Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En modell membran plattform for rekonstituere mitokondrie membran dynamikk

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61620
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

Mitokondriefusjon er en viktig homeostatisk reaksjon underliggende mitokondriedynamikk. Beskrevet her er et in vitro rekonstitueringssystem for å studere mitokondrie indre membran fusjon som kan løse membran tethering, docking, hemifusjon, og pore åpning. Allsidigheten til denne tilnærmingen i å utforske cellemembransystemer diskuteres.

Abstract

Mitokondriedynamikk er avgjørende for organelles ulike funksjoner og cellulære reaksjoner. Den overfylte, romlig komplekse, mitokondriemembranen er et utfordrende miljø for å skille regulatoriske faktorer. Eksperimentell kontroll av protein- og lipidkomponenter kan bidra til å svare på spesifikke spørsmål om regulering. Likevel er kvantitativ manipulering av disse faktorene utfordrende i cellulære analyser. For å undersøke den molekylære mekanismen for mitokondrier indre membranfusjon introduserte vi en in vitro rekonstitueringsplattform som etterligner lipidmiljøet i mitokondrie indre membran. Her beskriver vi detaljerte trinn for å forberede lipid bilayers og rekonstituere mitokondriemembranproteiner. Plattformen tillot analyse av mellomprodukter i mitokondrie indre membranfusjon, og kinetikken for individuelle overganger, på en kvantitativ måte. Denne protokollen beskriver fabrikasjon av bilayers med asymmetrisk lipidsammensetning og beskriver generelle hensyn for rekonstituering av transmembraneproteiner til en polstret bilayer. Metoden kan brukes til å studere andre membransystemer.

Introduction

Membran compartmentalization er et kjennetegn på eukaryotiskeceller 1 (Figur 1A). Biologiske membraner blir i økende grad anerkjent som mer enn et todimensjonalt løsningsmiddel, og regnes som et miljø som spiller kritiske roller i å regulere proteinfunksjon og makromolekylær kompleksmontering 2,,3. Innfødte lipider er ligands som regulerer membranproteinaktivitet3,4. Membran romlig organisasjon og evnen til membraner som skal skulptureres i ulike former er viktige fysiske egenskaper for å velge nyefunksjoner 3,5.

Modell membran plattformer er biomimetiske systemer som kan hjelpe oss å forstå cellulær membranstruktur, dynamikk,og funksjon 6,7,8. Modellmembraner består vanligvis av en lipidblanding av veldefinert sammensetning, med definerte biofysiske egenskaper (stivhet, tykkelse og elastisitet). Sammenlignet med fluorescens bildebehandling, modell membran plattformer tillate kvantitativ analyse av membranstruktur og funksjon 9,10,11. Lipid bilayer rekonstitueringsstrategier har blitt brukt til å studere SNARE-mediert membranfusjon9,,10,DNA-mediert membranfusjon12og viralfusjon 11,,13. En fordel med slike metoder er potensialet til å få kinetisk informasjon for mellomliggende trinn før en observerbar reaksjonshendelse14.

Plasmamembranen har blitt grundig studert ved hjelp av modellmembraner. Bilayers med lipid fase separasjon er utviklet for å studere lipid flåte strukturer viktig i cellulær signalisering11,,15,,16. Mikropatterned lipid planar bilayers17,18 har blitt brukt til å undersøke organiseringen av cellereseptorer. Polymer- eller gelstøttede membraner har blitt brukt som biomimetiske systemer for å studere membran-cytoskeleton-organisasjonen, membranproteinpartisjonering under cellesignalering og migrasjon ved cellecellekontakter19.

Kunstige membransystemer brukes også til å studere subcellulære organeller20. Organeller har karakteristiske morfologier som skaper distinkte undermiljøer. Den endoplasmaiske reticulum (ER) nettverk er ett eksempel. Ved rekonstituering av reticulons til liposomer dannes rørformede membranstrukturer med egenskaper som ligner på cellulære ER21. Tilsetning av atlastin, et ER fusion protein, kan indusere lipid tubuli fra liposomer for å danne et nettverk20. Dette er et eksempel på hvordan proteoliposomer kan gi funksjonell innsikt i organelle morfologi og dynamikk.

Mitokondriemembranfusjon og fisjon er avgjørende for helsen til mitokondriepopulasjonen22,23,,24,,25., Et sett med dynaamin familie GTPases katalyserer mitokondrier membran fusjon. Mfn 1/2 katalyserer ytre membranfusjon. Opa1 medierer indremembranfusjon 26 (figur 1B). Opa1 har to former: en lang form (l-Opa1), transmembrane-forankret til mitokondrie indre membran, og en "løselig" kortform (s-Opa1), tilstede i mellommembrane rommet. Forholdet mellom de to Opa1-skjemaene reguleres av aktiviteten til to proteaser, Oma1 og Yme1L27,,28,,29,,30. Viktige spørsmål i Opa1 regulering inkluderer: hvordan de to formene for Opa1, (kort og lang) megle membran fusjon og deres regulatoriske samspill28,,29,,31,,32,,33.

Her beskriver vi en rekonstitueringsstrategi som ble brukt til å undersøke mitokondrie indre membranfusjon som klargjorde rollene til l- og s-Opa1 i indre membranfusjon. Vi utviklet en plattform som etterlignet mitokondrie indre membran ved hjelp av en polymer-bundet lipid bilayer og 200 nm unilamellar vesikler. Fordelene med en polymer tether under lipid bilayer inkluderer følgende. For det første bevarer det rekonstituerte transmembraneproteinet, som ellers kan bli forstyrret av nærheten til glasslysbildet34. For det andre tjener det et tykt vannlag mellom lipid bilayer og glasssubstrat, noe som letter studier av poreåpning9, og for det tredje tillater viskoelastisk natur peg polymer membran krumningendringer 35. Vi brukte tre-farge fluorescens imaging å karakterisere trinn i membran fusjon (Figur 1C-F).

Figure 1
Figur 1: Overvåking av mitokondriemembranfusjon.
Organellerer cellulære membranrom. (B)Sekvensielle trinn av mitokondriemembranfusjon. Fusjon av den ytre membranen av mitokondrier er katalysert av Mfn1 og/ eller Mfn2, mens indre membranfusjon er mediert av Opa1. (C-F) Skjematisk av in vitro rekonstitueringsplattformen for å studere mitokondriemembranfusjon. Plattformen inneholder to deler: en proteoliposom og en polymer-bundet lipid bilayer, begge med rekonstituert l-Opa1. Fluorescerende etiketter, inkludert to forskjellige fluorescerende membranfargestoffer og en innholdsmarkør, bidrar til å skille trinn under membranfusjon. De to membranmarkørene (Cy5-PE (rød) og TexasRed PE (oransje) lager et FRET-par, som kan rapportere om tett membrandokking. Diffusjon av TexasRed-PE som merker proteoliposome er en indikator på lipid demixing (hemifusjon). Innholdsutgivelse overvåkes gjennom dequenching av calcein signalet (vist i grønt). Panel A og B opprettet ved hjelp av Biorender. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Tilberedning av lipidblandinger

  1. Forbered en lipid lagerløsning ved å oppløse 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3fosfolkolin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE), L-α-fosfatatidylinositol (Liver PI), kardiolipin, og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[methoxy(polyetylenglykol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) i kloroform ved konsentrasjon av 25 mg/ml. Oppløs fluorescerende fargestoffkonjugert lipid (TexasRed DHPE og Cy5 DOPE) kloroform med en konsentrasjon på 1 mg/ml. Oppbevar lipidoppløsningen i ravbeger med kloroformbestandig liner, forseglet ytterligere med polytetrafluoretylentape. Oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder.
  2. Lag løsninger A og B.
    1. Bland lipid for å klargjøre oppløsning A (endelig konsentrasjon 1 mg/ml) som inneholder DOPC (52,8 mol%), POPE (20 mol%), Lever PI (7 mol%) og kardiolipin (20 mol%), og 0,2 mol% fluorofor.
    2. Lag oppløsning B (endelig konsentrasjon 1 mg/ml) som inneholder DOPC (47,8 mol%), POPE (20 mol%), leverEN PI (7 mol%), kardiolipin (20 mol%) og DOPE-PEG2000 (5 mol%), og 0,2 mol% fluorofor.
    3. Generer lipidblandingen ved å tilsette det beregnede volumet av oppbevaringsoppløsning i gule hetteglass ved hjelp av en glasssprøyte. Match det endelige volumet ved å legge til ekstra kloroform i hetteglassene.
      MERK: For FCS (fluorescenskorrelasjonsspektroskopi) reduseres forholdet mellom fargestoffkonjugert lipid til 0,002 mol% og skift resten av DOPC.

2. Fabrikasjon av lipid bilayers

  1. Bake mikroskop deksel glass lysbilder ved 520 °C i 30 min. Etter baking, avkjøle dekselet glir til romtemperatur.
  2. Vei ca. 10 g natriumhydroksid og tilsett 500 ml metanol under omrøring. Rør i 2 timer, fortsett å tilsette natriumhydroksid i oppløsningen til bunnsetter begynner å vise seg. Pass på at du bruker riktig PPE under hele prosessen.
  3. Rengjør glassskliene i 10% natrium dodecylsulfatoppløsning; metanol mettet med natriumhydroksid; og 50 mM saltsyre, sekvensielt (bad sonikering under hver tilstand i 30 min). Rengjør glasssklie i ultrarent vann i 10 minutter mellom hver tilstand.
    MERK: Selv om det anbefales å bruke nye løsninger for glasssklieforberedelse, kan hver løsning brukes på nytt opptil 5x eller innen 1 måned, uansett hva som kommer først. Sørg for å røre oppløsningen før hver bruk.
  4. Oppbevar det rengjorte dekkglasset forseglet i HCl-oppløsning opptil 2 uker for å sikre god bilayerkvalitet. Hvis det oppbevares i ultrarent vann, bruker du skliene innen en uke.
  5. Rengjør polytetrafluoretylen gjennom Langmuir-Blodgett dyppesystemet ved hjelp av kloroform og ultrapure vann til ingen fukting er observert på trauet. Spray kloroform på trauoverflaten, tørk grundig med celluloseservietter 3x. Skyll med ultrarent vann og fjern vannet via suging. Gjenta 3x.
  6. Dekk overflaten av trauet med rent ultrarent vann.
  7. Ta 2 stykker overflatebehandlet dekkglass fra rengjøringsløsning eller ultrarent vann, og skyll glasssklien med ultrarent vann i ca. 30 s.
  8. Plasser dekkglasset på en back-to-back måte. Bruk underlaget klemmen til å holde glassskliene. Senk glasssklien under vannoverflaten ved å klikke "dipper down" manuelt på Langmuir-kontrollprogramvaren.
  9. Null filmbalansen, forsiktig spre Løsning B dråpe for dråpe på luft-vann grensesnittet (Figur 2A). Pass på at lipider bare sprer seg ved luftvannsgrensesnittet, uten kloroform og lipiddråper som synker til bunnen av polytetrafluoretylenoverflaten.  Unnlatelse av å sikre at dette vil skape en lipid "kanal" og hindre monolayer dannelse.
  10. Slutt å legge lipider til filmbalansen leses rundt ~ 15-20 mN / m, vent i ~ 10-15 min. Start barrierekontrolleren for å endre overflatearealet ved å klikke på "start eksperimenter", til filmbalansen leses ut til 37 mN/m. Hold trykket i ~20-30 min (Figur 2B).
  11. Hev dekkglasset med en hastighet på 22 mm/min samtidig som overflatespenningen opprettholdes ved 37 mN/m. En lipid monolayer med polymertetering vil bli overført fra luftvannsgrensesnittet til overflaten av dekkglass gjennom Blodgett-dyppeprosessen (figur 2C). Dette danner bunnbrosjyren til lipid bilayer.
  12. Rengjør luftvannsgrensesnittet ved suging, skyll trauet med ultrarent vann.
  13. Rengjør en enbrønnet glasssklie (f.eks. Shaefer-gliden) ved hjelp av kloroform, etanol og ultrarent vann før bruk. Sett den rene glasssklien på trauet med ultrarent vann under vannlaget. Pass på at brønnen vender opp mot luftvannsgrensesnittet og hell friskt ultrarent vann til glasssklien er helt dekket. Gjenta trinn 2.8.
  14. Hold dekkglasset med lipidmonilag fra trinn 2.4 ved hjelp av en silisiumsugekopp (pass på at monolayersiden er borte fra sugekoppen), skyv forsiktig lipidmonolaget til luftvannsgrensesnittet, hold dekkglasset i ~ 2-3 s på grensesnittet, og skyv deretter dekselglasset mot lysbildet (figur 2D). Ta lysbildet ut med et deksellysbilde.
    MERK: Lipid bilayeren vil bli holdt på overflaten av dekkglasset vendt mot det sandwichede området mellom de to lysbildene (figur 2E).
  15. Ta dekkglasset med bilayeren til et epifluorescence mikroskop. Bilde lipid bilayer. Hvis en homogen fordeling av lipidfarge observeres, fotobleach et lite område av bilayer i 30 s, slå av lyskilden i ~ 30 s-1 min., deretter bilde igjen for å observere utvinning. Lipid bilayer vil vise fluorescens utvinning.
    MERK: Membraner med defekter eller dårlig fluorescensgjenvinning bør ikke brukes til videre eksperimenter.

Figure 2
Figur 2: Trinn i å lage en polymer-bundet lipid bilayer.
Trinn for å lage lipid bilayers ved hjelp av Langmuir-Blodgett dipping (A-C) og Langmuir-Schaefer overføring (D) teknikker. (E) Den endelige "sandwich" som inneholder lipid bilayer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Protein rekonstituering i polymer-bundet lipid bilayer

  1. Forbered en krystalliseringsfat som inneholder ultrarent vann. Forbered en ren mikroskopbildering og plasser under parabolen.
  2. Dypp "sandwich" av Schaefer lysbildet og dekk glass som inneholder lipid bilayer under vannet, forsiktig skille Schaefer lysbildet og dekke glass, hold dekselet glass lysbildet fra bunnen, vekk fra bilayer side, overføre dekselet glass inn i bilderingen, lukk bilderingen.
    MERK: Pass på at dekkglasset med lipid bilayer alltid er i vann, og at ringen er godt forseglet.
  3. Bytt ut det ultrapure vannet i bilderingen med Bis-Tris NaCl-bufferen, sørg for at lipid bilayer ikke utsettes for noen luftbobler. Tilsett 1,1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside til lipid bilayer. Tilsett umiddelbart blandingen av 1,2 x 10-9 M DDM og 1,3 x 10-12 mol renset l-Opa136 inn i bilderingen. Inkuber prøven på en benkeplate shaker ved lav hastighet i 2 timer (Figur 3).
    MERK: Rengjøringsmidler kan variere avhengig av protein som skal rekonstitueres.
  4. Fordel 30 mg SM-2 Harpiksperler i 3 ml Bis-Tris buffer og rist før påføring. Bruk en plastpipette til å legge til 5 ~ 10 μL SM-2 Harpiksperler til bildering, inkuber i 10 min, fjern harpiksperler ved skylling. Det endelige volumet av bufferen i bilderingen er 1,5 ml.

Figure 3
Figur 3: Prosedyre for rekonstituering av l-Opa1 til en polymer-bundet lipid bilayer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Fremstilling av proteoliposomer

  1. Forbered 1 mg lipidblanding A i kloroformoppløsning. Fordampe kloroform under nitrogenstrøm i 20 min og hold under vakuum over natten og danner en lipidfilm.
  2. Forbered 50 mM calcein som inneholder buffer ved å oppløse 15,56 g kalcein til 50 ml 1,5 mol NaOH-løsning, rør ved romtemperatur til kalvein er fullstendig oppløst, lagt til 12,5 mM Bis-Tris og ultrapure vann til det endelige volumet på 500 ml. Juster pH-en til 7,5.
  3. Suspend lipidfilm i calcein som inneholder buffer, fullt hydrere lipid ved å varme opp suspensjonen ved 65 °C i 20 min. 200 nm liposomer dannes gjennom ekstrudering ved hjelp av en polykarbonatmembran.
  4. Tilsett 2 μg l-Opa1 i 0,5 μM DDM til 0,2 mg liposomet og inkuber ved 4 °C i 1,5 timer. Fjern overflateaktivt middel ved dialyse ved hjelp av en 3,5 kDa dialysekassett mot 250 ml 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl og 50 mM kalceinbuffer ved 4 °C over natten, og endre bufferen to ganger.
  5. Fjern ekstra calcein ved hjelp av en PD-10 desalting kolonne.

5. Bildebehandling og dataanalyse

  1. Skaff deg TIRF-bilder ved hjelp av et 100x oljenedsenkingsmål (N.A 1.4). Bruk 543 nm laser og en 488 nm laser for analyse av TexasRed-PE merket liposomer og proteoliposomer innkapslet med calcein. Bruk en 633 nm laser for analyse av Cy5-PE innebygd i planar lipid bilayer.
  2. Juster TIRF-vinkelen ved hjelp av en lipid bilayer for å oppnå maksimal utslipp. Kvaliteten på lipid bilayer etter rekonstituering observeres ved hjelp av et 100x oljemål ved 25 °C. Diffusjonskoeffisienten til fosfolippid og rekonstituert bilayer bestemmes ved hjelp av FCS med en protokoll som beskriver andresteder 37.
  3. Tilsett 10 μL 2 mg/ml proteoliposomer i bilderingen og sett i 10 minutter før bildet. GTP, GMPPCP eller BNP legges til i reaksjonsringen med 1 mM MgCl2 og 1 mM nukleotid.
  4. For å bestemme påvirkning av s-Opa1 i membranfusjon, titrer s-Opa1 til en proteoliposom / støttet bilayer prøve som inneholder l-Opa1, og registrere fusjonshendelser.
  5. Samtidig avbildning av TexasRed-DHPE og calcein oppnås gjennom et strålesplittingssystem. Både 488 nm og 543 nm lasere påføres samtidig på prøven som blomstrende eksitasjonskilder. Utslippslyset deles deretter med en 560 nm strålesplitter. Det delte utslippslyset filtreres deretter av et 510 nm-filter med en båndbredde på 42 nm og et 609 nm-filter med en båndbredde på 40 nm. Den filtrerte strålen projiseres til to tilstøtende områder på kamerabrikken.
  6. Fluorescerende utslipp registreres samtidig gjennom et 609-utslippsfilter med en båndbredde på 40 nm, og et 698-utslippsfilter med en båndbredde på 70 nm. Mikroskopsystemet er utstyrt med et CMOS-kamera som vedlikeholdes ved -10 °C.
  7. Partikkelidentifisering av liposomer kan utføres ved hjelp av en gaussisk-basert partikkelgjenkjenningsalgoritme. Partikkelfordelingen og intensiteten analyseres kanal for kanal. Et lipid bilayer signal brukes som maske for å isolere partikler.

Representative Results

Det rekonstituerte transmembraneproteinet sprer seg fritt og fordeles homogent i membranen.

Eksempelbilder av en lipid bilayer og lipid flyt validert av epifluorescence mikroskopi er vist i figur 4. Lipidfordeling i bilayer før og etter fotobleaching er vist i figur 4A, B. Homogeniteten til lipid bilayer ble visualisert ved hjelp av et epifluorescence mikroskop før og etter rekonstituering (figur 4D, E). l-Opa1 rekonstituert i lipid bilayer ble validert ved fluorescens korrelasjonspektroskopi (FCS). Vi bruker fargestoff konjugerte lipider for å evaluere lipid diffusiviteten til bilayeren. Rekonstituert Opa1 ble merket ved hjelp av et fluorescerende-merket anti-Opa1 C-terminal antistoff. Bilayer lipiddiffusjon ble målt som 1,46 ± 0,12 μm2/s,mens diffusjonskoeffisienten til bilayer-rekonstituert l-Opa1 var 0,88 ± 0,10 μm2/s. Intensitetsavlesning fra FCS-kurvene indikerte at 75 % av l-Opa1 rekonstitueres i lipid bilayer (figur 4G,H). Disse resultatene tyder på at l-Opa1 fritt sprer seg i polymer-bundet lipid bilayer med potensial til å selv montere i funksjonelle komplekser.

Figure 4
Figur 4: Fordeling av lipid og rekonstituert protein i modellmembranen.
(A-C) Eksempel bilder av en lipid bilayer og dens lipid flyt validert av epifluorescence mikroskopi. (A)Homogen lipidfordeling i bilayer før fotobleaching. (B) Øyeblikksbilde umiddelbart etter fotobleaching. (C) Bilayer avbildet etter fluorescens utvinning indikerer god lipid flyt av membranen etter rekonstituering. (D, E) Representative bilder av lipiddistribusjon før (D), og etter (E) l-Opa1 rekonstituering indikerer at rekonstitueringsprosessen ikke skapte feil i bilayeren. Representativt TIRF-bilde av l-Opa1 merket med Alexa 488 konjugert antistoff (F) som viser en homogen fordeling av Opa1 ved rekonstituering. G. Representative rå foton teller av l-Opa1 signal ved fluorescerende korrelasjonspektroskopi. I kontrollen ble ingen l-Opa1 rekonstituert i bilayeren, mens antistoffet ble tilsatt og skylt. Diffusjonen av l-Opa1 er betydelig langsommere enn lipider i membranen, i samsvar med vellykket rekonstituering av transmembrane l-Opa1 (H). Skala bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fluorescens trinn bleking indikerte i gjennomsnitt 2-3 kopier av l-Opa1 ble rekonstituert i en gitt liposomet (figur 5A, B). Størrelsesfordelingen av Opa1 rekonstituerte proteoliposomer ble testet etter rekonstituering ved hjelp av DLS (figur 5C). Rekonstituering av Opa1 i proteoliposomer ble også verifisert ved hjelp av FCS. Diffusjonskoeffisienten for fritt antistoff var 164 ± 22 μm2/s; diffusjonskoeffisienten for liposomer merket med lipidfargestoff var 2,22 ± 0,33 μm2/s, og diffusjonskoeffisienten for l-Opa1 proteoliposomer bundet til et TexasRed merket antistoff var 2,12 ± 0,36 μm2/s.

Figure 5
Figur 5: Fabrikasjon og karakterisering av proteoliposomer.
(A)Trinn i fabrikasjon proteoliposomer med innkapslet, slukket calcein. (B)Representative data for fluorescerende step-bleking viser i gjennomsnitt 2-3 kopier av l-Opa1 innebygd i liposomet. (C) Representative størrelsesfordelinger av proteoliposomer (rød) uten nukleotid 1 t etter GTP inkubasjon (grønn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Påvisning av membrantetering, lipid demixing/hemifusjon og poreåpning ved fluorescerende mikroskopi.

Membranteter overvåkes ved å observere signalet fra TexasRed på overflaten av lipid bilayer ved hjelp av TIRF mikroskopi (figur 6A). Membran lipid demixing (hemifusion) oppførsel ble overvåket gjennom TexasRed som fargestoff sprer seg fra liposomer inn i lipid bilayer. Calcein dequenching bidrar til å skille full fusjon pore dannelse fra bare lipid demixing. Dette gjør det mulig å sammenligne mellom forhold der partikler stopper ved hemifusjon (Fig. 6B) og partikler som går videre til full fusjon (figur 6C).

Membrantetering indikeres av et stabilt lipidsignal fra liposomer. Avstanden kan evalueres basert på FRET-signalet mellom etikettene på de to membranene36. Hemifusjonssignalet har ingen dequenching i calceinsignalet (Figur 6B, nedre rad), men en rask forfall av TexasRed-signalet indikerer diffusjon av fargestoffet inn i lipid bilayer (Figur 6B øvre rad). Full fusjon (med poreåpning) har både lipidforfall og innholdsutgivelse (figur 6C). TexasRed intensitet og kalcein intensitet kan spores på en tidsavhengig måte for å gi kvantitative detaljer for kinetikk av membranfusjon 36.

Figure 6
Figur 6: Representative resultater som viser partikkeltetering (A, vektstangen 10 μm), hemifusjon (B, vektstangen 0,5 μm) og fusjon (C, vektstangen 0,5 μm).
(A)Proteoliposomer bundet til Opa1-rekonstituert lipid bilayer før GTP tillegg. (B)Et eksempel på hemifusjon. Den øvre raden i B viser lipid demixing (TexasRed signal, rød), nedre rad i B viser ingen innholdsutgivelse (calcein signal, grønn) under disse forholdene. (C)Et representativt spor av proteoliposom fiksering med lipid bilayer. Innholdsutgivelse kan observeres fra bilder i den nedre raden for å vise dequenching av calcein (nedre rad, grønn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

In vitro modell-membransystemer kan beskrive komplekse membranprosesser under veldefinerte forhold. Disse systemene kan skille mellom minimale komponenter som er nødvendige for komplekse molekylære prosesser for å avdekkemolekylære mekanismer 6,,15,,20,,38. For membranproteiner er liposomer og planarstøttede bilayers vanlige rekonstitueringssystemer. I motsetning til solid-støttet lipid bilayers, polymer pute mellom substratet og støttet membran i polymer-bundet bilayers tillater fri mobilitet av store membranproteiner, og transmembran-proteiner å diffuse og montere fritt34. Disse funksjonene hjalp oss med å undersøke kinetikken til mitokondrier indre membranfusjon36.

Vi utarbeidet en polymer-bundet lipid bilayer ved hjelp av Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer (LB / LS) teknikker. Dette gjør at vi kan forberede en bilayer med asymmetriske lipidkomponenter. Cellulære membraner har asymmetrisk brosjyresammensetning, og LB / LS-tilnærmingen tillater studiet av slike bilayers. Med Schaefer-overføring kan et helt glasssubstrat dekkes av en lipid bilayer. Det er viktig å forberede en ren overflate for bilayer forberedelse. I tillegg kreves det praksis å utføre en Schaefer-overføring riktig. Mislykket Schaefer overføring kan skape uønskede defekter i en lipid bilayer. I denne protokollen gjelder trykket som legges til filmbalansen for en bilayer som inneholder 20% kardiolipin. For bilayers med andre komponenter, se overflaten trykk-området isotherm av de viktigste komponentene. En alternativ metode er Langmuir-Blodgett / vesicle fusion (LB / VF) metoden, hvor bunnen lipid monolayer overføres fra luft-vann grensesnittet til en Langmuir trau på et rent substrat, deretter liposomer sikring til toppen av støttet lipid monolayer og danner den endelige bilayer39. Rekonstituering av membranproteiner ved hjelp av LB/VF-metoden er enklere enn LB/LS, da rekonstituering kan utføres gjennom fusjon av proteoliposomer. Vesikkelfusjon krever imidlertid tilsetning av overflødige liposomer, noe som kan komplisere studiet av membranhendelser avhengig av konsentrasjonsavhengige proteinproteininteraksjoner.

Den vellykkede rekonstituering av transmembraneproteiner i både polymer-bundet lipid bilayers og liposomer i en foretrukket funksjonell orientering er viktig, men vanskelig å håndheve. Eksperimentelle kontroller er nødvendig for å ta hensyn til dette. For polymer-bundet lipid bilayers, er det også viktig å opprettholde integriteten til lipid bilayer under rekonstituering. Overflateaktive konsentrasjoner må holdes relativt lave for å forhindre oppløsning av lipid bilayer, men høy nok til å forhindre denaturation av protein av interesse37,40. Metoden som er beskrevet her er ideell for rekonstituering av membranproteiner for enkeltmolekylstudier, men er ikke nødvendigvis skalerbar for større studier. Overflateaktivt valg er en annen viktig vurdering. Ofte er overflateaktivt middel som brukes til rensing og lagring et godt utgangspunkt. Maksimal konsentrasjon av overflateaktivt middel er vanligvis ~ 200 ganger mindre av CMC36, i et område hvor overflateaktivt middel opprettholder proteinstabilitet og forhindrer proteinaggregasjon, samtidig som integriteten tilmembranen 36. Cocktailer som inneholder 2 eller 3 overflateaktive stoffer kan vurderes. For rekonstituering i liposomer er det ikke nødvendig med lav konsentrasjon av overflateaktivt middel. Imidlertid er overflateaktive konsentrasjoner under CMC å foretrekke å opprettholde jevn størrelse og morfologifordeling for liposomer. For å forhindre lekkasje av innhold fargestoff, er det nødvendig å dialyze mot en fargestoffholdig buffer.

I motsetning til liposomenbaserte fusjonsanalyser, gir plattformen vi etablerte en tilnærming for å undersøke kinetikken til hvert trinn av membranfusjon. Denne metoden gir muligheten til å studere transmembrane fusjonsproteiner under nesten innfødte forhold. Modell membran plattformer kan brukes til å studere membran protein montering og oligomerisering, membran "sculpting", og protein-lipid interaksjoner av proteiner i subcellulære miljøer, som mitokondrie indre membran. Denne metoden tillater også utforskning av viktige fysiologiske forhold i membran-protein samspillet, for eksempel bilayer sammensetning asymmetri. Rollen som en viktig mitokondrielipid, kardiolipin, i bilayeregenskapene til både liposomer og polymerstøttede bilayers gjenstår å definere. Egenskaper som ionisk styrke, membrantykkelse, membranstivhet, membrankrumning og membranelastisk viskositetsegenskaper kan alle påvirke proteinenes evne til å monteres i spesifikke funksjonelle tilstander. Fremtidige studier kreativt bruker modell membran systemer har potensial til å avdekke nye aspekter av membran protein organisasjon og funksjon.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner støtten fra Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award og sjenerøs støtte fra Institutt for molekylærbiologi ved Massachusetts General Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) Avanti polar lipid Cat #: 810335C1mg membrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 880130P lipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 710335P lipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti Polar lipids Cat #: 850375P lipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar lipids Cat #: 850757P lipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit ThermoFisher Scientific A20181
Amber vial with PTFE liner Fisher scientific 14-955-332 sample vials to keep lipid solutions
Calcein Sigma-Aldrich Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 fluorescent dye
Chloroform Fisher scientific 298-500/ C295-4 Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well) Electron Microscopy Science 71878-05 applied as Schaefer Slide
FCS analysis tool Smith Lab, University of Akron software tool
Fiji /ImageJ Fiji SCR_002285 software tool
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher scientific 12-545-102 Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium salt SIGMA-ALDRICH INC Cat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough Biolin Scientifc KN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 850091P lipid molecules
Mini Extruder Avanti Polar lipids 610020
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace Cat #: D310 25 GM surfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside Anatrace Cat #: O311HA 25 GM surfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μm Avanti Polar Lipids 610006
Rabbit Anti-Opa1 antibody NOVUS BIOLOGICALS Cat #: NBP2-59770 antibody for Opa1 C-terminal detection
Slidebook Intelligent imaging RRID: SCR_014300 software tool
Teflon threaded seal tape Fisher Scientific NC0636085 taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) ThermoFisher Scientific Cat #: T1395MP membrane fluorescent markers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 163 mitokondrie indre membran Opa1 polymer-bundet lipid bilayer in vitro rekonstituering membran fusjon TIRF mikroskopi
En modell membran plattform for rekonstituere mitokondrie membran dynamikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A.,… More

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A., Chao, L. H. A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics. J. Vis. Exp. (163), e61620, doi:10.3791/61620 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter