Summary
Этот протокол представляет собой метод визуализации активности популяции нейронов с одноклеточным разрешением у непереночных видов беспозвоночных с использованием чувствительных к поглощающему напряжению красителей и матрицы фотодиодов. Этот подход обеспечивает быстрый рабочий процесс, в котором визуализация и анализ могут осуществляться в течение одного дня.
Abstract
Разработка трансгенных препаратов беспозвоночных, в которых активность определенных наборов нейронов может регистрироваться и манипулироваться светом, представляет собой революционный прогресс в изучении нейронных основ поведения. Однако недостатком этого развития является его тенденция сосредотачивать исследователей на очень небольшом количестве «дизайнерских» организмов (например, C. elegans и Drosophila),потенциально негативно влияя на проведение сравнительных исследований по многим видам, что необходимо для выявления общих принципов сетевой функции. В настоящей статье показано, как оптическая запись чувствительными к напряжению красителями в мозге неперегенных видов брюхоногих моллюсков может быть использована для быстрого (т.е. в течение времени одиночных экспериментов) выявления особенностей функциональной организации их нейронных сетей с одноклеточным разрешением. Мы подробно описываем методы вскрытия, окрашивания и записи, используемые нашей лабораторией для получения потенциальных следов действия от десятков до ~ 150 нейронов во время поведенчески релевантных двигательных программ в ЦНС нескольких видов брюхоногих моллюсков, включая один новый для неврологии - голожаберный Berghia stephanieae. Визуализация выполняется с помощью абсорбирующих чувствительных к напряжению красителей и 464-элементного фотодиодного массива, который производит образцы со скоростью 1 600 кадров в секунду, достаточно быстро, чтобы захватить все потенциалы действия, генерируемые зарегистрированными нейронами. Несколько многоминутных записей могут быть получены за один препарат практически без отбеливания сигнала или фототоксичности. Необработанные оптические данные, собранные с помощью описанных методов, впоследствии могут быть проанализированы с помощью различных иллюстрированных методов. Наш подход к оптической записи может быть легко использован для исследования сетевой активности у различных неперегенных видов, что делает его хорошо подходящим для сравнительных исследований того, как мозг генерирует поведение.
Introduction
Развитие трансгенных линий беспозвоночных, таких как Drosophila и C. elegans, обеспечило мощные системы, в которых нейронные основы поведения могут быть оптически опрашиваемы и манипулироваться. Тем не менее, эти специальные препараты могут иметь обратную сторону снижения энтузиазма к исследованиям нейронных цепей нетрансгенных видов, особенно в отношении введения новых видов в исследования в области неврологии. Сосредоточение внимания исключительно на одной или двух модельных системах губительно для поиска общих принципов сетевой функции, поскольку сравнительные исследования представляют собой существенныйпуть,по которому такие принципы открываются1,2,3,4. Наша цель здесь состоит в том, чтобы продемонстрировать крупномасштабный подход к визуализации для получения быстрого понимания функциональной структуры нейронных сетей брюхоногих моллюсков в попытке облегчить сравнительные исследования функции нейронных сетей.
Брюхоногие моллюски, такие как Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea и другие, уже давно используются для исследования принципов функционирования нейронных сетей, в значительной степени потому, что их поведение опосредовано большими, часто индивидуально идентифицируемыми нейронами, расположенными на поверхности ганглиев, что делает их легко доступными для методов записи5. В 1970-х годах были разработаны чувствительные к напряжению красители (VSD), которые могут интегрироваться в плазматическую мембрану, что вскоре позволило вскоре записать без электродов потенциалы действия, генерируемые несколькими нейронами6. Здесь мы демонстрируем наше использование VSD для изучения сетевой активности у нескольких видов брюхоногих моллюсков, в том числе у одного новичка в неврологии, Berghia stephanieae. Устройство визуализации представляет собой коммерчески доступную 464-элементную фотодиодную матрицу (PDA), которая сэмплирует со скоростью 1 600 кадров в секунду(рисунок 1),которая при использовании с быстрым поглощением VSD раскрывает потенциалы действия всех зарегистрированных нейронов7. Сигналы, регистрируемые всеми диодами, отображаются сразу после захвата и накладываются на изображение ганглия в программном обеспечении для сбора КПК, что позволяет исследовать интересующие нейроны острыми электродами в том же препарате8,9.
В необработанных данных КПК многие диоды избыточно записывают более крупные нейроны, и многие также содержат смешанные сигналы от нескольких нейронов. Поворотным моментом стала разработка автоматизированного метода сортировки шипов с использованием независимого компонентного анализа для быстрой обработки каждого необработанного 464-канального набора данных КПК в новый набор следов, в котором каждый зарегистрированный нейрон появляется в отдельном следе, содержащем только его потенциалы действия10,11.
В этой статье мы опишем основные шаги, связанные с получением крупномасштабных записей потенциала действия от нервной системы брюхоногих моллюсков с фотодиодным массивом и быстрым поглощением VSD. Кроме того, мы иллюстрируем аналитические методы, которые могут быть использованы для кластеризации и отображения оптически записанных нейронов относительно их функциональных ансамблей, а также для характеристики особенностей на уровне популяции, которые часто не проявляются при простом осмотре следов стрельбы12,13.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс, описанный ниже, обобщен на рисунке 2.
1. Минимизируйте вибрацию
- Если возможно, убедитесь, что установка находится на первом этаже, и используйте пружинный изоляционный стол, который гасит более широкий диапазон частот вибрации, чем воздушные столы.
- Если вы используете таблицу на основе пружины, убедитесь, что она плавающая (ее нужно настраивать каждый раз, когда кто-то добавляет или снимает что-то со стола).
- Максимально уменьшите вибрационный шум в комнате визуализации, вплоть до отключения воздушного потока во время визуализации, если это необходимо. Сведите к минимуму любую вибрацию, вызванную турбулентностью жидкости в перфузионных системах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейронная подготовка не должна двигаться во время приобретения. Движения любого рода производят смещения контрастных краев через диоды, что приводит к артефактным сигналам. Если процедура включает в себя стимул во время приобретения, она не должна вызывать движение препарата.
2. Запустите тест на точечное отверстие, чтобы обеспечить правильное выравнивание фотографий ганглий с данными КПК
- Поместите кусок алюминиевой фольги с 3 небольшими отверстиями, проткнунными в нем, на предметное стекло микроскопа. Сделайте снимок трех отверстий с помощью цифровой камеры, установленной на его парфокальном фотопорте.
- Используя программное обеспечение для создания образов, которое поставляется с КПК, получите короткий файл (например, 5 с). На полпути к столу нажмите на стол, чтобы вызвать вибрационные артефакты, которые будут очень заметны по краям точечных отверстий, что позволит точно выровнять изображение точечных отверстий с оптическими данными.
- Используйте функцию наложения в программном обеспечении для обработки изображений, найденную в пункте меню«Отображать | Страница Наложения | Наложение трассировок с внешними | изображения Наложение изображения»,чтобы наложить данные диода на фотографию точечных отверстий, а затем итеративно настроить параметры x, y и увеличения для фотографии, пока точечные отверстия не сядут непосредственно поверх артефактов точечных отверстий в данных диодов.
- Сохраните эти числа, чтобы согласовать подготовительные изображения, сделанные с помощью камеры, с данными диодов в будущих экспериментах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание КПК нужно выполнять только один раз после установки КПК на микроскоп, пока он не будет повернут или удален, после чего это должно быть сделано снова.
- Сохраните эти числа, чтобы согласовать подготовительные изображения, сделанные с помощью камеры, с данными диодов в будущих экспериментах.
3. Рассечения для трех видов морских брюхоногих моллюсков
- Для видов, которые вырастают до больших размеров, таких как Tritonia и Aplysia,начните с более мелких особей, которые имеют более тонкие, менее непрозрачные ганглии, облегчая получение достаточного количества света для оптимального сигнала-шума.
- Иметь готовую фильтрованную искусственную морскую воду для использования в качестве физиологического раствора для рассечений и экспериментов по визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех последующих этапах протокола "соленый раствор" означает искусственную морскую воду. - Рассечение тритонии диомедии
- Поместите животное в холодильник примерно на 20 минут, чтобы обезболить его.
- Для более крупных животных обнажите мозг, держа животное в одной руке, позволяя головным концам драпироваться над указательным пальцем, чтобы обнажить «шею». Для более мелких животных прикрепите их дорсальной стороной вверх в выложенной воском диссекционной чашке, прежде чем обнажить мозг.
- С помощью рассеченных ножниц сделайте 3-4 см разрез средней линии на дорсальной стороне животного, над щечковой массой (которую можно прощупвать через стенку тела).
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимая часть ЦНС, состоящая из сроснующихся, двусторонних цереброплевральных и педальных ганглиев, имеет оранжевый цвет и отличается по внешнему виду от окружающих тканей; он лежит непосредственно позадней частью ринофоров и поверх щечковой массы. - Иссекать ЦНС, перерывая нервы, иннервируемые тело животного, с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц, сохраняя нетронутыми все нервы, соединяющие центральные ганглии. Оставьте длинную длину педального нерва 3 (PdN3) или любого нерва, который будет стимулироваться.
- Используйте миниатюрные булавки, чтобы прикрепить ЦНС к нижней части заполненной физиологическим раствором эластомерной посуды для дальнейшего рассечения. Поддерживайте температуру приготовления на уровне 11 °C, перфузируя блюдо физиологическим раствором, поставляемым с помощью поточной системы охлаждения Пельтье с обратной связью с помощью перистальтического насоса.
- С помощью щипцов и микродиссекционных ножниц аккуратно удалите неплотно прилипающий слой соединительной ткани вокруг ЦНС. Оставьте тонкую оболочку, плотно прилипающую к ганглиям.
- Ненадолго (~10 с) окунуть ганглии в раствор 0,5% глутаральдегида в физиологический раствор. Поместите ганглии обратно в посуду с солевым раствором, высточенной эластомерами, позволяя физиологичему раствору смыть глутаровый альдегид перед началом окрашивания VSD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта легкая фиксация соединительной ткани и ее внутренних мышц поможет предотвратить движение во время визуализации.
- Рассечение Aplysia californica
- Обезболивают животное примерно 40 г, вводя ~ 20 мл 350 мМ MgCl2 в организм через вентральную поверхность (стопу).
- Используйте булавки, чтобы расположить брюшную сторону животного вверх в восковой подкладке для рассечения.
- С помощью рассеченных ножниц сделайте разрез средней линии 2-3 см вдоль самой передней протяженности стопы. Зафиксировать лоскуты стопы по обе стороны разреза, чтобы выявить часть ЦНС и щечную массу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимая часть ЦНС, состоящая из сроснущихся церебральных ганглиев и плотно прилегающих двусторонних плевральных и педальных ганглиев, желто-оранжевая и отличается по внешнему виду от окружающих тканей; он сидит дорсально и заднеголовя к луковице мышечной щековой массы. - Используйте щипцы и ножницы для рассечения, чтобы тщательно рассечь щечную массу, обнажив церебральные ганглии.
- Иссекать ЦНС, перерывая нервы, иннервируемые тело животного, с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц, сохраняя нетронутыми все нервы, соединяющие центральные ганглии. Оставьте длинную длину педального нерва 9 (PdN9) или любого нерва, который будет стимулироваться.
- Используйте миниатюрные булавки, чтобы расположить ЦНС в заполненной физиологическим раствором блюде с эластомерной подкладкой. Поддерживайте температуру приготовления на уровне 15-16 °C, перфузив блюдо физиологическим раствором, проходящим через охлаждающее устройство Пельтье.
- Используя щипцы и микродиссекционные ножницы, удалите излишнюю соединительную ткань из ЦНС и рассекните поверхностную часть оболочки на ганглии или ганглиях, которые будут изображены. Будьте осторожны во время этого процесса, чтобы не сделать отверстие в оболочке, которое приведет к тому, что нейроны выльются изнутри.
- Ненадолго (~20 с) окунуть ганглии в раствор 0,5% глутарового альдегида в физиологический раствор. Поместите ганглии обратно в посуду с солевым раствором, высточенной эластомерами, позволяя физиологичему раствору смыть глутаровый альдегид перед началом окрашивания VSD.
- Вскрытие Berghia stephanieae
- Поместите животное в холодильник примерно на 20 минут, чтобы обезболить его.
- Используя блюдо с эластомерной подкладкой, наполненное физиологическим раствором комнатной температуры, поместите миниатюрные булавки как в голову, так и в хвост.
- С помощью микродиссекционных ножниц сделайте 5-7 мм дорсальный разрез поверхностно к ЦНС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза, темные пятна, которые находятся внутри животного рядом с ЦНС, удобно отмечают положение необходимой части ЦНС, которая состоит из двусторонне сросшееся цереброплейвральных и педальных ганглиев и сидит на вершине щековой массы. - Иссечение ЦНС путем разрыва нервов, иннервируемых телом животного, с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц. Оставьте любой нерв стимулированным достаточно долго для всасывающего электрода.
4. Окрашивание препарата чувствительным к напряжению красителем
- Подготовьте стандартные растворы RH155 (также известный как NK3041) или RH482 (также известный как NK3630 или JPW1132).
- RH155: Растворите 5,4 мг твердого красителя в 1 мл 100% EtOH, пипетируя 29 мкл в каждую из 34 микроцентрифужных пробирок. Когда содержимое каждой трубки подвергается воздействию воздуха, дайте им высохнуть на ночь в темноте. Поместите полученные твердые аликвоты RH155, каждая из которых содержит 0,15 мг, в морозильную камеру с -20 °C.
- RH482: Растворите 2 мг твердого красителя в 100 мкл ДМСО, разделите раствор на 20 аликвот по 5 мкл, каждая из которых содержит 0,1 мг RH482, и храните в морозильной камере с -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для тритонии и аплизиидля загрузки VSD RH155 в мембраны нейронов в препарате может быть использована перфузия ванны или применение под давлением. Применение давления имеет то преимущество, что подвергает vsD только ганглий, который визуалируется.
- Для перфузии в ванне добавляют 5 мл физиологического раствора к каждой из двух вышеперечисленных аликвот твердого RH155 и вихря в раствор, производя комбинированный раствор 10 мл, содержащий 0,03 мг/мл RH155.
- Перфьюировать в темноте (во избежание фотоотбеливания) в течение 1-1,5 ч при 11 °C для тритонии и при 16 °C для Aplysia. Поддерживайте температуру, пропуская перфузионный раствор через систему охлаждения Пельтье.
- Для применения под давлением добавьте 500 мкл физиологического раствора к одной аликвоте RH155 и вихрь для получения концентрации красителя 0,3 мг/мл.
- Втяните около 200 мкл раствора в полиэтиленовую трубку с помощью ручного микродиспенсера, гарантируя, что между диаметром трубки и диаметром ганглия, который необходимо окрашивать, есть хорошее соответствие.
- Используйте микроманипулятор, чтобы аккуратно поместить конец трубки над целевым ганглием, опуская его до тех пор, пока он не образует плотное уплотнение на ганглии. Используйте тип системы охлаждения, описанный выше, чтобы поддерживать ганглии при желаемой температуре.
- Приглушите свет в комнате, чтобы избежать фотоотбеливания, и поворачивайте ручку аппликатора микродизера каждые 5 минут, чтобы нанести больше красителя на ганглий.
- Проверьте через 30 минут, чтобы убедиться, что происходит хорошее окрашивание, а затем продолжайте в течение общего времени окрашивания около 1 ч.
- Для окрашивания в Бергиюдобавьте 1 мл физиологического раствора в замороженную аликвоту RH482 и вихрь растворится.
- Переложить 200 мкл этого раствора в микроцентрифужную трубку, содержащую 800 мкл физиологического раствора и вихрь в раствор, производя окончательный окрашивающий раствор 0,02 мг/мл RH482 в физиологическом растворе с 0,1% ДМСО.
- Поместите всю ЦНС в трубку микроцентрифуги, обернув трубку в алюминиевую фольгу, чтобы избежать фотоотбеливания, и встряхивайте вручную каждые 5-6 минут в течение примерно 1 ч. Хранить оставшиеся 800 мкл первого раствора в холодильнике, и использовать до 3 дней для окрашивания последующих препаратов.
5. Сгладить подготовку и настроить на стимуляцию нервов
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом разделе должны выполняться при минимальном освещении или с зеленым светом, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание.
- После окрашивания погрузите ЦНС в физиологический раствор в камере визуализации и поместите под рассекающий микроскоп.
- Поместите кусочки силикона (для Тритонии или Аплисии)или капли вазелина (для Бергии) слева и справа от ганглия/ганглия,чтобы получить изображение.
- Прижмите кусочек стекла или пластиковой крышки соответствующего размера к препарату, чтобы сгладить его. Надавить сильно, но не так сильно, чтобы повредить нейроны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сплющивание выпуклой поверхности препарата таким образом сделает большее количество нейронов парфокальным, тем самым увеличивая количество регистрируемых нейронов, и, кроме того, поможет обездвижить препарат во время визуализации. - Если стимуляция нерва вызывает фиктивную двигательную программу, подготовьте всасывающий электрод, передний кончик которого примерно такой же широкий, как диаметр нерва. Достигните этого путем тщательного плавления сегмента полиэтиленовой трубки ПЭ-100 над пламенем, осторожно вытягивая оба конца сегмента трубки, а затем разрезая полученный конус в нужной точке.
- Протяните небольшой объем физиологического раствора через конический конец агломера всасывающего электрода полиэтилена, а затем конец нерва, который необходимо стимулировать, прикрепив длинную толстостенную гибкую полимерную трубку к задней части электрода и используя ротовое всасывание для применения отрицательного давления.
- Подтвердите, что в физиологическом растворе в электроде отсутствуют пузырьки, которые могут прервать электрическую проводимость.
6. Подготовка и оптимизация для визуализации
- Переместите камеру на установку для обработки изображений. Запустите перфузию физиологического раствора через регистривную камеру и поместите температурный зонд рядом с препаратом. Установите регулятор температуры для температуры, желаемой для изображения вида (для тритонии,11 °C, для Aplysia,15-16 °C, или для Berghia,26-27 °C).
- Поместите одну хлоридную серебряную проволоку вниз по всасываемкому электроду, убедившись, что она контактирует с физиологическим раствором в электроде, и поместите другую проволоку Ag-AgCl (обратный путь) в физиологический раствор ванны, рядом с всасывающим электродом.
- Опустите линзу погружения в воду в физиологический раствор. Закройте базовую диафрагму, а затем поднимите или опустите конденсатор подступенчатой и отрегулируйте фокус до тех пор, пока края диафрагмы не будут в резком фокусе, создавая подсветку Köhler.
- Сосредоточьтесь на области подготовки, которая будет изображена. Смещение фокусировки на меньших нейронах над более крупными, поскольку оптические сигналы, исходящие из более крупных нейронов, с большей вероятностью, чем более мелкие, регистрируются, даже если они немного не в фокусе.
- Сфотографировать ганглий, чтобы получить его с помощью парфокальной цифровой камеры.
- С переключателем усиления панели управления, установленным на 1x, проверьте интенсивность света в покое (RLI) в программном обеспечении для обработки изображений, нажав кнопку «RLI»и проверив средний RLI диодов. Отрегулируйте уровень напряжения, отправляемого от стимулятора к источнику питания светодиодной лампы, и продолжайте проверять средний уровень RLI, пока он не находится в нужном диапазоне (обычно около 3-4 В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно высокое РЛО, соответствующее приблизительно 3-4 В на КПК. Чем выше свет, тем лучше отношение сигнал/шум оптических сигналов, однако это должно быть сбалансировано с более высокой скоростью фотоотбеливания при более высоких ОRL. Этот риск сводится к минимуму за счет использования объективов с высоким NA. Используются объективы с погружением в воду: 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA и 40x/1.15 NA.
- Установите переключатель усиления панели управления на 100x для записи.
- Если стимуляция нерва, установите желаемое напряжение, частоту и продолжительность на отдельном стимуляторе от того, который использовался для установки уровня освещенности. Убедитесь, что Срабатывание TTL между панелью управления и стимулятором настроено правильно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нервного стимула образца у каждого вида следующие: Tritonia PdN3, 2 с, 10 Гц импульсный ход 5 мс, импульсы 10 В; Аплизия PdN9, 2,5 с, 20 Гц импульсный ход 5 мс, импульсы 8 В; педальный нерв Бергии, 2 с, 10 Гц импульсный ход 5 мс, импульсы 5 В. - Дважды проверьте, что пружинный или воздушный стол плавает.
7. Оптическая запись
- Выключите или приглушите свет в комнате, включая любое верхнее флуоресцентное освещение.
- Задайте желаемую продолжительность файла, путь и имя файла, а затем нажмите кнопку«Принять данные»в программном обеспечении для создания образов, чтобы получить файлы до емкости доступной оперативной памяти компьютера. Оставайтесь неподвижными во время оптической записи, так как небольшие вибрации могут вводить большие артефакты в данные оптической записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приобретений, которые превышают доступную оперативную память компьютера, через доктора Цзянь-Ёна Ву из Джорджтаунского университета доступна индивидуальная программа приобретения C++. - Для просмотра данных сразу после получения используйте функцию Наложения в программном обеспечении для визуализации, чтобы наложить данные, собранные всеми 464 диодами, на изображение ганглия, взятое ранее препарата7. Нажмите на любой из диодов, представленных в программном обеспечении, чтобы развернуть то, что они записали, на отдельном экране трассировки.
- Достигните точного выравнивания диодов по отношению к препарату, введя коэффициенты x, y и увеличения, как это было предварительно определено в ходе испытания на точечное отверстие.
- Чтобы максимизировать видимость потенциала действия и улучшить выход нейронов для последующей сортировки шипов14,наложите полосовой фильтр Баттерворта с отсечками 5 Гц и 100 Гц (доступные в программном обеспечении для визуализации) для удаления как низкочастотных, так и высокочастотных шумов.
- Чтобы сохранить отфильтрованные оптические данные в виде текстового файла для дальнейшего анализа в научной вычислительной платформе, сначала выберите поле«Фильтр TP»прямо под экраном«Страница»в программном обеспечении для обработки изображений. Затем выберите«Сохранить страницу как ASCII»на вкладке«Вывод»и введите нужное имя файла в появившемся диалоговом окне.
Representative Results
Тритония
Контакт кожи с хищником морской звезды вызывает побег Tritonia diomedea, состоящий из ритмичной серии сгибаний всего тела, которые продвигают его в безопасное место(рисунок 3A). В изолированных препаратах мозга кратковременный стимул к педальному нерву 3 (PdN3) вызывает ритмическую двигательную программу плавания (SMP) для этого поведения, которая легко распознается в оптических записях из педальных ганглиев. На рисунке 3B изображена компоновка эксперимента по визуализации VSD, предназначенного для регистрации активности возбуждения нейронов на дорсальной поверхности левого ганглия педали Tritonia, над которым был расположен КПК, поскольку стимул контралатеральной (правой) PdN3 вызывает SMP. Необработанные и отфильтрованные данные (полосовой фильтр Баттерворта, отсечки 5 и 100 Гц) с 20 диодов, регистрировающих активность до, во время и после стимуляции PdN3, показаны на рисунках 3C,D соответственно. Нервный стимул доставлялся через 20 с в 2-минутный файл. Сразу после получения сигналы, измеренные всеми 464 диодами регистривного массива, могут быть топографически отображены над изображением препарата в программном обеспечении для визуализации(рисунок 3E). В этот момент многие следы содержат шипы, записанные избыточно от одних и тех же нейронов, а некоторые следы содержат шипы от более чем одного нейрона. Пиковая сортировка отфильтрованных следов диодов с помощью ICA дала 53 уникальных нейронных следа, 30 из которых показаны на рисунке 3F. Кинетика отдельных шипов может быть оценена на рисунке 3G,который расширяет отрывок из четырех следов из рисунка 3F (красная рамка); точность алгоритма сортировки шипов ICA была предварительно проверена с использованием одновременных резких электродных записей, которые показали, что все всплески в отсортированных следах соответствуют внутриклеточным зарегистрированным всплескам от отдельных нейронов11,14.
Аплизия
Сильно аверсивный хвостовой стимул для Aplysia californica вызывает стереотипную двухчастную ритмическую реакцию побега15. Первая фаза реакции представляет собой скачок из нескольких циклов выпадов головы и выпадов хвоста, которые быстро перемещают животное вперед. За этим обычно следует период ползания, включающий повторяющиеся волны мышечных сокращений голова к хвосту, которые двигают животное вперед с более медленной скоростью в течение нескольких минут(рисунок 4A). Чтобы запечатлеть эти моторные программы побега в оптических записях, КПК фокусировали на дорсальной поверхности ганглия правой педали в изолированной подготовке мозга, а всасывающий электрод помещали на контралатеральный (левый) педальный нерв 9 (PdN9; Рисунок 4B). Через минуту непрерывной 20-минутной оптической записи(рисунок 4C)PdN9 стимулировали, чтобы вызвать последовательность двигательной программы галоп-ползание. Вероятностные пространственные распределения гаусса сигналов от всех 81 зарегистрированных нейронов были нанесены на ганглий(рисунок 4D). Уменьшение размерности, примененное к полной записи, показало, что галопная (голубая) и ползунка (темно-синяя) фазы программы побега занимали разные области и образовывали разные траектории, спиралевидные и петлевые, соответственно, в пространстве главных компонентов(рисунок 4E).
Три видео, основанные на записи Aplysia, изображенной на рисунке 4, демонстрируют дальнейшие типы анализов, которые могут быть выполнены на таких наборах данных. Видео 1 оживляет запуск всех записанных нейронов в течение всего периода записи. Начальный постстимулирующий период моторной программы побега характеризовался галопом, при котором активность в ганглии отмечалась чередующимся разрывом различных функциональных кластеров(Видео 2). Галоп впоследствии перешел к ползучему, в котором активность через кластеры нейронов оставалась в целом фазовой, но предполагала траекторию вращения против часовой стрелки в ганглии(Видео 3). Последние два видео также включают кластеризацию консенсуса, которая раскрывает стрельбу и расположение различных функциональных ансамблей для фаз галопа и ползания реакции на побег отдельно. Обратите внимание, что многие нейроны, назначенные одному и тому же кластеру как в фазе галопа, так и в фазе ползания, демонстрировали физическую близость друг к другу в ганглии, что согласуется с предыдущими выводами12.
Бергия
Эолидная голожаберная Berghia stephanieae (рисунок 5A)представляет собой новую модельную систему для нейробиологии. Настройка изображения для типичного эксперимента Berghia показана на рисунке 5B. Чтобы вызвать широкомасштабную нейронную активность, всасывающий электрод был помещен на наиболее заметный нерв левой педали, а нервный стимул был доставлен через 30 с в 2-минутную запись. Следы, обработанные ICA, выявили как спонтанную, так и вызванную стимулом активность в 55 нейронах(рисунок 5C). Обнаружение сообщества с помощью консенсусной кластеризации выявило десять различных функциональных ансамблей, которые изображены на рисунке 5D в сетевом графике и на рисунке 5E,который реорганизует трассировки, показанные на рисунке 5C, на основе их назначений кластеризации. Гауссовские распределения сигналов от всех зарегистрированных нейронов накладываются на изображение препарата на рисунке 5F для указания позиций всех 55 зарегистрированных нейронов.
Рисунок 1: Виды установки оптической визуализации и фотодиодной матрицы (КПК). (A) Установка оптической визуализации с КПК, цифровой камерой, микроскопом и сценой. (B) Внутренняя конструкция КПК, в которой волоконная оптика соединяет диафрагму изображения с 464 фотодиодами. Ряд усилителей расположен над фотодиодами. (C)Шестиугольная грань диафрагмы изображения, на которой фокусируется изобразуемая область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Блок-схема, иллюстрирующая основной рабочий процесс получения оптических записей. Основные шаги в протоколе визуализации VSD, от рассечения и окрашивания до деталей визуализации, изображены на этой блок-схеме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Результаты Tritonia diomedea,иллюстрирующие необработанные, отфильтрованныеи отсортированные по всплескам данные. Тритония, выбегающая из хищной морской звезды Pycnopodia helianthoides посредством своего плавания, которое состоит из чередующихся дорсальных и вентральных сгибаний тела. (B) Схема настройки образа. Ce= церебральная доля цереброплевального ганглия; Pl = плевральная доля цереброплевального ганглия; Pd = педальный ганглий. (C)Необработанные данные с 20 фотодиодов, отображающих активность в левом педальном ганглии для стимуляции контралатерального PdN3 (стимул, обозначенный стрелкой). (D) Отфильтрованные данные с тех же диодов, что и в C (полоса пропусканий 5 и 100 Гц фильтра Баттерворта). (E)Программный вывод изображений, в котором сжатые следы, собранные всеми 464 диодами, накладываются топографически на изображение препарата. Позиции 20 диодов, следы которых показаны в C и D, выделены красным цветом. (F) Тридцать отобранных однопротейронных следов, генерируемых путем сортировки шипов через ICA. (G) Расширенный вид четырех однодневронных следов, соответствующих красной раме в F,отображает их потенциалы действия при более высоком временном разрешении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Результаты Aplysia californica,иллюстрирующие длительную запись, отображение сигналов и уменьшение размерности. (A) Две фазы последовательной программы эвакуации Aplysia, галоп и ползание. (B) Схема настройки образа. Ce = мозговой ганглий; Pl = плевральный ганглий; Pd = педальный ганглий. (C) 20-минутная запись 81 нейрона в правом педальном ганглии, реагирующем на стимул на контралатеральный PdN9 (обозначен стрелкой). Зеленые, голубые и темно-синие полосы под следами указывают на период до стимула, галоп и фазы ползания моторной программы побега соответственно. (D)Изображение препарата с картографическими вероятностными распределениями Гаусса местоположений всех 81 нейронных источников сигналов, идентифицированных ICA. Зеленый контур представляет положение шестиугольной грани КПК по отношению к ганглию. Числа на каждом гауссовском номере соответствуют следам в C. (E)Уменьшение размерности с использованием анализа главных компонентов, в результате которого первые три основных компонента соотносятся друг с другом в течение 20-минутного файла. Предстимулирующие базовые, галопные и ползучие эпохи показаны зеленым, голубым и темно-синим цветами соответственно. Смотрите видео 1-3 для анимации нейронного возбуждения, соответствующего этой записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Результаты Berghia stephanieae,нового вида для нейробиологии, иллюстрирующего сетевое графирование, функциональную кластеризациюи двустороннее отображение сигналов. (A) Образец Berghia. (B) Схема настройки образа. Ce = церебральная доля цереброплеврального ганглия; Pl = плевральная доля цереброплевального ганглия; Pd = педальный ганглий; Rh = ринофорный ганглий. (C)Следы, демонстрирующие спонтанную и вызванную стимулом активность 55 двусторонних нейронов в цереблоплевральных ганглиях (доставка стимула обозначена стрелкой). (D) Сетевой график, отображающий десять функциональных ансамблей, каждому из которых присвоен уникальный цвет, идентифицированный с помощью консенсусной кластеризации. Узлы на этом графике представляют нейроны, где расстояние в сетевом пространстве представляет собой степень корреляции внутри и между ансамблями. (E) Следы в C перестраиваются и кодируются цветом (в соответствии с цветовой схемой D)в функциональные ансамбли. (F)Изображение препарата, показывающее нанесенные на карту местоположения сигналов от каждого зарегистрированного нейрона и номера трассировок в C и E, которым они соответствуют. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Анимация полной, 20-минутной программы Aplysia escape locomotor. Непрозрачность белых фигур, покрывающих 81 отдельный нейрон в ганглии правой педали (левая панель), определялась соответствующими нейронными следами (правая панель) и изменяясь линейно в зависимости от средней скорости всплеска (на каждые 0,61 с реального времени в записи). Для каждого нейрона полная непрозрачность нормализовалась до максимальной скорости срабатывания в течение всего периода записи. Одна секунда прошедшего времени в видео представляет собой 12,2 с реального времени. Шкала соответствует реальному времени, с зелеными, голубыми и темно-синими линиями под следами, указывающими на базовую линию, галоп и ползание фаз до стимула двигательной программы, соответственно. Желтые поля вокруг фазы галопа и части фазы ползания указывают на отрывки записи, используемые для создания анимации в видео 2 и 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Видео 2: Анимация фазы галопа опорно-двигательного аппарата Aplysia. Кластеризация консенсуса была выполнена на всех 81 зарегистрированных нейронах только в фазе галопа моторной программы для получения функциональных ансамблей, используя подход и программное обеспечение, описанные и доступные в ref.12. Нейронные ансамбли, демонстрирующие в основном тонические или нерегулярные паттерны стрельбы во время этой фазы программы побега, были опущены из этого видео. Потенциалы действия нейронов, принадлежащих к черному и оливково-зеленому ансамблям, можно услышать в звуковой дорожке видео, с выделением соответствующих нейронов и следов. Средние частоты всплесков были нормализованы, как в Видео 1 и с эквивалентным биннингом времени; 1 с прошедшего времени в видео соответствует 6,1 с реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Видео 3: Анимация фазы ползания двигательной программы Aplysia escape. Кластеризация консенсуса была выполнена на всех 81 зарегистрированных нейронах только в фазе ползания двигательной программы для получения функциональных ансамблей. Ансамбли, демонстрирующие в основном тонические или нерегулярные паттерны стрельбы во время этой фазы двигательной программы, были опущены из этого видео. Средние показатели пиков были нормализованы, как в видео 1 и 2 и с эквивалентным биннингом времени; 1 с прошедшего времени в видео соответствует примерно 12,2 с реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Discussion
Одной из наиболее важных деталей в реализации нашего крупномасштабного подхода к визуализации VSD является минимизация вибрации, которая производит движения контрастных краев по диодам, что приводит к большим артефактным сигналам. Поскольку поглощение VSD производит очень небольшие процентные изменения интенсивности света с потенциалами действия, вибрационные артефакты, если их не предотвратить, могут скрыть интересующих нейронных сигналов. Мы используем несколько методов для минимизации вибрационных артефактов. Во-первых, наш кабинет визуализации расположен на первом этаже, что изолирует подготовку от вибраций, связанных с оборудованием для обработки воздуха в здании и многими другими источниками. Во-вторых, была использована пружинная изоляционная таблица, которая, как подтвердили другие пользователи КПК, обеспечивает лучшее гашение вибрации, чем более распространенный воздушный стол16. В-третьих, использовались водомерные объективы, которые устраняют колебания изображения, возникающие из-за поверхностной ряби. В-четвертых, изображенный препарат слегка прижимали между дном крышки камеры и прижатым сверху фрагментом крышки, который удерживается на месте силиконовыми пробками или вазелином, что еще больше стабилизирует препарат. Это также выравнивается выпуклая поверхность ганглия или ганглиев, что приводит к увеличению количества нейронов в плоскости фокуса объектива, что увеличивает количество зарегистрированных нейронов.
Чтобы максимизировать отношение сигнал/шум для очень небольших изменений в степени поглощения света VSD в результате потенциала действия, важно достичь почти насыщенного света через подготовку к КПК, в то же время сводя к минимуму фотоотбеливание красителя. С этой целью мы обычно работаем при 3-4 В интенсивности света в состоянии покоя, измеренной с помощью переключателя усиления панели управления КПК в положении 1x (464 усилителя PDA насыщаются при 10 В света). При сборе данных этот коэффициент усиления изменяется на 100x. Получение достаточного количества света для достижения 3-4 В, измеренного КПК, может быть достигнуто несколькими способами. Во-первых, используйте ультраяркий светодиодный источник света, который обеспечивает длину волны, соответствующую абсорбционным свойствам абсорбционного красителя в использовании. Соответственно, была использована 735-нм светодиодная коллимированная лампа, которая перекрывается с оптимальными длинами волн поглощения RH155 и RH482. Во-вторых, при необходимости используйте конденсатор с откидной подступенчатой подстадией, который концентрирует свет от светодиодного источника света на меньшую площадь. В-третьих, отрегулируйте высоту конденсатора для достижения освещенности Köhler, которая обеспечивает высокую, равномерную яркость и максимальное качество изображения. В-четвертых, убедитесь, что в оптическом тракте нет тепловых фильтров, которые могут охладить длину волны светодиодной лампы 735 нм. В-пятых, удалите диффузоры, если требуется больше света, с оптического пути. В-шестых, используйте объективы с высоким NA, которые обеспечивают высокое пространственное разрешение и обеспечивают достаточные уровни света для достижения КПК при более низкой интенсивности света. Это позволило нам свести к минимуму фотоотбеливание до такой степени, что мы можем получить несколько файлов захвата продолжительностью 10-20 минут за подготовку, используя одинаковую интенсивность света во всех файлах и без значительной потери амплитуды сигнала или необходимости повторного окрашивания. Важно отметить, что если экспериментатор хочет отслеживать нейроны в этих более длинных файлах, убедитесь, что фокальная плоскость не изменяется и что препарат не движется. Наконец, дополнительным способом направить достаточное количество света к КПК является использование молодых животных, которые имеют более тонкие и, следовательно, менее непрозрачные ганглии.
Время от времени мы обнаруживаем, что отношение сигнал/шум оптических сигналов ухудшается и/или ритмы двигательной программы являются неоптимальными (например, медленными или ненормальными). Когда это начинает происходить последовательно, мы смешиваем свежие растворы ВСД. Аликвоты ВСД обычно остаются жизнеспособными в течение примерно 6 месяцев в морозильной камере -20 °C. Соответственно, стоит отметить, что для Berghiaнаилучшие результаты до сих пор были получены с поглощением VSD RH482. Поскольку RH482 более липофильный, чем RH155, он может лучше окрашивать сравнительно меньшие нейроны Berghiaили оставаться в нейронных мембранах более эффективно при более высокой регистрирующей температуре физиологического раствора, используемой для этого тропического вида.
Одно из ограничений визуализации нейронной активности на основе КПК связано с переменной связью сигналов напряжения в аппаратном обеспечении перед 100-кратным этапом предварительного оплодотворения: хотя это представляет собой необходимую особенность для удаления большого смещения постоянного тока, создаваемого высоким уровнем покоящегося света, требуемым этим методом, связь переменного тока, присущая КПК, исключает измерение медленных изменений мембранного потенциала, например, связанные с синаптическими входами. Если желательна запись медленных или стационарных потенциальных изменений, для захвата подпороговой активности может быть использована система визуализации КМОП-камер с постоянным току. Бирн и его коллеги недавно использовали такую установку с RH155 для изображения активности нейронов в щецком ганглии Aplysia17,18. Мы использовали обе системы и обнаружили, что КМОП-камера, благодаря гораздо более высокой плотности детекторов (128 x 128), генерирует в 50 раз большие файлы данных за то же время изображения7. Меньшие файлы КПК облегчают более быструю обработку и анализ. Это также позволяет создавать расширенные записи одиночных испытаний(рисунок 4)и исследования обучения, в которых данные нескольких испытаний объединены в один большой файл перед сортировкой пиков, что позволяет отслеживать сетевую организацию по мере развития обучения19.
В других исследованиях на основе камер флуоресцентные VSD использовались Кристаном и его коллегами для изучения сетевой функции в сегментных ганглиях пиявки. В одном влиятельном исследовании это привело к идентификации нейрона, участвующего в решении животного плавать или ползать20. В другом исследовании Kristan et al. изучили степень, в которой плавательное и ползающее поведение пиявки обусловлено многофункциональными и выделенными схемами21. Совсем недавно Вагенаар и его коллеги использовали двусторонний микроскоп для визуализации напряжения, который позволяет им записывать почти все нейроны в сегментный ганглий пиявки22. В отличие от многих методов визуализации на основе камеры, преимуществом нашего метода визуализации на основе КПК является быстрая и непредвзятая сортировка всплесков с помощью ICA, форма слепого разделения источников, которая не включает в себя никаких решений о границах нейронов для обработки результатов.
Что касается выбора VSD, одним из преимуществ абсорбирующих красителей RH155 и RH482 является небольшая фототоксичность, связанная с ними23,24,что позволяет более длительное время записи, чем это характерно для флуоресцентных VSD. Кроме того, используемые нами VSD с быстрым поглощением хорошо подходят для регистрации избыточных потенциалов соматического действия у брюхоногих моллюсков, которые обычно составляют амплитуду 80 мВ. Как показано на рисунке 3G,наш оптический метод может регистрировать недоудары потенциала действия (ни одна из наших записей не усредняется по трассировкам): это говорит о том, что используемые нами VSD должны быть в состоянии различать потенциалы действия в других модельных системах, которые в некоторой степени затухают и, следовательно, не перегружаются к тому времени, когда они достигают сомы. Тем не менее, наш оптический подход не может быть идеальным для видов, которые, как известно, демонстрируют сильно ослабленные потенциалы действия при регистрации в соме.
Большая часть современных исследований нейронных сетей сосредоточена на небольшом количестве дизайнерских трансгенных видов. Тем не менее, нейробиология выигрывает от изучения широкого спектра филогенетически различных видов. Изучение множества различных видов дает представление отом,как развиваются схемы25,26,и освещает принципы сетевой функции, которые могут быть общими для типов1,2,3,4,27. До сих пор мы применяли наш метод визуализации к ряду видов брюхоногих моллюсков, включая Aplysia californica8,11, 12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (неопубликованные данные) и совсем недавно Berghia stephanieae (рисунок 5). Привлекательность этого подхода заключается в том, что он может быть легко применен ко многим видам, без необходимости в трансгенных животных. Мы хотим признать, что наше использование визуализации ВСД с быстроабсорбирующими красителями и КПК следует по стопам новаторской работы, которая достигла этого в полунетронутых, ведущих себя препаратах Navanax29 и Aplysia30. Наш акцент на быстроте нашего подхода отчасти является ответом на опасения, что многие исследователи могут все более неохотно инициировать сетевые исследования на новых видах из-за опасений, что годы исследований будут необходимы для характеристики базовой сетевой организации, прежде чем они смогут исследовать научные вопросы, представляющие широкий интерес для нейробиологии31. Соответственно, наша цель здесь состоит в том, чтобы продемонстрировать технику, которая значительно ускоряет процесс - до такой степени, что значительная информация об организации сети в тот же день может быть получена из отдельных препаратов.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NSF 1257923 и NIH 1U01NS10837. Авторы хотели бы выразить признательность Жану Вану за его помощь в лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
| Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
| Digital camera | Optronics | S97808 | |
| Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
| Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
| Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
| Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
| Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
| Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
| Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
| Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
| NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
| Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
| PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
| Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
| Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
| Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
| RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
| RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
| Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
| Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |
References
- Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
- Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
- Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
- Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
- Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
- Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
- Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
- Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
- Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
- Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
- Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
- Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
- Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
- Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
- Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
- Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
- Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
- Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
- Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
- Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
- Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
- Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
- London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
- Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
- Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).
