Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.

Abstract

ניאונים נמצאים בסיכון מוגבר לאח דם חיידקי בשל הפרופיל החיסוני הייחודי שהם מציגים בחודשים הראשונים לחיים. הקמנו פרוטוקול לחקר הפתוגנזה של E. coli O1:K1:H7, סרוטיפ האחראי לשיעורי תמותה גבוהים בערימות. השיטה שלנו משתמשת בהדמיה תוך-בלתי נמנעת של גורי יילודים בנקודות זמן שונות במהלך התקדמות הזיהום. הדמיה זו, המקבילה למדידת חיידקים בדם, פרופיל דלקתי והיסטופתולוגיה של רקמות, מסמלת גישה קפדנית להבנת דינמיקת הזיהום במהלך אלח דם. בדו"ח הנוכחי, אנו מודל שני inoculums זיהומיות להשוואה של נטל חיידקי וחומרת המחלה. אנו מוצאים כי זיהום תת-שרירי מוביל לזיהום מופץ על ידי 10 שעות לאחר ההדבקה. על ידי 24 שעות, זיהום של זוהר E. coli היה בשפע בדם, ריאות, ורקמות היקפיות אחרות. ביטוי של ציטוקיני דלקתיות בריאות הוא משמעותי ב 24 שעות, וזה ואחריו חדירה תאית וראיות של נזק לרקמות כי עולה עם מינון זיהומיות. להדמיה תוך-ויתית יש כמה מגבלות. זה כולל סף אות זוהר וכמה סיבוכים שיכולים להתעורר עם בירנים במהלך ההרדמה. למרות כמה מגבלות, אנו מוצאים כי מודל הזיהום שלנו מציע תובנה להבנת דינמיקת זיהום אורך במהלך אלח דם מורין יילודים, זה לא נבדק ביסודיות עד כה. אנו מצפים מודל זה יכול להיות מותאם גם ללמוד זיהומים חיידקיים קריטיים אחרים במהלך החיים המוקדמים.

Introduction

אלח דם חיידקי הוא דאגה משמעותית עבור neonates המציגים פרופיל חיסוני ייחודי בימים הראשונים של החיים שאינו מספק הגנה נאותה מפניזיהום 1. אלח דם יילודים ממשיך להיות בעיה משמעותית בארה"ב. בריאות חשבונאות יותר מ 75,000 מקרים בשנה בארה"בלבדה 2. כדי לחקור את זיהומים אלה לעומק, מודלים חדשניים של בעלי חיים כי recapitulate היבטים של מחלות אנושיות נדרשים. הקמנו מודל זיהום עכבר יילודים באמצעות Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli הוא הגורם המוביל השני של אלח דם יילודים בארה"ב, אבל אחראי על רוב התמותה הקשורים אלחדם 4,5. עם זאת, זוהי הסיבה המובילה כאשר טרום טווח ותינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (VLBW) נחשבים באופן עצמאי5. הסרוטיפ K1 מזוהה לעתים קרובות ביותר עם זיהומים פולשים במחזור הדם ודלקת קרום המוח בneonates 6,7. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפול אחרות מעבר לאנטיביוטיקה וטיפול תומך. בינתיים, שיעורי עמידות לאנטיביוטיקה ממשיכים לעלות עבור חיידקים פתוגניים רבים, עם כמה זנים של E. coli עמידים בפני שפע של אנטיביוטיקה נפוץבטיפול 8. לכן, זה הכרחי כי אנו ממשיכים לייצר שיטות ללמוד את המנגנונים של אלח דם ואת התגובה המארחת ב neonates. תוצאות אלה יכולות לעזור לשפר את הטיפולים הנוכחיים ואת תוצאות הזיהום.

המצב החיסוני של מילים מאופיין בהבדלים פנוטיפיים ותפקודיים בהשוואה למבוגרים. לדוגמה, רמות גבוהות של ציטוקינות אנטי דלקתיות ורגולטוריות, כגון אינטרלוקין (IL)-10 ו IL-27, הוכחו להיות מיוצר על ידי מקרופאגים שמקורם בדם טבור נמצאים ברמות גבוהות יותר בסרום שלניאונטיות מורין 9,10,11. זה עולה בקנה אחד עם רמות נמוכות יותר של IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 ו- TNF-α המדווחים לעתים קרובות מתאים יילודים בהשוואה לעמיתיהםהבוגרים 10. בנוסף, מערכת החיסון של יילודים מוטה לכיוון תגובת תאי T Th2 ורגולציה לעומתמבוגרים 12. מספרים גבוהים של נויטרופילים, תאי T, תאי B, תאי NK ומונוציטים נמצאים גם הם בניבים, אך עם ליקויים תפקודיים משמעותיים. זה כולל פגמים בביטוי של סמני פני תאים והצגת אנטיגן המצביעים עלחוסר בגרות 13,14,15. בנוסף, נויטרופילים יילודים לוקים בחוסר משמעותי ביכולתם לנדוד לגורמים כימוטקטיים16. תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) נמצאים גם הם ברמות גבוהות של יאלואטים והוצג לאחרונה כמקור ל- IL-2711. MDSCs הם מאוד מדכאים כלפי תאי T17. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים מגבלות בחסינות יילודים המלוות רגישות מוגברת לזיהום.

כדי לחקור את התקדמות הנטל החיידקי ול לנתח תגובות חיסוניות מארח מגן במהלך אלח דם יילודים, פיתחנו מודל זיהום חדשני. עכברי יילודים בימים 3-4 של החיים קשה להזריק בחלל תוך-לידתי או וריד הזנב. במודל שלנו, יום 3 או 4 גורים מנוהלים inoculum חיידקי או PBS תת עורית לאזור השעיר לעזאזל. זיהום מערכתי מתפתח באמצעות אור E. coli O1:K1:H7, אנחנו יכולים אורך תמונה עכברים יילודים בודדים כדי לעקוב אחר הנטל החיידקי המופצת ברקמות היקפיות. זהו המודל המדווח הראשון להשתמש הדמיה תוך ואט כדי להבין את הקינטיקה של הפצת חיידקים במהלך אלח דם ב- murine neonates3.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום זיהומים ספיגה E. coli בעכברים יילודים3. אנו מתארים כיצד להכין את אינוקולום החיידקים להזרקה, וכיצד לקצור רקמה להערכת פתולוגיה, מדידת סמנים דלקתיים על ידי ניתוח ביטוי גנים, ו ספירת הנטל החיידקי. בנוסף, מתואר גם השימוש ב- E. coli זוהר להדמיה תוך-בלתי נמנעת של יילודים נגועים וכימות הרג חיידקים על ידי תאי חיסון יילודים. פרוטוקולים אלה עשויים גם להיות מותאמים ללמוד זיהומים חיידקיים חשובים אחרים בוייחומים. הנתונים המוצגים כאן מייצגים גישה חדשנית כוללת להבנת דינמיקת ההדבקה במודל אלח דם יילודים מתתרגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדות לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים במערב וירג'יניה ונערך בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה על ידי המועצה הלאומיתלמחקר 18.

1. הכנת Inoculum בקטריאלי

  1. פס אגר סויה טריפטי (TSA) צלחת עם לולאה חיסון לבידוד של מושבה אחת ממלאי מקפיא של E. coli O1:K1:H7-lux המבטאת לוציפראז באופן יציב ונושאת עמידות קנאמיצין3. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת לאפשר מרק לוריא (LB) לבוא לטמפרטורת החדר (25 °C (60 °F) ב ארון biosafety.
  3. מתחת למכסה המנוע של ארון biosafety, לזהות מושבה אחת מהצלחת מפוספסת לחסן אותו 3 מ"ל של LB בתוספת kanamycin (30 מיקרוגרם / מ"ל). דגירה לילה ב 37 °C (60 °F) עם רעידות (220 סל"ד). זו תרבות המתנע.
  4. לדלל את תרבות המתנע 1:100 לתוך טרי 3 מ"ל של LB תחת מכסה המנוע ארון biosafety ולהחזיר אותו החממה עבור 2-3 שעות ב 37 °C (60 °F) עם רועד (220 סל"ד). זו תרבות המניות.
  5. קרא את הצפיפות האופטית (OD) של תרבות הריק והמלאי ב- 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. הוסף 100 μL של LB (לא מכיל חיידקים) לתוך באר אחת של צלחת מים תחתונה שטוחה 96 היטב; זה הריק. לאחר מכן להוסיף 100 μL מתרבות המניות לבא באר נפרדת. חזור על הפעולה עבור שני שכפולים נוספים. הספיגה נקראת באמצעות קורא לוחות.
  6. הפחת את הספיגה הריקה מתאים הספיגה של תרבות המניות (ערך ה- OD) והשווה לעקומת צמיחה שנוצרה בעבר ואומתה כדי לקבוע קירוב של צפיפות החיידקים בתרבות המניות להכנת מינון זיהומיות.
  7. צור inoculums היעד בהתאם לשאלת המחקר. אינקולום היעד של 2 x 106 (נמוך) ו 7 x 106 (גבוה) יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל עכבר (/עכבר) שימשו למחקר זה.
    1. לחלק את מינון היעד לכל עכבר(מינון T) על ידי הריכוז המשוער של חיידקים בתרבות המלאי (מלאי) כדי לקבל את נפח החיידקים הדרושים מצינור המניות (VS).
    2. הכפל VS במספר העכברים (NM)שצריכים להיות נגועים יחד עם מספיק עבור 5-10 תוספות עבור הכמות הכוללת של חיידקים הדרושים לזיהום בתוספת 5-10 מנות נוספות. הסר נפח זה מצינור המניות והוסף אותו לצינור צנטריפוגה חדש.
    3. השתמש במשוואה שלהלן:
      מינוןT/ Stock = VS x NM = נפח כולל (VT)של חיידקים שיש להסיר מצינור המניות.
  1. צנטריפוגה החיידקים ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ו resuspend גלולה חיידקית ב 50 μL של PBS (pH 7.2-7.6) לכל עכבר להידבק (למשל, עבור 10 מנות של 2 x 106 חיידקים בכל מנה, גלולה של 2 x 107 חיידקים יהיה resuspended ב 500 μL PBS). שוב, מומלץ להכין יותר אינוקולום מהצריך. הכן אמצעי אחסון שווה של PBS רק עבור חיסוני בקרה. לשמור על שליטה inoculum זיהומיות PBS על קרח עד זיהום.
  2. בצע שבעה דילולים סדרתיים פי עשרה לתוך PBS בצלחת דילול תחתונה מפלסטיק 96 היטב, וצלחת 25 μL של הדילולים כפול על צלחות TSA מרובע בתוספת kanamycin (30 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למנות את הכמות בפועל של חיידקים מנוהלים. דגירה ב 37 °C (69 °F) לילה להיווצרות המושבה לפני ספירת.

2. זיהוי בעלי חיים

  1. מסדרים מספר מספיק של זוגות רבייה כך שניתן לסנכרן פסולת עבור גורים תואמי גיל. השתנות גיל ± יום אחד מקובלת.
  2. זהה עכבר נקבה C57BL/6 בהריון ונטר ללידה של המלטה לקראת הניסוי המתוכנן כדי לקבוע במדויק את הגיל.
  3. כדי להבחין בין שליטה לבין גורים נגועים בני 3 או 4 ימים, השתמשו בזוג מספריים קטנים, בעלי קצה דק, כדי ללחוץ את קצות הזנבות של גורי הבקרה בלבד. הגורים הנגועים אינם מקבלים תווי זנב. לפני חיתוך הזנב, לחטא את העור עם כדור צמר גפן שתוך 70% אתנול. יש להפעיל לחץ על קצה הזנב עם כדור צמר גפן או גזה לפי הצורך.
    הערה: הליך זה מתבצע תחת מכסה המנוע של ארון biosafety. מספיק לחטוף זנב של בערך 1/8 אינץ'.
  4. כדי לזהות גורים בתוך קבוצות הבקרה והנגועות, השתמש במזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט קבועה של 28 גרם x 1/2 '' כדי לקעקע את זנבות הגורים. לפני הקעקוע, לחטא את העור עם כדור צמר גפן שתוך 70% אתנול. הליך זה מבוצע תחת מכסה המנוע של ארון biosafety.
  5. כדי לקעקע את הזנב, להחיל דיו קעקוע בעלי חיים על קצה המחט. לאחר מכן, לרסן בזהירות את הגור ביד אחת, עם הזנב שלהם חשוף לחלוטין. הכנס בעדינות את המחט מתחת לעור, תוך שמירה על רמת עומק שטחית, והזז את המחט במקביל לעור כמה מילימטרים עד שנוצר סימון קטן, או נקודה. המתן מספר שניות לפני הסרת המחט לאט מתחת לעור, כדי למנוע שחרור דיו עודף מתחת לעור.
  6. החל לחץ על הפצע עם כדור צמר גפן או גזה לפי הצורך. הסר דיו קעקוע עודף על פני השטח של העור עם 70% אתנול.
  7. חזור על תהליך זה עם העכברים הבאים בקבוצות נגועים ושליטה, תוך הוספת נקודה נוספת עם כל גור עוקב מקועקע (למשל, גור 1 יהיה 1 נקודה על הזנב שלהם, גור 2 יהיו שתי נקודות על הזנב שלהם, וכו ').
    הערה: עבור שכבה נוספת של זיהוי, מומלץ להשתמש בצבעים נפרדים של דיו קעקועים של בעלי חיים עבור קבוצות הבקרה והנגועים.

3. חיסון תת-יכול

הערה: עבור מחקר זה, 2 ניסויים בוצעו עם מינון נמוך וקבוצה במינון גבוה המיועדים לכל ניסוי. בניסוי הראשון, 7 גורים קיבלו את inoculum במינון נמוך (4 גורים שימשו פקדים), ו 5 גורים מן המלטה נפרדת קיבלו את המינון הגבוה (3 גורים שימשו פקדים). הגורים מניסוי 1 סיפקו נתונים רק לנקודת הזמן של 24 שעות. בניסוי השני, 8 גורים קיבלו את המינון הנמוך inoculum (2 גורים שימשו בקרות), ו 6 גורים קיבלו את inoculum במינון גבוה (2 גורים שימשו פקדים). גורים מניסוי 2 סיפקו נתונים עבור נקודות הזמן של 0, 10 ו- 24 שעות.

  1. גיל התאמה גורים ≤ 1 יום. להקצות כל המלטה כמו גם מינון נמוך או המלטה במינון גבוה. בתוך המלטה באופן אקראי להקצות גורים כגור שליטה או נגוע.
  2. ביום 3 או 4 לאחר הלידה, שיא משקולות של כל הגורים לפני חיסון עם E. coli-lux או בקרת PBS. הפרד את הסכר מהגורים במהלך תקופה זו כדי להבטיח שהם לא יועברו במהלך הזיהום.
  3. בתוך ארון biosafety באמצעות מחט אינסולין, שאפו PBS או E. coli-lux inoculum. עבור עבודה זו, נעשה שימוש ב- inoculums של 2 x10 6 ו- 7 x10 6 CFUs לכל עכבר. שמור הן אינוקולום זיהומיות PBS על קרח עד הממשל באמצעות הזרקה תת-שרירית.
  4. מניחים את הניאון על משטח נקי במכסה המנוע של הארון biosafety ולהרים את העור בעורף הצוואר כאילו כדי לגרד את הגור.
  5. בחלל שנוצר כעת בין העור לשריר החיה, הכנס את המחט, משופע, ממש מתחת לעור והזרק 50 μL של PBS או E. coli-lux. בו זמנית לשחרר את החלק הצבט של העור כדי למנוע הזרקה חזרה.
  6. הסר את המחט לאט ובזהירות. מניחים גורים בחזרה עם סכרים לאחר הזריקות הסתיימו.
    הערה: בשל השלב האנטומי שלהם בפיתוח, זה מאתגר מבחינה טכנית לנהל וריד זנב או הזרקת תוך לידתית לגורי יילודים ביום 3-4. לכן, מסלול ההדבקה התת-שרירי נבחר למחקר זה בשל קלות הביצוע.

4. הערכת קריטריונים למחלות ונקודות קצה

  1. לפקח על הגורים פעמיים ביום לאורך כל תקופת הזיהום. שים לב לכל חריגות במראה.
  2. שיא משקולות כמדידה אובייקטיבית של תחלואה.
  3. בנוסף לשינויים במשקל, לבדוק את היכולת של הגורים לימין את עצמם על ידי מיקום הניאון בצד הגב. בעלי חיים חולים לא יוכלו להתהפך לצד הגחוני ולרגליים או ישלימו פעולה זו בקושי.
  4. בדוק את הדברים הבאים כדי לסמן את בעלי החיים קרוב לקריטריונים של נקודות קצה: פחות מ -85% ממשקל הגוף הרגיל; ירידה בתנועה וחוסר היכולת לימין את עצמם; שינוי צבע של העור ומראה אפור או שקוף יותר לעומת ורוד; מרגיש קריר למגע, המעיד על ירידה בטמפרטורת הגוף וחבורות מדמם לאורך הצדדים, גם מעיד על מחלה מראש.
    הערה: אם הנידון לא הצליח לעלות במשקל במשך יומיים והתאים לאף אחד מהתיאורים בשלבים 4.4, הם עמדו בקריטריונים של נקודות קצה. גורים המקבלים את המינון הגבוה לעיתים קרובות עומדים בקריטריונים של נקודות קצה על ידי 24 שעות. גורי בקרה בתוך המלטה במינון נמוך וגוה יהיו מורדמים בו זמנית כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין קבוצות הבקרה והניסויים. המשך למדור המתת החסד למטה.

5. הדמיה ויוו של נטל חיידקי

  1. השתמש בתמונה ובתוכנות microCT להדמיה וניתוח עוקב.
    הערה: צבע עור גור אינו משפיע על איכות ההדמיה.
  2. מניחים את הכלוב עם עכברי יילודים נגועים ב- E. coli-luxוסכר לתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית ברמה BSL-2. הסר עכברים לתמונה, והצב לתוך תא isoflurane שקוף בתוך מכסה המנוע. מומלץ להתחיל עם פקדים לא מושפעים כדי לאמוד את כמות isoflurane הדרוש.
  3. פתח את התוכנה במחשב המחובר למיקרו-CT. אתחל את המערכת והמתן לטמפרטורת CCD לנעול ב -90 °C (60 °F).
  4. הפעל את אידוי isoflurane ולהתאים את החוגה לזרימת isoflurane 5%. שמור עכברים בתא עם תערובת isoflurane זה במשך 20-30 s עד שהם מפסיקים לזוז; ייתכן שיהיה צורך בזמני חשיפה ארוכים או קצרים יותר של הרדמה עבור עכברים מסוימים. ברגע שעכברים מפסיקים לזוז, הם מספיק מרודמה, ו ניתן לדמיין אותם.
  5. מעבירים עכברים לתא ההדמיה של microCT וממקמים אותם על תיבת ההדמיה בתדר הנוטה, כאשר האף פונה בניצב לקוביות האף. השתמש שעווה דנטלית בעדינות לרסן את הרגליים על תיבת ההדמיה כדי להגביל כל תנועה. ניתן דימוי של עד 4 עכברי יילודים בכל פעם.
  6. להפוך את אידוי isoflurane עד 2-4% זרימה כדי לשמור על עכברים הרדמה במהלך הדמיה. סגור את דלת תא ההדמיה של המיקרו-סי.טי. תבדוק את העכברים כמה שניות מאוחר יותר. אם הם מתחילים לזוז, לשרוט כדור צמר גפן ב isoflurane ולהחזיק אותו לאף של החיה נע במשך 5 שניות כדי להרדום. שמור את כדור הכותנה ליד בעלי החיים במהלך ההדמיה. היזהר לא יותר מדי הרדמה ולסיים את העכברים.
  7. באמצעות התוכנה, בחר באפשרות Luminescent להדמיה. השתמש במסנן העירור מוגדר כבלוק ומסנן הפליטה מוגדר כפתיחה, 500 ננונום, 520 ננום, 560 ננונום, 580 ננונום, 600 ננונום ו- 620 ננום. יהיו שבעה מסנני פליטה הכולל להגדיר עבור זוהר.
  8. תדמיין את העכברים בכל נקודת זמן (0, 10 ו- 24 שעות לאחר ההדבקה [hpi]) ושמור את כל התמונות בתיקיה עבור כל נקודת זמן. החזירו את הגורים לכלוב עם הסכר ובדקו שכל הגורים התאוששו מהרדמה.
  9. כדי לנתח תמונות הדו-מימד, פתח תמונות בתוכנה. שנה יחידות ל-Radiance (פוטונים); פעולה זו תהפוך לשטף הכולל (פוטונים/שניה).
  10. נתח ערכת תמונות אחת בלבד באמצעות מסנני הפליטה המרובים שלה בכל פעם. מכל ערכת תמונות, שים לב לערכי הזוהר המינימליים והמקסימום הממוקמים בפינה השמאלית התחתונה של כל תמונה (לדוגמה, אם קיימים 7 מסנני פליטה, יהיו 7 תמונות ו- 7 ערכי מינימום ומקסימום). חזור על הפעולה עבור כל ערכת תמונות שיש להשוות.
  11. לקביעת קנה מידה שיכלול את הערכים והתהוות של כל התמונות, אתר את הערך המינימלי הנמוך ביותר ואת הערך המרבי הגבוה ביותר עבור כל ערכת תמונות. לצורך מחקר זה, תמונות המסנן הפתוח שימשו כנציגות.
    1. סמן ופתח את התמונה לבחירה כדי לשנות את קנה המידה. בלוח הכלים, לחץ על הכרטיסיה התאמת תמונה ושנה את סרגל הצבעים לערכים המרביים המינימליים והגבוהים ביותר שזוהו בעבר. שמור כל ערכת תמונות כ- TIFF. לנתח בנפרד כל נקודת זמן באופן זה כדי להבטיח את קנה המידה הנכון מוצג.
  12. כדי לכמת את השטף הכולל (כמות אות זוהר לכל עכבר) עבור כל עכבר בודד, פתח תמונה כפי שתואר קודם לכן בשלב 5.9-5.10. פתחו את הכרטיסייה 'כלי ROI' בלוח הכלים ובחרו בכלי עיגול. בחר עיגול אחד אם מנתחים אזור אחד של זוהר.
  13. העבר את ROI ל-Overlay באזור האלוהות. התאם את גודל ההשקעה במקרה הצורך.
    הערה: אם יש צורך בהתאמה, התאימו את ה-ROIs בתמונות אחרות באופן דומה כדי לשמור על עקביות. בחר מדידת ROIs. החלון 'מדידות ROI' ייפתח ויוצג סה"כ שטף (p/s), זוהר ממוצע (p/s/cm2/sr),סטיית תקן של זוהר, זוהר מינימלי וזוהר מרבי.
  14. רשום מדידות שטף כוללות עבור כל ערכת תמונות. מספר זה הוא הכמות הכמות מכומתת של זוהר בעכבר בתמונות 2D.
  15. כדי ליצור תמונות microCT משוחזרות תלת-מימד, פתחו את החלונית 'שחזור תלת-מימדי של DLIT' בלוח הכלים ובדקו את כל אורכי הגל שייכללו תחת הכרטיסייה 'נתח'.

6. המתת חסד

  1. הכן וסמן צינורות עבור רקמות / איברים מעניינים עבור necropsy ויישומים במורד הזרם המתאים.
  2. הפרד את הניאונים מהסכר בארון ביו-בטיחותי.
  3. משרים כדור צמר גפן באזורים וטרינריים ומ מניחים בתוך תא בלימה שקוף.
  4. אם אוספים דם, להכין micropipette P200 עם קצה יש צינור 1.5 מ"ל עם 10 μL של 5 mM EDTA כמו נוגד קרישה. נפח של 50-200 μL של דם צפוי.
  5. מניחים ניאון בתא ומנטרים את הגור עד שהוא הופך להיות ללא תנועה.
  6. במהירות, להסיר ניאונט לערוף עם מספריים. אם מותר לנשום אוויר צח לתקופה ממושכת, הגור יכול לחזור להכרה. ניאונים צמצמו את קיבולת הריאות יחסית לעכברים בוגרים, ולכן אינם נושמים עמוק מספיק עבור המתת חסד על ידי isoflurane לבד.
  7. לאסוף דם מתא המטען בבסיס הראש באמצעות micropipette P200. כדי למקסם את כמות הדם שנאסף, בצע שלב זה מהר ככל האפשר לאחר עריפת ראש. לספור חיידקים בדם על ידי דילול סדרתי וספירת צלחת סטנדרטית כמתואר בשלב 1.9.
  8. לעקר את כל הניאון עם 70% אתנול לפני כריתה של דגימות רקמה.

7. קציר רקמות

  1. בתוך ארון biosafety, לשים את הניאון עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. הניחו את החיה על צדה הימני.
  2. באמצעות מדפים, לתפוס את העור בנקודה בין הבטן ורגל שמאל האחורית ולעשות חתך עם מספריים כירורגיים עדין. המשך לחתוך את העור משם נע כלפי מעלה לכיוון הגב. התקדם עד שכל הטחול ייחשף.
  3. השתמש במטסים כדי לתפוס את הטחול ולהסיר אותו מהבטן, באמצעות מספריים כדי לנתק את רקמת החיבור. מקם את הטחול בפתרון המתאים ליישום במורד הזרם שלו.
  4. כדי להשיג את הריאות, לקלף בחזרה את העור של החזה לחלוטין.
  5. נכנסים לבסיס עצם החזה עם מספריים מוחזקים אנכית, חותכים כלפי מעלה עד שכלוב הצלעות מתפצל.
  6. השתמש במקלפים כדי לתפוס את הריאות הימניות והשמאליות בנפרד ולהסיר אותן חלל בית החזה. הסר את הלב מרמת הריאה על ידי חיתוך עם מספריים.
  7. מניחים את הריאה בתסרון המתאים ליישום במורד הזרם שלה. לבידוד RNA, יש להשתמש ב-500 מיקרו-ל' של גואנידין תיוצ'יאנט/פנול (GTCP). עבור היסטופתולוגיה, השתמש 5 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי-מאגר.

8. בידוד רנ"א מרמת הריאה לביטוי גנים

  1. מצננים מראש את המיקרוצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. טחון את רקמת הריאה ב GTCP עם מספריים. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה עם homogenizer מופעל על ידי סוללה. המשך עד שהפתרון יהיה אחיד ככל האפשר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 - 5 דקות.
  3. באמצעות עצות פיפסה מסוננת, להוסיף 100 μL של כלורופורם. להפוך את הצינור במשך 15 s ו דגירה 3 - 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 x גרם.
  5. במהלך הספין, להכין 1.5 צינורות מ"ל עם 500 μL של 70% אתנול. להרכיב ולתייג את העמודות ואת צינורות האיסוף מתוך ערכת בידוד RNA.
  6. מוציאים בזהירות את השכבה העליונה והמיימת מבלי להפריע לשכבת האינטרפאז שנוצרה במהלך הצנטריפוגה. מניחים את השכבה המים בצינורות המכילים 70% אתנול.
  7. מעבירים את תערובת האתנול והליזות לעמודה בצינור האיסוף.
  8. מנקודה זו, בצע את פרוטוקול המוצר המסחרי ערכת בידוד RNA עד האלוטה הסופית של RNA.
  9. נתח את ה- RNA עבור טוהר וכמות. יש להשתמש מיד או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

9. סינתזת cDNA

  1. תווית צינורות PCR ולהניח בצד.
  2. הוסף 1 מיקרוגרם של RNA לתערובת התגובה cDNA עבור כל מדגם.
  3. הוסף את חברי ההנהלה והתבנית לצינור PCR כמתואר בפרוטוקול cDNA. מוסיפים את האנזים לתערובת אחרונה.
  4. מניחים צינורות PCR בתרמוציקלר עם הגדרות הריצה הבאות: 5 דקות ב 25 °C (69 °F) , 40 דקות ב 42 °C (69 °F) , 15 דקות ב 85 °C (69 °F) ו 4 °C (69 °F) אחיזה סופית.
  5. הסר צינורות PCR מן התרמוצ'ילר ולהשתמש מיד או לאחסן ב -20 °C (60 °F) עד לשימוש נוסף.

10. מחזור PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

  1. הכינו קוקטייל תערובת תגובה לכל אחד מהגנים שיש לנתח. כל 15 תגובת PCR μL דורש 7.5 μL של תערובת ריאגנט 2x, 0.75 μL של 20X 5'-FAM שכותרתו גנים ספציפי פריימר / בדיקה, ו 3.75 μL של מים ללא גרעין. אמפיליקונים נעים בדרך כלל בין 60-120 bp.
  2. הוסף 3 μL של תבנית cDNA עבור כל קבוצת ניסוי ל בארות המתאימות.
  3. הוסיפו 12 מיקרו-ל' של תערובת התגובה הספציפית לגנים לבאנות המתאימות.
  4. מכסים את הצלחת עם סרט דבק אופטי צנטריפוגה במשך 1 דקות ב 1,000 x גרם כדי להסיר את כל הבועות שאולי נוצרו בארות.
  5. מקם את לוחית PCR בתרמוסיקל PCR בזמן אמת.
  6. הגדר את שיטת הריצה כדלקמן: 3 דקות ב 95 °C (69 °F, 40 מחזורים של 95 °C (60 °F) עבור 15 s ואחריו 60 °C (60 °F) במשך 1 דקות.
  7. נתח נתונים על-ידי נרמול הגן המעניין לבקרה פנימית ובטא נתונים מדגימות נגועות ביחס לדגימות בקרהלא נגועות באמצעות הנוסחה 2-ΔΔCtוהמספורת יומן 2 של המספרים.

11. היסטופתולוגיה של ריאות

  1. הסר את הריאות מהתושבת היולדלית כמתואר לעיל.
  2. מניחים את הרקמה בנפח של 10% פורמלין נייטרלי-מאגר, כך היחס של פתרון לרקמה הוא כ 20:1 במשך 3-7 ימים.
  3. תאם עם שירות היסטולוגיה מתאים להטבעת פרפין, חתך, המטוקסילין וכתמים (H&E). עבור עבודה זו נוצל ליבת ההיסטופתולוגיה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה. לחלופין, בצע פרוטוקולים שתוארו קודםלכן 19.

12. במבחנה הרג חיידקים

  1. מוציאים את הטחול מהגור היולד לא מדביק כמתואר לעיל וממקם אותו בסל ניילון 40 מיקרומטר בתוך צלחת פטרי סטרילית של 60 מ"מ. חזור על זה ובריכה טחול לתוך צינור אחד כדי להיות שנקטפו הומוגני יחד.
  2. הוסף 5 מ"ל של PBS בתוספת 10% FBS.
  3. לפרק את הרקמה באמצעות בוכנה סטרילית 3 מ"ל מזרק עד ההשעיה תא יחיד נוצר.
  4. לאסוף את ההשעיה תא יחיד מחוץ לסל ניילון, להעביר צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, ותאי גלולה ב 350 x גרם במשך 5 דקות.
  5. להשעות את התאים במאגר תזה תא דם אדום (2 מ"ל עבור עד 7-8 טחול) ולתת לו לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל אריתרוקיטים.
  6. לשטוף טשטוש עם PBS ו גלולה כאמור.
  7. להשעות את הטחול ב 0.25 מ"ל של PBS בתוספת 0.5% BSA ו 2 mM EDTA על פי תשואת התא הצפוי.
  8. לספור את הטחול באמצעות hemocytometer או יישום מתאים אחר.
  9. לבודד Ly6B.2+ (אוכלוסיית מיאלואידים של גרנולוציטים / מונוציטים דלקתיים) תאים עם חרוזים אימונומגנטיים על פי פרוטוקול היצרן.
  10. Seed Ly6B.2+ תאים בצפיפות של 1 x 105 תאים לבא בצלחת 96 באר בשחור או לבן בנפח של 0.1 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 2 מ"מ ו 25 mM HEPES (בינוני מלא).
  11. למנות bioluminescent E. coli כמתואר בסעיף 1 ולהכין את inoculum חיידקי בריבוי הרצוי של זיהום (MOI) בנפח סופי של 0.1 מ"ל. זה נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי ביצוע מה שצריך עבור כל הבארים ב MOI נפוץ באצווה.
  12. הוסף 0.1 מ"ל של inoculum חיידקי או מדיום מלא לבד כפקד. הדגירה צלחת רב באר ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 במשך 1 שעות.
  13. החלף את המדיה ב- 0.2 מ"ל של מדיה שלמה טרייה המכילה ג'נטמיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) על-ידי הסרה עדין של מדיה עם פיפטה והוספת מדיה טרייה עם קצה פיפטה חדש. להחזיר את התרבות הדגירה עבור 2 שעות נוספות.
  14. ב 3 שעות לאחר ההדבקה, למדוד את luminescence בכל באר של צלחת התרבות שיפוע מלמטה באמצעות קורא צלחת ולאחר מכן להחזיר את התרבות הדגירה.
  15. חזור על מדידות של זוהר בנקודות זמן רצויות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה גרם לאח דם חיידקי בעכברים יילודים, והשתמשנו בהדמיה תוך-חוץ-אודינלית, ספירת חיידקים בדם, הערכות היסטולוגיות של פתולוגיה ופרופילי ביטוי ציטוקיני דלקתיים כדי לחקור את מהלך המחלה. סימנים של תחלואה נצפו בגורים יילודים נגועים הן נמוך (~ 2 x 106 CFUs) וגבוה (~ 7 x10 6 CFUs) inoculums של E.coli לאורך זמן. גורים שקיבלו את ההתגלמות הגדולה יותר הראו סימני מצוקה בולטים יותר שכללו ירידה בניידות, חוסר היכולת לתקן את יציבתם ויכולת לקויה לשמור על מצב זקוף ב-24 שעות לאחר ההדבקה (hpi). עם זאת, היה מגוון של תחלואה כמו כמה גורים נראו גרועים יותר מאחרים. מיד לאחר ההדבקה, חיה אחת במינון נמוך מתה עקב חשיפה isoflurane במהלך מפגש הדמיה כדי להקים בסיס. ב-24 כ"ס, שניים מתוך שישה בעלי חיים במינון גבוה נכנעו לזיהום המערכתי (33.3% תמותה). גורים נגועים שקיבלו אינקולום במינון גבוה או נמוך שקלו באופן משמעותי פחות מהפסולת השליטה שלהם ב 24 hpi (איור 1A,B). כל הגורים שקיבלו את האינוקולום הגבוה יותר עמדו בקריטריוני נקודת הקצה ב-24 כ"ס. ככזה, כל הגורים הנגועים בקבוצה זו היו המתת דם לאחר הדמיה. חיידקים בדם היו ממופרים עבור תת קבוצה של עכברים שקיבלו את inoculum התחתון, ועל כל בעלי החיים שקיבלו את inoculum גבוה יותר מאז כולם היו כל המתת דם. התוצאות משני ניסויים שבוצעו באופן דומה מצביעות על כך שבעוד שלרוב בעלי החיים היו רמות גבוהות של חיידקים בדם (CFUs/mL) ב-24 כ"ס, לחלק מבעלי החיים לא היו חיידקים ניתניםלגילוי בדם ( איור 1C). האחרון מציע שהם ניקו את הזיהום בנקודת זמן זו. כצפוי, גורים שקיבלו את inoculum גבוה יותר היו כמעט שלושה סדרי גודל יותר CFUs / מ"ל ב 24 כ"ס יחסית גורים שקיבלו את inoculum במינון נמוך (איור 1C).

הדמיה חיה של בעלי חיים של חיידקים זוהרים אישרה עוד יותר את הפצת החיידקים ואת הגידול בצמיחה של גורי יילודים לאורך זמן ב-10 ו-24 כ"ס (איור 2 ואיור 3). בנוסף, באמצעות הדמיה תוך-חוץ-ויטראלית עם המיקרו-CT, הצלחנו לזהות מוקדי זיהום, כולל המוח (איור 2B),ריאות (איור 2B, איור 3A,B)ורקמות היקפיות אחרות (איור 2B). הריאות של כמה עכברים נגועים מאוד הפגינו אזורים אטומים התואמים את הקונסולידציה הדלקתית שהתבססה על אות חיידקי זוהר (איור 3A). אזורים אלה של פרודנטי דלקתי המשוער אינם נמצאים בריאות שליטה לא מודלקות (איור 3A). עדות נוספת לתגובת ציטוקין דלקתית בולטת בתוך הריאות של גורים נגועים מוכחת על ידי ניתוח ביטוי גנים של IL-1β, IL-6, ו TNF-α. עלייה משמעותית בביטוי ביחס לפקדים נצפתה עבור כל שלושת הציטוקינות הן בקבוצות האנוקולום הנמוכות והן בקבוצות ה-inoculum הגבוהות (איור 4A). היסטופתולוגיה של הריאה נבדקה גם ב 24 hpi בשליטה וגורים נגועים. למרות פרופילי ציטוקין דלקתיים דומים, עלייה הדרגתית בפתולוגיה נצפתה בדרך כלל מהתחתון אל התעלות הגבוהה יותר. בהשוואה לרקמות של פקדים לא נגועים, הריאות של גורים נגועים הראו שינויים דלקתיים בולטים, עיבוי של קיר מכתב, דימום מכתלח מוגבר, חדירה דלקתית (איור 4B). בזיהומים החמורים ביותר, הגודש הריאה ושטחי הדימום תרמו לירידה מסיבית בשטח האוויר הפתוח (איור 4B). באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מראות כי במודל שלנו של אלח דם יילודים תחילת מוקדם, הפצה של חיידקים זוהרים ניתן לעקוב לאורך זמן מאתר חיסון תת-שרירי כדי מוקדי זיהום חשובים ולגרום דלקת משמעותית ופתולוגיה בבעלי חיים נגועים קשות.

כדי לחקור גורמים מארחים התורמים להריגת חיידקים על ידי תאי חיסון המולדים כגון מונוציטים, מקרופאגים ונויטרופילים, פיתחנו מבחן במבחנה רגיש למדידת סיווג חיידקי. Ly6B.2+ תאים מבודדים מן הטחול של עכברים יילודים נדבקו bioluminescent E. coli במגוון של MOIs במשך 1 שעות ולאחר מכן טופלו עם gentamicin להרוג חיידקים חוץ תאיים. ב 3, 6, 20, ו 48 hpi, זוהר תאי נמדד עם קורא multimode. כצפוי, עם הגדלת ה-MOI, נרשם אות זוהר יותר ב-3 שעות (איור 5). בהדרגה, אות זה אבד, מה שמעיד על סיווג חיידקי (איור 5). מבחן זה נוח ציטוקיני בתוספת, נטרול של משפיעים מופרשים, ותוספת של מעכבי פרמקולוגיים של מסלולים הסלולר ללמוד התערבויות שעשויות לקדם סיווג חיידקי ולשמש כדי לשפר את התוצאות במודל אלח דם יילודים המתוארים כאן.

Figure 1
איור 1: שינויים במשקל הגוף ושכפול חיידקים בעכברי יילודים ספיגה.
(א,ב) משקולות עכבר בודדות בתוך קבוצה (נמוכה וגוהה) מבוטאות כאחוז מהמשקל הממוצע של גורי בקרת פסולת. הנתונים מוצגים כאחוז ממוצע ± SEM. בדיקות T בודדות בכל נקודת זמן שלאחר ההדבקה חושפות הבדלים משמעותיים ב-24 שעות בין גורי בקרה וגורים שקיבלו את ה- inoculum הנמוך (p<0.0001) (A), או בין גורי בקרה וגורים שקיבלו את ה- inoculum הגבוה (p= 0.0031) (B). (C) CFU / מ"ל בדם ב 24 hpi השתנו יומן והוצג כמבחן ממוצע ± SEM. מאן ויטני מגלה מגמה לקראת משמעות בין inoculums במינון נמוך וגבה (p= 0.0882). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה תוך-חיים מדגימה הפצה של חיידקים בעכברי יילודים לאורך זמן.
(A) עכבר יילודים ייצוגי (#1) נגוע ב- inoculum של ~ 2 x 106 CFUs מוצג בזמן 0, 10 ו 24 כ"ס. סרגל צבעוני עם ערכי הזוהר המינימלי והמקסימי לכל נקודת זמן מוצגים עבור כל נקודת זמן. עכברים ב 0 ו 10 שעות מוצגים הן בסולם נקודת הזמן שלהם ואת סולם 24 שעות כדי להדגים שינויים בצמיחה חיידקית לאורך זמן. (B)תמונות מיקרו-CT משוחזרות תלת-מימדיות של אותו עכבר יילודים ב-10 ו-24 כ"ס מוצגות. בכל נקודת זמן יש תמונות בפרספקטיבות תקורה, טרנסאקסיאליות וקורוליות. בתמונה הטרנסאקסיאלית ב 24 hpi, המטוס נע לכיוון הפריפריה של העכבר כדי להציג טוב יותר מוקדי זיהום ברקמות ההיקפיות. החצים הלבנים מצביעים על המוח והכליות על 10 כ"ס ועל הכליה והריאות ב 24 כ"ס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הריאות הן אתר של זיהום מרכזי במהלך אלח דם חיידקי ביאלואנטים.
(A) נציג 3D תמונות microCT משוחזרות של עכבר יילודים (#5) נגוע inoculum של ~ 7 x10 6 CFUs מוצגים ב 24 hpi לעומת פקד נגוע. שני העכברים מוצגים בפרספקטיבה הטרנסאקסיאלית והריאות מסומנות על ידי חצים לבנים. העכבר הנגוע הונח על שני קשקשי זוהר (פוטונים /שניות). Scale #1 כולל את כל 6 אורכי הגל (500, 520, 560, 580, 600, 620 ננוגרם) ואת קנה המידה #2 כולל רק 500, 520, ו 560 nm אורכי גל. סולם שני זה איפשר לנו לדמיין אות מוגבר בחיידקים בריאות מכיוון אורכי גל נמוכים יותר נספגים יותר על ידי רקמות ומייצרים אות חזק יותר. (B)נציג 3D תמונות microCT משוחזרות של עכבר יילודים (#4) נגוע inoculum של ~ 7 x10 6 CFUs מוצגים ב 24 hpi. בנקודת זמן זו יש תמונות בפרספקטיבות תקורה, קשתית, טרנסאקסיאלית וקורונה. חצים לבנים מצביעים על מוקדי זיהום בריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דלקת וממצאים היסטופתולוגיים נלווים בריאות של ניתומי ספיגה.
ב 24 hpi הריאות נקצרו גורים שקיבלו ~ 2 x 106 או 7 x 106 CFUs או פקדים לא מושפעים. (A)RNA היה מבודד ואת הביטוי של IL-1β, IL-6, או TNF-α כפי שנקבע ביחס פקדים לא מושפעים על ידי PCR כמותי בזמן אמת באמצעות הנוסחה 2-ΔΔCt. הנתונים מוצגים כיומן הרישום הממוצע2 השתנה שינוי בביטוי ± SEM עבור כל אינוקולום כפי שצוין. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחני t לא מפוספרים של ΔCt בין גנים ציטוקיניים בודדים לבין הבקרה הפנימית במרווח הביטחון של 95%. כוכביות מציינות p<0.01. (B-D) חלקים היסטופתולוגיים של רקמות ריאה מוכתמות H&E (20x, אזור עניין שנבנה לתוך מסכת גזירות ומוגדל לבהירות) מוצגים. רקמות ריאה משליטה לא נגועה מייצגת (B) או ניאון נגוע בנמוך (C) או גבוה (D) אינוקולום מוצגים. חצים צהובים מצביעים על עיבוי מים (C) או דימום (D). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: חקירה במבחנה לסיווג חיידקים.
Ly6B.2+ תאים בודדו מן הטחול של ורידים שליטה לא מושפעים. התאים נזרעו בצלחות 96 באר נגועים ב- E. coli O1:K1:H7 מבטא לוציפראז בריבוי של זיהום (MOI) של 10, 50 או 250 כפי שצוין. לאחר 1 שעות, המדיום הוחלף טרי שהכיל gentamicin (100 מיקרוגרם / מ"ל). יחידות אור יחסי ממוצע (RLU) ± SE עבור נציג ניסוי בודד של מרובים מוצגים. מובהקות סטטיסטית במרווח בר-הסמך של 95% נקבעה באמצעות מבחני t לא מפוספרים עם התיקון של וולש; כוכביות מציינות p<0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל הזיהום התת-שרירי שלנו לחידוש אלח דם חיידקי בעכברים יילודים הוא שיטה חדשנית לחקר התפשטות האורך של פתוגנים חיידקיים בזמן אמת. הדמיה תוך-תתיאטרית מספקת את ההזדמנות לחקור הפצת חיידקים בזמן אמת ביאלונדטים. זה קריטי כדי להבין את הקינטיקה של הפצת חיידקים כדי להמשיך לחקור את התגובה המארחת ואת הנזק בשלב המתאים של המחלה. גורי עכבר מנוהלים תת עורית, הזרקה תת-עורית של אינוקולום חיידקי. טכניקת הזרקה זו פשוטה יותר מאשר חלופות נפוצות אחרות, כגון וריד הזנב וזיהומים תוך-חוץ-חיים, כיוון שהיא דורשת פחות דיוק בתוך אתר הזרקה. זה חשוב בהתחשב בגודל הקטן של הגורים. ההדמיה התוך-ויטמינים מאפשרת הערכה אורך של התפשטות חיידקים והפצה לרקמות היקפיות ולמערכת העצבים המרכזית לאורך זמן ללא צורך להקריב את החיה. גישות הדמיה דומות וטכנולוגיות שימשו לחקר הביולוגיה של סרטן גרורות20,21. יתר על כן, בעוד מחקר אחר ציטט את השימוש בהדמיה bioluminescent במהלך זיהום E. coli בחולדותיילודים 22, כאן, יישמו את הגישה עכברים יילודים, שבו המתודולוגיה שלנו מאפשרת הערכה של קינטיקה חיידקית במהלך אלח דם מורין. הדמיה של החיידקים מבוססת על פליטת אור ביולומינסנטי באורך גל שונים מחיידקים (למשל, פעילות לוציפראז חיידקית) בתוך החיה. לאחר מכן, הביולומינציה מתדמית באמצעות מצלמת התקן מזוגג (CCD) מקורר. לאחר מכן ניתן לשחזר את הביולומינציה המדמיינה שנוצרת לתמונה תלת-מימדית המציגה הן השפעות מרחביות והן השפעות תלויות זמן של חיידקים בתוך בעל חיים. עבור שכבה נוספת, ניואנסים יותר של רכישת נתונים, זיהוי מוצלח של בעלי חיים באמצעות קעקוע זנב מאפשר הערכת אמצעים חוזרת ונשנית של גורים בודדים לאורך זמן וזיהוי חריגים אפשריים בתוך קבוצת ניסוי נתונה.

היישום המוצלח ביותר של המודל המתואר דורש דיוק בהכנת אינוקולום החיידקי. כאן, אנו מתארים שיטה ממוטבת להכנת חיידקים באמצעות עקומת צמיחה E. coli הוקמה מראש מאומתת המפחיתה את השונות בין היעד לבין inoculum בפועל. זה מאפשר רבייה ניסיונית ב inoculum המיועד. הכללתם של שני אינוקולומים במודל שלנו הדגימה תוצאות תלויות מינון בחוזי CFUs בדם, תמותה ופתולוגיה של ריאות. עם זאת, היבטים מסוימים של מסלול המחלה לא היו תלויי מינון. אי עלייה במשקל בבעלי חיים נגועים לא היה תלוי inoculum ב 24 hpi. בנוסף, רמות דומות של ביטוי ציטוקיני דלקתי נצפו בריאה בתגובה לזיהום עם שני inoculums. אם דפוס זה ישוכפל בכל הרקמות שבהן נצפו חיידקים, כגון הכליה, הכבד, הטחול והמוח, נותר לקבוע. בנוסף אלח דם, E. coli O1:K1:H7 קשורה דלקת קרום המוח באוכלוסיית יילודים23. זיהום מוחי זה מתרחש כאשר חיידקים מהפריפריה פולשים וחודרים את מחסום הדם למוח. מחקרים עתידיים יחקרו היבט זה של המודל באמצעות ניתוח שינויים בביטוי חלבון צומת הדוק, כמו גם לבדוק טווחים שונים של אינוקולומים חיידקיים. שינוי נוסף במהלך הדמיה תוך-ואטראלית כולל תוספת של כדור צמר גפן יחיד, הנטוי באיזופלורן, הממוקם במרחק של כ-2-3 אינץ' מהעכברים במהלך ההדמיה. בתגובה לניסויים קודמים שבהם גורי היולדות חזרו להכרה במהלך ההדמיה, ומנעו רכישת תמונה מדויקת, אנו מניחים כעת את כדור הכותנה קרוב מספיק לעכברים כדי לשמור אותם ללא הרף במהלך ההדמיה. עם זאת, חשוב שזה לא נעשה כל כך קרוב כי הם לא מצליחים להתאושש מן ההרדמה.

למרות גמיש וניתן להתאמה בקלות לחקר הקינטיקה של חיידקים שונים במודלים שונים של בעלי חיים ומחלות, הפרוטוקול שלנו יש כמה מגבלות לשקול. המגבלה הראשונה שיש לקחת בחשבון היא כי המסלול התת-שרירי של זיהום אינו משקף נתיב טבעי של שידור. עם זאת, המטרה העיקרית בהתפתחות המודל שלנו מלכתחילה הייתה להקים מצב מסירה שניתן לשחזר בקלות שניתן להשתמש בו כדי ליצור זיהום מערכתי המשכפל היבטים של מחלה אנושית. לכן, בדו"ח זה, אנו מתארים מודל של תסמונת מחלת אלח דם התפרצות מוקדמת אנושית, לא מודל של שידור טבעי. יש מודל מבוסס של משלוח אוראלי בחולדות יילודים המשכפל היבטים מסוימים של שידור אנושי נפוץ, כגון קולוניזציה ראשונית של זיהום E. coli בתעלת המזונות והפצה לאחר מכן למחזור הדם ולרקמות ההיקפיות,כולל המוח 22. המודל שהוקם על ידי ויטקומב ועמיתיו משלב גם ביולומינסנט E. coli והדמיה תוך-בלתי נמנעת. יתר על כן, חשוב למזער את החשיפה isoflurane, כמו גם להזריק, קעקוע זנב, ולטפל גורים מהר ככל האפשר מבלי להתפשר על דיוק ודיוק של הטכניקות בניסיון למתן את רמות הלחץ עבור שני neonates ואת הסכרים. במקרים מסוימים, אם הגורים חווים מניפולציות אנושיות ו/או ניסיוניות משופרות, הסכרים יכולים להפסיק להניק ולטפל בגורים, וכתוצאה מכך ירידה בהישרדות שאינה קשורה לזיהום. באופן דומה, גורים החשופים isoflurane לתקופות ממושכות מעבר 10 דקות משוער של מפגש הדמיה יש סיכון מוגבר למוות; לפיכך, חיוני לספק מספיק isoflurane כדי להרדום מספיק את העכברים, אך לא מספיק כדי להתרכך בהם. נקודת התחשבות אחרונה היא גבול הרגישות. רקמות שבהן פחות מ 104 CFUs / מ"ל E. coli היו ספירת האות זוהר נרשם נופל בקצה הנמוך של הטווח לגילוי, על פי שיטת קנה המידה המשמש בתוכנתההדמיה 3. לכן, רקמות מסוימות עשויות להיות מיושבות עם רמות נמוכות של חיידקים אך מופיעות ללא ביולומינציה נראית לעין.

כיום, רוב המחקרים משתמשים בשיטות למבוגרים להפצת חיידקים, כגון זריקות ורידים תוך-חיים וזנב עבור ורידים. Pluschke ו Pelkonen ניתח את ההשפעה של E. coli K1 על עכברי יילודים דרך i.p., וריד הזנב, וזיהומים אוראליים24. מחקר זה הראה כי גנוטיפים שונים של עכברים עם כשל חיסוני רגישים יותר לזן K1; עם זאת, היבטים רבים של התגובה החיסונית המארחת לזיהום, כמו גם את המנגנונים להתפשטות חיידקים נשארים ללא כיסוי. פשמוך ועמיתיו הדביקו עכברי יילודים תוך-חיים עם E. coli K1 או K. דלקת ריאות ונמדדו CFUs בטחול ובכבד ב 72 כ"ס25. מחקר זה גם ניתח היבטים מסוימים של התגובה המארחת לזיהום המבוסס על חשיפה מוקדמת של עכברים לאנטיביוטיקה. עם זאת, חקירה יסודית של הפצת חיידקים לרקמות היקפיות ודם לאורך זמן במקביל לאפיון דלקתי באותה רקמה (מלבד גרנולוצויוזיס) לא טופלה. מחקרים אחרים של אלח דם יילודים בעכברים עם סטפילוקוקוס aureus, אפידרמידיס סטפילוקוקוס, קבוצה B סטרפטוקוקוס, ו E. coli לחקור היבטים שונים של המערכת החיסונית המארחת בתגובה לזיהום. עם זאת, אף אחד מהמחקרים האלה להשתמש הדמיה תוך ואטטרלית כדי לחקור את הקינטיקה של הפצתחיידקים או לוקליזציה של מוקדי זיהום 23,25,26,27. שיטת ההדבקה וההדמיה הבין-רואית שלנו, בשילוב עם הערכת נטל חיידקי ופרופיל דלקתי של רקמות היקפיות, מאפשרת לנו לבחון באופן מקיף היבטים של המארח והפתוגן במהלך ההדבקה, ומספקת הבנה מדויקת יותר של יחסי הגומלין בין המארח לפתוגן במהלך אלח דם.

אנו מתכוונים לנצל מודל זיהום והדמיה זה כדי לקדם את ההבנה שלנו של אלח דם יילודים תחילת מוקדם באמצעות מגוון רחב של חיידקים פתוגניים בדרך כלל אחראי אלח דם ביאלונאטים, כולל סטרפטוקוצ'י קבוצה B, K. pneuomoniae, ו ליסטריה monocytogenes. מודל זיהום זה יאפשר לנו להשוות באופן אורך הפצה של פתוגנים חיידקיים שונים במקביל לתגובה המארחת בניאונים. בנוסף, מודל זה מסתגל להעברה המאמצת של סוגי תאים חיסוניים ספציפיים (מצומדים באופן פלואורסצנטי) כדי לחקור את נדידתם לאתרי זיהום ואת ההשפעה הבאה על התגובה המארחת והשליטה בחיידקים. זה מעניק את ההזדמנות להבין טוב יותר את האינטראקציות המארח-פתוגן המתרחשות במהלך אלח דם בתחילת החיים בדרכים שלא הוכחו בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מוסדיות .M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 162 ביולומינציה הדמיה תוך-חוץ-ואט E. coli חיסון תת-תאי ניאונטיטים אלח דם דלקת ציטוקינים
מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter