dérivé d’iPSC acquises dans différentes conditions d’imagerie. Les filaments de sarcomère semblent plus épais dans les échantillons qui ont été photographiés avec tampon de faible qualité. Les lignes rouges indiquent une mesure représentative de la longueur du sarcomère, tandis que les structures de filament vert ont été incluses dans l’analyse de z-Disc. (B) L’évaluation quantitative a confirmé une différence significative dans l’épaisseur du disque z entre la mémoire tampon de faible et de haute qualité (haute par rapport à la faible qualité tampon : 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm) (C)Cette différence de précision de l’image était basée sur une capacité de clignotement réduite du fluorophore, conduisant à une réduction du nombre de photons détectés par molécule (haute par rapport à faible qualité tampon : 29689 photons/événement vs 16422 photons/événements). Dans le même temps, la précision de localisation a diminué, ce qui a réduit la résolution globale (haute par rapport à la faible qualité tampon: 14,25 ± 5,85 contre 19,56 ± 6,7) (D)De même, la dérive excessive de l’échantillon peut nuire à la qualité de l’image. Bien que l’acquisition appropriée d’image sans dérive d’échantillon entraîne des pics d’intensité bien définis des filaments de α-actinine, la dérive accrue de l’échantillon provoque un modèle d’intensité irrégulière, ce qui affecte fortement l’analyse précise de la longueur du sarcomere. Les données sont présentées comme moyennes ± les filaments de SEM. 155 ont été analysés. La signification statistique ta été déterminée à l’aide d’élèves t-Test. Barre d’échelle 10μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La génération de CM in vitro fonctionnel dérivé de l’iPSC est importante pour les thérapies régénératives, la modélisation des maladies et le développement de plates-formes de dépistage des médicaments. Cependant, la maturité insuffisante de ces CM est un obstacle majeur dans la recherche cardiovasculaire20. À cet égard, des techniques d’imagerie à haute résolution sont nécessaires pour permettre la surveillance de l’état de maturation structurale du CM dérivé de l’iPSC. Dans le même temps, la microscopie à super résolution peut être un outil précieux pour analyser avec précision la fonction de protéines spécifiques, nécessaire pour la formation appropriée de sarcomère comme récemment démontré pour la titine et la troponine10,21,22.

Dans le protocole actuel, nous présentons une approche basée sur le PALM pour évaluer quantitativement la maturation structurelle de l’iPSC CM en analysant le réseau de sarcomere α-actinine.

Par rapport à la microscopie lumineuse conventionnelle, PALM permet la visualisation des structures cellulaires avec une résolution de ~20-50 nm23. Ainsi, il permet de détecter même des altérations subtiles du réseau de sarcomères cardiaques qui sont à peine ou même pas détectables par les approches classiques de microscopie lumineuse. En appliquant PALM, nous avons mesuré une longueur moyenne de sarcomère d’environ 1,84 μm en iPSC et CM néonatal (figure 2). Ceci est en ligne avec plusieurs rapports précédents montrant que la taille des sarcomeres individuels est de ~1.7-2.0 μm24,25,26. Par rapport à la longueur du sarcomere, l’estimation précise de l’épaisseur des lignes z est plus compliquée car sa taille est bien en dessous de la limite de résolution classique de la microscopie légère. À l’aide de la microscopie électronique, des études antérieures ont révélé que l’épaisseur du disque z varie de 50 à 80 nm dans iPSC CM, ce qui est similaire à notre détection basée sur PALM de ~73 nm (figure 2).

La comparaison avec la microscopie confocale standard a démontré l’augmentation dramatique de la résolution quand PALM a été appliqué. Nous avons trouvé une épaisseur z-Disc 3 fois plus faible, après l’imagerie PALM (Figure 2). Cependant, aucune différence significative n’a été mesurée pour la longueur de sarcomère. Puisque ce paramètre est mesuré en détectant la distance de pointe au pic des parcelles d’intensité, l’effet d’une résolution accrue est moins prononcé.

Pour atteindre cette haute résolution spatiale, PALM nécessite des conditions d’imagerie bien définies qui doivent être soigneusement traitées par l’utilisateur. Pour une localisation précise des molécules simples, des fluorophores sont nécessaires qui possèdent des propriétés photophysiques spéciales, permettant une commutation rapide entre l’état fluorescent et l’état sombre, appelé clignotant27. Comme nous l’avons déjà démontré, la sélection des fluorophores peut fortement affecter la qualité de l’image28. Une capacité de clignotement profond a été décrite pour Alexa 647, l’un des meilleurs colorants et largement utilisés pour la microscopie de localisation à molécule unique29,30,31. Toutefois, étant donné que de nombreux fluorophores PALM sont disponibles, les utilisateurs auront une grande flexibilité en termes d’étiquetage de l’échantillon27,28.

Outre la sélection de fluorophore approprié, le système tampon d’imagerie est un autre point critique dans l’imagerie PALM car il dicte les propriétés photophysiques du colorant fluorescent. Nous avons appliqué la pyranose oxydase comme un système de charognard d’oxygène qui est supérieur à l’oxydase de glucose car il fournit une stabilité accrue de pH, par conséquent, permettant l’imagerie à long terme sans une diminution significative de fluorophore clignotant au fil du temps32,33. Pourtant, comme la durée de vie de la mémoire tampon d’imagerie est limitée à plusieurs heures, il doit être fraîchement préparé pour chaque expérience afin d’assurer une reproductibilité élevée. Nos résultats démontrent une diminution spectaculaire de la précision des données après l’imagerie PALM avec tampon de faible qualité, conduisant à une capacité de clignotement altérée et une précision de localisation réduite (Figure 3A-C).

De plus, la stabilité thermique du système d’imagerie est obligatoire pour éviter une augmentation de la dérive de l’échantillon. Bien que la dérive modérée puisse être corrigée par l’analyse computationnelle, le mouvement excessif de l’échantillon conduit à une localisation mal calculée des fluorophores détectés et réduit la qualité de l’image et la précision des données. Cela peut être évité en utilisant des microscopes avec des chambres chauffantes et un équilibre thermique suffisant de l’échantillon respectif avant de commencer l’imagerie PALM. En outre, la densité et l’efficacité de l’étiquetage ainsi que l’utilisation de fragments d’anticorps ou de nanobodies devraient être considérés pour optimiser les conditions d’imagerie34,35,36.

Le processus d’acquisition de grandes structures cellulaires peut prendre de 10 à 30 min, selon les paramètres d’imagerie (champ de vision, sonde fluorescente, tampon d’imagerie, etc.). Ce long temps d’acquisition est un inconvénient de PALM qui le rend moins approprié pour l’imagerie cellulaire vivante. En règle générale, 5.000-10.000 images sont capturées pour atteindre un nombre suffisant d’événements clignotants avec une grande précision de localisation. En outre, la profondeur d’imagerie est généralement limitée à quelques centaines de nanomètres, ce qui rend difficile l’étude d’échantillons plus épais. Toutefois, une résolution améliorée dans z-direction peut être obtenue avec une configuration 3D PALM37.

Nous avons sélectionné deux paramètres pour caractériser le réseau α-actinine d’iPSC CM, y compris la longueur du sarcomère et l’épaisseur du z-Disc. D’autres dispositifs pourraient être recueillis pour obtenir une vue plus complète sur l’échafaudage de sarcomère, tel que l’orientation de filament. De même, 3D PALM peut aider à analyser quantitativement l’ensemble de la structure sarcomère par l’estimation des nœuds et des branches actuels dans le réseau.

Bien que PALM permette une analyse très détaillée de la structure du sarcomere, cette méthode ne permet pas l’acquisition de paramètres fonctionnels comme la contractilité cellulaire, qui est une autre caractéristique importante pour évaluer la maturité cardiaque. D’anciens rapports ont montré que l’évaluation basée sur la microscopie de la structure du sarcomère peut être combinée avec l’analyse vidéo pour obtenir des données fonctionnelles38,39. Cependant, puisque les auteurs ont utilisé la microscopie de fluorescence conventionnelle obtenu des données sur la structure de sarcomère sont moins précises si comparées à PALM. Notre approche offre également la possibilité de corréler les données PALM avec les enregistrements précédents time lapse et permet donc l’acquisition de mesures de contraction.

En résumé, ce protocole fournit une méthode pour évaluer quantitativement la maturation structurelle du réseau sarcomère en CM. En utilisant cette approche basée sur la super résolution, des stratégies peuvent être établies ciblant un développement cardiaque amélioré de CM dérivé d’iPSC pour obtenir un phénotype plus adulte-comme.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par le Fonds structurel de l’UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). En outre, H.L. est soutenu par le programme FORUN du Centre médical universitaire de Rostock (889001 et 889003) et la Fondation Josef et Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. est soutenu par le Programme de cliniciens-chercheurs du Centre médical de l’Université Rostock. R.D est soutenu par la DFG (DA1296/6-1), la fondation DAMP, la Fondation allemande du cœur (F/01/12) et la BMBF (VIP+ 00240).

Nous remercions Madeleine Bartsch pour son soutien technique dans la culture cellulaire iPSC et la différenciation cardiaque.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

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Biologie numéro 165 cellules souches pluripotentes induites par l’homme cardiomyocyte super résolution maturation réseau sarcomère microscopie de localisation photoactivée
Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique
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Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

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