Summary
Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.
Abstract
iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin olgunlaşması rejeneratif tedavi, ilaç testi ve hastalık modelleme uygulamaları için kritik bir konudur. Birden fazla farklılaşma protokolünün geliştirilmesine rağmen, yetişkin benzeri fenotipi andıran iPSC kardiyomiyositlerin üretimi zorlu olmaya devam etmektedir. Kardiyomiyosit olgunlaşmasının önemli bir yönü, yüksek daralma kapasitesini sağlamak için iyi organize edilmiş bir sarcomere ağının oluşmasını içerir. Burada kardiyomiyositlerde α-aktinin ağının yarı kantitatif analizi için süper çözünürlük tabanlı bir yaklaşım salıyoruz. Fotoaktil lokalizasyon mikroskopisi kullanılarak iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin ve yenidoğan dokusundan izole edilen kardiyak hücrelerin sarkokan uzunluğu ve z-disk kalınlığı karşılaştırması yapıldı. Aynı zamanda, güvenilir veri elde etmek için uygun görüntüleme koşullarının önemini de gösteriyoruz. Sonuçlarımız, bu yöntemin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip kardiyak hücrelerin yapısal olgunluğunu kantitatif olarak izlemek için uygun olduğunu ve sarcomere organizasyonunun ince değişikliklerinin bile saptanmasını sağladığını göstermektedir.
Introduction
Miyokard enfarktüsü veya kardiyomiyopati gibi kardiyovasküler hastalıklar (KVD) batı dünyasında önemli ölüm nedeni olmaya devam etmektedir1. İnsan kalbi sadece kötü rejeneratif kapasiteye sahip olduğundan, CVD'lerden iyileşmeyi teşvik etmek için stratejilere ihtiyaç vardır. Bu kayıp kardiyomiyositler doldurmak için hücre replasman tedavileri içerir (CM), yanı sıra verimli ve güvenli farmasötik müdahale için yeni anti-aritmik ilaçların geliştirilmesi. Indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) insan CM in vitro sınırsız nesil için umut verici bir hücre kaynağı olduğu gösterilmiştir, rejeneratif tedaviler için uygun, hastalık modelleme, ve ilaç tarama tahlilleri gelişimi için2,3,4.
Birçok farklı kardiyak farklılaşma protokolleri mevcut olmasına rağmen, iPSC kaynaklı CM hala in vitro ve in vivo uygulama5,,6engel bazı fenotipik ve fonksiyonel yönleri eksikliği . Elektrofizyolojik, metabolik ve moleküler değişikliklerin yanı sıra, kardiyak olgunlaşma süreci sarcomeres yapısal organizasyon içerir, hangi kuvvet üretimi ve hücre daralması için gerekli temel birimleri olan7. Yetişkin CM'ler iyi organize edilmiş bir kontraktil cihaz sergilerken, iPSC kaynaklı CM'ler genellikle azaltılmış kasılma yeteneği ve değiştirilmiş daralma dinamikleri ile ilişkili, düzensiz sarcomere filamentler göstermek8,9. Tek eksenli kasılma deseni gösteren olgun CM aksine, olgunlaşmamış CM içinde şaşırmış yapılar tüm hücrenin radyal daralma sonuçları veya daralma odak noktaları nın görünümünü teşvik9,10.
Kardiyak olgunlaşmageliştirmek için, birden fazla yaklaşımlar uygulanmıştır, 3D hücre kültürü yöntemleri de dahil olmak üzere, elektrik ve mekanik stimülasyon, yanı sıra vivo koşullarda taklit hücre dışı matriskullanımı11,12,13. Bu farklı kültür koşullarının başarısını ve verimliliğini değerlendirmek için, iPSC CM'nin yapısal olgunlaşma derecesini mikroskobik teknikler ile izlemek ve tahmin etmek için tekniklere ihtiyaç vardır. Konvansiyonel konfokal görüntülemenin aksine fotoaktik lokalizasyon mikroskobu (PALM) durumunda çözünürlük yaklaşık 10 kat daha yüksektir. Sırayla bu teknik daha doğru bir analiz sağlar, hücresel yapıların bile ince değişiklikler tespit14. PALM tabanlı görüntülemenin yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, bu yöntemin genel amacı, iPSC kaynaklı CM'lerde z-Disk kalınlığı ve sarcomere uzunluğunun kesin olarak belirlenmesi ile sarcomere olgunluğunun mikroskobik değerlendirilmesidir. Daha önceki çalışmalarda, bu yapısal özellikleri kardiyak olgunluk değerlendirmek için uygun parametreler olduğu gösterilmiştir15. Örneğin, hastalıklı iPSC-CM tam uzunlukta distrofin sergileyen vahşi tip hücrelere göre sarcomere uzunluğu ve z-bant genişliği azaltılmış16. Aynı şekilde, bireysel sarcomeres uzunluğu kardiyak gelişim16üzerinde topografik ipuçları etkisini araştırmak için ölçüldü. Bu nedenle bu yaklaşımı, sarcomere uzunluğu ve z-disk kalınlığını nicel olarak ölçerek iPSC-CM'deki sarcomere ağının yapısal olgunlaşmasını değerlendirmek için uyguladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yenidoğan ve erişkin fareleri içeren bu protokoldeki tüm adımlar Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan bakımına yönelik etik kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yetiştirilmesi ve ayrıştırılması
- Daha önce açıklandığı gibi 2D monolayer yöntemi kullanarak 25 gün boyunca hiPSC-CMs ayırt17.
- 37 °C'ye kadar önceden ısınan dissosyon orta ve oda sıcaklığına orta destek.
- Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
- Hücrelere önceden ısınmış ayrışma ortamı ekleyin ve 37 °C'de 12 dakika kuluçkaya yatırın ve %5 CO2.
- Hücrelere destek ortamı ekleyin.
NOT: Eklenen destek ortamının hacmi, adım 1.4'te kullanılan dissosiation ortamının iki katı hacim olmalıdır. - Hücreleri 5 mL serolojik pipet kullanarak yerinden çıkar.
- 5 dk için 200 x g santrifüj hücreleri ve hiPSC-CM kültür orta 3 mL pelet resuspend17.
- Tohum hücreleri 8 iyi cam alt odalarında bir hücre yoğunluğu 75.000 hücre / iyi ve kültür 3 gün.
2. Erişkin kardiyomiyosit izolasyonu
- NMRI farelerden erişkin kardiyomiyositlerin izolasyonu ve ekimi daha önce bildirildiği gibi18.
- Tohum hücreleri 8 iyi cam odası slayt ve kültür bir gün için.
3. Yenidoğan kardiyomiyositlerin izolasyonu ve ekimi
- NMRI farelerden elde edilen neonatal kardiyomiyositlerin izolasyon işlemi daha önce açıklandığı gibi19.
- Tohum izole hücre 8 iyi cam odasında slayt bir hücre yoğunluğu 75.000 hücre / iyi ve kültür 3 gün boyunca neonatal CM kültür orta19.
4. α-aktinin ağının immünofloresan etiketleme
NOT: En iyi sonuçlar için hücreler 8 kuyu cam alt bölmesinde kültürlenir. Görüntülemeden bir gün önce etiketleme yapılmalıdır.
- 37 °C'de %4'lük Bir EBM ısı.
- IPSC-CM'yi doğrudan kültür ortamına %4 paraformaldehit ekleyerek düzeltin (1:1 seyreltme) ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Fiksasyon için PFA'nın son konsantrasyonu %2'dir.
- Sabit hücreleri %0.2 Triton-X'te, PBS'de seyreltilmiş olarak oda sıcaklığında 5 dk inkübedin.
- Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her biri 5 dk.
- %1 BSA çözeltisi (PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatırın.
- %0.05 Triton-X içeren α-aktin antikor 1:100% 1 BSA seyrelterek primer antikor çözeltisi 150 μL hazırlayın. Hücrelere ekleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Hücreleri %0,2 BSA çözeltisi ile iki kez yıkayın, her biri 5 dakika.
- Keçi-anti-fare Alexa647 antikor 1:100% 1 BSA seyreltme tarafından ikincil antikor çözeltisi 150 μL hazırlayın, içeren 0.05% Triton-X. Hücrelere ekleyin ve 40 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Hücreleri %0,2 BSA çözeltisi ile iki kez yıkayın, her biri 5 dakika.
- Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her biri 5 dk. PALM görüntülemeye kadar etiketli hücreleri 4 °C'de karanlıkta tutun.
5. PALM görüntüleme tamponunun hazırlanması
NOT: Her deney için PALM görüntüleme tamponunu yeni olarak hazırlamak çok önemlidir.
- 25 g glikozu 50 mL distile suda eriterek %50 glikoz çözeltisi hazırlayın.
- 50 mM Tris-HCl, %10 glikoz ve 10 mM sodyum klorür içeren temel tamponu hazırlayın.
- Hidroklorik asit kullanarak pH seviyesini ~8.0'a ayarlayın.
- 0.6 mg piranose oksidazın 316 μL bazik tamponda eriterek piranose oksidaz çözeltisini hazırlayın.
- Temel tampon500 μL 7 mg katalaz eriterek katalaz çözeltisi hazırlayın. Mix iyice ve santrifüj 10,000 x g 3 dakika için. Daha fazla kullanım için supernatant tutun. Katalaz çözeltisi 4 °C'de birkaç gün tutulabilir.
- 316 μL piranose oksidaz çözeltisi, 25 μL katalaz çözeltisi, 100 μL%50 glikoz çözeltisi, 50 μL cysteamine, 5 μL siklooctatetraene ve 3,5 l β-Mercaptoethanol'u karıştırarak 500 μL PALM görüntüleme tamponu hazırlayın. Piranoz oksidaz ve katalazın son katalitik aktivitesi sırasıyla 7.5 U, 35.00U olmalıdır.
NOT: PALM görüntüleme tamponu 3-5 saat için en uygun görüntüleme koşullarını sağlar. Floresan boyanın yanıp sönme kapasitesi azalırsa, yeni bir arabellek aliquot hazırlayın.
6. PALM görüntü edinimi
- Kullanmadan önce mikroskobu en az 3 saat açın ve termal dengesağlamak için görüntülemeden önce numuneyi oda sıcaklığına getirin. Mikroskop bir kuluçka odası ile donatılmışsa, sıcaklığı 30 °C'ye ayarlayın.
- Uygun bir temizleme çözücüsi kullanarak hazne slaydının amacını ve altını temizleyin.
- Etiketli hücrelerin bir kuyuiçine 300 μL PALM görüntüleme tamponu ekleyin ve oda slaytını mikroskobun sahne tutucuya yerleştirin.
- PALM görüntü edinme parametrelerini ayarlayın.
- Satın alma için 1.57 N.A. 100x yağ hedefini seçin.
- PALM modunu seçin ve TIRF ayarlarını etkinleştirin.
- Elde edilecek kare sayısını ayarlayın. Genellikle 5, 000-10, 000 kare optimum sonuçları elde etmek için yeterlidir. Ancak, edinilen çerçevelerin sayısı güçlü etiketleme verimliliği ve floresan boya yanıp sönen yeteneğine bağlıdır ve kullanıcı tarafından ayarlanabilir.
- UV lazer gücünü %0,1'e, 647 lazeri %0,2'ye ayarlayın.
- Kazanç seviyesini 50-100'e ayarlayın.
- Lazer aydınlatmasını açın ve bir hedef hücre seçin. Sinyal yoğunluğu düşükse (floresan etiketlemeye bağlı olarak) kazanç seviyesi artırılabilir.
- Lazer aydınlatmasını kapatın
- PALM görüntü edinimi
- Kazancı 0'a düşürün ve lazer gücünü (ex 647) %100'e yükseltin.
- ~5 s için hedef hücrebleach.
- Kazancı 50'ye yükseltin ve PALM görüntü edinimi başlatın.
NOT: Aşırı doygun piksellerden kaçınılması gerekirken, yeterli sinyal yoğunluğu elde etmek için kazancın ayarlanması gerekir. Sinyal yoğunluğu azalırsa, kazanç düzeyini artırın.
- İsteğe bağlı olarak, sürekli UV lazer gücünü artırmak (%0.1-10%) sinyal yoğunluğunu artırmak ve florofor yanıp sönmesini teşvik etmek.
7. PALM verilerinin yeniden yapılandırılması
- Image J yazılımını açın ve PALM verilerini aktarın.
- Açık Thunderstorm Eklentisi ve "Run analizi"
- "Camera setup" menüsünde piksel boyutu ve EM kazanç girin.
NOT: 100x hedefleri ve 1.6x büyütme lensi kullanırken, 100 nm piksel boyutu uygundur. Ancak, piksel boyutu PALM görüntüleme için kullanılan mikroskop ve kameranın donanım özelliklerine bağlı olarak, kullanıcıların dikkatle kontrol etmek ve bu parametre uyarlamak gerekir. EM kazanç değerleri meta verilerden elde edilebilir. - "Çalıştır analizi menüsünde" Analiz menüsünde " set parametreleri: B-spline sırası: 3, B-spline ölçeği: 2.0, tepe yoğunluk eşiği: stf(Wave.F1), montaj yarıçapı: 3, başlangıç sigma: 1.6, büyütme: 5.0, güncelleme frekansı: 50, yanal vardiya: 2. "Ok" düğmesine tıklayarak onaylayın.
- "Camera setup" menüsünde piksel boyutu ve EM kazanç girin.
- Yeniden inşa edilen PALM görüntüsünün işlenmesi sonrası
- "Plot histogram" menüsünde "Sigma" parametresini seçin.
- Olası eşyalar hariç olmak üzere bir YG seçmek ve filtreye YG uygulamak için "Dikdörtgen" aracını kullanın. YG değerleri filtre komut kutusunda görünür.
- YG değerlerine "& belirsizlik &25" ekleyin. Olası bir filtre komutu şuna benzer: "(sigma > 48.6821 & sigma & 1117.40) & belirsizlik & belirsizlik &25". Seçili sigma değerlerini uygulayın.
- "Yinelenenleri kaldır" menüsünde, "10 nm" mesafe eşiğini girin ve uygulayın.
- "Birleştirme menüsünde,maksimum mesafeyi "20"ye, molekül başına maksimum kareyi "0"a, maksimum kapalı kareleri ise "1"e ayarlayın. Ayarları uygulayın.
- "Drift düzeltme menüsünde" Drift düzeltme menüsünde, çapraz korelasyon seçin ve "Kutu Sayısı" ile "5" ve "Büyütme" ile "5,0" olarak ayarlayın. Drift düzeltme ayarlarını uygulayın.
- Son PALM görüntüsünü kaydedin ve istenirse işlenmiş verileri dışa aktarın.
8. Sarcomere filamentlerin analizi
- Sarcomere uzunluğunun analizi
- Image J yazılımını açın ve yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü aktarın.
- Aktin filamentleri arasındaki en kısa mesafeyi ölçmek için z diske dik olarak seçilen sarcomere yapıları arasında bir çizgi çizin.
- "Analyze" menüsünde "Çizim profili" seçeneğini belirleyin ve iki tepe arasındaki uzunluğu elde edin. Sarcomere uzunluğu bir hücre içinde farklılık gösterebileceğinden, hedef hücrenin farklı bölgelerinde en az 20 sarcomere ölçülmelidir.
- z-Disk kalınlığının analizi
- Image J yazılımını açın ve yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü aktarın.
- Yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü 8 bit lik modlu bir görüntüye dönüştürün.
- Sırt algılama eklentisini açın ve aşağıdaki parametreleri girin: çizgi genişliği: 20, yüksek kontrast: 230, düşük kontrast: 10, sigma: 0,79, alt eşik: 25,84, minimum hat uzunluğu: 20.
- "Tahmin genişliği", "Genişletme satırı" ve "Görüntü sonuçları" kümesi.
- Daha fazla analiz için "Tamam" ı tıklayın ve sonuçlar tablosundan "Ortalama çizgi genişliği" kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CM yapısal olgunlaşma derecesini tahmin etmek için, neonatal, tamamen olgun yetişkin, ve iPSC CM başlangıçta sarcomere ağ görselleştirmek için α-aktinin antikor ile CM etiketli edildi. PALM'ın satın alınmasının ardından görüntüler yeniden oluşturuldu ve z-disk kalınlığı, tek tek filamentlerin genişliğinin otomatik olarak algılanması için eklenti tabanlı görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sarcomere uzunluğu komşu filamentlere karşılık gelen iki komşu yoğunluk zirvesi arasındaki mesafe ölçülerek hesaplanmıştır. Şekil 1, iPSC'lerden türetilen CM'deki sarcomere organizasyonunun değerlendirmesini göstermektedir.
Şekil 2A'dasunulduğu gibi, iPSC-CM ve yenidoğan hücrelerinde düzensiz, düzensiz sarcomere yapıları ile benzer bir α aktinin deseni saptadı. Aynı şekilde, kantitatif değerlendirme, α-aktin in filamentlerinin uzunluğu ve kalınlığının hemen hemen aynı olduğunu ve bu da iPSC CM'nin erken gelişimdurumunu gösterdiğini göstermiştir. Daha doğrusu, ortalama sarcomere uzunluğu yaklaşık 1.83 μm (yetişkin vs iPSC CM vs neonatal CM: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm vs. idi. 1.82±0.03 μm, n=20 hücre), z-Disk kalınlığı yaklaşık 74 nm iken (yetişkin vs. iPSC CM vs. yenidoğan CM: 71.30 ± 1.64 vs. 73.95 ± 0.86 nm vs. ± 0.12 nm, n=20 hücreleri)(Şekil 2B). Buna karşılık, yetişkin olgun CM biraz artmış sarcomere uzunluğu ve azaltılmış z-Disk kalınlığı ile düzenli bir sarcomere ağ gösterdi.
Konvansiyonel konfokal görüntüleme ve PALM karşılaştırması sarcomere uzunluğu(Şekil 2C)(konfokal vs PALM: 1,75 ± 0,02 vs 1,70 ± 0,02, n=10 hücreleri) anlamlı bir fark göstermedi. Ancak, iPSC-CM PALM görüntülemeye(Şekil 2C)(konfokal vs PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31, n=10 hücreler) maruz kaldığında derin bir azalma z-Disk kalınlığı saptanmıştır. Temsili görüntüler, PALM uygulandığında, ilgili yoğunluk çizimleri tarafından desteklenen çözünürlükteki kazancı vurgular (Şekil 2D,E). Floresan yoğunluğunun yarı maksimum olarak hesaplanan tam genişliği, standart konfokal mikroskopiile karşılaştırıldığında PALM görüntülerinde α aktinin yapılarının ~3 kat daha ince olduğunu ortayakoymuştur (Şekil 2E).
PALM gibi tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu, kırınım sınırının çok altında hücre içi yapıların tespitini sağlar. Maksimum uzamsal çözünürlüğü sağlamak için, tek moleküllü lokalizasyonun kesin tespiti için uygun görüntüleme koşulları gereklidir. Kullanılan görüntüleme tampon sistemi, floresan boyanın fotofiziksel özelliklerini etkilediği ve böylece son PALM görüntüsünün genel çözünürlüğü ve doğruluğu üzerinde önemli bir etkisi olduğu için bu satın alma süreci için çok önemlidir. Görüntülemeden bir gün önce hazırlanan yüksek kaliteli tampon ve tampon arasındaki karşılaştırmada filament kalınlığında derin bir fark saptandı(Şekil 3A,B). Düşük kaliteli tampon ile elde edilen sarcomere yapıları optimum görüntüleme koşullarına göre daha kalın görüner(Şekil 3A). Nitekim kantitatif değerlendirme z-Disk kalınlığının ~%65 oranında arttığını göstermiştir (yüksek kalite ile düşük kalite: 73,87 ± 1,02 nm ile 113,9 ± 1,33 nm, n=155 filament)(Şekil 3B). Bu veri doğruluğu eksikliği, floroforun yerelleştirme olayı başına daha az algılanan fotonların (yüksek ve düşük arabellek kalitesi: 29689 foton/olay vs. 16422 foton/olaylar) daha az algılanan fotonlarla sonuçlanan yanıp sönme özelliklerinin azalmasından kaynaklanmaktadır (Şekil 3C). Ayrıca, bozulan görüntüleme koşullarında yerelleştirme hassasiyeti azalır (yüksek kalite ye karşı düşük kalite: 14,25 ± 5,85 nm ile 19,56 ± 6,7 nm), bu da yeniden inşa edilen PALM görüntüsünün genel çözünürlüğünü düşürür(Şekil 3C).
Buna ek olarak, örnek kayması, örneğin, termal istikrarsızlık nedeniyle, floresan moleküllerin hassas lokalizasyonu etkileyebilir ve bulanık görüntüler sonuçları, Şekil 3Dsunulduğu gibi . Optimal PALM görüntüleme açık ve iyi tanımlanmış yoğunluk zirveleri sağlarken, aşırı örnek kayması iki bitişik filament arasındaki mesafeyi doğru bir şekilde belirlemeyi zorlaştıran düzensiz bir yoğunluk deseni üretir. Bu veriler, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobunda sıkı bir şekilde kontrol edilen görüntüleme koşullarının önemini vurgular, çünkü satın alma işlemi sırasında ki ince değişiklikler bile görüntü kalitesini ve veri doğruluğunu önemli ölçüde azaltabilir.
Şekil 1: iPSCs kaynaklı CM sarcomere organizasyonunun değerlendirilmesi.
Sarcomere ağ floresan bir α-actinin antikor ile etiketlenmiş, PALM görüntü edinimi izledi. Sonraki yeniden yapılanma nicel analiz için kullanılan son PALM görüntü yol açar. Bireysel sarkometrelerin uzunluğu komşu sarcomere filamentlerine karşılık gelen iki yoğunluk zirvesi arasındaki mesafe ölçülerek belirlendi (1-5). Z-Disk kalınlığı otomatik olarak bir eklenti tabanlı görüntü işleme aracı tarafından hesaplandı. Ölçek çubuğu 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CM'de z-disk kalınlığı ve sarcomere uzunluğunun iPSC'ler, erişkin ler ve neonatal kalp dokusundan elde edilen kantitatif karşılaştırması.
(A) iPSC ve neonatal CM α-actinin ağının yeniden inşa palm görüntüleri. (B) Kantitatif değerlendirme tüm yenidoğan ve sarcomere uzunluğu yüksek benzerlik paylaşmak (yetişkin vs iPSC CM vs neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1.82±003 μm) ve bireysel fillaments kalınlığı (vs yetişkin) ve kalınlık ortaya koymuştur. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 ile 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), iPSC CM.' nin erken fenotipini gösteren (C) Konvansiyonel konfokal görüntüleme ile PALM tabanlı veri toplama arasında sarcomere uzunluğu ve z-Disk kalınlığının karşılaştırılması. Sarcomere uzunluğu pik-to-peak mesafe ölçülerek belirlendi, veri doğruluğu üzerinde artan çözünürlük etkisi daha az belirgin oldu (konfokal vs PALM: 1,75 ± 0,02 vs 1,70 ± 0,02). Buna karşılık PALM uygulandığında önemli ölçüde daha düşük z-Disk kalınlığı saptanır (konfokal vs PALM: 224,71 ± 4,31 ± 1,31). (D) Konfokal ve PALM görüntüleme ile elde edilen iPSC-CM'nin temsili mikroskobik görüntüleri. (E) (D)'de gösterilen kırmızı çizgiye karşılık gelen floresan yoğunluğu çizimleri. Değerler, tam genişliği en fazla yarı floresan yoğunluğunda temsil eder ve palm görüntülerinde çözünürlüğün de derin bir artış gösterdiğini gösterir. Veriler ortalama ± SEM, n=10-20 hücre, hücre başına 20 sarcomere olarak değerlendirildi. İstatistiksel anlamlılık t-Test. **p<0.005, Ölçek çubuğu 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Tampon kalitesi ve örnek kaymasının veri doğruluğu ve güvenilirliği üzerindeki etkisi.
(A) Farklı görüntüleme koşullarında elde edilen iPSC kaynaklı CM'nin temsili PALM görüntüleri. Sarcomere filamentler düşük kaliteli tampon ile görüntülenmiş örneklerde kalın görünür. Kırmızı çizgiler sarcomere uzunluğunun temsili ölçümlerini gösterirken, yeşil filament yapıları z-Disk analizine dahil edilmiştir. (B) Kantitatif değerlendirme, z-Disk kalınlığının düşük ve yüksek kaliteli tampon (yüksek vs. arasında önemli bir fark olduğunu doğruladı. düşük tampon kalitesi: 73,87 ± 1,02 nm vs 113,9 ± 1,34 nm) (C) Görüntü doğruluğundaki bu fark floroforun daha az yanıp sönme yeteneğine dayanıyordu ve molekül başına tespit edilen fotonların sayısı azaldı (yüksek vs. düşük tampon kalitesi: 29689 foton/olay vs. 1642 foton/olaylar). Aynı zamanda, yerelleştirme hassasiyeti azaltıldı ve bu da genel çözünürlüğü düşürdü (yüksek ve düşük tampon kalitesi: 14,25 ± 5,85 ± 6,7)(D)Aynı şekilde, aşırı numune kayması görüntü kalitesini bozabilir. Örnek kayması olmadan uygun görüntü edinimi α-aktin filamentlerinin iyi tanımlanmış yoğunluk zirvelerine yol gösterirken, artan numune kayması düzensiz bir yoğunluk deseni ne kadar da güçlü bir şekilde sarcomere uzunluğunun doğru analizini etkiler. Veriler ortalama ± sem. 155 filament analiz edildi. Öğrenciler t-Test ile istatistiksel anlamlılık belirlendi. ****p<0.0001. Ölçek çubuğu 10μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fonksiyonel iPSC türetilmiş CM in vitro üretimi rejeneratif tedaviler, hastalık modelleme ve ilaç tarama platformlarının geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, bu CM yetersiz olgunluk kardiyovasküler araştırma önemli bir engeldir20. Bu bağlamda, iPSC kaynaklı CM'nin yapısal olgunlaşma durumunun izlenmesini sağlayacak yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerine ihtiyaç vardır. Aynı zamanda, süper çözünürlüklü mikroskopi tam olarak belirli proteinlerin işlevini analiz etmek için değerli bir araç olabilir, son zamanlarda titin ve troponin için gösterildiği gibi uygun sarcomere oluşumu için gerekli10,21,22.
Mevcut protokolde, α-aktinin sarcomere ağını analiz ederek iPSC CM'nin yapısal olgunlaşmasını nicel olarak değerlendirmek için PALM tabanlı bir yaklaşım savuruyoruz.
Geleneksel ışık mikroskobu ile karşılaştırıldığında, PALM ~ 20-50 nm23çözünürlüğü ile hücresel yapıların görselleştirilmesisağlar. Böylece, klasik ışık mikroskobu yaklaşımları ile zar zor ya da hatta tespit edilemeyen kardiyak sarcomere ağının bile ince değişikliklerini tespit etmenizi sağlar. PALM uygulayarak, iPSC ve neonatal CM 'de ~1.84 μm ortalama sarcomere uzunluğunu ölçtük(Şekil 2). Bu bireysel sarcomeres boyutunu ~ 1.7-2.0 μm24,25,26olduğunu gösteren birkaç önceki raporlar ile uyumludur. Sarcomere uzunluğu ile karşılaştırıldığında, z-çizgilerin kalınlığının kesin tahmini, ışık mikroskobunun klasik çözünürlük sınırının çok altında olduğu için daha karmaşıktır. Elektron mikroskobu kullanılarak yapılan önceki çalışmalarda z-Disk kalınlığının iPSC CM'de 50 ile 80 nm arasında değiştiği ortaya konmuş, bu da PALM tabanlı ~73 nm tespitine benzer(Şekil 2).
Standart konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında PALM uygulandığında çözünürlükdramatik artış gösterdi. PALM görüntülemeden sonra 3 kat daha düşük z-Disk kalınlığı bulduk (Şekil 2). Ancak sarcomere uzunluğu için anlamlı bir fark ölçüldü. Bu parametre yoğunluk çizimlerinin en tepeden tepeye uzaklığı algılandırılarak ölçüldüğünde, artan çözünürlüğün etkisi daha az belirgindir.
Bu yüksek uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için PALM, kullanıcı tarafından dikkatle ele alınması gereken iyi tanımlanmış görüntüleme koşulları gerektirir. Tek moleküllerin doğru bir lokalizasyonu için, fluoropores özel fotofiziksel özelliklere sahip, floresan ve koyu hal arasında hızlı geçiş sağlayan gereklidir, yanıp sönen denir27. Daha önce de gösterildiği gibi, floroforların seçimi kuvvetle görüntü kalitesini etkileyebilir28. Derin bir yanıp sönen yeteneği Alexa 647, tek molekül lokalizasyon mikroskopisi için en iyi ve yaygın olarak kullanılan boyalar biri için tarif edildi29,30,31. Ancak, çok sayıda PALM floropores mevcut olduğundan, kullanıcılar örnek etiketleme açısından yüksek esnekliğe sahip olacak27,28.
Uygun florofor seçiminin yanı sıra, görüntüleme tampon sistemi floresan boyanın fotofiziksel özelliklerini dikte olarak PALM görüntülemede bir başka kritik noktadır. Biz artan bir pH stabilitesi sağlar gibi glikoz oksidaz üstün bir oksijen çöpçü sistemi olarak pyranose oksidaz uyguladık, dolayısıyla, florofor önemli bir azalma olmadan uzun vadeli görüntüleme sağlayan zaman içinde yanıp sönen32,33. Ancak, görüntüleme arabelleği ömrü birkaç saat ile sınırlı olduğundan, yüksek tekrarlanabilirlik sağlamak için her deney için taze hazırlanmış olmalıdır. Sonuçlarımız, düşük kaliteli tampon ile PALM görüntüleme sonrasında veri doğruluğunda önemli bir azalma olduğunu, bu da göz kırpma yeteneğinin bozulmasına ve lokalizasyon hassasiyetinin azalmasına yol açan sonuçlar göstermektedir(Şekil 3A-C).
Ayrıca, artan numune sürüklenmeönlemek için görüntüleme sisteminin termal stabilitesi zorunludur. Orta düzeyde ki sapma hesaplamalı analizle düzeltilebilirken, aşırı numune hareketi tespit edilen florofororların yanlış hesaplanmış lokalizasyonuna yol açar ve görüntü kalitesini ve veri doğruluğunu azaltır. Bu, PALM görüntülemeye başlamadan önce ısıtma odaları na sahip mikroskoplar ve ilgili numunenin yeterli termal dengelemesi ile önlenebilir. Buna ek olarak, etiketleme yoğunluğu ve verimliliği yanı sıra antikor parçaları veya nanobodies kullanımı görüntüleme koşulları optimize etmek için düşünülmelidir34,35,36.
Büyük hücresel yapıların edinim süreci görüntüleme parametrelerine (görüş alanı, floresan prob, görüntüleme tamponu vb.) bağlı olarak 10-30 dakika sürebilir. Bu uzun edinme süresi palm bir dezavantajı olan daha az canlı hücre görüntüleme için uygun hale getirir. Genellikle, 5.000-10.000 kare, yüksek yerelleştirme hassasiyetiyle yeterli sayıda yanıp sönen olay elde etmek için yakalanır. Ayrıca, görüntüleme derinliği genellikle birkaç yüz nanometre ile sınırlıdır, hangi zor kalın örnekleri araştırmak için yapar. Ancak, z yönünde gelişmiş çözünürlük 3D PALM kurulumu37ile elde edilebilir.
Sarcomere uzunluğu ve z-Disk kalınlığı dahil olmak üzere iPSC CM'nin α-aktinin ağını karakterize etmek için iki parametre seçtik. Filaman oryantasyonu gibi sarcomere iskelesi hakkında daha kapsamlı bir görünüm elde etmek için ek özellikler toplanabilir. Aynı şekilde, 3D PALM, ağ içindeki mevcut düğümleri ve dalları tahmin ederek tüm sarcomere yapısını nicel olarak analiz etmeye yardımcı olabilir.
PALM sarcomere yapısının çok ayrıntılı bir analizini sağlar rağmen, Bu yöntem hücresel kontrility gibi fonksiyonel parametrelerin edinimi izin vermez, hangi kardiyak olgunluk değerlendirmek için başka önemli bir özelliktir. Eski raporlar sarcomere yapısının mikroskopi tabanlı değerlendirme fonksiyonel veri elde etmek için video analizi ile kombine edilebilir göstermiştir38,39. Ancak, yazarlar geleneksel floresan mikroskobu kullanmış olduğundan sarcomere yapısı hakkında elde edilen veriler PALM ile karşılaştırıldığında daha az doğrudur. Yaklaşımımız aynı zamanda PALM verilerini önceki zaman atlamalı kayıtlarla ilişkilendirme olanağı sağlar ve bu nedenle daralma ölçümlerinin elde edilmesine olanak sağlar.
Özetle, bu protokol cm sarcomere ağının yapısal olgunlaşma sını nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma AB Yapısal Fonu (ESF/14-BM-A55-0024/18) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, H.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi FORUN Programı (889001 ve 889003) ve Josef ve Käthe Klinz Vakfı (T319/29737/2017) tarafından desteklenir. C.I.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi'nin Klinisyen Bilim Adamı Programı tarafından desteklenir. R.D DFG (DA1296/6-1), DAMP vakfı, Alman Kalp Vakfı (F/01/12) ve BMBF (VIP+ 00240) tarafından desteklenir.
Madeleine Bartsch'a iPSC hücre kültürü ve kardiyak farklılaşmadaki teknik desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
