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Biology

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Abstract

Transposon-Sequenzierung (Tn-seq) ist eine leistungsstarke Methode, die Transposon-Mutagenese und massive parallele Sequenzierung kombiniert, um Gene und Wege zu identifizieren, die zur bakteriellen Fitness unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen beitragen. Tn-seq-Anwendungen sind umfangreich und haben nicht nur die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen auf Organismusebene ermöglicht, sondern auch auf Populations-, Gemeinschafts- und Systemebene. Gram-negative Bakterien sind stark mit antimikrobiellen Resistenz Phänotypen verbunden, die erhöhte Vorfälle von Antibiotika-Behandlungsversagen hat. Antimikrobielle Resistenz ist definiert als bakterielles Wachstum in Gegenwart von ansonsten tödlichen Antibiotika. Das antimikrobielle Colistin der "letzten Linie" wird zur Behandlung von gramnegativen bakteriellen Infektionen eingesetzt. Jedoch, mehrere Gram-negative Krankheitserreger, einschließlich Acinetobacter baumannii kann Colistin-Resistenz durch eine Reihe von molekularen Mechanismen entwickeln, von denen einige mit Tn-seq charakterisiert wurden. Darüber hinaus variieren Signaltransduktionswege, die die Colistinresistenz regulieren, innerhalb gramnegativer Bakterien. Hier schlagen wir eine effiziente Methode der Transposon-Mutagenese in A. baumannii vor, die die Erzeugung einer sättigenden Transposon-Einfügungsbibliothek und amplicon-Bibliothekskonstruktion rationalisiert, indem die Notwendigkeit von Restriktionsenzymen, Adapterligation und Gelreinigung entfällt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine eingehende Analyse molekularer Determinanten, die zur A. baumannii-Fitness beitragen, wenn sie mit Colistin herausgefordert werden. Das Protokoll gilt auch für andere Gram-negative ESKAPE-Erreger, die in erster Linie mit medikamentenresistenten Krankenhausinfektionen in Verbindung gebrachtwerden.

Introduction

Die Entdeckung von Antibiotika ist zweifellos eines der folgenreichsten gesundheitsbezogenen Ereignisse des20. Jahrhunderts. Antibiotika lösen nicht nur schwere bakterielle Infektionen schnell auf, sie spielen auch eine zentrale Rolle in der modernen Medizin. Größere Operationen, Transplantationen und Fortschritte in der Neonatalmedizin und Chemotherapie lassen Patienten anfällig für lebensbedrohliche Infektionen und diese Therapien wären ohne Antibiotika nicht möglich1,2. Jedoch, schnelle Entwicklung und Ausbreitung der Antibiotikaresistenz unter menschlichen Krankheitserregern hat die Wirksamkeit aller klinisch wichtigen Klassen von Antibiotika deutlich verringert3. Viele bakterielle Infektionen, die einst leicht mit Antibiotika-Behandlung entimiert wurden, reagieren nicht mehr auf klassische Behandlungsprotokolle, was eine ernsthafte Bedrohung für die globale öffentlicheGesundheit1 . Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist, wo Bakterienzellen in ansonsten tödlichen Konzentrationen von Antibiotika wachsen, unabhängig von der Behandlungsdauer4,5. Es ist dringend notwendig, molekulare und biochemische Faktoren zu verstehen, die AMR regulieren, was dazu beitragen wird, die alternative antimikrobielle Entwicklung zu steuern. Insbesondere ESKAPE-Erreger sind im klinischen Umfeld problematisch und mit umfangreicher AMR verbunden. Dazu gehören Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp. Während mehrere Mechanismen bei ESKAPE-Erregern zur AMR beitragen, sind die letzten vier Organismen gramnegativ.

Gram-negative Bakterien montieren eine definierende äußere Membran, die sie vor widrigen Umweltbedingungen schützt. Die äußere Membran dient als Durchlässigkeitsbarriere, um den Eintritt toxischer Moleküle wie Antibiotika in die Zelle zu beschränken. Im Gegensatz zu anderen biologischen Membranen ist die äußere Membran asymmetrisch. Die äußere Packungsbeilage ist mit oberflächenexponiertem Lipopolysaccharid angereichert, während die innere Packungsbeilage eine Mischung aus Phospholipiden6ist. Lipopolysaccharidmoleküle werden durch ein konserviertes Lipid A-Moiety, das in die Lipid-Bilayer7eingebettet ist, an der äußeren Membran verankert. Das kanonische Lipid Eine Domäne von Escherichia coli Lipopolysaccharid wird für das Wachstum der meisten Gram-negativen Bakterien benötigt und wird durch einen neunstufigen enzymatischen Weg synthetisiert, der einer der grundlegendsten und konserviertesten Wege in Gram-negativen Organismen6,7,8ist.

Polymyxine sind kationische antimikrobielle Peptide, die auf die Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid abzielen, um die äußere Membran zu stören und die Zelle zu lysen. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenen Rückständen von Polymyxinen und den negativ geladenen Lipid-A-Phosphatgruppen stören die bakterielle Zellmembran, was letztlich zum Zelltod9,,10,11,12,13führt. Colistin (Polymyxin E) ist ein letztes Mittel antimikrobielle zur Behandlung von Infektionen durch multiresistente Gram-negative nosokomiale Krankheitserreger, wie Acinetobacter baumannii14,15,16. Erstmals 1947 entdeckt, werden Polymyxine von den Bodenbakterien Paenibacillus polymyxa17,18,19produziert. Polymyxine wurden zur Behandlung von Gram-negativen Infektionen jahrelang verschrieben, bevor ihre klinische Anwendung aufgrund von Berichten über signifikante Nephro- und Neurotoxizität20,21begrenzt war.

A. baumannii ist ein nosokomialer Gram-negativer Erreger, der die Morbidität und Sterblichkeit der Patientenergebnisse in den letzten Jahrzehnten dramatisch erhöht hat22. Was einst als ein schwacher Erreger galt, stellt heute ein erhebliches Risiko für krankenhauserworbene Infektionen auf der ganzen Welt aufgrund seiner unglaublichen Fähigkeit, AMR zu erwerben und hohes Risiko der Epidemie23,24. A. baumannii ist für mehr als 10% der nosokomialen Infektionen in den Vereinigten Staaten. Krankheit manifestiert sich als Lungenentzündung, Bakteriämie, Harnwegsinfektionen, Haut- und Weichteilinfektionen, Meningitis und Endokarditis25. Behandlungsmöglichkeiten für A. baumannii Infektionen sind aufgrund der Resistenz gegen fast alle Antibiotika-Klassen, einschließlich β-Lactams, Fluorchinolone, Tetracyclin, und Aminoglykoside23,24. Die Prävalenz multiresistenter, extensiv medikamentenresistenter und pan-drogenresistenter A. baumannii-Isolate hat zu einem Wiederaufleben der Colistin-Behandlung geführt, die als eine der wenigen verbleibenden therapeutischen Optionen angesehen wurde, die noch wirksam gegen multiresistente A. baumanniisind. Jedoch, erhöhte Colistin Resistenz unter A. baumannii Isolate hat seine Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit weiter verstärkt10,11,12,13,27,30,31.

Die jüngsten Fortschritte bei den Sequenzierungstechnologien mit hohem Durchsatz, wie z. B. die Transposonsequenzierung (Tn-seq), haben wichtige Werkzeuge geliefert, um unser Verständnis der bakteriellen Fitness in vitro und in vivozu verbessern. Tn-seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das genutzt werden kann, um Gennotyp-Phänotyp-Wechselwirkungen bei Bakterien zu untersuchen. Tn-seq ist allgemein anwendbar auf bakterielle Krankheitserreger, wo es traditionelle Transposon-Mutagenese mit massiver paralleler Sequenzierung zu schnellen Karteneinfügungsstellen kombiniert, die verwendet werden können, um DNA-Mutationen mit phänotypischen Varianten im genomweiten Maßstab32,33,34,35zu verknüpfen. Während Transposon-Mutagenese-Methoden bereits beschrieben wurden, sind die allgemeinen Schritte ähnlich33. Zunächst wird eine Insertionsbibliothek mittels Transposon-Mutagenese erzeugt, wobei jede Bakterienzelle innerhalb einer Population auf eine einzelne Transposon-Insertion in die genomische DNA (gDNA) beschränkt ist. Nach der Mutagenese werden einzelne Mutanten gepoolt. gDNA wird aus dem Insertionsmutantpool extrahiert und die Transposonknoten verstärkt und einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen. Die Lesevorgänge stellen Einfügestellen dar, die dem Genom zugeordnet werden können. Transposon-Einfügungen, die die Fitness reduzieren, fallen schnell aus der Bevölkerung, während nützliche Einfügungen bereichert werden. Tn-seq war maßgeblich daran beteiligt, unser Verständnis dafür zu fördern, wie Gene die bakterielle Fitness in Stress beeinflussen33.

Das in pJNW684 kodierte Himar1-Marinetransposonsystem wurde speziell für die Transposon-Mutagenese konstruiert und optimiert. Es enthält ein Mariner-Familientransposon, das das Kanamycin-Resistenzgen flankiert, das für die Auswahl von Transposoninsertionsmutanten in A. baumannii verwendet wird. mariner Es kodiert auch einen A. baumannii spezifischen Promotor, der die Expression des Transposase-Codierungsgens36antreibt. Das marinebasierteTransposon enthält auch zwei translationale Terminatoren nach dem Kanamycin-Resistenzgen, die ein Durchlesen flussabwärts der Insertion37verhindern. pJNW684 enthält auch einen RP4/oriT/oriR6K-bedingten Replikationsursprung, der das vom Spenderstamm beigesteuerte 'pir-Gen erfordert, um38zu replizieren. In Ermangelung des Gens von 'pir' kann sich der pJNW684-Vektor, der die Transpositionsmaschinerie trägt, nicht im A. baumannii-Empfängerstamm 10,36,38replizieren. Daher wird während der bakteriellen Konjugation nur das Transposon in das Empfängergenom ohne Hintergrundeinfügung des Plasmids eingeführt, das das Transposase-Gen trägt. Dies ist wichtig, da der Verlust der Transposaseaktivität zusammen mit dem Plasmid zu einem einzigen, stabilen Transpositionsereignis führt, das verhindert, dass sich das Transposon an verschiedene Stellen bewegt, sobald es in das Empfängergenom einfügt.

pJNW648 wurde auch auf Aktivität in einem anderen gramnegativen Organismus, E. coli,getestet. Die erfolgreiche Montage einer sättigenden Tn-seq-Bibliothek im E. coli-Stamm W3110 zeigte, dass das System für die Durchführung von Mutagenese bei einer Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Enterobacteriaceae, geeignet ist. Darüber hinaus kann der a. baumannii-spezifische Promotor, der den Transposase-Ausdruck antreibt, schnell mit einem artspezifischen Promotor ausgetauscht werden. Schließlich kann das Kanamycin-Resistenzgen in andere Resistenzkassetten ausgetauscht werden, abhängig vom AMR-Phänotyp des untersuchten Organismus.

Ein Faktor, der zur Colistinresistenz bei A. baumannii beiträgt, ist die Verabreichung unzureichender Dosen, bei denen Bakterien selektivem Druck auf nicht-tödlichen Ebenen ausgesetzt sind39. Mehrere Berichte zeigten, dass subhemmende antimikrobielle Konzentrationen regulierte Reaktionen induzieren können, die die Zellphysiologie verändern, um die Anfälligkeit der gesamten Bakterienpopulation zu reduzieren11,12,30,31. Mit Tn-seq entdeckten wir Faktoren, die die Colistinresistenz im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 nach Exposition gegenüber hemmenden10 und subhemmenden Konzentrationen von Colistin regulieren. In diesem Beispiel wird eine Tn-seq-Methode erläutert, die den Aufbau und die Anreicherung einer gesättigten Transposon-Mutantenbibliothek mithilfe der auf Seetierenbasierenden Transposons-Familie40,41optimiert. Während mehrere Tn-seq-Protokolle 20.000 - 100.000 Mutanten35,42,43,44,45,46erzeugen, kann das hier beschriebene Protokoll schnell eine Transposonbibliothek von 400.000 + Mutanten erzeugen, was in etwa einer Transposoneinfügung in A. baumannii10entspricht. Darüber hinaus kann die Bibliotheksgröße ohne erheblichen zusätzlichen Aufwand vergrößert werden. Diese Methode eliminiert auch die Anforderung für Restriktionsendonukleasen, Adapterligation und Gelreinigung, die die endgültige Bibliotheksvielfalt reduzieren können.

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Protocol

1. Bakterielle Stammvorbereitung

  1. Streichen Sie den "Spender"-Stamm (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Materialtabelle) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani-Agar, ergänzt mit 600 M Diaminopimelsäure (DAP), 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml Luria Brühe (LB) ergänzt mit 600 'M DAP, 100 mg/L Ampicillin und 25 mg/L Kanamycin in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und kennzeichnen Sie es als "Spender".
  2. Streifen Sie den "Empfänger" Stamm (A. baumannii Stamm ATCC 17978, Tabelle der Materialien) für isolierte Kolonien auf Luria-Bertani Agar. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einer einzigen isolierten Kolonie, impfen 50 ml LB in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben und beschriften Sie es als "Empfänger".
  3. Inkubieren Sie beide Kulturen ("Spender" und "Empfänger") über Nacht bei 37 °C mit Schütteln.

2. Bakterielle Paarung

  1. Übernachtkulturen auf 50 ml konische Röhren übertragen.
  2. Pellet sowohl Empfänger- als auch Spenderkulturen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das "Spender"-Stammpellet in 35 ml LB, ergänzt mit DAP, wieder aus, um Restantibiotika abzuwaschen.
  4. Pellet der "Spender" Stammzellen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das "Spender"-Stammpellet in 4,5 ml LB, ergänzt durch DAP, wieder aus. Verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette.
  6. Übertragen Sie den resuspendierten "Spender"-Stamm in das "Empfänger"-Stammrohr, das die pelletierten "Empfänger"-Zellen enthält. Verwenden Sie die gleiche 10 ml serologische Pipette aus Schritt 2.5, um die Kulturen zu mischen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Endsuspension sollte 5 ml betragen.
  7. Verteilen Sie die Stecksuspension als einzelne 100-L-Tröpfchen auf LB-Agarplatten, ergänzt durch DAP (5-7 Tröpfchen pro Platte)(Abbildung 1A).
  8. Inkubieren Sie Platten bei Raumtemperatur für 30 min.
  9. Ohne die Tröpfchen zu stören, die Platten vorsichtig auf einen 37 °C-Inkubator übertragen und Kulturen für 1 h verpaarenlassen.
    HINWEIS: Inkubationszeiten von mehr als 1 h riskieren die Erzeugung von Schwestermutanten.
  10. Nach der Inkubation 1,5 ml LB auf jede Platte geben und ernten, indem Sie Bakterien von den Platten wieder aufhängen. Verwenden Sie eine 1 ml Mikropipette für die Resuspension. Das Endvolumen sollte ca. 12 - 15 ml betragen.
  11. Kombinieren Sie geerntete Zellen in einem 50 ml konischen Rohr.
  12. Pellet die gepaarten Zellen mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  13. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in 50 ml LB wieder auf, um Rest-DAP zu entfernen.
  14. Pellet die Paarung mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  15. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritte 2.13 und 2.14).
  16. Mit einer 10 ml serologischen Pipette, setzen Sie das Pellet in 10 ml LB ergänzt mit 25% Glycerin.
  17. Mit gewaschenen Zellen fünf serielle Verdünnungen in LB-Brühe (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Verteilen Sie 100 l jeder Verdünnung auf 4 verschiedene Platten mit sterilen Glasperlen: Luria-Bertani Agar ergänzt mit Kanamycin, Agar mit Ampicillin ergänzt, Agar mit DAP und Agar nur ergänzt.
  19. Platten bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  20. Die verbleibende Paarung in 1 ml Aliquots aliquotes aliquotieren und bei -80 °C lagern.

3. Bestimmen Sie die geeignete Verdünnung der Transposonbibliothek

  1. Zeichnen Sie koloniebildende Einheiten (CFU) von Nachtplatten auf.
  2. Stellen Sie sich eine Platte mit zählbaren Kolonien für jede einzelne Plattenbedingung vor (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Sowohl "Spender" als auch "Empfänger" Stämme sollten auf Agarplatten wachsen, die mit DAP ergänzt werden, so dass die meisten plattierten Verdünnungen einen Rasen ergeben. Nur die "Empfänger"-Sorte kann auf Agarplatten wachsen. Weder der "Spender" noch der "Empfänger" Stamm kann auf Agarplatten wachsen, die mit Ampicillin ergänzt werden, so dass es kein/minimales Wachstum geben sollte. Nur Zielstammzellen, die die Transposon-Einfügung kodieren, können auf Agarplatten wachsen, die mit Kanamycin ergänzt werden. Kolonien sollten in der Größe variieren, was auf Transposon-Einfügungen in Gene hindeutet, die zur Fitness auf Agar beitragen, die mit Kanamycin ergänzt werden.
  3. Berechnen Sie die Anzahl der Transposonmutanten in der gefrorenen Paarung, indem Sie die Anzahl der Kolonien auf LB-Agarplatten zählen, die mit Kanamycin ergänzt werden.
    HINWEIS: Für das A. baumannii Genom (ca. 4 Mbit/s) war das Ziel, etwa 400.000 Kolonien zu erhalten, um eine hochauflösende Mutantenbibliothek (etwa ein Transposoninsertion/10 Basenpaare) zu erzeugen. Diese Zahl sollte jedoch auf der Grundlage der Genomgröße der Zielart optimiert werden).

4. Generierung der endgültigen bakteriellen Mutantenbibliothek

  1. Ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis auftauen.
  2. Plattenpaarung auf 150 mm Luria-Bertani Agarplatten, ergänzt mit Kanamycin auf Basis von KBE, berechnet in Schritt 3.1. Passen Sie das Volumen mit LB an, um 13.333 Kolonien pro 150 l vor der Beschichtung zu ergeben.
    ANMERKUNG: Die KBE-Zahl wurde hier auf etwa 105 KBE/ml festgelegt, so dass das Paarungsvolumen angepasst wurde, um 13.333 Kolonien pro Platte zu erhalten, da dies eine optimale Anzahl von Kolonien auf 30 Platten für eine hochauflösende Mutantenbibliothek ohne Überfüllung der Platten bieten würde.
  3. Verwenden Sie sterile Glasperlen, um 150 l der Verdünnung pro Platte auf 30 x 150 mm Luria-Bertani Agarplatten zu verteilen, die mit Kanamycin ergänzt werden, um 400.000 Kolonien zu erhalten (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Sterile Stäbe oder jede Art von sterilem Streuwerkzeug (d. h. Glasperlen) können verwendet werden, um die Bakterien auf Platten zu verbreiten.
  4. Entsorgen Sie das verwendete Rohr, das eine übermäßige Paarung enthält.
    HINWEIS: Frost-/Tauzyklen erhöhen selektive Drücke auf die Bakterienkultur, die die Ergebnisse des Tn-seq-Experiments verzerren können. Verwenden Sie jedes Mal ein frisches Aliquot.
  5. Platten bei 37 °C für 14 h inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit ist optimiert, um Überwucherung zu verhindern (Kolonien berühren). Es wird vorgeschlagen, das Wachstum durch verkürzung der Inkubationszeit zu minimieren.

5. Schätzen der Bibliotheksdichte und Pooling für die Speicherung

  1. Zählen Sie KBE auf jeder Platte, um die Gesamtmutanten in der Transposonbibliothek zu schätzen. Zählen Sie 20 % von mindestens 3 Platten, um die Schätzung der Kolonieanzahl für die gesamte Plattengruppe zu bestimmen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die Kolonien keine andere Kolonie berühren.
  2. Nach der Berechnung des geschätzten Kolonieertrags 3-5 ml (oder bei Bedarf mehr) zu jeder Platte hinzufügen und die Bakterien mit einem sterilen Abkratzwerkzeug abkratzen.
    HINWEIS: Sterile Impfschlaufen wurden verwendet, um Platten effizient zu kratzen.
  3. Bakterielle Suspensionen von allen Platten in 50 ml konische Rohre bündeln (Abbildung 1D). Dies erfordert mehrere 50 ml konische Rohre, mindestens 3.
  4. Pellet gepoolte bakterielle Suspension mit Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Pellet in 5 ml LB mit 30% Glycerin ergänzt auf.
  6. Aliquot 1 ml der Transposonbibliothek in Kryovials und lagern bei -80 °C.

6. Identifizierung von Faktoren, die die Colistinresistenz in A. baumannii regulieren

  1. 4 x 250 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 50 ml LB Brühe und Etikett als (Abbildung 2B) vorbereiten
    1. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii Stamm ATCC 17978 Tn-seq Bibliothek; (+) colistin_2
      HINWEIS: In der hier beschriebenen Herausforderung wird jede Bedingung, (-) Colistin-Kontrolle und (+) Colistin-Herausforderung in doppelter Ausführung getestet. Daher erfordert die Einrichtung 4 x 250 ml Erlenmeyer Kolben, zwei pro Bedingung.
  2. 50 l mit 0,5 mg/L Colistin zu (+) Colistinkolben (6.1.3 und 6.1.4) und 50 l Wasser zu (-) Colistinkolben (6.1.1 und 6.1.2) hinzufügen.
  3. Tauen Sie eine gefrorene Tn-seq Bibliothek aliquot aus Schritt 5 auf Eis.
  4. Pipette 1 l der aufgetauten Bibliothek in 1 ml PBS.
  5. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und multiplizieren Sie sie mit 1.000.
    HINWEIS: Dies ermittelt OD600 von 1 L der Tn-Bibliothek.
  6. Basierend auf der Berechnung in Schritt 6.5, impfen Sie jeden Kolben mit 50 ml LB bis zu einem endgültigen OD600 0.001.
  7. Kulturen in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bis OD600 0.5 anbauen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass Die Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase bleiben, sodass die OD600 angepasst werden muss, um sicherzustellen, dass sich die Kultur innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase so oft wie möglich repliziert, wenn ihr Stamm während des exponentiellen Wachstums auf einer anderen OD600 liegt. Wenn sich die Kultur nur dreimal repliziert, ist die Fähigkeit, Fitnessfehler bei Mutanten zu erkennen, theoretisch auf 3-fache Unterschiede begrenzt. Da verschiedene Bakterien unterschiedliche Verdoppelungszeiten haben, ist es wichtig, die Kulturen an einem festen OD600 auszusäen, um das Beginneninokulum zu normalisieren. Dies gewährleistet eine konsistente Darstellung der gesamten Bibliothek in allen Kulturen.
  8. Erntekulturen mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 7 min.
  9. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 50 ml PBS.
  10. Pellet mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 7 min.
  11. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf. Aliquot - 200 l in 5 Mikrozentrifugenröhren.
  12. Pellet mit Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer Pipettenspitze.
  13. Pellets bei -20 °C lagern oder mit der gDNA-Extraktion fortfahren.

7. gDNA-Extraktion

  1. Ein Zellpellet auf Eis auftauen.
  2. Fügen Sie 0,6 ml Lysepuffer (Materialtabelle) und Wirbel hinzu, um das Pellet vollständig wieder aufzuhängen.
  3. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
  4. 0,6 ml Phenol/Chlorform/Isoamylalkohol in die Probe geben und kräftig wirbeln.
  5. Separate Phasen mit Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
  6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf eine neue Röhre. Vermeiden Sie es, die Phasenschnittstelle während der Übertragung zu stören.
  7. Fügen Sie der oben erhaltenen wässrigen Phase ein gleiches Chloroformvolumen hinzu und wirbeln Sie kräftig.
  8. Separate Phasen mit Zentrifugation in Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
  9. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf eine neue Röhre.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Schnittstelle während der Übertragung nicht zu stören.
  10. 2,5x wässrige Phase Volumen von kaltem 100 % Ethanol hinzufügen und schonend mischen. Gefällte DNA wird sichtbar sein.
  11. Rohr mindestens 1 h bei -80 °C stellen.
  12. Pellet-DNA mit Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 min.
  13. Entfernen Sie überstand es sorgfältig, ohne das DNA-Pellet zu stören, und waschen Sie es mit 150 l 70 % Ethanol durch Pipettieren.
  14. Pellet-DNA mit Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 2 min.
  15. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
  16. Wiederholen Sie Schritt 7.14 einmal. Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Ethanol.
  17. Trockene DNA durch Inkubation bei Raumtemperatur für 5-10 min.
  18. Resuspend DNA-Pellet in 100 l TE-Puffer durch Pipettieren.

8. DNA-Scherung (Abbildung 3A)

  1. Verdünnen Sie gDNA mit TE-Puffer auf eine Konzentration von 250 ng/ml bei einem Gesamtvolumen von 200 l.
  2. Rohre in einen Wasserbad-Beschallungsgerät legen.
  3. Beschallen Sie DNA, um Fragmente von etwa 300 Nukleotiden zu ergeben. Leistung: 60 %, Gesamtzeit: 20 min, Zyklen: 10 s EIN und 10 s AUS bei 4 °C (Abbildung 3A).
  4. Bestätigen Sie, dass die DNA angemessen geschert wird, indem 10 l ungehörte DNA und 10 l gescherte DNA auf einem 1% Agarose-Gel getrennt werden. Beschallung wiederholen oder nach Bedarf optimieren (Abbildung 3B).

9. Poly-C Schwanzzusatz zum 3'-Ende (Abbildung 3A)

  1. Poly-C-Reaktion gemäß Tabelle 1 einrichten.
  2. Inkubationsreaktion bei 37 °C für 1 h.
  3. Reinigen Sie die Poly-C-Reaktion mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Abbildung 3A), indem Sie die folgenden Schritte befolgen.
    1. Fügen Sie jeder Probe 40 L paramagnetische Perlen der Größenauswahl hinzu. Wirbel 5 s oder Pipette rauf und runter.
    2. Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. Kurz gesagt, Zentrifugenrohre, um Flüssigkeit in der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    4. Übertragen Sie die Rohre in ein magnetisches Rack und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    5. Mit Rohren auf magnetischen Rack, vorsichtig entfernen Sie den Überstand.
    6. Mit Rohren auf magnetischem Rack, fügen Sie 200 l frisch zubereitete 80% Ethanol (nicht stören Perlen).
    7. Inkubieren Sie Proben für mindestens 30 s, bis die Lösung klar ist.
    8. Mit Rohren auf magnetischen Rack, vorsichtig entfernen Sie den Überstand.
    9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritte 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Sammeln Sie Flüssigkeit im Boden des Rohres mit einem kurzen Zentrifugationsschritt (ca. 2 s).
    11. Übertragen Sie Die Rohre auf das Magnetgestell und entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit.
    12. Bei Raumtemperatur für 2-5 min inkubieren, um Proben zu trocknen. Nicht übertrocknen.
    13. Entfernen Sie die Rohre aus dem magnetischen Rack und fügen Sie jeweils 25 L Wasser hinzu. Wirbel für 5 s oder Pipette rauf und runter.
    14. Kurz gesagt, Zentrifugenrohre, um Flüssigkeit in der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    15. Übertragen Sie die Rohre auf das Magnetgestell und lassen Sie sie für ca. 2 min sitzen, bis die Lösung klar ist.
    16. Mit Röhren auf dem magnetischen Rack, entfernen Sie Flüssigkeit, ohne die Perlen zu stören und in ein neues Rohr zu übertragen (ca. 23 L DNA).

10. Transposon-Kreuzungsverstärkung (Abbildung 3A)

  1. PCR 1 wie in Tabelle 1 für die erste verschachtelte PCR beschrieben einrichten (Tabelle 2).
  2. Führen Sie PCR 1 unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen aus.
  3. Reinigen Sie PCR-Produkte mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Schritte 9.3.1 – 9.3-12). Elute in 50 l Wasser (Schritte 9.3.13 – 9.3.16). An dieser Stelle können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
  4. Bereiten Sie Streptavidin-gekoppelte paramagnetische Perlen vor:
    1. Streptavidin Perlen durch kräftiges Schütteln resuspendieren.
    2. Fügen Sie 32 L Perlen pro Probe in ein frisches Mikrozentrifugenrohr.
      HINWEIS: Perlen für 6 + Proben können in einem einzigen Rohr hergestellt werden.
    3. Übertragen Sie das Rohr in ein magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    4. Mit Rohr auf magnetischen Rack, entfernen Überstand.
    5. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack. Waschen Sie Perlen, indem Sie in 1 ml 1x B&W Puffer durch Pipettieren nach oben und unten.
    6. Übertragen Sie das Rohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    7. Entfernen Sie mit dem Rohr auf dem magnetischen Rack den Überstand.
    8. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 1 ml 1x B&W Puffer (Schritte 10.4.5 – 10.4.7) zweimal mehr für insgesamt 3 Waschungen.
    9. Entfernen Sie die Röhre aus dem magnetischen Rack und setzen Sie die Perlen in 52 L 2x B&W-Puffer pro Probe wieder auf.
  5. Kombinieren Sie 50 l der vorbereiteten Perlen mit 50 l gereinigtem PCR1 (ab Schritt 10.3). Pipette zu mischen.
  6. Drehen Bei Raumtemperatur für 30 min.
  7. Ungebundene DNA wegwaschen:
    1. Kurz gesagt, Zentrifuge, um Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln (ca. 2 s).
    2. Übertragen Sie das Rohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    3. Entfernen Sie mit dem Rohr auf dem magnetischen Rack den Überstand.
    4. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack, waschen Sie Perlen, indem Sie in 100 l 1x B&W Puffer und Pipettiernach oben und unten.
    5. Transferrohr auf magnetisches Rack. Inkubieren Sie für ca. 2 min, bis die Lösung klar ist.
    6. Mit Rohr auf magnetischen Rack, entfernen Überstand.
    7. Wiederholen Sie die Waschschritte mit 100 l LoTE (Schritte 10.7.4 – 10.7.6) zweimal mehr für insgesamt 3 Waschungen.
  8. PCR 2 wie in Tabelle 1 beschrieben einrichten, um Transposon-Knoten zu verstärken und jeder Stichprobe einen einzigen Barcode hinzuzufügen(Tabelle 2 und Tabelle 3).
  9. Führen Sie PCR 2 unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenenBedingungen aus.
  10. Reinigen Sie mit 40 L paramagnetischen Perlen der Größenauswahl (Schritte 9.3.1 – 9.3.12). Elute in 17 l Wasser (Schritte 9.3.13 – 9.3.16), sammeln Sie 15 l.
  11. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Die Endkonzentrationen sollten 50 bis 250 ng/l betragen.
  12. Beurteilung der DNA-Qualität mit einer chipbasierten Kapillarelektrophorese (Abbildung 4A).

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Representative Results

Die skizzierten Methoden beschreiben die Erzeugung einer Transposonbibliothek mit hoher Dichte im A. baumannii-Stamm ATCC 17978 durch bakterielle Konjugation mit E. coli MFD DAP- ,die das Plasmid pJNW684 repliziert (Abbildung 4B). Das detaillierte Protokoll verwendet die bielte bakterielle Konjugation für die Übertragung von pJNW684 vom E. coli-Pir+ Spenderstamm auf den A. baumannii-Empfängerstamm. Dies ist eine effiziente und kostengünstige Methode zur Erzeugung dichter Transposon-Mutantenbibliotheken. Bakterien wurden in optimierten Verhältnissen gemischt und Paarungen wurden auf Luria-Bertani Agarplatten für 1 h gesichtet (Abbildung 1A). Während der Paarung wurde das Transposon vom Spender auf den Empfängerstamm übertragen, wo es in die gDNA eingeführt wurde (Abbildung 1B). Es wurden Paarungen gesammelt, ca. 105 KBE/ml berechnet und auf 150 mm x 15 mm Agarplatten mit Kanamycin vergoldet.. Nach 14 h Wachstum bei 37 °C enthielten Platten Tausende von Kolonien unterschiedlicher Größe(Abbildung 1C), was auf eine erfolgreiche Erzeugung einer transposonmutierten Bibliothek hindeutet. Die Transposon-Insertionsmutanten wurden gepoolt (Abbildung 1D) und in Aliquots eingefroren, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu verhindern, die selektiven Druck auf die Einfügebibliothek erhöhen könnten.

Die gepoolte Transposon-Mutantenbibliothek von A. baumannii wurde verwendet, um Fitnessfaktoren zu identifizieren, die für die Colistinresistenz unter subhemmenden Konzentrationen der antimikrobiellen Konzentrationen von(Abbildung 2B) wichtig sind. Die mutierte Bibliothek wurde in Abwesenheit/Präsenz von 0,5 mg/L Colistin in Doppelter Anzahl von mutierten Zellen, die Insertionen in Gene kodieren, die zur Colistinresistenz beitragen, zu einer logarithmischen Phase herangewachsen. Die gesamte gDNA des verbleibenden Bibliothekspools wurde aus Kontroll- und Versuchskulturen isoliert und zur Herstellung von DNA für die Sequenzierung verarbeitet (Abbildung 3A).

Isolierte gDNA wurde mit mechanischer Scherung fragmentiert und ein Poly-C-Schwanz wurde auf den DNA-Fragmenten hinzugefügt (Abbildung 3A). Nach der Zugabe von Poly-C-Schwanz wurde die DNA gereinigt und die Transposon-Genom-Knoten wurden mit dem Poly-C-spezifischen Primer angereichert, gefolgt von einer zweiten Runde pcR mit einem anderen poly-C-spezifischen Primer, der die P7-Sequenzierungsstelle einführte, die für die Bindung der Illumina-Flusszelle und Clustergenerierung erforderlich ist, und einem Sechs-Basis-Barcode, der zur Demultiplex-Bibliothek nach der Sequenzierung verwendetwird.,47 DNA-Konzentrationen wurden berechnet und die Proben wurden mit einer spanbasierten Kapillarelektrophorese analysiert, um erfolgreiche Bibliotheksbauten zu bestätigen (Abbildung 4A), die für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz bereit sind.

DNA-Bibliotheken wurden durch Sequenzierung der nächsten Generation sequenziert. Es wurde ein Single-End-50-Zykluslauf durchgeführt, der 30 Millionen hochwertige Lese-/Proben lieferte, die eine 62,5-fache Abdeckung der Transposon-Bibliothek boten. Transposon-Knoten (Lesevorgänge) wurden dem Referenzgenom48zugeordnet, mit hilfe einer kommerziell erhältlichen Bioinformatik-Analysesoftware. Die Anzahl der Lesevorgänge an jeder Einfügestelle in den Eingabestichproben, (-) Colistin-Kontrollbedingung, wurden mit der Anzahl der Lesevorgänge in den Ausgabestichproben, (+) Colistin-Experimentalzustand und Fitness-Scores für jede Einfügestelle verglichen. Die Fitness-Scores wurden dann nach Gen gruppiert. Gene, die reduzierte Werte zeigten, wenn die Bibliothek in Gegenwart von Colistin im Verhältnis zu den Eingangsproben angebaut wurde, wurden als Fitnessdeterminanten für das Überleben von A. baumannii bei subhemmenden Konzentrationen von Colistin betrachtet. Beispielsweise waren Transposoneinfügungen innerhalb des PmrAB-Zweikomponentensystems in der Eingangsstichprobe vorhanden, aber in der Ausgabestichprobe nicht gefunden. PmrAB reguliert direkt die Expression von pmrC, das Phosphoethanolamin auf Lipid A überträgt, um die Ladung auf der Zelloberfläche zu neutralisieren12,31. Die Neutralisierung der bakteriellen Oberflächenladung wird gedacht, um das elektrostatische Potenzial zu reduzieren, das für Colistin-vermittelte Tötung erforderlich ist. Die Identifizierung erschöpfter Gene, von der bekannt ist, dass sie zum Resistenz-Phänotyp beitragen, bestätigte die Methode.

Figure 1
Abbildung 1: Schematic der Transposon-Mutanten-Bibliothekskonstruktion. (A) Bakterielle Konjugation. Der "Spender"-Stamm, der die Umsetzungsmaschinerie kodiert, wurde mit dem "Empfänger"-Stamm vermischt. Die Mischung wurde auf LB AgarPlatten gesichtet und erlaubt, für 1 h zu paaren. (B) Generation der Transposon-Bibliothek. Das Plasmid, das die Transpositionmaschinerie trägt, wurde vom "Spender"-Stamm auf den "Empfänger"-Stamm übertragen und das Transposon wurde nach dem Zufallsprinzip in das Genom des "Empfänger"-Stamms eingefügt. (C) Auswahl. Die resultierenden Zellen wurden auf Agarplatten plattiert, die mit Kanamycin ergänzt wurden, um für Transposon-Einfügungsmutanten auszuwählen. (D) Gepoolte Bibliothek. Kolonien wurden von Platten abgekratzt, in LB wieder aufgehängt und gepoolt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der bakteriellen Konjugation und ein Schema des Colistin-Tn-seq-Experiments. (A) Repräsentative Kanamycin-Auswahlplatte. Die Platte ist in fünf gleiche Abschnitte unterteilt. Blaue Punkte stellen Koloniezählung für die Schätzung von A. baumannii Transposon Insertion Mutanten dar. Zur Berechnung der endgültigen Schätzung wurden mindestens drei separate Platten gezählt. (B) Identifizierung von Fitnessfaktoren bei subhemmenden Colistinkonzentrationen. Die gepoolte Transposonbibliothek wurde entweder in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart (experimentell) von Colistin zu einer logarithmischen Wachstumsphase herangewachsen. Sobald die Kulturen die entsprechende optische Dichte erreicht enden, wurden die Zellen pelletiert und gDNA wurde aus jeder Probe extrahiert. Jede Bedingung wurde in doppelter Ausfertigung für insgesamt vier Proben getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Flussdiagramm der DNA-Amplicon-Bibliothek für massive parallele Sequenzierung und repräsentativ eared gDNA erstellen. (A) Tn-seq DNA-Bibliothek erstellen schematisch. Nach der Extraktion wurde gDNA durch mechanisches Scheren fragmentiert. Terminal desoxynukleotidyl transferase wurde verwendet, um einen Poly-C-Schwanz am 3' Ende der fragmentierten DNA vor PCR-Verstärkung der Transposon-Genom-Knoten und Barcode-Zugabe hinzuzufügen. (B) 1% Agarose-Gel von ungehörten und gescherten A. baumannii mutierten Bibliotheken nach gDNA-Scherschritt. 1 Kb Leiter wurde als DNA-Marker verwendet. Der vererbte gDNA-Abstrich liegt in erster Linie zwischen 100 und 500 Basenpaaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Qualitätskontrolle (QC) und Karte des Plasmids, das die Transpositionsgene trägt. (A) QC-Ablauf für einen DNA-Bibliotheksbau. Es gibt einen Spitzenwert von 350 Basispaaren, was auf einen erfolgreichen Bibliotheksaufbau hinweist. Wenn in den QC-Ergebnissen eine größere DNA nachgewiesen wurde, können die Proben weiter gereinigt werden, um große DNA-Fragmente zu entfernen. (B) Plasmid pJNW684 besteht aus einem Himar1 Mariner Transposon (grün) mit einer Kanamycin-Widerstandskassette (lila) zur Mutantenauswahl, ein Gen, das den hyperaktiven Mariner Himar1 C9 Transposase (rot) unter Kontrolle eines A. baumannii 17978 spezifischen Promotors (blau), eines Ampicillinresistenzgens(bla,orange) und eines RP4/oriT/oriR6K-bedingten Ursprungs der Replikation (gelb) kodiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reaktion Setup Bedingungen
Poly-C-Reaktion 30 l geergelten gDNA
2,5 l von 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 l 5X Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase (Tdt) Reaktionspuffer
1,25 l rTdt
6,25 l Wasser bis 50 l		 Inkubieren bei 37oC für 1 Stunde
PCR 1 23 l 3'-poly-C gereinigte DNA (gesamte Probe aus dem vorherigen Schritt)
10 l 10x High-Fidelity DNA-Polymerase-Reaktionsmix
2 l 10 mM dNTPs
2 l 50 mM MgSO4
1 L 30 'M olj 510 Biotin
3 l 30 'M olj 376
High-Fidelity-DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit
8,5 l Reines Wasser bis insgesamt 50 l		 1 Zyklus: 2 min 94 oC
15 Zyklen: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 Zyklus: 4 min 68 oC
Halten: ∞ 4 oC
PCR 2 DNA gebundene Perlen aus dem vorherigen Schritt
10 l 10x High-Fidelity DNA-Polymerase-Reaktionsmix
2 l 10 mM dNTP
2 l 50 mM MgSO4
1 L 30 'M olj 511
Barcode-Primer (Tabelle 2)
High-Fidelity-DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit
33,5 l reines Wasser bis 50 l		 1 Zyklus: 2 min 94 oC
15 Zyklen: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 Zyklus: 4 min 68 oC
Halten: ∞ 4 oC

Tabelle 1: Reaktionsaufbau. Aufbau und Bedingungen für Poly-C-, PCR 1- und PCR 2-Reaktionen.

Zweck Namen Sequenz
Anneals zum Transposon olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCGCGCG
Anneals zu Poly-C Schwanz olj376 GTGACTGGAGGAGAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
Geschachtelt mit Transposon + P5-Adapter:
P5-Erfassungsstelle – P5-Sequenzierungsstelle – N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Verschachtelt zu olj376: P7-Sequenzierungsstelle
– Barcode XXXXXX – P7-Erfassungsstelle)		 Bc ## CAAGGAGAGAACGGCATACGAGATxxxxxxGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
siehe Tabelle 2 für bestimmte Barcodes***

Tabelle 2: PCR-Verstärkungsgrundierungen. PCR-Verstärkungsprimer, die im Protokoll verwendet werden, um die Transposon-Knoten zu verstärken. Der Zweck der einzelnen Wird in der ersten Spalte aufgeführt.

Primer Lesen Barcode Sequenz
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACCATACACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACCATACACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
LC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
LC7 CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGtG
17. Chr. GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGGAGAGACGTGTG
BC30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGGAGAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabelle 3: Barcode-Primer. Barcode-Primer werden im zweiten PCR-Schritt verwendet, um die Transposon-Knoten zu verstärken, während dem Amplicon eine P7-Sequenzierungsstelle und Barcodes hinzugefügt werden. Nicht alle Barcode-Primer werden benötigt, um eine Bibliothek zu generieren. Für die Anzahl der Proben sind nur Barcode-Primer erforderlich.

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Discussion

A. baumannii ist eine neue Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit aufgrund der schnellen Übernahme von AMR gegen "Last-Line"-Therapeutika, wie Colistin10,11,12,23,24,30,31. In den letzten Jahrzehnten hat Tn-seq eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Genotyp-Phänotyp-Wechselwirkungen über zahlreiche Bakterienarten und die Erweiterung unseres Verständnisses der Bakteriellegenetik34,35,42,43gespielt. Tn-seq Protokolle haben bei der Identifizierung wesentlicher Gene in verschiedenen Bakterienarten wie Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, dem Parodontaler Erreger Porphyromonas gingivalisund sogar Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. . Neben der Identifizierung wesentlicher Gene wurde Tn-seq verwendet, um Antibiotikaresistenzgene in Pseudomonas aeruginosa, mehrere bedingt essentielle Gene in Salmonella typhimurium und zahlreiche Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in Streptococcus pneumoniae52,53,54zuidentifizieren. In jüngerer Zeit wurde die Transposonsequenzierung von Vibrio cholerae im Säuglingskaninchenmodell der Cholera eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die für die In-vivo-Fitness während der Infektion wichtig sind47. Diese Studien zeigen die Vielseitigkeit von Tn-seq, da es sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Studien genutzt werden kann.

Der Hauptvorteil von Tn-seq gegenüber anderen Methoden, wie Mikroarray-Technologien, 2D-Gel-Elektrophorese und qPCR, ist, dass es keine Vorkenntnisse über das Genom oder genomische Informationen erfordert55. Daher ermöglicht die Transposon-Mutagenese in Verbindung mit der massiv-parallelen Sequenzierung die Untersuchung bekannter Gene und Genome sowie die Entdeckung neuartiger genetischer Wechselwirkungen. Hier haben wir eine umfassende Methode zur Erzeugung einer hochdichten Transposon-Mutantenbibliothek in A. baumannii vorgestellt, um Faktoren zu identifizieren, die für die bakterielle Fitness wesentlich sind, wenn sie subhemmenden Konzentrationen von Colistin ausgesetzt sind. Die beschriebene Methode wurde auch erfolgreich in E. coli (unveröffentlichte Daten) verwendet, um zu zeigen, dass das System für die Durchführung von Tn-seq-Analysen bei anderen Gram-negativen Krankheitserregern, einschließlich Enterobacteriaceae, geeignet ist.

Die Verwendung von mariner transposons für die Insertionsmutagenese hat mehrere Vorteile. Die Transposon-Familie stammt von eukaryotischen Wirten und wurde weit verbreitet, um sättliche mutierte Bibliotheken in verschiedenen Bakterienpopulationen zu generieren. Mariner-Transposons sind hostunabhängig, was bedeutet, dass stabile zufällige Einfügungen ohne spezifische Wirtsfaktoren erreicht werden können40,41. Darüber hinaus haben marinetransposons eine definierte Anzahl von Insertionsereignissen, da sie bevorzugt in Thymin-Adenin-Motive ("TA") einfügen, was die Einfügungsverzerrung reduziert und zu einerrobusterenstatistischen Analyse 37,56,57,58führt.

Mehrere marinerbasierteTn-seq-Methoden verwenden MmeI-Einschränkungsverdauung für gDNA-Fragmentierung32,42,43. Während enzymatische DNA-Fragmentierung eine beliebte und erfolgreiche Methode ist, fügt sie unnötige Schritte in das Verfahren hinzu und erhöht die potenzielle Verzerrung37. Diese Techniken erfordern nicht nur große Mengen an Ausgangsstoffen, sie können auch zu einer ungleichen Darstellung von Einfügesequenzen in nachgeschalteten Analysen37,59führen. Wie einige andere Methoden, die sich nicht auf die MmeI-Nukleaseaktivität 52,60,61verlassen, beruht die hierbeschriebene Methode auf dem mechanischen Scheren, um gDNA zu fragmentieren, und TdT, um dem 3'-Ende der DNA-Fragmente einen Poly-C-Schwanz hinzuzufügen. Im Vergleich zu enzymatischen DNA-Fragmentierungs- und Adapterligationsmethoden erfordert dieser Ansatz deutlich geringere Mengen an Start-DNA bei gleichzeitig konsistenteren Ergebnissen, senkt auch das Risiko einer DNA-Kreuzkontamination und reduziert den Probenverlust durch ein versiegeltes Rohr37,59,62. Darüber hinaus liefert diese Methode längere, qualitativ hochwertige Sequenzierungs-Lesevorgänge von 50 Nukleotiden, die eine effektivere und präzisere Kartierung von Sequenzen und eine robustere nachgelagerte Analyse37,59unterstützen. Die Zugabe eines synthetischen Poly-C-Schwanzes ignoriert potenzielle Überhänge, die sich aus der Fragmentierung ergeben können, da diese Methode auf dem exogen zugesetzten Poly-C-Schwanz als Erkennungsstelle für den Reverseprimer beruht, der 16 dG-Nukleotide an seinem 3'-Ende und eine Sequenz enthält, die für die Sequenzierung der nächsten Generation spezifisch ist (z. B. Illumina-Sequenzierung) am 5'-Ende, bis zur Prime-Synthese47,59. Die Verwendung eines synthetischen Nukleotidschwanzes erweitert die Anwendung dieser Methode auf viele verschiedene Genome unabhängig von ihrem nativen Gehalt59. Anschließend werden Transposon-Genom-Knoten mit dem poly-C-spezifischen Primer37verstärkt. Diese Alternative vereinfacht das Verfahren, indem teure Restriktionsenzyme, Adapterligation, Die Bildung von Adapterdimerund und Gelreinigungsschritte entfallen. Wir haben das Protokoll weiter optimiert, um effizient hochgesättigte Transposon-Insertionsbibliotheken in mehreren Gram-negativen ESKAPE-Erregern, einschließlich Acinetobacter baumannii, zu erzeugen und können zur Untersuchung genetischer Wechselwirkungen unter verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Bedingungen 10verwendet werden.

Eine Einschränkung der Tn-Mutagenese ist, dass sie sich auf die Antibiotikaresistenzmarker zur Selektion stützt. Jedoch, viele Gram-negative ESKAPE-Erreger sind multidrug oder weitgehend medikamentenresistent, was bedeutet, dass der Benutzer möglicherweise die Resistenzkassette entsprechend dem spezifischen Pathogen von Interesse austauschen müssen. Darüber hinaus sind einige klinische Isolate nicht für die Transposon-Mutagenese mit dem maritimen Transposon geeignet.

Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Berechnung der Anzahl der Tn-Mutanten auf Platte. Zu viele Kolonien zu beschichten, führt zu einem Rasen, der die nachgelagerte Analyse erschweren kann. Wenn die Kolonien zu nah oder berührend sind, können sie unerwünschten selektiven Druck auf die Bibliothek hinzufügen, der zu Artefakten führen kann. Im Idealfall würden Kolonien nicht berührt und gleichmäßig über die Platte verteilt, wie gezeigt (Abbildung 2A). Umgekehrt, wenn zu wenige Kolonien plattiert sind, wird es schwierig sein, mehrere Tn-Einfügungen in jedem Gen zu isolieren.

Es ist auch wichtig, die in Schritt 2.18 aufgeführten Steuerelemente auszuführen. Wie in der Anmerkung von Abschnitt 3 angegeben. 2, weder "Spender" noch "Empfänger" Stamm sollte auf Platten mit Ampicillin ergänzt wachsen. Da exogene DAP für das Wachstum des "Spender"-Stamms erforderlich ist, würde jedes Wachstum auf die "Empfänger"-Sorte hinweisen, die pJNW684 repliziert. Dies ist ein erhebliches Problem, da, wenn das Transposon nicht in die gDNA integriert wird, die Sequenzierungvon lese vorgänge nausen nur dem Plasmid zugeordnet wird, nicht einem Integrationsstandort. In diesem Fall liefert das Experiment wahrscheinlich keine verwertbaren Daten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des National Institute of Health (Grant AI146829 an J.M.B.) unterstützt und wird dankbar anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 161 Transposon Hochdurchsatzsequenzierung Gram-negativ Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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