Summary
Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.
Abstract
Die mitochondriale Dynamik ist für die vielfältigen Funktionen und zellulären Reaktionen der Organelle von wesentlicher Bedeutung. Die überfüllte, räumlich komplexe, mitochondriale Membran ist ein herausforderndes Umfeld, um regulatorische Faktoren zu unterscheiden. Die experimentelle Kontrolle von Protein- und Lipidkomponenten kann helfen, spezifische Regulierungsfragen zu beantworten. Dennoch ist die quantitative Manipulation dieser Faktoren in zellulären Assays eine Herausforderung. Um den molekularen Mechanismus der Mitochondrien-Innenmembranfusion zu untersuchen, haben wir eine In-vitro-Rekonstitutionsplattform eingeführt, die die Lipidumgebung der mitochondrialen Inneren Membran imitiert. Hier beschreiben wir detaillierte Schritte zur Herstellung von Lipid-Bilayern und zur Rekonstituierung von mitochondrialen Membranproteinen. Die Plattform ermöglichte die Analyse von Zwischenprodukten in der mitochondrialen Inneren-Membran-Fusion und der Kinetik für einzelne Übergänge auf quantitative Weise. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Bilayern mit asymmetrischer Lipidzusammensetzung und beschreibt allgemeine Überlegungen zur Rekonstituierung von Transmembranproteinen in eine gepolsterte Bilayer. Die Methode kann angewendet werden, um andere Membransysteme zu untersuchen.
Introduction
Membrankompartalisation ist ein Markenzeichen der eukaryotischen Zellen1 (Abbildung 1A). Biologische Membranen werden zunehmend als mehr als ein zweidimensionales Lösungsmittel erkannt und gelten als eine Umgebung, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Proteinfunktion und der makromolekularen komplexen Baugruppe2,3spielt. Native Lipide sind Liganden, die die Membranproteinaktivität regulieren3,4. Membran räumliche Organisation und die Fähigkeit von Membranen in verschiedenen Formen geformt werden wichtige physikalische Eigenschaften für die Auswahl neuer Funktionen3,5.
Modellmembranplattformen sind biomimetische Systeme, die uns helfen können, Zellmembranstruktur, Dynamik und Funktion6,7,8zu verstehen. Modellmembranen bestehen in der Regel aus einer Lipidmischung aus klar definierter Zusammensetzung mit definierten biophysikalischen Eigenschaften (Steifigkeit, Dicke und Elastizität). Gekoppelt mit Fluoreszenz-Bildgebung ermöglichen Modellmembranplattformen die quantitative Analyse der Membranstruktur und -funktion9,10,11. Lipid-Bilayer-Rekonstitutionsstrategien wurden verwendet, um SNARE-vermittelte Membranfusion9,10, DNA-vermittelte Membranfusion12und virale Fusion11,13zu studieren. Ein Vorteil solcher Methoden ist das Potenzial, kinetische Informationen für Zwischenschritte vor einem beobachtbaren Reaktionsereignis14zu erhalten.
Die Plasmamembran wurde mit Modellmembranen ausgiebig untersucht. Bilayer mit Lipidphasentrennung wurden entwickelt, um Lipid-Floßstrukturen zu untersuchen, die für die zelluläre Signalisierung wichtig sind11,15,16. Mikromusterte lipidplanare Bilayer17,18 wurden verwendet, um die Organisation von Zellrezeptoren zu untersuchen. Polymer- oder Gel-unterstützte Membranen wurden als biomimetische Systeme verwendet, um die Membran-Zytoskelett-Organisation, die Membranprotein-Partitionierung während der Zellsignalisierung und die Migration bei Zell-Zellkontakten zu untersuchen19.
Künstliche Membransysteme werden auch zur Untersuchung subzellulärer Organelleneingesetzt 20. Organellen zeichnen sich durch charakteristische Morphologien aus, die unterschiedliche Subumgebungen erzeugen. Das endoplasmatische Retikulum-Netzwerk (ER) ist ein Beispiel. Bei Rekonstitution von Retikulonen in Liposomen werden röhrenförmige Membranstrukturen mit ähnlichen Eigenschaften wie der zelluläre ER gebildet21. Die Zugabe von Atlastin, einem ER-Fusionsprotein, kann Lipidtubuli aus Liposomen zu einem Netzwerk induzieren20. Dies ist ein Beispiel dafür, wie Proteoliposomen funktionelle Einblicke in organelle Morphologie und Dynamik geben können.
Mitochondriale Membranfusion und Spalt sind für die Gesundheit der mitochondrialen Population22,23,24,25wesentlich. Ein Satz von Dynamin Familie GTPases katalysiert Mitochondrien Membranfusion. Mfn 1/2 katalysiert die Außenmembranfusion. Opa1 vermittelt die Innenmembranfusion26 (Abbildung 1B). Opa1 hat zwei Formen: eine lange Form (l-Opa1), die an der mitochondrialen Innenmembran verankert ist, und eine "lösliche" Kurzform (s-Opa1), die im Intermembranraum vorhanden ist. Das Verhältnis der beiden Opa1-Formen wird durch die Aktivität von zwei Proteasen, Oma1 und Yme1L27,28,29,30reguliert. Wichtige Fragen in Opa1 Regulierung sind: wie die beiden Formen von Opa1, (kurz und lang) vermitteln Membranfusion und ihr regulatorisches Zusammenspiel28,29,31,32,33.
Hier beschreiben wir eine Rekonstitutionsstrategie, die erfolgreich angewendet wurde, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die die Rolle von l- und s-Opa1 in der inneren Membranfusion klarstellte. Wir entwickelten eine Plattform, die die mitochondriale Innenmembran mit einem polymergebundenen Lipid-Bilayer und 200 nm unilamellalaren Vesikeln imitiert. Zu den Vorteilen eines Polymertethers unter der Lipid-Bilayer gehören die folgenden. Zunächst bewahrt es das rekonstituierte Transmembranprotein, das sonst durch die Nähe zum Glasschlitten34gestört werden könnte. Zweitens dient es einer dicken Wasserschicht zwischen Lipid-Bilayer und Glassubstrat, die Studien der Porenöffnung9erleichtert, und drittens ermöglicht die viskoelastische Natur des PEG-Polymers Membrankrümmungsänderungen35. Wir verwendeten dreifarbige Fluoreszenz-Bildgebung, um Schritte in der Membranfusion zu charakterisieren (Abbildung 1C-F).
Abbildung 1: Überwachung der mitochondrialen Membranfusion.
(A) Organellen sind Zellmembrankompartimente. (B) Sequenzielle Schritte der mitochondrialen Membranfusion. Die Verschmelzung der äußeren Membran von Mitochondrien wird durch Mfn1 und/oder Mfn2 katalysiert, während die innere Membranfusion durch Opa1 vermittelt wird. (C-F) Schematisch der In-vitro-Rekonstitutionsplattform zur Untersuchung der mitochondrialen Membranfusion. Die Plattform besteht aus zwei Teilen: einem Proteoliposom und einem polymergebundenen Lipid-Bilayer, beide mit rekonstituiertem l-Opa1. Fluoreszierende Etiketten, darunter zwei verschiedene fluoreszierende Membranfarbstoffe und ein Inhaltsmarker, helfen dabei, Schritte während der Membranfusion zu unterscheiden. Die beiden Membranmarker (Cy5-PE (rot) und TexasRed PE (orange) bilden ein FRET-Paar, das über das enge Andocken der Membran berichten kann. Diffusion von TexasRed-PE, die Proteoliposom etikettet, ist ein Indikator für Lipid-Demix (Hemifusion). Die Inhaltsfreigabe wird durch das Dequenching des Calceinsignals (grün dargestellt) überwacht. Die Panels A und B wurden mit Biorender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
1. Herstellung von Lipidmischungen
- Bereiten Sie eine Lipid-Stammlösung vor, indem Sie 1,2-Dioleoyl-Sn-Glycero-3phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE), L-A-Phosphatidylinositol (Liver PI), Cardiolipin, und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Methoxy(Polyethylenglycol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) in Chloroform in der Konzentration von 25 mg/ml. Fluoreszenz-konjugiertes Lipid (TexasRed DHPE und Cy5 DOPE) Chloroform in einer Konzentration von 1 mg/ml auflösen. Bewahren Sie die Lipidlösung in Bernsteinfläschchen mit chloroformbeständigem Liner auf, die weiter mit Polytetrafluorethylenband versiegelt sind. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C aufbewahrt werden.
- Herstellung von Lösungen A und B.
- Mischen Sie Lipid zur Herstellung von Lösung A (Endkonzentration 1 mg/ml), die DOPC (52,8 mol), POPE (20 mol%), Liver PI (7 mol%) enthält und Cardiolipin (20 Mol) und 0,2 Mol% Fluorophor.
- Herstellung von Lösung B (Endkonzentration 1 mg/ml) mit DOPC (47,8 mol), POPE (20 mol), Leber PI (7 mol), Cardiolipin (20 mol%) DOPE-PEG2000 (5 Mol%) und 0,2 Mol% Fluorophor.
- Erzeugen Sie die Lipidmischung, indem Sie das berechnete Volumen der Speicherlösung mit einer Glasspritze in Bernsteinfläschchen einteilen. Passen Sie das endgültige Volumen an, indem Sie den Durchstechflaschen zusätzliches Chloroform hinzufügen.
HINWEIS: Bei FCS (Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie) verringern Sie das Verhältnis des farbkonjugierten Lipids auf 0,002 Mol% und ersetzen den Rest durch DOPC.
2. Herstellung von Lipid-Doppelschichten
- Mikroskopabdeckung Glasschlitten bei 520 °C für 30 min backen. Nach dem Backen abkühlen die Abdeckung gleitet auf Raumtemperatur.
- Wiegen Sie ca. 10 g Natriumhydroxid und fügen Sie unter Rühren 500 ml Methanol hinzu. 2 h umrühren, Natriumhydroxid in die Lösung geben, bis die Ausscheidungen zu zeigen beginnen. Achten Sie darauf, während des gesamten Prozesses eine entsprechende PSA zu tragen.
- Reinigen Sie die Glasgleletten in 10% Natriumdodecylsulfatlösung; Methanol mit Natriumhydroxid gesättigt; und 50 mM Salzsäure, sequenziell (Badbeschallung unter jeder Bedingung für 30 min). Reinigen Sie die Glasrutsche in Reinstwasser für 10 min zwischen jedem Zustand.
HINWEIS: Obwohl es dringend empfohlen wird, frische Lösungen für die Glasschiebervorbereitung zu verwenden, kann jede Lösung bis zu 5x oder innerhalb von 1 Monat wiederverwendet werden, je nachdem, was zuerst eintritt. Achten Sie darauf, die Lösung vor jedem Gebrauch zu rühren. - Bewahren Sie das gereinigte Deckglas in HCl-Lösung bis zu 2 Wochen ab, um eine gute Bilayer-Qualität zu gewährleisten. Wenn Sie in Reinstwasser gelagert werden, verwenden Sie die Dias innerhalb einer Woche.
- Reinigen Sie den Polytetrafluorethylen-Trog des Langmuir-Blodgett-Tauchsystems mit Chloroform und Reinstwasser, bis keine Benetzung am Trog beobachtet wird. Chloroform auf die Trogoberfläche sprühen, mit Zellulosetüchern 3x gründlich abwischen. Mit Reinstwasser abspülen und das Wasser durch Absaugen entfernen. Wiederholen Sie 3x.
- Bedecken Sie die Oberfläche des Trogs mit sauberem Reinstwasser.
- Nehmen Sie 2 Stück oberflächenbehandeltes Deckglas aus Reinigungslösung oder Reinstwasser und spülen Sie die Glasrutsche mit Reinstwasser für ca. 30 s.
- Legen Sie das Deckglas in einer Back-to-Back-Manier. Verwenden Sie die Substratklemme, um die Glasgletten zu halten. Tauchen Sie die Glasrutsche unter die Wasseroberfläche ein, indem Sie manuell auf "Dipper down" auf die Langmuir-Steuerungssoftware klicken.
- Null die Filmwaage, streuen Sie die Lösung B tropfenweise an der Luft-Wasser-Schnittstelle ab (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass sich Lipide nur an der Luft-Wasser-Schnittstelle ausbreiten, ohne Chloroform und Lipidtröpfchen, die auf den Boden der Polytetrafluorethylenoberfläche sinken. Wenn dies nicht gewährleistet wird, entsteht ein Lipidkanal und verhindert die Bildung von Monolayern.
- Beenden Sie das Hinzufügen von Lipiden bis zur Auslesung des Filmgleichgewichts um 15-20 mN/m, warten Sie auf 10-15 min. Initiieren Sie den Schrankenregler, um die Oberfläche zu verändern, indem Sie auf "Experimente starten" klicken, bis die Filmbilanz auf 37 mN/m ausgelesen wird. Halten Sie den Druck für 20-30 min(Abbildung 2B).
- Heben Sie das Deckglas mit einer Geschwindigkeit von 22 mm/min an, während die Oberflächenspannung bei 37 mN/m erhalten bleibt. Eine Lipid-Monoschicht mit Polymer-Tethering wird durch den Blodgett-Tauchprozess von der Luft-Wasser-Schnittstelle auf die Oberfläche des Deckglases übertragen (Abbildung 2C). Dies bildet die untere Packungsbeilage der Lipid-Bilayer.
- Reinigen Sie die Luft-Wasser-Schnittstelle durch Absaugen, spülen Sie den Trog mit Reinstwasser ab.
- Reinigen Sie vor Gebrauch eine einwellige Glasrutsche (z. B. Shaefer-Rutsche) mit Chloroform, Ethanol und Reinstwasser. Stellen Sie die saubere Glasrutsche mit reinem Wasser unter der Wasserschicht auf den Trog. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen zur Luft-Wasser-Schnittstelle nach oben gerichtet ist und gießen Sie frisches Reinstwasser, bis die Glasrutsche vollständig abgedeckt ist. Wiederholen Sie Schritt 2.8.
- Halten Sie das Deckglas mit Lipid-Monolayer aus Schritt 2.4 mit einem Silizium-Saugnapf (stellen Sie sicher, dass die Monolayer-Seite vom Saugnapf entfernt ist), drücken Sie die Lipid-Monoschicht vorsichtig an die Luft-Wasser-Schnittstelle, halten Sie das Deckglas für 2-3 s an der Schnittstelle, dann schieben Sie das Deckglas gegen den Schlitten (Abbildung 2D). Nehmen Sie die Folie mit einer Abdeckungsfolie heraus.
ANMERKUNG: Die Lipid-Doppelschicht wird an der Oberfläche des Deckglases gehalten, das auf den Sandwichbereich zwischen den beiden Dias gerichtet ist (Abbildung 2E). - Nehmen Sie das Deckglas mit der Bilayer zu einem Epifluoreszenzmikroskop. Bild der Lipid-Bilayer. Wenn eine homogene Verteilung des Lipidfarbstoffs beobachtet wird, photobleichen Sie einen kleinen Bereich der Bilayer für 30 s, schalten Sie die Lichtquelle für 30 s-1 min. aus, dann wieder Bild, um die Erholung zu beobachten. Lipid-Bilayer zeigen Fluoreszenz-Erholung.
HINWEIS: Membranen mit Defekten oder schlechter Fluoreszenzrückgewinnung sollten nicht für weitere Experimente verwendet werden.
Abbildung 2: Schritte bei der Herstellung einer polymergebundenen Lipid-Bilayer.
Schritte zur Herstellung von Lipid-Bilayern mit Langmuir-Blodgett-Dipping (A-C) und Langmuir-Schaefer-Transfer -D) Techniken. (E) Das letzte "Sandwich" mit dem Lipid-Doppelschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Protein-Rekonstitution in die polymerte Lipid-Bilayer
- Bereiten Sie eine Kristallisationsschale mit Reinstwasser vor. Bereiten Sie einen sauberen Mikroskop-Bildring vor und legen Sie ihn unter die Schale.
- Tauchen Sie das "Sandwich" der Schaefer-Rutsche ein und decken Sie das Glas ab, das Lipid-Bilayer unter dem Wasser enthält, trennen Sie sanft die Schaefer-Rutsche und das Deckglas, halten Sie die Abdeckungglasrutsche von unten, weg von der Doppelschichtseite, übertragen Sie das Deckglas in den Bildring, schließen Sie den Bildring.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Deckglas mit Lipid-Bilayer immer in Wasser ist, und der Ring ist gut versiegelt. - Ersetzen Sie das Reinstwasser im Bildring durch den Bis-Tris NaCl Puffer, stellen Sie sicher, dass der Lipid-Doppelschichter keiner Luftblasen ausgesetzt ist. 1,1 x 10-9 M n-Octyl--D-Glucopyranoside in die Lipid-Bilayergeben. Die Mischung aus 1,2 x 10-9 M DDM und 1,3 x 10-12 mol gereinigtem l-Opa136 sofort in den Bildring geben. Inkubationsprobe auf einem Tischschüttler bei niedriger Geschwindigkeit für 2 h(Abbildung 3).
HINWEIS: Waschmittel können je nach zu rekonstituierendem Protein variieren. - Verteilen Sie 30 mg SM-2 Harzperlen in 3 ml Bis-Tris Puffer und schütteln Sie vor dem Auftragen. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um 5 x 10 L SM-2-Harzperlen zum Bildring hinzuzufügen, 10 min zu brüten, Harzperlen durch Spülen zu entfernen. Das endige Volumen des Puffers im Bildring beträgt 1,5 ml.
Abbildung 3: Verfahren zur Rekonstituierung von l-Opa1 in eine polymergebundene Lipid-Bilayer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Vorbereitung von Proteoliposomen
- 1 mg Lipidmischung A in Chloroformlösung vorbereiten. Chloroform unter Stickstofffluss 20 min verdampfen und über Nacht unter Vakuum halten und einen Lipidfilm bilden.
- 50 mM Calcein enthaltender Puffer vorbereiten, indem 15,56 g Calcein auf 50 ml 1,5 mol NaOH-Lösung aufgelöst werden, bei Raumtemperatur rühren, bis Calcein vollständig gelöst ist, 12,5 mM Bis-Tris und Reinstwasser auf das Endvolumen von 500 ml aufbringen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein.
- Lipidfilm in Calcein enthaltenden Puffer aussetzen, das Lipid vollständig hydratisieren, indem die Suspension bei 65 °C für 20 min erhitzt wird. 200 nm Liposomen werden durch Extrusion mit einer Polycarbonatmembran gebildet.
- Fügen Sie 2 g l-Opa1 in 0,5 m DDM zu 0,2 mg Liposom hinzu und brüten bei 4 °C für 1,5 h. Entfernen Sie das Tensid durch Dialyse mit einer 3,5 kDa Dialysekassette gegen 250 ml 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl und 50 mM Calceinpuffer bei 4 °C über Nacht, wodurch der Puffer zweimal gewechselt wird.
- Entfernen Sie zusätzliches Kalkein mit einer PD-10-Entaltungsspalte.
5. Bildgebung und Datenanalyse
- Erfassen Sie TIRF-Bilder mit einem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv (N.A 1.4). Verwenden Sie 543 nm Laser und einen 488 nm Laser für die Analyse von TexasRed-PE markierten Liposomen und Proteoliposomen mit Calcein verkapselt. Verwenden Sie einen 633 nm Laser für die Analyse von Cy5-PE eingebettet in die planare Lipid-Bilayer.
- Richten Sie den TIRF-Winkel mit einer Lipid-Bilayer aus, um maximale Emissionen zu erzielen. Die Qualität der Lipid-Bilayer nach Rekonstitution wird mit einem 100-fachen Ölobjektiv bei 25 °C beobachtet. Der Diffusionskoeffizient von Phospholipid und rekonstituierter Doppelschicht wird mit FCS mit einem Protokoll bestimmt, das an anderer Stelle beschrieben wird37.
- Fügen Sie dem Bildring 10 l mit 2 mg/ml Proteoliposomen hinzu und stellen Sie 10 Min. vor dem Bild ein. GTP, GMPPCP oder BIP werden mit 1 mM MgCl2 und 1 mM Nukleotid in den Reaktionsring aufgenommen.
- Um den Einfluss von s-Opa1 in der Membranfusion zu bestimmen, titrate s-Opa1 in eine Proteoliposom/unterstützte Bilayer-Probe, die l-Opa1 enthält, und aufzeichnung Fusionsereignisse.
- Die gleichzeitige Abbildung von TexasRed-DHPE und Calcein wird durch ein Strahlspaltsystem erreicht. Sowohl 488 nm als auch 543 nm Laser werden gleichzeitig als mehleszierende Anregungsquellen auf die Probe aufgebracht. Das Emissionslicht wird dann mit einem 560 nm Strahlsplitter geteilt. Das geteilte Emissionslicht wird dann durch einen 510 nm Filter mit einer Bandbreite von 42 nm und einen 609 nm Filter mit einer Bandbreite von 40 nm gefiltert. Der gefilterte Strahl wird auf zwei angrenzende Bereiche auf dem Kamerachip projiziert.
- Die Fluoreszenzemissionen werden gleichzeitig über einen 609-Emissionsfilter mit einer Bandbreite von 40 nm und einen 698-Emissionsfilter mit einer Bandbreite von 70 nm erfasst. Das Mikroskopsystem ist mit einer CMOS-Kamera ausgestattet, die bei -10 °C gehalten wird.
- Die Partikelidentifikation der Liposomen kann mit einem Gaußschen-basierten Partikelerkennungsalgorithmus durchgeführt werden. Die Partikelverteilung und -intensität werden Kanal für Kanal analysiert. Ein Lipid-Bilayer-Signal wird als Maske verwendet, um Partikel zu isolieren.
Representative Results
Das rekonstituierte Transmembranprotein diffundiert frei und ist homogen in der Membran verteilt.
Beispielbilder einer Lipid-Bilayer und ihrer durch Epifluoreszenzmikroskopie validierten Lipidfluidität sind in Abbildung 4dargestellt. Die Lipidverteilung in Bilayer vor und nach der Photobleichung ist in Abbildung 4A,Bdargestellt. Die Homogenität der Lipid-Bilayer wurde mit einem Epifluoreszenzmikroskop vor und nach der Rekonstitution visualisiert (Abbildung 4D,E). l-Opa1 rekonstituiert in Lipid-Bilayer wurde durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) validiert. Wir verwenden farbkonjugierte Lipide, um die Lipiddiffusivität der Bilayer zu bewerten. Rekonstituierte Opa1 wurde mit einem fluoreszierenden Anti-Opa1 C-Terminal Antikörper gekennzeichnet. Die bilayerlipiddiffusion wurde mit 1,46 x 0,12 x2/s gemessen, während der Diffusionskoeffizient der bilayer-rekonstituierten l-Opa1 0,88 x 0,10 x2/s betrug. Aus den FCS-Kurven angegebene Intensitätsanzeige 75% l-Opa1 wird in die Lipid-Bilayer-Ebene rekonstituiert (Abbildung 4G,H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass l-Opa1 frei in der polymergebundenen Lipid-Bilayer mit dem Potenzial diffundiert, sich selbst zu funktionellen Komplexen zusammenzusetzen.
Abbildung 4: Verteilung von Lipid und rekonstituiertem Protein in der Modellmembran.
(A-C) Beispielbilder einer Lipid-Bilayer und ihrer Lipidfluidität, die durch Epifluoreszenzmikroskopie validiert wird. (A) Homogene Lipidverteilung in Doppelschicht vor dem Photobleichvorgang. (B) Schnappschuss unmittelbar nach dem Photobleichen. (C) Bilayer nach Fluoreszenzerholung zeigt eine gute Lipidfluidität der Membran nach Rekonstitution. (D,E) Repräsentative Bilder der Lipidverteilung vor (D) und nach (E) l-Opa1 Rekonstitution zeigen, dass der Rekonstitutionsprozess keine Defekte in der Bilayer verursacht hat. Repräsentatives TIRF-Bild von l-Opa1 mit Alexa 488 konjugiertem Antikörper (F) mit einer homogenen Verteilung von Opa1 bei Rekonstitution. G. Repräsentative Rohe Photonenanzahl des l-Opa1-Signals durch fluoreszierende Korrelationsspektroskopie. Bei der Kontrolle wurde kein l-Opa1 in der Bilayer-Datei rekonstituiert, während Antikörper hinzugefügt und gespült wurden. Die Diffusion von l-Opa1 ist deutlich langsamer als Lipide in der Membran, im Einklang mit einer erfolgreichen Rekonstitution der Transmembran l-Opa1 (H). Maßstabsleiste: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Fluoreszenz-Schrittbleiche deutete darauf hin, dass durchschnittlich 2-3 Kopien von l-Opa1 in einem gegebenen Liposom rekonstituiert wurden (Abbildung 5A,B). Die Größenverteilung der Opa1-rekonstituierten Proteoliposomen wurde nach der Rekonstitution mit DLS getestet (Abbildung 5C). Die Rekonstitution von Opa1 in Proteoliposomen wurde auch mit FCS überprüft. Der Diffusionskoeffizient des freien Antikörpers betrug 164 x 22 x2/s; Diffusionskoeffizient für Liposomen, die mit einem Lipidfarbstoff gekennzeichnet waren, betrug 2,22 x 0,33 x2/s, und der Diffusionskoeffizient für l-Opa1-Proteoliposomen, die an einen TexasRed-beschrifteten Anti-His-Antikörper gebunden waren, betrug 2,12 x 0,36 x2/s.
Abbildung 5: Herstellung und Charakterisierung von Proteoliposomen.
(A) Schritte bei der Herstellung von Proteoliposomen mit gekapseltem, abgeschrecktem Kalkein. (B) Repräsentative Daten der fluoreszierenden Stepbleichung zeigen durchschnittlich 2-3 Kopien von l-Opa1, die in das Liposom eingebettet sind. (C) Repräsentative Größenverteilungen von Proteoliposomen (rot) ohne Nukleotid 1 h nach GTP-Inkubation (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nachweis von Membrantethering, Lipiddemixing/Hämifusion und Porenöffnung durch fluoreszierende Mikroskopie.
Die Membran-Tethering wird überwacht, indem das Signal von TexasRed auf der Oberfläche der Lipid-Doppelschicht mittels TIRF-Mikroskopie beobachtet wird (Abbildung 6A). Das Verhalten der Membranlipiddemischung (Hemifusion) wurde durch TexasRed überwacht, da der Farbstoff von den Liposomen in die Lipid-Bilayer diffundiert. Calcein Dequenching hilft, die vollständige Fusionsporenbildung von nur Lipid-Demixing zu unterscheiden. Dies ermöglicht einen Vergleich zwischen Bedingungen, unter denen Partikel bei der Hämifusion stehen bleiben (Abb. 6B), und Partikeln, die zur vollständigen Fusion übergehen (Abbildung 6C).
Membran-Tethering wird durch ein stabiles Lipidsignal von Liposomen angezeigt. Der Abstand konnte anhand des FRET-Signals zwischen den Etiketten der beiden Membranen36ausgewertet werden. Das Hemifusionssignal weist keine Dequenching im Calceinsignal auf(Abbildung 6B, untere Reihe), aber ein schneller Zerfall des TexasRed-Signals zeigt die Diffusion des Farbstoffs in die Lipid-Bilayer an(Abbildung 6B obere Reihe). Volle Fusion (mit Porenöffnung) verfügt sowohl über Lipidzerfall als auch über die Freisetzung von Inhalten (Abbildung 6C). TexasRed Intensität und Calcein-Intensität können zeitabhängig verfolgt werden, um quantitative Details für die Kinetik der Membranfusion36zu liefern.
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse, die Partikel-Tethering (A, Maßstabsbalken 10 m), Hemifusion (B, Skalenstab 0,5 m) und Fusion (C, Skalenstab 0,5 m) zeigen.
(A) Proteoliposomen, die vor gtP-Zugabe an Opa1-rekonstituierte Lipid-Bilayer gebunden sind. (B) Ein Beispiel für die Hämifusion. Die obere Reihe in B zeigt Lipid-Demixing (TexasRed-Signal, rot), untere Reihe in B zeigt keine Inhaltsfreisetzung (Calcein-Signal, grün) unter diesen Bedingungen. (C) Eine repräsentative Spur der Proteoliposom-Verschmelzung mit der Lipid-Bilayer. Die Inhaltsfreigabe kann anhand von Bildern in der unteren Reihe beobachtet werden, die das Entzern von Calcein (untere Reihe, grün) zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
In-vitro-Modellmembransysteme können komplexe Membranprozesse unter genau definierten Bedingungen beschreiben. Diese Systeme können minimale Komponenten unterscheiden, die für komplexe molekulare Prozesse erforderlich sind, um molekulare Mechanismen6,15,20,38zu offenbaren. Für Membranproteine sind Liposomen und planar unterstützte Doppelschichten gängige Rekonstitutionssysteme. Im Gegensatz zu festunterstützten Lipid-Doppelschichten ermöglicht das Polymerkissen zwischen Substrat und unterstützter Membran in polymergebundenen Doppelschichten die freie Mobilität großer Membranproteine und Transmembranproteine, um frei zu diffundieren und zu montieren34. Diese Eigenschaften halfen uns, die Kinetik der Mitochondrien-Innenmembranfusion36zu untersuchen.
Wir haben eine polymertete Lipid-Bilayer mit Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) Verfahren vorbereitet. So können wir eine Doppelschicht mit asymmetrischen Lipidkomponenten zubereiten. Zellmembranen haben eine asymmetrische Packungsbeilage, und der LB/LS-Ansatz ermöglicht die Untersuchung solcher Doppelschichten. Mit Schaefer-Transfer kann ein ganzes Glassubstrat mit einer Lipid-Bilayer abgedeckt werden. Es ist wichtig, eine saubere Oberfläche für die Bilayer-Vorbereitung vorzubereiten. Zusätzlich braucht es Übung, um einen Schaefer-Transfer korrekt durchzuführen. Eine erfolglose Schaefer-Übertragung kann unerwünschte Defekte in einer Lipid-Bilayer verursachen. In diesem Protokoll ist der Druck, der der Filmwaage zugesetzt wird, für eine Bischicht mit 20% Cardiolipin anwendbar. Für Doppelschichten mit anderen Komponenten finden Sie die Oberflächendruckflächenisotherme der Schlüsselkomponenten. Eine alternative Methode ist die Langmuir-Blodgett/Vesicle Fusion (LB/VF) Methode, bei der die untere Lipidmonoschicht von der Luft-Wasser-Schnittstelle eines Langmuir-Trogs auf ein sauberes Substrat übertragen wird, dann Liposomen an die Oberseite der unterstützten Lipidmonoschicht verschmelzen und die endgültige Doppelschicht39bilden. Die Rekonstitution von Membranproteinen mit der LB/VF-Methode ist einfacher als LB/LS, da die Rekonstitution durch die Fusion von Proteoliposomen durchgeführt werden kann. Die Vesikelfusion erfordert jedoch die Zugabe von überschüssigen Liposomen, was die Untersuchung von Membranereignissen erschweren kann, die von konzentrationsabhängigen Protein-Protein-Wechselwirkungen abhängig sind.
Die erfolgreiche Rekonstitution von Transmembranproteinen in polymergebundene Lipid-Doppelschichten und Liposomen in bevorzugter funktioneller Ausrichtung ist wichtig, aber schwer durchsetzbar. Um dies zu berücksichtigen, sind experimentelle Kontrollen erforderlich. Für polymergebundene Lipid-Doppelschichten ist es auch wichtig, die Integrität der Lipid-Doppelschicht während der Rekonstitution zu erhalten. Die Tensidkonzentrationen müssen relativ niedrig gehalten werden, um eine Auflösung der Lipid-Bilayer zu verhindern, aber hoch genug, um eine Denaturierung des in Interesse sindden Proteins zu verhindern37,40. Die hier beschriebene Methode ist ideal für die Rekonstituierung von Membranproteinen für Einzelmolekülstudien, ist aber nicht unbedingt für größere Studien skalierbar. Die Entscheidung für Tensidisten ist eine weitere wichtige Überlegung. Häufig ist das zur Reinigung und Lagerung verwendete Tensid ein guter Ausgangspunkt. Die maximale Konzentration von Tensid ist in der Regel 200 mal weniger von der CMC36, in einem Bereich, in dem das Tensid die Proteinstabilität aufrechterhält und die Proteinaggregation verhindert, während die Integrität der Membran36erhalten bleibt. Cocktails mit 2 oder 3 Tensiden können in Betracht gezogen werden. Zur Rekonstitution zu Liposomen ist eine geringe Konzentration von Tensid nicht erforderlich. Tensidkonzentrationen unterhalb von CMC sind jedoch vorzuziehen, um eine gleichmäßige Größe und Morphologieverteilung für die Liposomen aufrechtzuerhalten. Um das Auslaufen von Inhaltsfarbstoffen zu verhindern, ist es notwendig, gegen einen farbstoffhaltigen Puffer zu dialysieren.
Im Gegensatz zu Liposomen-basierten Fusionstests bietet die von uns etablierte Plattform einen Ansatz, um die Kinetik jedes Schritts der Membranfusion zu untersuchen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, Transmembran-Fusionsproteine unter nahezu nativen Bedingungen zu untersuchen. Modellmembranplattformen können zur Untersuchung der Membranprotein-Montage und-Oligomerisierung, der Membran-"Skulptur" und der Protein-Lipid-Wechselwirkungen von Proteinen in subzellulären Umgebungen, wie der mitochondrialen Inneren Membran, eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht auch die Erforschung wichtiger physiologischer Bedingungen im Membran-Protein-Interspiel, wie z. B. Bilayer-Zusammensetzungsasymmetrie. Die Rolle eines wichtigen mitochondrialen Lipids, Cardiolipin, in den bilayern Eigenschaften sowohl von Liposomen als auch von polymerunterstützten Doppelschichten muss noch definiert werden. Eigenschaften wie Ionenstärke, Membrandicke, Membransteifigkeit, Membrankrümmung und Membran-Elastizitätsviskositätseigenschaften können die Fähigkeit von Proteinen beeinflussen, sich in bestimmte Funktionszustände zu montieren. Zukünftige Studien, die Modellmembransysteme kreativ anwenden, haben das Potenzial, neue Aspekte der Membranproteinorganisation und -funktion aufzudecken.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Unterstützung des Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award und die großzügige Unterstützung durch das Department of Molecular Biology am Massachusetts General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
| 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
| Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
| Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
| Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
| Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
| Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
| FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
| Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
| GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
| Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
| L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
| Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
| n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
| PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
| Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
| Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
| Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |
References
- Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
- Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
- Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
- Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
- Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
- Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
- Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
- Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
- Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
- Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
- Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
- Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
- Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
- Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
- Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
- Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
- Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
- Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
- DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
- Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
- Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
- Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
- Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
- Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
- Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).
