Summary
Denne protokol præsenterer en metode til billeddannelse neuronal befolkning aktivitet med enkelt-celle opløsning i ikke-transgene hvirvelløse arter ved hjælp af absorbans spænding-følsomme farvestoffer og en fotodiode array. Denne tilgang muliggør en hurtig arbejdsgang, hvor billeddannelse og analyse kan forfølges i løbet af en enkelt dag.
Abstract
Udviklingen af transgene hvirvelløse præparater, hvor aktiviteten af specifikke sæt neuroner kan registreres og manipuleres med lys, repræsenterer et revolutionerende fremskridt for undersøgelser af det neurale adfærdsgrundlag. En ulempe ved denne udvikling er imidlertid dens tendens til at fokusere efterforskere på et meget lille antal "designer" organismer (f.eks. C. elegans og Drosophila), hvilket potentielt har en negativ indvirkning på forfølgelsen af sammenlignende undersøgelser på tværs af mange arter, hvilket er nødvendigt for at identificere generelle principper for netværksfunktion. Denne artikel illustrerer, hvordan optisk optagelse med spændingsfølsomme farvestoffer i hjernen hos ikke-transgene gastropodarter kan bruges til hurtigt (dvs. inden for tidsforløbet af enkelte eksperimenter) afsløre funktioner i den funktionelle organisering af deres neurale netværk med enkeltcelleopløsning. Vi skitserer i detaljer dissektion, farvning og registreringsmetoder, der bruges af vores laboratorium til at opnå potentielle spor fra snesevis til ~ 150 neuroner under adfærdsmæssigt relevante motorprogrammer i CNS af flere gastropodarter, herunder en ny til neurovidenskab - nudibranch Berghia stephanieae. Imaging udføres med absorbans spændingsfølsomme farvestoffer og en 464-element fotodiode array, prøver på 1.600 billeder / sekund, hurtigt nok til at fange alle handling potentialer genereret af de registrerede neuroner. Flere flere minutters optagelser kan opnås pr. præparat med lidt eller ingen signalblegning eller fototoksicitet. De rå optiske data, der indsamles ved hjælp af de beskrevne metoder, kan efterfølgende analyseres ved hjælp af en række illustrerede metoder. Vores optiske optagelse tilgang kan let bruges til sonde netværk aktivitet i en række ikke-transgene arter, hvilket gør det velegnet til sammenlignende undersøgelser af, hvordan hjerner generere adfærd.
Introduction
Udviklingen af transgene linjer af hvirvelløse dyr som Drosophila og C. elegans har givet kraftfulde systemer, hvor de neurale baser af adfærd kan være optisk forhørt og manipuleret. Disse særlige præparater kan dog have den ulempe, at de reducerer begejstringen for neurale kredsløbsundersøgelser af ikke-transgene arter, især med hensyn til indførelsen af nye arter i neurovidenskabsforskning. Det er skadeligt for søgningen efter generelle principper for netværksfunktionen udelukkende at fokusere på et eller to modelsystemer, fordi sammenlignende undersøgelser udgør en væsentlig vej, hvormed sådanne principper opdages1,2,3,4. Vores mål her er at demonstrere en storstilet billeddannelse tilgang til at opnå hurtig indsigt i den funktionelle struktur af gastropod neurale netværk, i et forsøg på at lette sammenlignende undersøgelser af neurale netværk funktion.
Gastropod bløddyr som Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea og andre har længe været brugt til at undersøge principper for neural netværksfunktion, for en stor del fordi deres adfærd formidles af store, ofte individuelt identificerbare neuroner placeret på overfladen af ganglier, hvilket gør dem let tilgængelige for registreringsteknikker5. I 1970'erne blev spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er), der kan integreres i plasmamembranen, udviklet, der snart muliggjorde de første elektrodefrie optagelser af handlingspotentialerne genereret af flere neuroner6. Her demonstrerer vi vores brug af VSD'er til at undersøge netværksaktivitet i flere arter af gastropoder, herunder en ny til neurovidenskab, Berghia stephanieae. Billedbehandlingsenheden er et kommercielt tilgængeligt 464-element fotodiode array (PDA), der prøver ved 1.600 billeder / sekund (Figur 1), som, når de bruges med hurtig absorbans VSD'er, afslører handlingspotentialerne for alle registrerede neuroner7. De signaler, der registreres af alle dioder, vises umiddelbart efter erhvervelsen og overlejret på et billede af ganglionen i PDA-erhvervelsessoftwaren, hvilket gør det muligt at undersøge neuroner af interesse med skarpe elektroder i samme forberedelse8,9.
I de rå PDA-data registrerer mange dioder overflødigt de større neuroner, og mange indeholder også blandede signaler fra flere neuroner. Et vendepunkt var udviklingen af en automatiseret spike-sorteringsmetode ved hjælp af uafhængig komponentanalyse til hurtigt at behandle hver rå 464-kanals PDA-datasæt til et nyt sæt spor, hvor hver registreret neuron vises i et separat spor, der kun indeholder dets handlingspotentialer10,11.
I denne artikel skitserer vi de væsentlige trin, der er involveret i at opnå store handlingspotentiale optagelser fra gastropodnervesystemer med et fotodiode array og hurtige absorbans-VSD'er. Vi illustrerer desuden analytiske metoder, der kan anvendes til klyngedannelse og kortlægning af de optisk registrerede neuroner med hensyn til deres funktionelle ensembler, og til at karakterisere befolkningsniveaufunktioner, der ofte ikke er synlige gennem simpel inspektion af affyringssporene12,13.
Protocol
BEMÆRK: Den arbejdsproces, der er skitseret nedenfor, er opsummeret i figur 2.
1. Minimer vibrationer
- Hvis det er muligt, skal du sikre dig, at riggen er i stueetagen, og bruge et fjederbaseret isolationsbord, som dæmper et bredere udvalg af vibrationsfrekvenser end luftborde.
- Hvis du bruger et fjederbaseret bord, skal du sørge for, at det flyder (det skal justeres, hver gang man tilføjer eller tager noget af bordet).
- Reducer vibrationsbaseret støj i billedrummet så meget som muligt, selv i det omfang, det er nødvendigt at lukke for luftstrømmen under billeddannelse. Minimer eventuelle vibrationer som følge af væsketurbulens i perfusionssystemer.
BEMÆRK: Det neurale præparat må ikke bevæge sig under erhvervelsen. Bevægelser af enhver art producerer skift af kontrastkanter på tværs af dioder, hvilket fører til artefaktelle signaler. Hvis proceduren indebærer en stimulus under erhvervelsen, må den ikke fremkalde forberedelsesbevægelse.
2. Kør en pinhole test for at muliggøre korrekt tilpasning af ganglion fotos med PDA data
- Placer et stykke aluminiumsfolie med 3 små huller stukket i det på et mikroskop dias. Tag et billede af de tre huller med det digitale kamera monteret på sin parfokale fotoport.
- Brug billedbehandlingssoftwaren, der følger med PDA'en, tilskaffe en kort fil (f.eks. 5 s). Halvvejs gennem erhvervelsen skal du trykke på bordet for at fremkalde vibrationsartefakter, der vil være meget synlige omkring kanterne af pinholes, hvilket gør det muligt at justere billedet af pinholes nøjagtigt med de optiske data.
- Brug funktionen Overlejring i billedbehandlingssoftwaren, der findes i menupunktet "Vis | Side overlejre | Overlejre sporinger m/eksternt billede | Overlejre Billede," at overlejre diode data på billedet af pinholes, og derefter iteratively justere x, y, og forstørrelse indstillinger for billedet, indtil pinholes sidde direkte på toppen af pinhole artefakter i diode data.
- Gem disse tal for at justere forberedelsesbilleder taget med kameraet med diodedataene i fremtidige eksperimenter.
BEMÆRK: Pinhole justering af PDA kun skal udføres én gang efter PDA er monteret på mikroskopet, indtil det er roteret eller fjernet, på hvilket tidspunkt det skal gøres igen.
- Gem disse tal for at justere forberedelsesbilleder taget med kameraet med diodedataene i fremtidige eksperimenter.
3. Dissektioner for tre marine gastropoderarter
- For arter, der vokser til stor størrelse, såsom Tritonia og Aplysia, skal du starte med mindre individer, som har tyndere, mindre uigennemsigtig ganglier, hvilket letter opnåelsen af tilstrækkeligt lys til optimal signal-til-støj.
- Har klar filtreret kunstigt havvand, der skal anvendes som saltvand til dissektioner og billeddiagnostik eksperimenter.
BEMÆRK: I alle efterfølgende trin i protokollen betegner "saltvand" kunstigt havvand. - Dissektion af Tritonia diomedea
- Placer et dyr i køleskabet i ca. 20 minutter for at bedøve det.
- For større dyr skal du udsætte hjernen ved at holde dyret i den ene hånd og lade hovedet ende drapere over pegefingeren for at udsætte "halsen". For mindre dyr, pin dem dorsale side op i en voks-foret dissektion parabol før udsætter hjernen.
- Brug dissektionssaks til at lave et 3-4 cm midterlinjeindsnit på dyrets dorsale side, over buccalmassen (som kan mærkes gennem kropsvæggen).
BEMÆRK: Den nødvendige del af CNS, der består af sammensmeltede, bilaterale cerebropleural og pedal ganglier, er orange og adskiller sig i udseende fra det omgivende væv; det ligger straks bagest til næsehornene og oven på buccalmassen. - Punktafgift CNS ved at afskære disse nerver innervating dyrets krop ved hjælp af pincet og microdissection saks, holde intakt alle disse nerver forbinder den centrale ganglier. Efterlad en lang længde af pedalnerven 3 (PdN3), eller hvilken nerve der vil blive stimuleret.
- Brug minutien stifter til at fastgøre CNS til bunden af en saltvand fyldt elastomer-foret parabol for yderligere dissektion. Tilberedningstemperaturen skal fastholdes ved 11 °C ved at gennemstå skålen med saltvand leveret med et feedbackstyret, in-line Peltier-kølesystem ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
- Ved hjælp af pincet og mikrodissection saks, forsigtigt fjerne løst vedhængende lag af bindevævet fra omkring CNS. Lad den fine skede nøje overholde ganglier.
- Kort (~ 10 s) dyppe ganglier i en opløsning på 0,5% glutaraldehyd i saltvand. Placer ganglier tilbage i saltvand-perfunderes elastomer-foret fad, så saltvand til at vaske væk glutaraldehyd før du begynder VSD farvning.
BEMÆRK: Denne lysrettelse af bindevævet og dets iboende muskler vil hjælpe med at forhindre bevægelse under billeddannelse.
- Dissektion af Aplysia californica
- Bedøve en ca 40 g dyr ved at injicere ~ 20 mL af 350 mM MgCl2 ind i kroppen gennem ventral overflade (fod).
- Brug stifter til at placere dyrets ventral side op i en voks-foret dissektion parabol.
- Brug dissektion saks, lave en 2-3 cm midterlinjen snit langs de mest forreste omfang af foden. Fastgør flaps af foden på hver side af snittet for at afsløre en del af CNS og buccal masse.
BEMÆRK: Den nødvendige del af CNS, der består af sammensmeltede cerebral ganglier, og tæt apposed, bilaterale pleural og pedal ganglier, er gul-orange og adskiller sig i udseende fra det omgivende væv; det sidder dorsal og posterolateral til pæreformet muskuløs buccal masse. - Brug tang og dissektion saks til omhyggeligt dissekere væk buccal masse, afslører cerebral ganglier.
- Punktafgift CNS ved at afskære disse nerver innervating dyrets krop ved hjælp af pincet og microdissection saks, holde intakt alle disse nerver forbinder den centrale ganglier. Efterlad en lang længde af pedalnerven 9 (PdN9), eller hvilken nerve der vil blive stimuleret.
- Brug minutien stifter til at placere CNS i en saltvand fyldt elastomer-foret parabol. Tilberedningstemperaturen skal fastholdes ved 15-16 °C ved at gennemstå skålen med saltvand, der passerer gennem en Peltier-køleanordning.
- Brug pincet og mikrodissection saks, fjerne overdreven bindevæv fra CNS, og dissekere væk en overfladisk del af kappen på ganglion eller ganglier, der skal afbildes. Vær forsigtig under denne proces for ikke at lave et hul i kappen, hvilket ville resultere i neuroner, der løber ud indefra.
- Kort (~ 20 s) dyppe ganglier i en opløsning på 0,5% glutaraldehyd i saltvand. Placer ganglier tilbage i saltvand-perfunderes elastomer-foret fad, så saltvand til at vaske væk glutaraldehyd før du begynder VSD farvning.
- Dissektion af Berghia stephanieae
- Placer et dyr i køleskabet i ca. 20 minutter for at bedøve det.
- Ved hjælp af en elastomer-foret skål fyldt med stuetemperatur saltvand, sted minutien stifter i både hoved og hale.
- Brug microdissection saks, lav en 5-7 mm dorsal snit overfladisk til CNS.
BEMÆRK: Øjnene, mørke pletter, der er bosat i dyret ved siden af CNS, markerer bekvemt placeringen af den nødvendige del CNS, som består af bilateralt sammensmeltede cerebropleural og pedal ganglier og sidder oven på buccalmassen. - Punktafgift CNS ved at afskære disse nerver innervating dyrets krop ved hjælp af pincet og microdissection saks. Efterlad enhver nerve, der stimuleres tilstrækkeligt længe til en sugeelektrode.
4. Plette præparatet med et spændingsfølsomt farvestof
- Forbered lagerløsninger af enten RH155 (også kendt som NK3041) eller RH482 (også kendt som NK3630 eller JPW1132).
- RH155: 5,4 mg fast farvestof opløses i 1 mL på 100% EtOH, der pipetter 29 μL i hvert af 34 mikrocentrifugerør. Med indholdet af hvert rør udsat for luften, lad dem tørre natten over i mørket. De deraf følgende faste aliquots af RH155, der hver indeholder 0,15 mg, anbringes i en fryser på -20 °C.
- RH482: 2 mg fast farvestof opløses i 100 μL DMSO, opløsningen opdeles i 20 aliquots på 5 μL, der hver indeholder 0,1 mg RH482, og opbevares i en fryser på -20 °C.
BEMÆRK: For Tritonia og Aplysiakan enten badperfusion eller trykpåføring bruges til at indlæse VSD RH155 i membranerne af neuronerne i præparatet. Trykapplikation har den fordel, at den kun udsætter ganglion, der afbildes til VSD.
- Til badperfusion tilsættes 5 ml saltvand til hver af de to ovennævnte aliquots af fast RH155 og vortex i opløsning, hvilket giver en kombineret opløsning på 10 ml, der indeholder 0,03 mg/mL RH155.
- Perfuse i mørke (for at undgå fotobleaching) i 1 til 1,5 timer ved 11 °C for Tritonia og ved 16 °C for Aplysia. Bevar temperaturen ved at føre perfusionsopløsningen gennem et Peltier-kølesystem.
- Til trykpåføring tilsættes 500 μL saltvand til en aliquot af RH155 og vortex for at producere en farvestofkoncentration på 0,3 mg /mL.
- Der tegnes ca. 200 μL af opløsningen i polyethylenrør ved hjælp af en håndholdt mikrodispenser, hvilket sikrer, at der er et godt match mellem rørdiameteren og diameteren af den ganglion, der skal farves.
- Brug en mikromanipulator til omhyggeligt at placere enden af røret over målet ganglion, sænke det, indtil det danner en lun forsegling på ganglion. Brug den type kølesystem, der er beskrevet ovenfor, til at holde ganglier ved den ønskede temperatur.
- Dæmp rumlysene for at undgå fotobleaching, og drej på mikrodispenser-applikatorknappen hvert 5. minut for at tvinge mere farvestof på ganglionen.
- Kontroller ved 30 min for at bekræfte, at god farvning finder sted, og fortsæt derefter i en samlet farvningstid på ca. 1 time.
- Til farvning i Berghiatilsættes 1 mL saltvand til en frossen aliquot af RH482 og vortex opløses.
- 200 μL af denne opløsning overføres til et mikrocentrifugerør, der indeholder 800 μL saltvand og vortex, til opløsning, hvilket giver en endelig farvningsopløsning på 0,02 mg/ml RH482 i saltvand med 0,1% DMSO.
- Placer hele CNS i mikrocentrifugerøret, indpakning af røret i aluminiumsfolie for at undgå fotobleaching, og ryst i hånden hver 5-6 minutter i ca. 1 time. Den resterende 800 μL af den første opløsning opbevares i køleskabet, og der anvendes i op til 3 dage til farvning af efterfølgende præparater.
5. Flad præparatet og sæt op til nervestimulation
BEMÆRK: Trinene i dette afsnit skal udføres under minimal belysning eller med grønt lys for at minimere fotobleaching.
- Efter farvning nedsænkes CNS i saltvand i billedkammeret og placeres under et dissekerende mikroskop.
- Placer stykker silikone (for Tritonia eller Aplysia)eller klatter af vaseline (for Berghia)til venstre og højre for ganglion / ganglier, der skal afbildes.
- Tryk et stykke glas eller plastovertræk i passende størrelse ned på præparatet for at flade det ud. Tryk fast, men ikke så hårdt, at skade neuronerne.
BEMÆRK: Udfladning af præparatets konvekse overflade på denne måde vil gøre et større antal neuroner parfokale og derved øge antallet af registrerede neuroner og vil desuden bidrage til at immobilisere præparatet under billeddannelse. - Hvis stimulere en nerve til at fremkalde en fiktiv motor program, forberede en sugeelektrode, hvis forreste spids er omtrent lige så bred som nervediameteren. Opnå dette ved omhyggeligt at smelte et segment af PE-100 polyethylenrør over en flamme, mens du forsigtigt trækker i begge ender af slangesegmentet og derefter skærer den resulterende koniske på det ønskede punkt.
- Tegn et lille volumen saltvand gennem den koniske ende af en polyethylen sugeelektrode, efterfulgt af enden af nerven, der skal stimuleres, ved at fastgøre en længde af tykvægget, fleksibel polymerrør til bagenden af elektroden og bruge mundsugning til at anvende negativt tryk.
- Bekræft, at saltvandet i elektroden mangler bobler, der kan afbryde elektrisk ledning.
6. Forberedelse og optimering til billedbehandling
- Flyt kammeret til billedbehandlingsriggen. Start saltvandstransfusionen gennem optagekammeret, og placer temperatursonden i nærheden af præparatet. Angiv temperaturregulatoren for den ønskede temperatur for de arter, der afbildes (for Tritonia, 11 °C, for Aplysia, 15-16 °C eller for Berghia, 26-27 °C).
- Placer en forkloren sølvtråd ned i sugeelektroden, og sørg for, at den kommer i kontakt med saltvandet i elektroden, og læg den anden Ag-AgCl-ledning (returvejen) i badesalven nær sugeelektroden.
- Sænk vand nedsænkning linsen i saltvandet. Luk basismembranen, og hæv eller sænk derefter underfasekondensatoren, og juster fokus, indtil membranens kanter er i skarp fokus, hvilket skaber Köhler-belysning.
- Fokuser på den region af forberedelsen, der skal afbildes. Bias med fokus på mindre neuroner over større, da optiske signaler, der stammer fra større neuroner, er mere tilbøjelige end mindre til at blive registreret, selvom de er lidt ude af fokus.
- Tag et billede af ganglion, der skal afbildes med parfocal digitalkamera.
- Når kontrolpanelets forstærkningskontakt er indstillet til 1x, skal du inspicere hvilelysintensiteten (RLI) i billedbehandlingssoftwaren ved at klikke på knappen "RLI"og kontrollere den gennemsnitlige RLI for dioder. Juster spændingsniveauet, der sendes fra en stimulator, til LED-lampens strømforsyning, og fortsæt med at kontrollere det gennemsnitlige RLI-niveau, indtil det er i det ønskede område (normalt omkring 3-4 V).
BEMÆRK: Høje RLI'er, svarende til ca. 3-4 V på PDA'en, er ønskelige. Jo højere lyset er, jo bedre signal-til-støj-forholdet for de optiske signaler skal dette dog afvejes mod en hurtigere fotobleaching ved højere RLI'er. Denne risiko minimeres ved hjælp af objektive linser med høj NA-mål. De anvendte objektiver til nedsænkning af vand er 10x/0,6 NA, 20x/0,95 NA, 40x/0,8 NA og 40x/1.15 NA.
- Indstil kontrolpanelets forstærkningskontakt til 100x for optagelsen.
- Hvis stimulere en nerve, indstille den ønskede spænding, frekvens og varighed på en separat stimulator fra den, der anvendes til at indstille lysniveauet. Bekræft, at TTL-udløseren mellem kontrolpanelet og stimulatoren er konfigureret korrekt.
BEMÆRK: Prøven nerve stimulus parametre i hver art er som følger: Tritonia PdN3, 2 s, 10 Hz puls tog på 5 ms, 10 V pulser; Aplysia PdN9, 2,5 s, 20 Hz pulstog på 5 ms, 8 V pulser; en Berghia pedal nerve, 2 s, 10 Hz puls tog på 5 ms, 5 V pulser. - Dobbelttjek, at fjeder- eller luftbordet flyder.
7. Optisk optagelse
- Sluk eller dæmp rumlysene, herunder eventuel lysstofrør over hovedet.
- Indstil den ønskede filvarighed, stien og filnavnet, og klik derefter på knappen "Hent data" i billedbehandlingssoftwaren for at hente filer op til kapaciteten af computerens tilgængelige RAM. Forbliv stille under den optiske optagelse, da små vibrationer kan introducere store artefakter i de optiske optagelsesdata.
BEMÆRK: For opkøb, der ville overstige computerens tilgængelige RAM, en skræddersyet C + + erhvervelse program er tilgængelig via Dr. Jian-unge Wu af Georgetown University. - For at se data umiddelbart efter erhvervelsen skal du bruge superimpose-funktionen i billedbehandlingssoftwaren til at overlejre de data, der er indsamlet af alle 464 dioder over billedet af ganglion taget tidligere afpræparatet 7. Klik på en af de dioder, der er repræsenteret i softwaren, for at udvide det, de optog på en separat sporskærm.
- Opnå nøjagtig justering af dioder med hensyn til præparatet ved at indtaste x, y og forstørrelsesfaktorer som tidligere bestemt af pinhole-testen.
- For at maksimere handlingspotentialets synlighed og forbedre neuronudbyttet for efterfølgende spike-sortering14, pålægge et bandpass Butterworth-filter med 5 Hz og 100 Hz cutoffs (fås i billedbehandlingssoftware) for at fjerne både lav- og højfrekvent støj.
- Hvis du vil gemme filtrerede optiske data som en tekstfil til yderligere analyse i en videnskabelig computerplatform, skal du først markere boksen "TP-filter" lige under skærmen "Side" i billedbehandlingssoftwaren. Vælg derefter "Gem side som ASCII" under fanen "Output", og skriv det ønskede filnavn i den dialogboks, der vises.
Representative Results
Tritonia
Hudkontakt med sin seastar rovdyr udløser Tritonia diomedea flugt svømme, der består af en rytmisk serie af hele kroppen fleksioner, der driver det væk i sikkerhed (Figur 3A). I isolerede hjernepræparater fremkalder en kort stimulus til pedalnerve 3 (PdN3) det rytmiske svømmemotorprogram (SMP) for denne adfærd, som er let genkendelig i optiske optagelser fra pedalganglier. Figur 3B viser layoutet af et VSD-billedeksperiment designet til at registrere neuronernes fyringsaktivitet på den dorsale overflade af venstre Tritonia pedalganglion, over hvilken PDA'en var placeret, som en stimulans til den kontralaterale (højre) PdN3 fremkalder SMP. Rå og filtrerede data (båndpass Butterworth filter, 5 og 100 Hz cutoffs) fra 20 dioder registrering aktivitet før, under og efter stimulering af PdN3 er vist i figur 3C, D hhv. Nervestimuleringen blev leveret 20 s i 2 min.-filen. Umiddelbart efter erhvervelsen kan de signaler, der måles af alle 464 dioder i optagelsesmatrixen, vises topografisk over et billede af præparatet i billedbehandlingssoftwaren (Figur 3E). På dette tidspunkt indeholder mange spor pigge registreret overflødigt fra de samme neuroner, og nogle spor indeholder pigge fra mere end en neuron. Spike-sortering af de filtrerede dioder med ICA gav 53 unikke neuronale spor, hvoraf 30 er vist i figur 3F. Kinetik af individuelle pigge kan værdsættes i Figur 3G, som udvider et uddrag af fire spor fra Figur 3F (rød boks); nøjagtigheden af ICA spike-sorteringsalgoritmen blev tidligere verificeret ved hjælp af samtidige skarpe elektrodeoptagelser, som viste, at alle pigge i de sorterede spor svarer til intracellulært registrerede pigge fra individuelle neuroner11,14.
Aplysia
En stærkt afvisende hale stimulus til Aplysia californica fremkalder en stereotyp todelt rytmisk flugtrespons15. Den første fase af svaret er en galop af flere cyklusser af hoved lunges og hale trækker, der bevæger dyret hurtigt fremad. Dette efterfølges typisk af en periode med gennemgang, der involverer gentagne bølger af muskelsammentrækninger fra top til hale, der driver dyret fremad med en langsommere hastighed i flere minutter (Figur 4A). For at fange disse flugtmotorprogrammer i optiske optagelser var PDA'en fokuseret på den dorsale overflade af højre pedalganglion i en isoleret hjerneforberedelse, og en sugeelektrode blev placeret på den kontralaterale (venstre) pedalnerve 9 (PdN9; Figur 4B). Et minut inde i en kontinuerlig 20 min optisk optagelse (Figur 4C), PdN9 blev stimuleret til at fremkalde galop-crawl motor program sekvens. De probabilistiske gaussiske rumlige fordelinger af signalerne fra alle 81 registrerede neuroner blev kortlagt på ganglion (Figur 4D). Dimensionalitetsreduktion anvendt på den fulde optagelse afslørede, at galop (cyan) og crawl (mørkeblå) faser af flugtprogrammet besatte forskellige områder og dannede forskellige baner, henholdsvis spiral- og loop-lignende i hovedkomponentrummet (Figur 4E).
Tre videoer baseret på Aplysia-optagelsen, der er afbildet i figur 4, demonstrerer yderligere typer analyser, der kan udføres på sådanne datasæt. Video 1 animerer affyring af alle optagede neuroner i hele optagelsens varighed. Den første post-stimulerende periode af flugt motor program var kendetegnet ved en galop, hvor aktiviteten i ganglion var præget af vekslende sprængning af forskellige funktionelle klynger (Video 2). Galoppen skiftede efterfølgende til en gennemgang, hvor aktiviteten på tværs af neuronale klynger forblev stort set faset, men antog en mod urets rotationsbane i ganglion (Video 3). De to sidstnævnte videoer indeholder også konsensusklynger, der afslører fyring og placering af de forskellige funktionelle ensembler til galop- og gennemgangsfaserne af flugtresponset separat. Bemærk, at mange neuroner tildelt den samme klynge i både galop og gennemgang faser udstillet fysisk nærhed til hinanden i ganglion, i overensstemmelse med tidligere resultater12.
Berghia
Den ædle nudibranch Berghia stephanieae (Figur 5A) repræsenterer et nyt modelsystem for neurovidenskab. Billedopsætningen for et typisk Berghia-eksperiment er vist i figur 5B. For at fremkalde bred neuronal aktivitet blev en sugeelektrode placeret på den mest fremtrædende venstre pedalnerve, og en nervestimulans blev leveret 30 s i en 2 minutters optagelse. ICA-forarbejdede spor afslørede både spontan og stimulus-fremkaldt aktivitet i 55 neuroner (Figur 5C). Fællesskabsdetektion via konsensusklynger identificerede ti forskellige funktionelle ensembler, som er afbildet i figur 5D i en netværksgraf og i figur 5E, som omorganiserer de spor, der er vist i figur 5C, baseret på deres klyngeopgaver. Gaussiske fordelinger af signalerne fra alle registrerede neuroner er overlejret på et billede af præparatet i figur 5F for at angive positionerne for alle 55 registrerede neuroner.
Figur 1: Visninger af den optiske billedrig og fotodiode-systemet (PDA). (A) Den optiske billedbehandling rig, byder PDA, digitalt kamera, mikroskop, og scene. (B) Det interne design af PDA, hvor fiberoptik forbinder billedåbningen med 464 fotodioder. En række forstærkere er placeret over fotodioder. (C) Den sekskantede side af billedbehandling blænden, som det område, der afbildes er fokuseret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Et rutediagram, der illustrerer den vigtige arbejdsgang i forbindelse med opnåelse af optiske optagelser. De væsentlige trin i VSD-billedprotokollen, fra dissektion og farvning gennem detaljerne i billedbehandling, er afbildet i dette rutediagram. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Resultater fra Tritonia diomedea, der illustrerer rå, filtreredeog spike-sorterede data. (A) Tritonia flygter fra den rovende havstjerne Pycnopodia helianthoides gennem sin svømmetur, som består af skiftevis dorsale og ventrale fleksioner af kroppen. (B) Skematisk over billedopsætningen. Ce=cerebral lap af cerebropleural ganglion; Pl = pleural lap af cerebropleural ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) Rå data fra 20 fotodioder, der viser aktivitet i venstre pedal ganglion til stimulering af kontralaterale PdN3 (stimulus angivet med pilen). (D) Filtrerede data fra de samme dioder som i filteret C (5 og 100 Hz. (E) Imaging software output, hvor komprimerede spor indsamlet af alle 464 dioder er overlejret topografisk over et billede af præparatet. Positionerne for de 20 dioder, hvis spor er vist i C og D, fremhæves med rødt. (F) Tredive udvalgte enkelt-neuron spor genereret af spike-sortering via ICA. (G) En udvidet visning af fire enkelt-neuron spor, svarende til den røde boks i F, viser deres handling potentialer ved højere tidsmæssige opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Resultater fra Aplysia californica, der illustrerer langvarig optagelse, signalkortlægning og dimensionalitetsreduktion. (A) De to faser af Aplysia's sekventielle flugt motor program, galop og kravle. (B) Skematisk over billedopsætningen. Ce = cerebral ganglion; Pl = pleural ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) En 20 min optagelse af 81 neuroner i højre pedal ganglion reagerer på en stimulus til kontralaterale PdN9 (angivet med pilen). Grønne, cyan og mørkeblå bjælker under sporene angiver henholdsvis præstimuleringsperioden, galoppen og gennemgangsfaserne i flugtmotorprogrammet. (D) Et billede af præparatet med kortlagte probabilistiske gaussiske fordelinger af placeringen af alle 81 neuronale signalkilder identificeret af ICA. Den grønne kontur repræsenterer placeringen af PDA'ens sekskantede ansigt med hensyn til ganglionen. Tallene på hver gaussisk svarer til spornumrene i C. (E) Dimensionalitetsreduktion ved hjælp af hovedkomponentanalyse, der plotter de første tre hovedkomponenter mod hinanden i løbet af 20 min.-filen. Den præ-stimulerende baseline, galop, og kravle epoker er vist i grøn, cyan, og mørkeblå, henholdsvis. Se Videoer 1-3 for animationer af neuronal fyring svarende til denne optagelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Resultater fra Berghia stephanieae, en ny art for neurovidenskab, der illustrerer netværksgrafering, funktionel klyngedannelseog bilateral signalkortlægning. (A)En Berghia-prøve. (B) Skematisk over billedopsætningen. Ce = cerebral lap af cerebropleural ganglion; Pl = pleural lap af cerebropleural ganglion; Pd = pedalganglion; Rh = næsehorn ganglion. (C) Spor, der viser den spontane og stimulus-fremkaldte aktivitet af 55 bilaterale neuroner i cerebropleural ganglier (levering af stimulus er angivet med pilen). (D) En netværksgraf, der viser de ti funktionelle ensembler, der hver især har fået tildelt en unik farve, identificeret gennem konsensusklynger. Noder i dette plot repræsenterer neuroner, hvor afstanden i netværksrummet repræsenterer graden af fyring korrelation inden for og mellem ensembler. (E) Sporene i C omarrangeres og farvekodes (efter D-farveskemaet) til funktionelle ensembler. (F)Et billede af præparatet, der viser de kortlagte placeringer af signalerne fra hver registreret neuron og de spornumre i C og E, som de svarer til. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Animation af den fulde, 20-minutters Aplysia undslippe lokomotivprogram. Uigennemsigtigheden af de hvide former, der ligger over 81 individuelle neuroner i højre pedalganglion (venstre panel), blev drevet af de tilsvarende neuronale spor (højre panel) og varierede lineært som en funktion af gennemsnitlig spike rate (binned pr. 0,61 s i realtid i optagelsen). For hver neuron blev fuld uigennemsigtighed normaliseret til sin maksimale fyringshastighed i løbet af optagelsens varighed. Et sekund af den forløbne tid i videoen repræsenterer 12,2 s i realtid. Skalalinjen svarer til realtid, med de grønne, cyan og mørkeblå linjer under sporene, der angiver henholdsvis præstimuleringslinjen, galop og gennemgangsfaser i flugtmotorprogrammet. De gule bokse omkring galopfasen og en del af gennemsøgningsfasen angiver de optagelsesuddrag, der bruges til at generere animationerne i Video 2 og 3. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 2: Animation af galop fase af Aplysia undslippe lokomotivprogram. Konsensus klyngedannelse blev udført på alle 81 registrerede neuroner i netop galop fase af motorprogrammet til at udlede den funktionelle ensembler, ved hjælp af den tilgang og software, der er beskrevet og stilles til rådighed i ref.12. Neuronale ensembler udviser stort set tonic eller uregelmæssig fyring mønstre i denne fase af flugt-programmet blev udeladt fra denne video. Aktionspotentialerne for neuronerne, der tilhører de sorte og olivengrønne ensembler, kan høres i videoens lydspor, med de tilsvarende neuroner og spor fremhævet. Gennemsnitlige stigningsrater blev normaliseret som i video 1 og med tilsvarende tidsplacering; 1 s forløbet tid i videoen svarer til 6,1 s i realtid. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 3: Animation af gennemgangen fase af Aplysia undslippe lokomotivprogram. Konsensus klyngedannelse blev udført på alle 81 registrerede neuroner i netop gennemgang fase af motor-programmet til at udlede den funktionelle ensembler. Ensembler udstiller stort set tonic eller uregelmæssig fyring mønstre i denne fase af motorprogrammet blev udeladt fra denne video. Gennemsnitlige stigningsrater blev normaliseret som i Video 1 og 2 og med tilsvarende tidsplacering; 1 s forløbet tid i videoen svarer til ca 12,2 s i realtid. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Discussion
En af de vigtigste detaljer i implementeringen af vores store VSD-billedbehandlingsmetode er at minimere vibrationer, der producerer bevægelser af kontrastkanter på tværs af dioder, hvilket resulterer i store artefaktistiske signaler. Fordi absorbans VSD'er producerer meget små procentvise ændringer i lysintensiteten med handlingspotentialer, kan vibrationsartefakter, hvis de ikke forhindres, skjule de neuronale signaler af interesse. Vi anvender flere metoder til at minimere vibrationsartefakter. For det første er vores billedrum placeret i stueetagen, hvilket isolerer præparatet fra vibrationer relateret til opbygning af lufthåndteringsudstyr og mange andre kilder. For det andet blev der anvendt et fjederbaseret isolationsbord, som andre PDA-brugere har bekræftet giver bedre vibrationsdæmpning end det mere almindelige luftbord16. For det tredje blev der anvendt målsætninger for nedsænkning af vand, som eliminerer billedudsving som følge af overflade krusninger. For det fjerde blev det præparat, der afbildes, let presset mellem kammerdækslet og et coverlipfragment presset ned ovenfra, der holdes på plads af silikonepropper eller vaseline, hvilket yderligere stabiliserer præparatet. Dette flader også konvekse overfladen af ganglion eller ganglier bliver afbildet, hvilket resulterer i flere neuroner i flyet af fokus på målet, hvilket øger antallet af registrerede neuroner.
For at maksimere signal-til-støj-forholdet for de meget små ændringer i graden af VSD-lysabsorpræsorpion som følge af et handlingspotentiale er det vigtigt at opnå næsten mættet lys gennem præparatet til PDA'en, samtidig med at fotobleaching af farvestoffet minimeres. Til dette formål arbejder vi typisk ved 3-4 V hvilelysintensitet, målt med PDA-kontrolpanelets forstærkningskontakt i 1x-positionen (PDA'ens 464 forstærkere mættes ved 10 V lys). Under dataindsamlingen ændres denne gevinstfaktor til 100x. Kom tilstrækkeligt lys til at nå 3-4 V målt ved PDA kan opnås på flere måder. Brug først en ultrabright LED-lyskilde, der leverer en bølgelængde, der passer til absorptionsegenskaberne for det absorberende farvestof, der er i brug. Derfor blev der anvendt en 735-nm LED-kollimeret lampe, som overlapper med de optimale absorptionsbølgelængder på RH155 og RH482. For det andet skal du om nødvendigt bruge en flip-top subtage kondensator, der koncentrerer lyset fra LED-lyskilden til et mindre område. For det tredje skal kondensatorhøjden justeres for at opnå Köhler-belysning, hvilket sikrer høj, jævn lysstyrke og maksimal billedkvalitet. For det fjerde skal du sikre dig, at der ikke er varmefiltre i den optiske vej, som kan dæmpe LED-lampens bølgelængde på 735 nm. For det femte skal du fjerne diffusorer, hvis der er behov for mere lys, fra den optiske vej. For det sjette skal du bruge målsætninger med høj NA, som giver høj rumlig opløsning, og tillade tilstrækkelige lysniveauer til at nå PDA'en ved lavere lampeintensiteter. Dette har gjort det muligt for os at minimere photobleaching i det omfang, at vi kan få flere erhvervelse filer på 10-20 min varighed pr forberedelse ved hjælp af samme lysintensitet på tværs af alle filer og uden et betydeligt tab af signal amplitude eller behovet for re-farvning. Afgørende, hvis eksperimentatoren ønsker at spore neuroner på tværs af disse længere filer, skal du sikre dig, at brændplanet ikke ændres, og at præparatet ikke bevæger sig. Endelig er en yderligere måde at dirigere tilstrækkeligt lys til PDA'en på at bruge yngre dyr, som har tyndere og dermed mindre uigennemsigtige ganglier.
Fra tid til anden finder vi, at signal-til-støj-forholdet mellem de optiske signaler forringes, og / eller motorprogrammets rytmer er suboptimale (f.eks. langsomme eller unormale). Når dette begynder at ske konsekvent, blander vi friske løsninger af VSD. Aliquots af VSD forbliver typisk levedygtige i ca. 6 måneder i en -20 °C fryser. Relateret er det værd at bemærke, at for Berghia, de bedste resultater er hidtil opnået med absorbans VSD RH482. Da RH482 er mere lipofil end RH155, kan det bedre plette Berghia's forholdsvis mindre neuroner eller forblive i neuronale membraner mere effektivt ved den højere registrering saltvand temperatur, der anvendes til denne tropiske art.
En begrænsning af PDA-baseret billeddannelse af neural aktivitet vedrører AC-koblingen af spændingssignalerne i hardware før 100x forforstærkningstrinnet: Selv om dette udgør en nødvendig funktion til at fjerne den store DC-forskydning, der produceres af det høje hvilelysniveau, der kræves af denne teknik, udelukker AC-koblingen, der er indbygget i PDA'en, måling af langsomme ændringer i membranpotentialet, f.eks. dem, der er forbundet med synaptiske input. Hvis du ønsker at optage langsomme eller konstante potentielle ændringer, kan et DC-koblet CMOS-kamerabilledsystem bruges til at registrere subthreshold-aktivitet. Byrne og kolleger for nylig brugt en sådan opsætning med RH155 at billedet aktiviteten af neuroner i buccal ganglion af Aplysia17,18. Vi har brugt begge systemer og konstateret, at CMOS kameraet, på grund af sin meget højere tæthed af detektorer (128 x 128), genererer 50x større datafiler til samme billedbehandling tid7. PDA's mindre filer letter hurtigere behandling og analyse. Dette gør det også muligt at udvide enkeltforsøgsoptagelser (Figur 4) og undersøgelser af læring, hvor data fra flere forsøg sammenkædes i en stor fil før spike-sortering, så netværksorganisation kan spores, efterhånden som læring udviklersig 19.
I andre kamerabaserede undersøgelser er fluorescerende VSD'er blevet brugt af Kristan og kolleger til at undersøge netværksfunktionen i iglens segmentale ganglier. I en indflydelsesrig undersøgelse førte dette til identifikation af en neuron, der var involveret i dyrets beslutning om at svømme eller gennemgå20. I en anden undersøgelse undersøgte Kristan et al. i hvilket omfang iglens svømning og krybende adfærd er drevet af multifunktionelle vs. dedikerede kredsløb21. For nylig brugte Wagenaar og kolleger et tosidet mikroskop til spændingsbilleddannelse, der giver dem mulighed for at optage fra næsten alle neuroner i en iglesegmental ganglion22. I modsætning til mange kamerabaserede billeddannelsesmetoder er en fordel ved vores PDA-baserede billeddannelsesmetode hurtig og upartisk spike-sortering af ICA, en form for blind kildeadskillelse, der ikke involverer beslutninger om neuronale grænser for resultatbehandling.
Med hensyn til valget af VSD'er er en fordel ved absorbansfarverne RH155 og RH482 den lille til ingen fototoksicitet, der er forbundet med dem23,24, hvilket muliggør længere optagelsestider end det er typisk for fluorescerende VSD'er. Desuden er de hurtige absorbans-VSD'er, vi bruger, velegnede til registrering af de overshooting somatiske virkningspotentialer i gastropodpræparater, som typisk er 80 mV i amplitude. Som vist i figur 3Gkan vores optiske metode registrere handlingspotentialeundershoots (ingen af vores optagelser er sporgennemsnit): Dette tyder på, at de VSD'er, vi bruger, bør være i stand til at skelne handlingspotentialer i andre modelsystemer, der dæmper til en vis grad og derfor ikke overskrides, når de når soma. Ikke desto mindre er vores optiske tilgang muligvis ikke ideel til arter, der er kendt for at udvise meget svækkede virkningspotentialer, når de registreres i soma.
Meget aktuel forskning på neurale netværk er ved at blive fokuseret på et lille antal designer transgene arter. Neurovidenskab nyder dog godt af undersøgelsen af en bred vifte af fylogentisk forskellige arter. At studere mange forskellige arter giver indsigt i, hvordan kredsløb udvikler sig25,26, og belyser principper for netværksfunktion, der kan være almindelige på tværs af phyla1,2,3,4,27. Vi har hidtil anvendt vores billeddannelse metode til en række gastropod arter, herunder Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (ikke offentliggjorte data) og senest Berghia stephanieae (figur 5). En appel af denne tilgang er, at den let kan anvendes på mange arter uden behov for transgene dyr. Vi ønsker at anerkende, at vores brug af VSD billeddannelse med hurtige absorbans farvestoffer og en PDA følger i fodsporene på banebrydende arbejde, der opnåede dette i semi-intakt, opfører Navanax29 og Aplysia30 præparater. Vores vægt på hurtigheden af vores tilgang er til dels et svar på bekymringer om, at mange efterforskere kan være mere og mere tilbageholdende med at indlede netværksundersøgelser i nye arter på grund af frygt for, at års studier vil være nødvendige for at karakterisere grundlæggende netværksorganisation, før de kan udforske videnskabelige spørgsmål af bred interesse for neurovidenskab31. Derfor er vores mål her at demonstrere en teknik, der i høj grad fremskynder processen - til det punkt, at betydelige samme dag indsigt i netværksorganisation kan opnås fra enkelt forberedelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF 1257923 og NIH 1U01NS10837. Forfatterne ønsker at anerkende Jean Wangs hjælp i laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
| Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
| Digital camera | Optronics | S97808 | |
| Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
| Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
| Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
| Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
| Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
| Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
| Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
| Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
| NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
| Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
| PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
| Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
| Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
| Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
| RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
| RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
| Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
| Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |
References
- Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
- Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
- Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
- Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
- Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
- Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
- Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
- Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
- Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
- Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
- Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
- Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
- Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
- Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
- Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
- Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
- Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
- Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
- Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
- Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
- Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
- Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
- London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
- Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
- Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).
