Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605

Summary

تشكيل شبكة ساركومير المناسبة مهم لنضوج القلب المشتق من iPSC. نقدم نهجًا فائقًا قائمًا على القرار يسمح بالتقييم الكمي للنضج الهيكلي للخلايا الجذعية المشتقة من خلايا القلب، لتحسين ظروف الثقافة التي تعزز تطور القلب.

Abstract

نضوج القلب المشتق من iPSC هو قضية حاسمة لتطبيقها في العلاج التجديدي واختبار الأدوية وطراز الأمراض. على الرغم من تطوير بروتوكولات التمايز المتعددة ، فإن توليد عضلة القلب iPSC تشبه النمط الظاهري الشبيه بالراشد لا يزال صعبًا. أحد الجوانب الرئيسية لنضوج القلب و القلب ينطوي على تشكيل شبكة ساركومير منظمة تنظيما جيدا لضمان قدرة انكماش عالية. هنا، نقدم نهج فائقة القرار القائم على التحليل شبه الكمي لشبكة α actinin في cardiomyocytes. باستخدام المجهر التعريب photoactivated مقارنة طول السارومير وسمك القرص z من خلايا القلب المشتقة من iPSC والخلايا القلبية المعزولة عن أنسجة حديثي الولادة تم تنفيذها. في الوقت نفسه، نبرهن على أهمية ظروف التصوير المناسبة للحصول على بيانات موثوقة. تظهر نتائجنا أن هذه الطريقة مناسبة لمراقبة كمية النضج الهيكلي للخلايا القلبية ذات الدقة المكانية العالية ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الدقيقة في تنظيم الساركومير.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) مثل احتشاء عضلة القلب أو اعتلال عضلة القلب لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في العالم الغربي1. وبما أن قلب الإنسان لا يملك سوى ضعف القدرة التجديدية، هناك حاجة إلى استراتيجيات لتعزيز التعافي من الأمراض القلبية الوعائية. وهذا يشمل العلاجات استبدال الخلايا لتجديد خلايا القلب المفقودة (CM)، فضلا عن تطوير أدوية جديدة لمكافحة عدم انتظام النشاط التدخل الدوائي آمنة وفعالة. وقد تبين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) مصدر خلية واعدة للجيل غير محدود من CM الإنسان في المختبر، ومناسبة للعلاجات التجديدية، ونمذجة المرض، وتطوير فحص المخدرات المقايسات2،3،4.

على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات تمايز القلب المختلفة ، لا يزال يوجد CM مشتق من iPSC بعض الجوانب الظاهرية والوظيفية التي تعوق المختبر وفي تطبيق vivo5،6. بجانب التغيرات الكهربية ، الأيضية ، والجزيئية ، تتضمن عملية نضوج القلب التنظيم الهيكلي للساركوميريات ، وهي الوحدات الأساسية المطلوبة لتوليد القوة وانكماش الخلايا7. في حين أن كبار CMs المعرض جهاز التعاقد منظمة تنظيما جيدا، وCMs المشتقة من iPSC عادة ما تظهر خيوط ساركومير غير مرتبة، المرتبطة انخفاض القدرة على الانكماش وتغيير ديناميات الانكماش8،9. على النقيض من درجة الحرارة الناضجة التي تظهر نمط انكماش uniaxial ، والهياكل مشوشة في نتائج CM غير ناضجة في تقلص شعاعي للخلية بأكملها أو تعزيز ظهور نقاط التركيز انكماش9،10.

لتحسين نضوج القلب، وقد تم تطبيق نهج متعددة، بما في ذلك 3D وسائل زراعة الخلايا، والتحفيز الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن استخدام مصفوفات خارج الخلية محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12،13. لتقييم نجاح وكفاءة هذه الظروف الثقافية المختلفة ، هناك حاجة إلى تقنيات لرصد وتقدير درجة النضج الهيكلي لـ iPSC CM ، على سبيل المثال ، عن طريق التقنيات المجهرية. على النقيض من التصوير confocal التقليدية، دقة في حالة المجهر تعريب مبطل ضوئي (بالم) هو ما يقرب من 10x أعلى. هذه التقنية بدورها تسمح لتحليل أكثر دقة، والكشف عن التعديلات حتى خفية من الهياكل الخلوية14. وبالنظر إلى الدقة العالية للتصوير القائم على النخلة، كان الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم المجهري لنضج الساروميري في CMS المشتقة من iPSC عن طريق التحديد الدقيق لسمك القرص z وطول الساركومير. في الدراسات السابقة، وقد تبين أن هذه السمات الهيكلية لتكون المعلمات المناسبة لتقييم نضج القلب15. على سبيل المثال، المرضى iPSC-CM تفتقر كامل طول ديستروفين معرض انخفاض طول الساركومير وعرض z-الفرقة بالمقارنة مع خلايا نوع البرية16. وبالمثل، تم قياس طول الساركوميريات الفردية للتحقيق في تأثير الإشارات الطبوغرافية على تطوير القلب16. ومن ثم، قمنا بتطبيق هذا النهج لتقييم النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في iPSC-CM عن طريق قياس كمية طول الساركومير وسمك القرص z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول التي تشمل فئران حديثي الولادة والبالغين وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوانات من المركز الطبي جامعة روستوك.

1. زراعة وتفكك من iPSC المشتقة من القلب

  1. تمييز hiPSC-CMs لمدة 25 يوما باستخدام أسلوب أحادية 2D كما هو موضح سابقا17.
  2. قبل الدفء تفكك المتوسطة إلى 37 درجة مئوية ودعم متوسطة لدرجة حرارة الغرفة.
  3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة ما قبل الدفء تفكك المتوسطة إلى الخلايا واحتضان لمدة 12 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. إضافة دعم المتوسطة للخلايا.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم الوسائط دعم المضافة ضعف حجم الوسيطة الانفصام المستخدمة في الخطوة 1.4.
  6. طرد الخلايا باستخدام ماصات المصلية 5 مل.
  7. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في 3 مل من hiPSC-CM ثقافة متوسطة17.
  8. خلايا البذور في 8 غرف القاع الزجاج جيدا في كثافة الخلية من 75،000 الخلايا / جيدا والثقافة لمدة 3 أيام.

2. عزل الكبار cardiomyocyte

  1. تم إجراء عزل وزراعة أمراض القلب البالغة من فئران NMRI كما تم الإبلاغ عنها سابقًا18.
  2. بذور الخلايا في 8 الزجاج جيدا شريحة الغرفة والثقافة ليوم واحد.

3. عزل وزراعة أمراض القلب الوليدية

  1. تم إجراء إجراء عزل أمراض القلب الوليدية، التي تم الحصول عليها من فئران NMRI، كما هو موضحسابقاً 19.
  2. بذور الخلية المعزولة في 8 8 زلقة غرفة زجاجية جيدا في كثافة الخلية من 75،000 خلية / جيدا والثقافة لمدة 3 أيام في ثقافة CM الوليدية المتوسطة19.

4. immunofluorescence وضع العلامات من شبكة α أكتينين

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، يتم استزراع الخلايا في 8 غرف قاع الزجاج. يجب أن يتم وضع العلامات قبل يوم واحد من التصوير.

  1. Prewarm 4٪ PFA في 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح iPSC-CM عن طريق إضافة 4٪ شبهformaldehyde مباشرة في وسائل الإعلام الثقافة (1:1 تخفيف) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التركيز النهائي ل PFA لل التثبيت هو 2٪.
  3. احتضان الخلايا الثابتة في 0.2٪ تريتون-X، المخفف في برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل من.
  5. إضافة 1٪ BSA الحل (المخفف في برنامج تلفزيوني) واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة α actinin 1:100 في 1٪ BSA، التي تحتوي على 0.05٪ تريتون-X. إضافة إلى الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  7. غسل الخلايا مرتين مع 0.2% BSA الحل, 5 دقيقة لكل من.
  8. إعداد 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف الماعز المضادة للماوس Alexa647 الأجسام المضادة 1:100 في 1٪ BSA، التي تحتوي على 0.05٪ تريتون-X. إضافة إلى الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
  9. غسل الخلايا مرتين مع 0.2% BSA الحل, 5 دقيقة لكل من.
  10. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل من. إبقاء الخلايا المسمى في الظلام في 4 درجة مئوية حتى تصوير بالم.

5. إعداد المخزن المؤقت للتصوير بالم

ملاحظة: من الضروري إعداد المخزن المؤقت لتصوير PALM حديثاً لكل تجربة.

  1. إعداد 50% محلول الجلوكوز عن طريق حل 25 غرام من الجلوكوز في 50 مل من الماء المقطر.
  2. إعداد العازلة الأساسية التي تحتوي على 50 M تريس-HCl، 10٪ الجلوكوز و 10 mM كلوريد الصوديوم.
    1. ضبط مستوى درجة الحموضة إلى ~ 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
  3. إعداد حل الأكسيداز بيروانز عن طريق حل 0.6 ملغ بيروانز أوكسيداز في 316 μL من العازلة الأساسية.
  4. تحضير حل كاتالز عن طريق حل 7 ملغ من كاتالوز في 500 ميكرولتر من العازلة الأساسية. تخلط جيدا والطرد المركزي في 10،000 س ز لمدة 3 دقائق. الحفاظ على سوبرناتل لاستخدامها. يمكن الاحتفاظ بحل Catalase عند 4 درجة مئوية لعدة أيام.
  5. إعداد 500 ميكرولتر من بالم العازلة التصوير عن طريق خلط 316 ميكرولتر من حل أوكسيديز بيروانز، 25 ميكرولتر من حل كاتالاز، 100 ميكرولتر من 50٪ حل الجلوكوز، 50 ميكرولتر من السيستينمين، 5 ميكرولتر من cyclooctatetraene و 3.5 ميكرولتر من β-Mercaptoethanol. النشاط الحفاز النهائي من الأكسيداز البيرانوز و catalase تحتاج إلى أن تكون 7.5 U، 35،00U على التوالي.
    ملاحظة: يوفر المخزن المؤقت للتصوير بالم ظروف تصوير مثالية لـ 3-5 ساعات. إذا انخفضت قدرة الوميض للصبغة الفلورية، قم بإعداد aliquot العازلة الجديدة.

6. الحصول على صورة بالم

  1. قم بتشغيل المجهر على الأقل 3 ساعات قبل الاستخدام وجلب العينة إلى درجة حرارة الغرفة قبل التصوير للسماح بالتكرار الحراري. إذا تم تجهيز المجهر مع غرفة الحضانة، وضبط درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية.
  2. تنظيف الهدف والجزء السفلي من الشريحة غرفة باستخدام المذيبات التنظيف المناسب.
  3. إضافة 300 μL من بالم العازلة التصوير في بئر واحد من الخلايا المسماة وإدراج الشريحة الغرفة في حامل المرحلة من المجهر.
  4. تعيين معلمات الحصول على صورة PALM.
    1. اختر 1.57 N.A. 100x هدف النفط لاقتناء.
    2. حدد وضع PALM ثم قم بتنشيط إعدادات TIRF.
    3. ضبط عدد الإطارات التي سيتم الحصول عليها. عادة 5، 000-10، 000 إطارات كافية للحصول على أفضل النتائج. ومع ذلك، فإن عدد الإطارات المكتسبة يعتمد بشدة على كفاءة وضع العلامات والقدرة على الوميض للصبغة الفلورية ويمكن تعديلها من قبل المستخدم.
    4. تعيين الأشعة فوق البنفسجية الليزر السلطة إلى 0.1٪ و 647 ليزر إلى 0.2٪.
    5. تعيين مستوى الربح إلى 50-100.
    6. قم بالتبديل على إضاءة الليزر وحدد خلية الهدف. ويمكن زيادة مستوى الكسب إذا كانت كثافة الإشارة منخفضة (اعتماداً على وضع علامة الفلوريس).
    7. إيقاف إضاءة الليزر
  5. الحصول على صورة بالم
    1. خفض مكاسب إلى 0 وزيادة قوة الليزر (647 السابق) إلى 100٪.
    2. تبييض الخلية المستهدفة ل ~ 5 s.
    3. زيادة كسب إلى 50 وبدء الحصول على صورة بالم.
      ملاحظة: يجب ضبط الكسب للحصول على كثافة إشارة كافية بينما يجب تجنب وحدات البكسل المشبعة. إذا قلّت كثافة الإشارة، فزيد مستوى الكسب.
  6. اختياريا، تعزيز باطراد قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية (0.1٪-10٪) لزيادة كثافة الإشارة وتعزيز وامض من الفلوروفور.

7. إعادة بناء بيانات PALM

  1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد بيانات PALM.
  2. فتح البرنامج المساعد العاصفة الرعدية و "تشغيل التحليل"
    1. في "إعداد الكاميرا" القائمة أدخل حجم بكسل وم م gain.
      ملاحظة: عند استخدام أهداف 100x وعدسة تكبير 1.6x، يكون حجم البكسل 100 نانومتر مناسبًا. ومع ذلك، حيث يعتمد حجم البكسل على ميزات الأجهزة الخاصة بالمجهر والكاميرا المستخدمة في تصوير PALM، يحتاج المستخدمون إلى التحقق بعناية من هذه المعلمة وتكييفها. يمكن الحصول على قيم كسب EM من بيانات التعريف.
    2. في "تشغيل قائمة التحليل" مجموعة المعلمات على النحو التالي: B-spline الترتيب: 3، مقياس B-spline: 2.0، ذروة كثافة عتبة: stf(Wave.F1)، نصف قطرها المناسب: 3، سيغما الأولي: 1.6، التكبير: 5.0، تحديث التردد: 50، التحولات الجانبي: 2. تأكيد عن طريق النقر على زر "Ok" .
  3. مرحلة ما بعد معالجة صورة PALM المعاد بناؤها
    1. في "رسم الرسم البياني" القائمة حدد"سيغما"المعلمة.
    2. استخدم أداة"Rectangle"لتحديد عائد الاستثمار، مع استبعاد القطع الأثرية المحتملة وتطبيق عائد الاستثمار على المرشح. ستظهر قيم عائد الاستثمار في مربع أمر التصفية.
    3. إضافة"& عدم اليقين <25" إلى قيم عائد الاستثمار. سوف تبدو الأمر مرشح ممكن مثل هذا: "(سيغما > 48.6821 & سيغما < 1117.40) & عدم اليقين & 25". تطبيق قيم سيجما المحددة.
    4. في"إزالة التكرارات"القائمة، أدخل عتبة مسافة "10 نانومتر" وتطبيق.
    5. في "دمج القائمة"، تعيين أقصى مسافة إلى "20"، الحد الأقصى للإطارات لكل جزيء إلى "0" والحد الأقصى قبالة الإطارات إلى "1". تطبيق الإعدادات.
    6. في"قائمة تصحيح الانجراف""، حدد تبادل الارتباط وتعيين "عدد من صناديق" إلى "5" و "التكبير" إلى "5.0". تطبيق إعدادات تصحيح الانجراف.
    7. حفظ صورة PALM النهائي وتصدير آخر البيانات المعالجة إذا رغبت في ذلك.

8. تحليل خيوط السارومير

  1. تحليل طول الساركومير
    1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد صورة PALM التي تم إعادة بنائها.
    2. رسم خط بين الهياكل الساركومير المحددة عمودي على القرص z لقياس أقصر مسافة بين خيوط actinin.
    3. حدد "ملف تعريف المؤامرة" في "تحليل" القائمة والحصول على طول بين اثنين من القمم. كما طول ساركومير قد تختلف داخل خلية واحدة، ينبغي قياس ما لا يقل عن 20 ساركوميري في مناطق مختلفة من الخلية المستهدفة.
  2. تحليل سمك القرص z
    1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد صورة PALM التي تم إعادة بنائها.
    2. تحويل صورة PALM التي تم إعادة بنائها إلى صورة وضع 8 بت.
    3. فتح البرنامج المساعد الكشف عن التلال وأدخل المعلمات التالية: عرض الخط: 20، التباين العالي: 230، التباين المنخفض: 10، سيغما: 0.79، عتبة أقل: 25.84، الحد الأدنى طول الخط: 20.
    4. تعيين "عرض التقدير"تمديد الخط"و "عرض النتائج".
    5. انقر فوق "موافق" واستخدم "متوسط عرض الخط" من جدول النتائج لمزيد من التحليلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتقدير درجة النضج الهيكلي ل CM، حديثي الولادة، بالغ ناضجة تماما، و iPSC CM وصفت في البداية CM مع الأجسام المضادة α actinin لتصور شبكة ساركومير. بعد الاستحواذ على PALM ، تم إعادة بناء الصور ، وتم قياس سمك القرص z باستخدام برنامج معالجة الصور المستند إلى البرنامج الإضافي للكشف التلقائي عن عرض خيوط فردية. تم حساب طول الساركومير عن طريق قياس المسافة بين قمتي شدة متجاورتين، تقابل خيوط مجاورة. ويبين الشكل 1 تقييم منظمة ساركومير في CM المشتق من iPSCs.

كما هو معروض في الشكل 2A، تم العثور على iPSC-CM والخلايا الوليدية لإظهار نمط مماثل α - actinin مع هياكل ساركومير غير منتظمة وغير مرتبة. وبالمثل، أظهر التقييم الكمي أن طول وسمك خيوط α- actinin كانت متطابقة تقريبا مما يشير إلى حالة نمو مبكرة من iPSC CM. وبشكل أكثر تحديداً، كان متوسط طول الساركومير حوالي 1.83 ميكرومتر (البالغ مقابل iPSC CM مقابل CM الوليدي: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 ميكرومتر مقابل 1.82±0.03 ميكرومتر، n= 20 خلية)، بينما كان سمك القرص z حوالي 74 نانومتر (البالغ مقابل iPSC CM مقابل CM الوليدي: 71.30 ± 1.64 مقابل 73.95 ± 0.86 نانومتر مقابل 74.08 ± 0.12 نانومتر، ن = 20 خلية)(الشكل 2B). في المقابل، أظهرت كبار ناضجة CM شبكة ساركومير العادية مع زيادة طفيفة في طول الساركومير وانخفاض سمك القرص z.

أظهرت المقارنة بين التصوير confocal التقليدية و PALM أي اختلاف كبير من طول الساركومير(الشكل 2C)(confocal مقابل PALM: 1.75 ± 0.02 مقابل 1.70 ± 0.02، ن = 10 خلايا). ومع ذلك، تم الكشف عن عمق انخفاض z-القرص سمك عندما تعرض iPSC-CM لتصوير بالم(الشكل 2C)(confocal مقابل PALM: 224.71 ± 4.31 مقابل 73.91 ± 1.31، ن = 10 خلايا). صور تمثيلية تسليط الضوء على مكاسب في القرار عندما تم تطبيق بالم، بدعم من المؤامرات كثافة المقابلة(الشكل 2D, E). عرض كامل محسوب في نصف الحد الأقصى من كثافة الفلوريسين كشفت أن هياكل α actinin هي ~ 3 أضعاف أرق في صور بالم إذا ما قورنت المجهرية confocal القياسية(الشكل 2E).

المجهر توطين جزيء واحد، مثل بالم، تمكن من الكشف عن الهياكل داخل الخلايا أقل بكثير من حد الحيود. لضمان أقصى دقة المكانية، هناك حاجة إلى ظروف التصوير المناسبة للكشف الدقيق عن توطين جزيء واحد. نظام العازلة التصوير المستخدمة أمر بالغ الأهمية لعملية الاستحواذ هذه لأنها تؤثر على الخصائص الفيزيائية الضوئية للصبغة الفلورية، وبالتالي، لها تأثير كبير على دقة ودقة الصورة النهائية بالم. المقارنة بين العازلة عالية الجودة والمخزن المؤقت أعدت قبل يوم واحد من التصوير كشفت عن وجود فرق عميق في سمك خيوط(الشكل 3A, B). الهياكل الساركوميري المكتسبة مع انخفاض جودة العازلة يبدو أن تكون أكثر سمكا بالمقارنة مع ظروف التصوير الأمثل (الشكل 3A). في الواقع، أظهر التقييم الكمي أن سمك القرص z تم زيادة بنسبة 65٪ (جودة عالية مقابل جودة منخفضة: 73.87 ± 1.02 نانومتر مقابل 113.9 ± 1.33 نانومتر، ن = 155 شعيرات) (الشكل 3B). ويرجع هذا النقص في دقة البيانات إلى انخفاض خصائص الوميض من الفلوروفور التي تؤدي إلى أقل الكشف عن الفوتونات لكل حدث التعريب (جودة عالية مقابل منخفضة العازلة: 29689 فوتونات / الحدث مقابل 16422 فوتونات / أحداث) (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، يتم تقليل دقة التعريب في ظل تدهور ظروف التصوير (جودة عالية مقابل جودة منخفضة: 14.25 ± 5.85 نانومتر مقابل 19.56 ± 6.7 نانومتر)، مما يقلل من الدقة الشاملة لصورة بالم المعاد بناؤها(الشكل 3C).

بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر الانجراف العينة، على سبيل المثال، الناجم عن عدم الاستقرار الحراري، على توطين دقيق لجزيئات الفلورسنت ويؤدي إلى صور ضبابية، كما هو معروض في الشكل 3D. في حين أن التصوير الأمثل بالم يعطي قمم كثافة واضحة ومحددة جيدا، فإن الانجراف المفرط للعينة ينتج نمط كثافة غير منتظم يجعل من الصعب تحديد المسافة بدقة بين خيوط متجاورتين. وتسلط هذه البيانات الضوء على أهمية ظروف التصوير التي تخضع لرقابة محكمة في المجهر الميكروي لتوطين الجزيء الواحد، حيث يمكن أن تؤدي حتى التغيرات الطفيفة أثناء عملية الاستحواذ إلى تقليل جودة الصورة ودقة البيانات بشكل كبير.

Figure 1
الشكل 1: تقييم تنظيم الساركومير في CM المشتق من iPSCs.
تم تسمية شبكة ساركومير بشكل فلوري مع جسم مضاد α actinin ، يليه الحصول على صورة PALM. إعادة الإعمار اللاحقة تؤدي إلى صورة PALM النهائية التي تم استخدامها للتحليل الكمي. تم تحديد طول الساركوميريات الفردية من خلال قياس المسافة بين قمتي الشدة المقابلة لخيوط الساركومير المجاورة (1-5). تم حساب سمك القرص Z تلقائيا من قبل أداة معالجة الصور المستندة إلى البرنامج المساعد. مقياس شريط 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة كمية لسمك القرص z وطول الساركومير في CM مشتقة من أنسجة القلب للبالغين والوليد.
(أ)صور PALM المعاد بناؤها لشبكة α actinin من iPSC وMM الوليدية . (B) كشف التقييم الكمي أن جميع حديثي الولادة وتشترك في تشابه عال في طول الساركومير (الكبار مقابل. iPSC CM مقابل CM الوليدية: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 ميكرومتر مقابل 1.82±0.03 ميكرومتر) وسمك الخيوط الفردية (البالغين مقابل iPSC CM مقابل. CM الوليدية: 71.30 ± 1.64 مقابل 73.95 ± 0.86 نانومتر مقابل 74.08 ± 0.12 نانومتر)، مما يشير إلى النمط الظاهري السابق لأوانه من iPSC CM.(C)مقارنة طول الساركومير وسمك القرص z بين التصوير ال confocal التقليدية واقتناء البيانات القائمة على النخلة. وكما تم تحديد طول الساركومير بقياس المسافة بين الذروة والذروة، كان تأثير زيادة الدقة على دقة البيانات أقل وضوحاً (confocal vs. PALM: 1.75 ± 0.02 مقابل 1.70 ± 0.02). وفي المقابل، تم اكتشاف سمك أقل بكثير من القرص z-disc عند تطبيق PALM (confocal مقابل PALM: 224.71 ± 4.31 مقابل 73.91 ± 1.31). ) صور مجهرية تمثيلية لـ iPSC-CM تم الحصول عليها بواسطة تصوير confocal و PALM. (ه) قطع كثافة الفلوريسنس المقابلة للخط الأحمر المبين في (D). تمثل القيم العرض الكامل بنصف الحد الأقصى من كثافة الفلوريسنس، مما يشير إلى زيادة كبيرة في الدقة في صور PALM. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 10-20 الخلايا، تم تقييم 20 ساركوميري لكل خلية. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام الطلاب t-Test. **p<0.005, Scale bar 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير جودة المخزن المؤقت و عينة الانجراف على دقة البيانات وموثوقيتها.
(أ)ممثل بالم صور من iPSC المستمدة من CM المكتسبة في ظل ظروف التصوير المختلفة. تظهر خيوط الساركومير أكثر سمكًا في العينات التي تم تصويرها مع مخزن مؤقت منخفض الجودة. تشير الخطوط الحمراء إلى قياس تمثيلي لطول الساركومير ، في حين تم تضمين هياكل خيوط خضراء في تحليل z-Disc. (ب)أكد التقييم الكمي وجود فرق كبير في سمك القرص z بين العازلة المنخفضة وعالية الجودة (جودة المخزن المؤقت العالية مقابل منخفضة: 73.87 ± 1.02 نانومتر مقابل. 113.9 ± 1.34 نانومتر)(C) هذا الاختلاف في دقة الصورة يستند إلى انخفاض قدرة الوميض من الفلوروفهور، مما أدى إلى انخفاض عدد الفوتونات المكتشفة لكل جزيء (جودة عالية مقابل منخفضة للمخزن: 29689 فوتونات/حدث مقابل 16422 فوتون/أحداث). في الوقت نفسه، انخفضت دقة التعريب التي بدورها خفضت القرار العام (جودة العازلة العالية مقابل المنخفضة: 14.25 ± 5.85 مقابل 19.56 ± 6.7)(D)وبالمثل، يمكن أن يضعف الانجراف المفرط للعينة جودة الصورة. في حين أن الحصول على الصورة السليمة دون العينة الانجراف النتائج في قمم كثافة محددة جيدا من خيوط α actinin، زيادة الانجراف العينة يثير نمط كثافة غير منتظمة، مما يؤثر بقوة تحليل دقيق لطول الساركومير. وتقدم البيانات على أنها متوسط ± تم تحليل 155 شعيرات من نوع الـ SEM. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام الطلاب t-Test. ****p<0.0001. مقياس شريط 10μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن توليد CM المشتق من iPSC الوظيفي في المختبر مهم للعلاجات التجديدية ، والنمذجة المرض وتطوير منصات فحص المخدرات. ومع ذلك، النضج غير الكافي لهذه CM عقبة رئيسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية20. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة تمكن من رصد حالة النضج الهيكلي لـ CM المشتقة من iPSC. في الوقت نفسه، يمكن أن يكون المجهر فائق القرار أداة قيمة لتحليل وظيفة بروتينات محددة بدقة، المطلوبة لتشكيل ساركومير السليم كما هو موضح مؤخرا لالتين والتروبونين10،21،22.

في البروتوكول الحالي، نقدم نهجًا قائمًا على بالم لتقييم النضوج الهيكلي لـ iPSC CM من خلال تحليل شبكة α actinin sarcomere.

بالمقارنة مع المجهر الخفيفة التقليدية، بالم تمكن التصور من الهياكل الخلوية مع قرار من ~ 20-50 نانومتر23. وهكذا، فإنه يسمح للكشف عن حتى تغييرات خفية من شبكة ساركومير القلب التي هي بالكاد أو لا يمكن الكشف عنها حتى من قبل نهج المجهر ضوء الكلاسيكية. تطبيق بالم، قمنا بقياس متوسط طول الساركومير من ~ 1.84 ميكرومتر في iPSC والمواليد الجدد CM(الشكل 2). وهذا يتماشى مع العديد من التقارير السابقة التي تبين أن حجم الساركوميري الفردية هو ~ 1.7-2.0 μm24،25،26. بالمقارنة مع طول الساركومير ، فإن التقدير الدقيق لسمك خطوط z أكثر تعقيدًا لأن حجمه أقل بكثير من الحد الكلاسيكي للمجهر الضوئي. باستخدام المجهر الإلكتروني، كشفت الدراسات السابقة أن سمك القرص z يتراوح من 50 إلى 80 نانومتر في iPSC CM، وهو مشابه للكشف عن النخيل لدينا من ~ 73 نانومتر(الشكل 2).

المقارنة مع المجهر confocal القياسية أظهرت الزيادة الهائلة في القرار عندما تم تطبيق بالم. وجدنا 3 أضعاف أقل z- القرص سمك، وبعد تصوير بالم (الشكل 2). ومع ذلك، لم يتم قياس أي فرق كبير لطول الساركومير. وبما أن هذه المعلمة تقاس عن طريق الكشف عن المسافة من الذروة إلى الذروة من مخططات كثافة، تأثير زيادة القرار هو أقل وضوحا.

لتحقيق هذا القرار المكاني عالية، تتطلب PALM ظروف التصوير محددة جيدا التي تحتاج إلى أن تعالج بعناية من قبل المستخدم. من أجل توطين دقيق للجزيئات المفردة، هناك حاجة إلى الفلوروفهورات التي تمتلك خصائص ضوئية خاصة، مما يتيح التبديل السريع بين الفلورسنت والظلام، ويسمى وامض27. كما هو موضح سابقا، واختيار الفلوروفور يمكن أن تؤثر بقوة على جودة الصورة28. ووصفت قدرة وامض عميق لاليكسا 647، واحدة من أفضل والأصباغ المستخدمة على نطاق واسع لمجهر جزيء واحد توطين29،30،31. ومع ذلك ، منذ العديد من الفلوروفهورات بالم المتاحة ، سيكون للمستخدمين مرونة عالية من حيث وضع علامات العينة27،28.

إلى جانب اختيار الفلوروفور المناسب، فإن نظام التصوير المؤقت هو نقطة أخرى حاسمة في تصوير بالم لأنه يملي الخصائص الفيزيائية الضوئية للصبغة الفلورية. لقد طبقنا oxidase بيروانز كنظام زبال الأكسجين الذي يتفوق على أوكسيديز الجلوكوز كما أنه يوفر زيادة درجة الهيدروجين، وبالتالي، مما يسمح التصوير على المدى الطويل دون انخفاض كبير من الفلوروفور وامض مع مرور الوقت32،33. ومع ذلك ، حيث أن عمر المخزن المؤقت للتصوير يقتصر على عدة ساعات ، يجب إعداده حديثًا لكل تجربة لضمان قابلية التكاثر العالية. تظهر نتائجنا انخفاضًا كبيرًا في دقة البيانات بعد تصوير PALM مع انخفاض جودة التخزين المؤقت ، مما يؤدي إلى ضعف القدرة على الوميض وانخفاض دقة الترجمة(الشكل 3A-C).

وعلاوة على ذلك، الاستقرار الحراري لنظام التصوير إلزامي لتجنب زيادة الانجراف العينة. في حين يمكن تصحيح الانجراف المعتدل عن طريق التحليل الحسابي ، وحركة العينة المفرطة يؤدي إلى توطين خطأ في الفلوروفورات المكتشفة ويقلل من جودة الصورة ودقة البيانات. ويمكن منع ذلك باستخدام المجاهر مع غرف التدفئة وتكبيل حراري كاف للعينة المعنية قبل البدء التصوير بالمي. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي النظر في كثافة وضع العلامات والكفاءة وكذلك استخدام شظايا الأجسام المضادة أو الأجسام النانوية لتحسين ظروف التصوير34،35،36.

قد تستغرق عملية اقتناء الهياكل الخلوية الكبيرة 10-30 دقيقة ، اعتمادًا على معلمات التصوير (مجال الرؤية ، المسبار الفلوري ، عازلة التصوير وما إلى ذلك). هذا الوقت الطويل اقتناء هو عيب من PALM مما يجعلها أقل ملاءمة للتصوير الخلية الحية. عادةً ما يتم التقاط إطارات 5.000-10.000 لتحقيق عدد كاف من الأحداث الوامضة بدقة التعريب العالية. أيضا، عادة ما يقتصر عمق التصوير على بضع مئات من نانومتر، مما يجعل من الصعب التحقيق في عينات أكثر سمكا. ومع ذلك، يمكن الحصول على دقة محسنة في الاتجاه z مع إعداد37PALM 3D.

لقد اخترنا اثنين من المعلمات لتوصيف شبكة α actinin من iPSC CM، بما في ذلك طول ساركومير وسمك القرص z. يمكن جمع ميزات إضافية للحصول على رؤية أكثر شمولا على سقالة ساركومير، مثل اتجاه خيوط. وبالمثل، يمكن أن يساعد 3D PALM على التحليل الكمي لهيكل السارومير بأكمله من خلال تقدير العقد والفروع الحالية داخل الشبكة.

على الرغم من أن بالم تمكن من تحليل مفصل جدا لهيكل ساركومير، هذه الطريقة لا تسمح لاكتساب المعلمات الوظيفية مثل انكماش الخلوية، والتي هي سمة أخرى هامة لتقييم نضج القلب. وقد أظهرت التقارير السابقة أن التقييم القائم على المجهر من بنية الساركومير يمكن الجمع بين تحليل الفيديو للحصول على البيانات الوظيفية38,39. ومع ذلك، منذ أن استخدمت المؤلفين المجهر الفلوريسنس التقليدية التي تم الحصول عليها بيانات حول بنية ساركومير هي أقل دقة إذا ما قورنت بالم. كما يوفر نهجنا إمكانية ربط بيانات PALM مع تسجيلات الفاصل الزمني السابقة وبالتالي يسمح بالحصول على قياسات الانكماش.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم كمي النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في CM. باستخدام هذا النهج القائم على القرار الفائق، يمكن وضع استراتيجيات تستهدف تطوير القلب المحسن لـ CM المشتق من iPSC للحصول على نمط ظاهري أكثر شبهاً بالراشد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الهيكلي للاتحاد الأوروبي (ESF/14-BM-A55-0024/18). بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم H.L. من قبل برنامج FORUN من المركز الطبي لجامعة روستوك (889001 و 889003) ومؤسسة جوزيف وكاثي كلينز (T319/29737/2017). ويدعم C.I.L. من قبل برنامج العلماء السريرية للمركز الطبي جامعة روستوك. ويدعم R.D من قبل DFG (DA1296/6-1)، ومؤسسة دامب، ومؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) وBMBF (VIP+ 00240).

نشكر مادلين بارتش على دعمها الفني في ثقافة خلايا iPSC وتمايز القلب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Tags

علم الأحياء، الإصدار 165، الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان، cardiomyocyte، القرار الفائق، النضج، شبكة ساركومير، المجهر التعريب الضوئية
تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johann, L., Chabanovska, O., Lang,More

Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter