Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.
Abstract
התפתחות של תכשירים מהונדסים ללא חוליות שבהן ניתן להקליט את הפעילות של קבוצות של נוירונים הניתנים לתמרון עם אור מייצג התקדמות מהפכנית למחקרים של הבסיס העצבי של ההתנהגות. עם זאת, החיסרון של התפתחות זו הוא נטייתה למקד את החוקרים במספר קטן מאוד של אורגניזמים "מעצבים" (למשל, C. elegans ו Drosophila), פוטנציאל להשפיע לרעה על המרדף אחר מחקרים השוואתיים על פני מינים רבים, אשר נדרש לזיהוי עקרונות כלליים של תפקוד הרשת. המאמר הנוכחי ממחיש כיצד הקלטה אופטית עם צבעים רגישים למתח במוחם של מינים גסטרופודיים שאינם מהונדסים יכולה לשמש במהירות (כלומר, במהלך ניסויים בודדים) לחשוף תכונות של הארגון הפונקציונלי של הרשתות העצביות שלהם עם רזולוציה של תא אחד. אנו מתארים בפירוט את שיטות הניתוח, הכתמים וההקלטה המשמשות את המעבדה שלנו כדי להשיג עקבות פוטנציאליים לפעולה מעשרות עד ~ 150 נוירונים במהלך תוכניות מוטוריות רלוונטיות מבחינה התנהגותית במערכת ן של מינים גסטרופוד מרובים, כולל אחד חדש למדעי המוח – nudibranch ברגיה סטפניאה. ההדמיה מתבצעת עם צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודה של 464 אלמנטים שדוגם במהירות של 1,600 פריימים לשנייה, מהר מספיק כדי ללכוד את כל פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי הנוירונים המוקלטים. הקלטות מרובות של מספר דקות ניתן להשיג לכל הכנה עם מעט מאוד אות הלבנת או פוטוטוקסיה. הנתונים האופטיים הגולמיים שנאספו בשיטות המתוארות ניתן לנתח לאחר מכן באמצעות מגוון שיטות מאוירות. ניתן להשתמש בגישה האופטית שלנו לבדיקת פעילות הרשת במגוון מינים לא מהונדסים, מה שהופך אותה להתאמה היטב למחקרים השוואתיים על האופן שבו המוחות מייצרים התנהגות.
Introduction
הפיתוח של קווים מהונדסים של חסרי חוליות כגון Drosophila ו- C. elegans סיפק מערכות חזקות שבהן הבסיסים העצביים של התנהגות עשויים להיחקר אופטית מניפולציה. עם זאת, תכשירים מיוחדים אלה עשויים להיות החיסרון של הפחתת ההתלהבות למחקרי מעגל עצבי של מינים לא מהונדסים, במיוחד לגבי כניסת מינים חדשים למחקר מדעי המוח. התמקדות אך ורק במערכת מודל אחת או שתיים מזיקה לחיפוש אחר עקרונות כלליים של פונקציית הרשת, מכיוון שמחקרים השוואתיים מייצגים מסלול חיוני שבאמצעותו מתגלים עקרונות כאלה1,2,3,4. המטרה שלנו כאן היא להדגים גישה הדמיה בקנה מידה גדול לקבלת תובנה מהירה לתוך המבנה הפונקציונלי של רשתות עצביות gastropod, במאמץ להקל על מחקרים השוואתיים של תפקוד הרשת העצבית.
רכיכות גסטרופוד כגון אפליה, לימנאה, טריטוניה, Pleurobranchaea ואחרים שימשו זמן רב כדי לחקור עקרונות של תפקוד הרשת העצבית, במידה רבה משום שההתנהגויות שלהם מתווכות על ידי נוירונים גדולים, לעתים קרובות לזיהוי אישי הממוקמים על פני השטח של הגרעינים, מהשהופךאותם נגישים בקלות לטכניקות הקלטה 5 . בשנות ה-70 פותחו צבעים רגישים למתח (VSDs) שיכולים להשתלב בקרום הפלזמה, אשר אפשרו עד מהרה את ההקלטות הראשונות ללא אלקטרודה של פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי נוירונים מרובים6. כאן, אנו מדגימים את השימוש שלנו VSDs כדי לבחון את פעילות הרשת במספר מינים של גסטרופודים, כולל אחד חדש למדעי המוח, ברגיה סטפניאה. מכשיר ההדמיה הוא מערך פוטודיודה (PDA) זמין מסחרית של 464 אלמנטים, אשר מדגם ב-1,600 פריימים לשנייה (איור 1),אשר, כאשר משתמשים בו עם VSDs לספיגה מהירה, חושף את פוטנציאל הפעולה של כל הנוירונים המוקלטים7. האותות שנרשמו על ידי כל הדיודות מוצגים מיד לאחר הרכישה ומונחים על גבי תמונה של הגנגליון בתוכנת רכישת מחשב כף היד, מה שמאפשר לחקור נוירונים מעניינים עם אלקטרודות חדות באותה הכנה8,9.
בנתוני מחשב כף היד הגולמיים, דיודות רבות מתעדות באופן יתיר את הנוירונים הגדולים יותר, ורבות מהן מכילות גם אותות מעורבים מתאי עצב מרובים. נקודת מפנה הייתה פיתוח של שיטת מיון ספייק אוטומטית באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי כדי לעבד במהירות כל ערכת נתוני PDA גולמיים של 464 ערוצים לתוך קבוצה חדשה של עקבות, שבה כל נוירון מוקלט מופיע בעקבות נפרדים המכילים רק את פוטנציאל הפעולה שלו10,11.
במאמר זה אנו מתארים את הצעדים החיוניים הכרוכים בהשגת הקלטות פוטנציאליות לפעולה בקנה מידה גדול ממערכות העצבים גסטרופוד עם מערך פוטודיודה ו VSDs ספיגה מהירה. יתר על כן, אנו ממחישים שיטות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאשכולות ומיפוי הנוירונים המתועדים אופטית ביחס להרכבים התפקודיים שלהם, ולאפיון תכונות ברמת האוכלוסייה שלעתים קרובות אינן נראות לעין באמצעות בדיקה פשוטה של עקבות הירי12,13.
Protocol
הערה: זרימת העבודה המתוארת להלן מסוכמת באיור 2.
1. מזער את הרטט
- במידת האפשר, ודא שהאסדה נמצאת בקומת הקרקע, והשתמש בשולחן בידוד מבוסס קפיץ, אשר מעמעם מגוון רחב יותר של תדרי רטט מאשר שולחנות אוויר.
- אם אתה משתמש בטבלה מבוססת קפיץ, ודא שהוא צף (יש להתאים אותו בכל פעם שמוסיפים או מורידים משהו מהשולחן).
- הפחיתו ככל האפשר רעשים מבוססי רטט בחדר ההדמיה, גם במידה של כיבוי זרימת האוויר במהלך ההדמיה במידת הצורך. מזער כל רטט הנובע מערבולת נוזלים במערכות זלוף.
הערה: אסור שההכנה העצבית תזוז במהלך הרכישה. תנועות מכל סוג מייצרות משמרות של קצוות ניגודיות על פני הדיודות, מה שמוביל לאותות חפצים. אם ההליך כרוך גירוי במהלך הרכישה, אסור לו לגרום לתנועת הכנה.
2. הפעל בדיקת חור סיכה כדי לאפשר יישור נכון של תמונות גנגליון עם נתוני מחשב כף היד
- מניחים פיסת רדיד אלומיניום עם 3 חורים קטנים שנתקעו בה במגלשת מיקרוסקופ. צלם תמונה של שלושת החורים עם המצלמה הדיגיטלית המותקנת על נמל הצילום הנוכר שלה.
- באמצעות תוכנת ההדמיה שמגיעה עם מחשב כף היד, לרכוש קובץ קצר (למשל, 5 s). בחלק מהרכישה, הקש על השולחן כדי לגרום לממצאי רטט שיהיו גלויים מאוד סביב קצות חורי הפינה, מה שיאפשר לתמונה של חורי הסיכה להיות מיושרים במדויק עם הנתונים האופטיים.
- השתמש בפונקציה Superimpose בתוכנת ההדמיה, הנמצאת בפריט התפריט "הצג | | העלה עמוד מעקבים על-זמניים עם | תמונה חיצונית על גבי תמונה," כדי לכסות את נתוני הדיודה על התמונה של חורי הסיכה, ולאחר מכן איטרטיבי להתאים את הגדרות x, y והגדלה עבור התמונה עד חורי הסיכה לשבת ישירות על ממצאי חור הסיכה בנתוני הדיודה.
- שמור מספרים אלה כדי ליישר תמונות הכנה שצולמו עם המצלמה עם נתוני הדיודה בניסויים עתידיים.
הערה: יישור חור הפינה של מחשב כף היד צריך להתבצע רק פעם אחת לאחר מחשב כף היד מותקן על המיקרוסקופ, עד שהוא מסתובב או מוסר, אז זה חייב להיעשות שוב.
- שמור מספרים אלה כדי ליישר תמונות הכנה שצולמו עם המצלמה עם נתוני הדיודה בניסויים עתידיים.
3. ניתוחים לשלושה מינים גסטרופוד ימיים
- עבור מינים הגדלים לגודל גדול, כגון טריטוניה ואפליסיה, התחל עם אנשים קטנים יותר, שיש להם גרעינים דקים יותר, אטומים פחות, להקל על קבלת מספיק אור עבור אות לרעש אופטימלי.
- יש מי ים מלאכותיים מסוננים מוכנים לשמש תמיסת מלח עבור ניתוחים וניסויי הדמיה.
הערה: בכל השלבים הבאים של הפרוטוקול, "מלוחים" מציין מי ים מלאכותיים. - פירוק טריטוניה דיומדאה
- מניחים חיה במקרר כ -20 דקות כדי להציק לה.
- עבור בעלי חיים גדולים יותר, לחשוף את המוח על ידי החזקת החיה ביד אחת, לתת את הראש בסופו של וילון מעל האפרף לחשוף את "הצוואר". עבור בעלי חיים קטנים יותר, הצמידו את הצד המגפי שלהם לצלחת ניתוח מצופה שעווה לפני חשיפת המוח.
- באמצעות מספריים ניתוח, לעשות 3-4 ס"מ פירוק קו האמצע בצד גבי של החיה, מעל המסה buccal (אשר ניתן להרגיש דרך דופן הגוף).
הערה: החלק הדרוש של CNS, המורכב מנגולד, גרעינים מוחיים דו-צדדיים ודוושות, הוא כתום ונבדל במראהו מהרקמה שמסביב; הוא שוכן מיד באחורי הקרנף ועל גבי המסה buccal. - Excise את מערכת העצבים המרכזית על ידי ניתוק עצבים אלה innerving הגוף של החיה באמצעות מלקחיים ומספריים microdissection, שמירה על שלמות כל העצבים האלה חיבור הגרעינים המרכזיים. השאירו אורך ארוך של עצב דוושה 3 (PdN3), או איזה עצב יהיה מגורה.
- השתמשו בסיכות מינוטין כדי להצמיד את כלי ה- CNS לתחתית צלחת מצופה אלסטומר ממולאת מלוחים לניתוח נוסף. שמור על טמפרטורת ההכנה ב 11 °C (50 °F) על ידי זלוף המנה עם מלוחים נמסר עם משוב, בשורה מערכת קירור Peltier באמצעות משאבה peristaltic.
- באמצעות מלקחיים ומספריים microdissection, להסיר בזהירות את השכבה דבקה רופף של רקמת החיבור מסביב ל- CNS. השאר את הנדן העדין צמוד לגרעע.
- בקצרה (~ 10 s) לטבול את הגרעינים בתמיסה של 0.5% גלוטרדהיד מלוחים. מחזירים את הגרעינים לצלחת מצופה אלסטומר, ומאפשרים לתחמן לשטוף את הגלוטרלדהיד לפני תחילת הכתמת ה-VSD.
הערה: תיקון אור זה של רקמת החיבור והשרירים המהותיים שלה יסייעו במניעת תנועה במהלך ההדמיה.
- ביתור של אפליה קליפורניקה
- מרדים כ 40 גרם בעלי חיים על ידי הזרקת ~ 20 מ"ל של 350 mM MgCl2 לתוך הגוף דרך פני השטח הגחון (רגל).
- השתמשו בסיכות כדי למקם את הצד הגחוני של בעלי החיים בצלחת ניתוח מרופד בשעווה.
- באמצעות מספריים דיסקציה, לבצע 2-3 ס"מ חותך קו האמצע לאורך ההיקף החלקירי ביותר של כף הרגל. הצמידו את מדפים כף הרגל משני צדי החתכים כדי לחשוף חלק מ- CNS ומסת buccal.
הערה: החלק הדרוש של CNS, המורכב גרעינים מוחיים מותכים, ו apposed מקרוב, pleural דו צדדי גרעיני דוושה, הוא צהוב-כתום ונבדל במראה מן הרקמה שמסביב; הוא יושב אחורי ו posterolateral למסה buccal שרירי הנפוח. - השתמש במלקחיים ומספריים כדי לנתח בזהירות את המסה buccal, חושף את הגרעינים המוחיים.
- Excise את מערכת העצבים המרכזית על ידי ניתוק עצבים אלה innerving הגוף של החיה באמצעות מלקחיים ומספריים microdissection, שמירה על שלמות כל העצבים האלה חיבור הגרעינים המרכזיים. השאירו אורך ארוך של עצב דוושה 9 (PdN9), או איזה עצב יהיה מגורה.
- השתמשו בסיכות מינוטין כדי למקם את כלי הערך בצלחת אלסטומר ממולאת מלוחים. לשמור על טמפרטורת ההכנה ב 15-16 °C (5 °F) על ידי זלוף המנה עם תמיסת מלח עובר דרך מכשיר קירור פלטייה.
- באמצעות מלקחיים ומספריים microdissection, להסיר רקמת חיבור מוגזמת מן מערכת רה"מ, ולנתח חלק שטחי של הנדן על גנגליון או גרעינים להיות בתמונה. היזהר במהלך תהליך זה לא לעשות חור במעטפת, אשר יגרום נוירונים נשפך מבפנים.
- בקצרה (~ 20 s) לטבול את הגרעינים בתמיסה של 0.5% גלוטרלדהיד מלוחים. מחזירים את הגרעינים לצלחת מצופה אלסטומר, ומאפשרים לתחמן לשטוף את הגלוטרלדהיד לפני תחילת הכתמת ה-VSD.
- ניתח ברגיה סטפניאה
- מניחים חיה במקרר כ -20 דקות כדי להציק לה.
- בעזרת מנה מרופד אלסטומר מלאה מלוחים בטמפרטורת החדר, מניחים סיכות מינוטין בראש ובזנב.
- באמצעות מספריים microdissection, להפוך 5-7 מ"מ פירוק געש שטחי מערכת רה"מ מערכת רה"מ.
הערה: העיניים, כתמים כהים ההתגוררים בתוך החיה ליד CNS, לסמן בנוחות את המיקום של חלק נחוץ CNS, אשר מורכב צוואר הרחם מותך דו-צדדית גרעינים דוושות ויושב על גבי המסה buccal. - Excise את CNS על ידי ניתוק עצבים אלה innerving הגוף של החיה באמצעות מלקחיים ומספריים microdissection. השאירו כל עצב מגורה מספיק זמן לאלקטרודה יניקה.
4. מכתימים את ההכנה בצבע רגיש למתח
- הכן פתרונות מלאי של RH155 (הידוע גם בשם NK3041) או RH482 (הידוע גם בשם NK3630 או JPW1132).
- RH155: להמיס 5.4 מ"ג של צבע מוצק ב 1 מ"ל של 100% EtOH, צינור 29 μL לתוך כל אחד 34 צינורות microcentrifuge. עם התוכן של כל צינור חשוף לאוויר, לתת להם להתייבש לילה בחושך. לכסות ולהניח את aliquots מוצק וכתוצאה מכך של RH155, כל אחד המכיל 0.15 מ"ג, במקפיא -20 °C ..
- RH482: להמיס 2 מ"ג של צבע מוצק ב 100 μL של DMSO, לחלק את הפתרון לתוך 20 aliquots של 5 μL, כל אחד מכיל 0.1 מ"ג של RH482, ולאחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור טריטוניה ו Aplysia, או זלוף אמבטיה או יישום לחץ עשוי לשמש כדי לטעון את VSD RH155 לתוך הממברנות של הנוירונים בהכנה. יישום לחץ יש את היתרון של חשיפת רק גנגליון להיות בתמונה VSD.
- עבור זלוף אמבטיה, להוסיף 5 מ"ל של תמיסת מלח לכל אחד משני aliquots לעיל של RH155 מוצק מערבולת לתוך פתרון, לייצר פתרון משולב של 10 מ"ל המכיל 0.03 מ"ג / מ"ל RH155.
- לשוטט בחושך (כדי למנוע צילומים) עבור 1 עד 1.5 שעות ב 11 °C (70 °F) עבור טריטוניה וב 16 °C (70 °F) עבור אפלזיה. שמור על הטמפרטורה על ידי העברת פתרון זלוף דרך מערכת קירור פלטייה.
- ליישום לחץ, להוסיף 500 תמיסת מלח μL אחד aliquot של RH155, ומערבולת כדי לייצר ריכוז צבע של 0.3 מ"ג / מ"ל.
- צייר כ 200 μL של הפתרון לתוך צינורות פוליאתילן באמצעות microdispenser כף יד, להבטיח כי יש התאמה טובה בין קוטר הצינור ואת הקוטר של הגנגליון להיות מוכתם.
- השתמש micromanipulator למקם בזהירות את קצה הצינור מעל גנגליון היעד, מוריד אותו עד שהוא יוצר חותם נוח על הגנגליון. השתמש בסוג מערכת הקירור המתוארת לעיל כדי לשמור על הגרעינים בטמפרטורה הרצויה.
- עמעמו את אורות החדר כדי להימנע מהלבנת תמונות וסובבו את ידית אפליקטור המיקרודיספנסר כל 5 דקות כדי לכפות יותר צבע על הגנגליון.
- בדוק בשעה 30 דקות כדי לאשר כי כתמים טובים מתרחשים, ולאחר מכן להמשיך במשך זמן הכתמים הכולל של כ 1 שעה.
- להכתמה בברגהיה, הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת מלח לאליקוט קפוא של RH482, ומערבולת להתמוסס.
- העבר 200 μL של פתרון זה לתוך צינור microcentrifuge המכיל 800 μL של תמיסת מלח ומערבולת לפתרון, לייצר פתרון מכתים סופי של 0.02 מ"ג / מיליליטר RH482 מלוחים עם 0.1% DMSO.
- מניחים את מערכת ן העניין כולה לתוך צינור microcentrifuge, עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום כדי למנוע לייעוד תמונות, וללחוץ ביד כל 5-6 דקות במשך כ 1 שעה. יש לאחסן את 800 ה-μL הנותרים של הפתרון הראשון במקרר, ולהשתמש עד 3 ימים כדי להכתים את ההכנות הבאות.
5. לשטח את ההכנה ולהגדיר לגירוי עצבי
הערה: השלבים בסעיף זה צריכים להתבצע תחת תאורה מינימלית או עם אור ירוק כדי למזער את ההלבנה.
- לאחר הכתמים, לטבול את CNS מלוחים בתוך תא ההדמיה ומניחים תחת מיקרוסקופ ניתוח.
- מניחים חתיכות סיליקון (עבור טריטוניה או אפליה)או כתמים של ג'לי נפט (עבור ברגיה)משמאל ומימין לגנגליון / גרעינים להצטוות.
- לחץ על חתיכה בגודל המתאים של או מכסה פלסטיק כלפי מטה על ההכנה כדי לשטח אותו. לחץ בחוזקה אבל לא כל כך קשה כמו לפגוע בנוירונים.
הערה: שיטוח פני השטח הקומרים של ההכנה באופן זה יהפוך מספר גדול יותר של נוירונים parfocal, ובכך להגדיל את מספר הנוירונים שנרשמו, ויתרה מכך יעזור לשתק את ההכנה במהלך הדמיה. - אם מגרה עצב כדי לעורר תוכנית מנוע פיקטיבי, להכין אלקטרודה יניקה שקצה קדמי שלה הוא בערך רחב כמו קוטר העצבים. השג זאת על ידי המסה זהירה של קטע של צינורות פוליאתילן PE-100 מעל להבה תוך משיכה עדינה בשני קצות קטע הצינורות ולאחר מכן חיתוך להתחדד המתקבל בנקודה הרצויה.
- צייר נפח קטן של תמיסת מלח דרך הקצה המחודד של אלקטרודה יניקה פוליאתילן, ואחריו את קצה העצב להיות מגורה, על ידי חיבור אורך של עבה דופן, צינורות פולימר גמישים לקצה האחורי של האלקטרודה ושימוש בשאיבה בפה כדי להפעיל לחץ שלילי.
- אשר כי מלוחים באלקטרודה חסר בועות שעלולות להפריע להולכת חשמל.
6. הכנה ואופטימיזציה להדמיה
- העבר את התא לאסדת ההדמיה. התחל את זלוף מלוחים דרך תא ההקלטה והניח את בדיקת הטמפרטורה ליד ההכנה. הגדר את בקר הטמפרטורה עבור הטמפרטורה הרצויה עבור המינים להיות בתמונה (עבור טריטוניה, 11 °C (5 °F), עבור אפליה, 15-16 °C (5 °F), או עבור ברגיה, 26-27 °C (7 °F).
- מניחים חוט כסף כלורי אחד במורד אלקטרודה היניקה, מוודאים שהוא יוצר קשר עם המלח באלקטרודה, ומכניסים את חוט Ag-AgCl האחר (נתיב החזרה) לתחכוך האמבטיה, ליד אלקטרודה היניקה.
- מנמיכים את עדשת טבילת המים לתוך תמיסת מלח. סגור את הסרעפת הבסיסית ולאחר מכן הרם או הנמך את המדחה של תת-הבמה והתאם את המוקד עד שקצוות הסרעפת נמצאים במוקד חד, מה שיוצר תאורת קולר.
- התמקד באזור ההכנה להתמונה. הטיה המתמקדת בנוירונים קטנים יותר על פני גדולים יותר, שכן אותות אופטיים שמקורם בנוירונים גדולים יותר נוטים יותר מאשר נוירונים קטנים יותר להירשם גם אם הם מעט מחוץ לפוקוס.
- צלם תמונה של הגנגליון כדי להצטלם עם המצלמה הדיגיטלית parfocal.
- עם מתג הרווח של לוח הבקרה מוגדר ל- 1x, בדוק את עוצמת האור המנוחה (RLI) בתוכנת ההדמיה על-ידי לחיצה על כפתור "RLI"ובדיקת RLI הממוצע של הדיודות. התאם את רמת המתח שנשלח ממריץ לאספקת החשמל של מנורת ה- LED והמשיך לבדוק את רמת ה- RLI הממוצעת עד שהיא נמצאת בטווח הרצוי (בדרך כלל סביב 3-4 V).
הערה: RLIs גבוה, המתאים כ 3-4 V על מחשב כף היד, רצויים. ככל שהאור גבוה יותר, כך יחס האות לרעש טוב יותר של האותות האופטיים, עם זאת, יש לאזן זאת מול קצב מהיר יותר של לייביס ב- RLIs גבוהים יותר. סיכון זה ממוזער באמצעות עדשות אובייקטיביות בעלות NA גבוה. עדשות המטרה טבילת מים בשימוש הן 10x/ 0.6 NA, 20x / 0.95 NA, 40x / 0.8 NA, ו 40x / 1.15 NA.
- הגדר את מתג ההשגה של לוח הבקרה ל- 100x עבור ההקלטה.
- אם מגרה עצב, הגדר את המתח, התדירות ומשך הזמן הרצויים על ממריץ נפרד מזה המשמש להגדיר את רמת האור. ודא כי הפעלת TTL בין לוח הבקרה לבין הממריץ מוגדרת כראוי.
הערה: פרמטרים גירוי עצבי מדגם בכל מין הם כדלקמן: Tritonia PdN3, 2 s, 10 הרץ פולס רכבת של 5 אלפיות השנייה, פולסים 10 V; אפלזיה PdN9, 2.5 s, 20 הרץ דופק רכבת של 5 אלפיות שני, פולסים 8 V; עצב דוושת ברגיה, 2 שניות, 10 הרץ רכבת דופק של 5 אלפיות שני, פולסים V 5. - בדוק שוב ששולחן האביב או האוויר צף.
7. הקלטה אופטית
- כבה או עמעם את אורות החדר, כולל תאורה פלואורסצנטית תקורה.
- הגדר את משך הקובץ הרצוי, את הנתיב ואת שם הקובץ ולאחר מכן לחץ על לחצן "קח נתונים" בתוכנת ההדמיה כדי להשיג קבצים עד לקיבולת ה- RAM הזמין של המחשב. הישארו דוממים במהלך ההקלטה האופטית, שכן תנודות קטנות יכולות להכניס חפצים גדולים לנתוני ההקלטה האופטיים.
הערה: עבור רכישות שיחרגו מ- RAM הזמין של המחשב, תוכנית רכישה C++ בהתאמה אישית זמינה באמצעות ד"ר ג'יאן-יאנג וו מאוניברסיטת ג'ורג'טאון. - כדי להציג נתונים מיד לאחר הרכישה, השתמש בפונקציה Superimpose בתוכנת ההדמיה כדי להחליף את הנתונים שנאספו על ידי כל 464 הדיודות מעל התמונה של הגנגליון שצולם מוקדם יותר של ההכנה7. לחץ על כל הדיודות המיוצגות בתוכנה כדי להרחיב את מה שהם הקליטו על מסך מעקב נפרד.
- השג יישור מדויק של הדיודות ביחס להכנה על-ידי הזנת גורמי x, Y והגדלה כפי שנקבע בעבר על-ידי מבחן חור הסיכה.
- כדי למקסם את הנראות הפוטנציאלית של הפעולה ולשפר את תפוקת הנוירונים עבור מיון ספייק14עוקב , להטיל מסנן Bandpass Butterworth עם ניתוקים של 5 הרץ ו-100 הרץ (זמינים בתוכנת הדמיה) כדי להסיר רעשים בתדר נמוך וגבוה כאחד.
- כדי לשמור נתונים אופטיים מסוננים כקובץ טקסט לניתוח נוסף בפלטפורמת מחשוב מדעית, בחר תחילה בתיבה "מסנן TP" ממש מתחת למסך "דף" בתוכנת ההדמיה. לאחר מכן, בחר באפשרות "שמור דף כ- ASCII" מהכרטיסיה "פלט" והזן את שם הקובץ הרצוי בתיבת הדו-שיח שמופיעה.
Representative Results
טריטוניה
מגע עור עם טורף כוכב הים מפעיל את השחייה המילוט של טריטוניה דיומדאה, המורכבת מסדרה קצבית של כיפופי גוף שלמים המניעים אותו למקום מבטחים(איור 3A). בהכנות מוח מבודדות, גירוי קצר לעצב דוושה 3 (PdN3) מעורר את תוכנית מנוע השחייה הקצבית (SMP) להתנהגות זו, הניתנת לזיהוי בקלות בהקלטות אופטיות מגנגרי הדוושה. איור 3B מתאר את הפריסה של ניסוי הדמיה VSD שנועד לתעד את פעילות הירי של נוירונים על פני השטח הגביים של גנגליון דוושת טריטוניה השמאלית, שעליה הוצב מחשב כף היד, כגירוי ל- PdN3 הנגדי (מימין) מעורר את ה- SMP. נתונים גולמיים ומסוננים (מסנן Bandpass Butterworth, ניתוקים של 5 ו-100 הרץ) מ-20 דיודות הקלטה לפני, במהלך ואחרי גירוי של PdN3 מוצגים באיורים 3C, D בהתאמה. הגירוי העצבי הועבר 20 s לתוך קובץ 2 דקות. מיד לאחר הרכישה, ניתן להציג את האותות הנמדדים על ידי כל 464 הדיודות של מערך ההקלטות על גבי תמונה של ההכנה בתוכנת ההדמיה (איור 3E). בשלב זה, עקבות רבים מכילים קוצים שנרשמו באופן מיותר מאותם נוירונים, וכמה עקבות מכילים קוצים מיותר נוירון אחד. מיון ספייק של עקבות הדיודה המסוננים עם ICA הניב 53 עקבות עצביות ייחודיות, 30 מהן מוצגות באיור 3F. ניתן להעריך את הקינטיקה של קוצים בודדים באיור 3G, המרחיב קטע של ארבעה עקבות מאיור 3F (תיבה אדומה); הדיוק של אלגוריתם מיון ספייק ICA אומת בעבר באמצעות הקלטות אלקטרודה חדות בו זמנית, אשר הראו כי כל קוצים בעקבות ממוינים תואמים קוצים מוקלטים תאית נוירונים בודדים11,14.
אפלזיה
גירוי זנב מרתיע מאוד לאפליסיה californica מעורר תגובת בריחה קצבית סטריאוטיפית בת שני חלקים15. השלב הראשון של התגובה הוא דהירה של כמה מחזורים של ריאות ראש ומשיכות זנב שמזיזות את החיה במהירות קדימה. זה בדרך כלל מלווה בתקופה של זחילה, הכוללת גלים חוזרים ונשנים של התכווצויות שרירים ראש-זנב המניעים את החיה קדימה במהירות איטית יותר במשך מספר דקות(איור 4A). כדי ללכוד את תוכניות מנוע הבריחה האלה בהקלטות אופטיות, מחשב כף היד התמקד במשטח הגנגליון הימני של הגנגליון הימני של הדוושה בהכנה מוחית מבודדת, ואלקטרודה יניקה הונחה על עצב הדוושה contralateral (שמאל) 9 (PdN9; איור 4ב. דקה אחת לתוך הקלטה אופטית רציפה של 20 דקות(איור 4C),PdN9 היה מגורה כדי לעורר את רצף תוכנית מנוע זחילת הדהירה. ההפצות המרחביות הגאוסיות הטעונות של האותות מכל 81 הנוירונים המתועדים מופו על גבי הגנגליון(איור 4D). הפחתת ממדיות החלה על ההקלטה המלאה גילתה כי שלבי הדהירה (ציאן) והסריקה (כחול כהה) של תוכנית הבריחה כבשו אזורים נפרדים ויצרו מסלולים שונים, דמויי ספירלה ולולאה, בהתאמה, בחלל הרכיבים העיקרי (איור 4E).
שלושה סרטונים המבוססים על ההקלטה של אפליה המתוארת באיור 4 מדגימים סוגים נוספים של ניתוחים שניתן לבצע בערכות נתונים כאלה. וידאו 1 מדמיין את הירי של כל הנוירונים המוקלטים לאורך כל ההקלטה. התקופה הראשונית שלאחר הגירוי של תוכנית מנוע הבריחה התאפיינה בדהירה, שבה הפעילות בגנגליון התאפיינה בהתפרצות מתחלפת של אשכולות פונקציונליים שונים(וידאו 2). הדהירה עברה לאחר מכן לזחילה, שבה הפעילות על פני אשכולות עצביים נותרה פאזית באופן רחב אך הניחה מסלול סיבובי נגד כיוון השעון בגנגליון(וידאו 3). שני הסרטונים האחרונים משלבים גם קיבוץ קונצנזוס, החושף את הירי והמיקומים של ההרכבים הפונקציונליים השונים לשלבי הדהירה והסריקה של תגובת הבריחה בנפרד. שים לב כי נוירונים רבים שהוקצו לאותו אשכול הן בשלבי הדהירה והן בשלבי הזחילה הראו קרבה פיזית זה לזה בגנגליון, בהתאם לממצאים קודמים12.
ברגיה
האיאוליד נודיברנץ' ברגיה סטפניאה (איור 5A)מייצג מערכת מודלים חדשה למדעי המוח. מערך ההדמיה לניסוי טיפוסי בברגהיה מוצג באיור 5B. כדי לעורר פעילות עצבית רחבת היקף, אלקטרודה יניקה הונחה על עצב הדוושה השמאלי הבולט ביותר, וגירוי עצבי הועבר 30 s לתוך הקלטה של 2 דקות. עקבות מעובדות של ICA חשפו פעילות ספונטנית ומעוררת גירויים ב-55 נוירונים(איור 5C). זיהוי הקהילה באמצעות קיבוץ קונצנזוס זיהה עשרה הרכבים פונקציונליים נפרדים, המתוארים באיור 5D בגרף רשת ובאיור 5E, המארגן מחדש את העקבות המוצגות באיור 5C בהתבסס על משימות ההקבצות שלהם. ההפצות הגאוסיות של האותות מכל הנוירונים המוקלטים מועלות על גבי תמונה של ההכנה באיור 5F כדי לציין את מיקומם של כל 55 הנוירונים המוקלטים.
איור 1: תצוגות של מערך ההדמיה האופטי ומערך הפוטודיודה (PDA). (A)אסדת ההדמיה האופטית, הכוללת את מחשב כף היד, המצלמה הדיגיטלית, המיקרוסקופ והבמה. (B)העיצוב הפנימי של מחשב כף היד, שבו סיבים אופטיים מחברים את צמצם ההדמיה ל-464 פוטודיודות. שורה של מגפים ממוקמת מעל פוטודיודות. (C)הפנים המשושה של צמצם ההדמיה, שאליו מתמקד האזור המצולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים זרימה הממחיש את זרימת העבודה החיונית בהשגת הקלטות אופטיות. השלבים החיוניים בפרוטוקול הדמיית VSD, החל מהפעלה והכתמה ועד לפרטי ההדמיה, מתוארים בתרשים זרימה זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות של טריטוניה דיומדאה, הממחישות נתונים גולמיים, אדנוןוסייק. (א) טריטוניה בורחת מכוכב הים הטורף פיקנופודיה הלינטודידים דרך השחייה שלה, המורכבת מכיפופים גב וגחוניים לסירוגין של הגוף. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = אונה מוחית של גנגליון המוח; Pl = אונה pleural של גנגליון המוח; Pd = גנגליון דוושות. (C)נתונים גולמיים מ -20 פוטודיודות, המציגים פעילות בגנגליון הדוושה השמאלי לגירוי של PdN3 הנגדי (גירוי המצוין על ידי החץ). (D)נתונים מסוננים מאותן דיודות כמו ב- C (מסנן באטרוורת' של 5 ו- 100 הרץ). (E)פלט תוכנת הדמיה שבו עקבות דחוסים שנאספו על ידי כל 464 הדיודות מוחלפים על גבי תמונה של ההכנה. מיקומן של 20 הדיודות שעקבותיהן מוצגות ב- C ו- D מסומנות באדום. (F)שלושים עקבות נוירון יחיד נבחר שנוצרו על ידי מיון ספייק באמצעות ICA. (G)תצוגה מורחבת של ארבעה עקבות נוירון יחיד, המתאימים לתיבה האדומה ב- F, מציגה את פוטנציאל הפעולה שלהם ברזולוציה זמנית גבוהה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות אפליה קליפורניקה, הממחישות הקלטה ארוכת טווח, מיפוי אותות והפחתת ממדים. (א)שני השלבים של תוכנית מנוע הבריחה הרציף של אפליה, הדהירה והסריקה. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = גנגליון מוחי; Pl = גנגליון pleural; Pd = גנגליון דוושות. (C)הקלטה של 20 דקות של 81 נוירונים בגנגליון הדוושה הימני מגיב לגירוי ל- PdN9 הנגדי (המצוין על ידי החץ). פסים ירוקים, ציאן וכחול כהה מתחת לעקבות מציינים את תקופת טרום הגירוי, את הדהירה ואת שלבי הסריקה של תוכנית מנוע הבריחה, בהתאמה. (D)תמונה של ההכנה עם הפצות גאוסיות נאיביליות ממופות של המיקומים של כל 81 מקורות האות העצביים שזוהו על ידי ICA. המתווה הירוק מייצג את המיקום של הפנים המשושה של מחשב כף היד ביחס לגנגליון. המספרים על כל גאוסיאן תואמים למספרי המעקב ב- C. (ה)הפחתת ממדיות באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים המתווה את שלושת הרכיבים העיקריים הראשונים זה נגד זה במהלך קובץ 20 הדקות. תקופות הבסיס, הדהירה והזחילה שלפני גירוי מוצגות בירוק, ציאן וכחול כהה, בהתאמה. ראה קטעי וידאו 1-3 עבור אנימציות של ירי עצבי המתאים להקלטה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות ברגיה סטפניאה, מין חדש למדעי המוח, הממחיש גרפים ברשת, קיבוץ פונקציונליומיפוי אותות דו-צדדיים. (א) דגימת ברגיה. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = אונה מוחית של גנגליון המוח; Pl = אונה pleural של גנגליון המוח; Pd = גנגליון דוושות; קרנף = גנגליון קרנף. (C)עקבות המציגים את הפעילות הספונטנית והמעוררת גירוי של 55 נוירונים דו-צדדיים בגרעפי המוח (אספקת הגירוי מסומנת על ידי החץ). (D)גרף רשת המציג את עשרת ההרכבים הפונקציונליים, שלכל אחד מהם מוקצה צבע ייחודי, שזוהה באמצעות קיבוץ באשכולות. צמתים בעלילה זו מייצגים נוירונים, כאשר המרחק במרחב הרשת מייצג את מידת מתאם הירי בתוך ובין הרכבים. (E)העקבות ב- C מסודרות מחדש ומקודדות בצבע (בהתאם לסכימת הצבעים של D) להרכבים פונקציונליים. (ו)תמונה של ההכנה המציגה את מיקומי האותות הממופים מכל נוירון מוקלט, ואת מספרי המעקב ב- C ו- E שאליהם הם תואמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: אנימציה של תוכנית הלוקומוטור המלאה של אפליה בת 20 הדקות . האטימות של הצורות הלבנות מעל 81 נוירונים בודדים בגנגליון הדוושה הימני (פאנל שמאלי) הונעה על ידי עקבות עצביים מתאימים (פאנל ימני) ומגוונת באופן ליניארי כפונקציה של שיעור ספייק ממוצע (binned לכל 0.61 s של זמן אמת בהקלטה). עבור כל נוירון, אטימות מלאה נוטרשה לקצב הירי המרבי שלה לאורך זמן ההקלטה. שנייה אחת של הזמן שחלף בסרטון מייצגת 12.2 שניות של זמן אמת. סרגל קנה המידה מתאים לזמן אמת, כאשר הקווים הירוקים, הציאן והכחול הכהה מתחת לעקבות המציינים את שלבי הבסיס, הדהירה והסריקה שלפני הגירוי של תוכנית ה- locomotor escape, בהתאמה. התיבות הצהובות סביב שלב הדהירה וחלק משלב הסריקה מציינים את קטעים הקלטה המשמשים ליצירת ההנפשות בסרטונים 2 ו - 3. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)
וידאו 2: אנימציה של שלב הדהירה של תוכנית locomotor לברוח אפליה. קיבוץ קונצנזוס בוצע על כל 81 הנוירונים המוקלטים רק בשלב הדהירה של תוכנית המנוע כדי להפיק את ההרכבים הפונקציונליים, באמצעות הגישה והתוכנה המתוארות והופכות לזמינות בנציג12. הרכבים עצביים המציגים בעיקר טוניק או דפוסי ירי לא סדירים במהלך שלב זה של תוכנית הבריחה הושמטו מסרטון זה. את פוטנציאל הפעולה של הנוירונים השייכים להרכבים השחורים וירוקי הזית ניתן לשמוע ברצועת השמע של הווידאו, כאשר הנוירונים והשעקבות המתאימים מודגשים. שיעורי היתד הממוצעים נוטרו את הנורמליזציה כמו בסרטון 1 ועם ביננינג זמן שווה; 1 s של זמן שחלף בסרטון מתאים 6.1 s של זמן אמת. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)
וידאו 3: אנימציה של שלב הסריקה של תוכנית locomotor לברוח אפליה. קיבוץ קונצנזוס בוצע על כל 81 הנוירונים המוקלטים רק בשלב הזחילה של תוכנית המנוע כדי להפיק את ההרכבים הפונקציונליים. הרכבים המציגים בעיקר טוניק או דפוסי ירי לא סדירים בשלב זה של תוכנית המנוע הושמטו מסרטון זה. שיעורי העלייה הממוצעת נוטרו כמו בסרטונים 1 ו-2 ועם ביננינג זמן שווה; 1 s של זמן שחלף בסרטון מתאים כ 12.2 s של זמן אמת. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)
Discussion
אחד הפרטים החשובים ביותר ביישום גישת הדמיית VSD בקנה מידה גדול שלנו הוא למזער רטט, אשר מייצר תנועות של קצוות ניגודיות על פני הדיודות, וכתוצאה מכך אותות חפצים גדולים. מכיוון ש-VSDs של ספיגה מייצרים שינויים באחוזים קטנים מאוד בעוצמת האור עם פוטנציאל פעולה, ממצאי רטט, אם לא נמנעים, יכולים לטשטש את אותות העניין העצביים. אנו משתמשים במספר שיטות כדי למזער חפצי רטט. ראשית, חדר ההדמיה שלנו ממוקם בקומת הקרקע, אשר מבודד את ההכנה מרעידות הקשורות לבניית ציוד לטיפול באוויר ומקורות רבים אחרים. שנית, נעשה שימוש בטבלת בידוד מבוססת קפיץ, אשר משתמשי PDA אחרים אישרו מספקת שיכוך רטט טוב יותר מאשר שולחן האוויר הנפוץ יותר16. שלישית, נעשה שימוש במטרות טבילת מים, אשר מבטלות תנודות תמונה הנובעות מאדוות פני השטח. רביעית, ההכנה המצולמת נלחצה קלות בין מכסה התא התחתון לבין שבר כיסוי לחוץ מלמעלה המוחזק במקום על ידי תקעים סיליקון או ג'לי נפט, עוד יותר מייצב את ההכנה. זה גם משטח את פני השטח הקומורים של הגנגליון או הגרעינים להיות בתמונה, וכתוצאה מכך נוירונים יותר במישור של המוקד של המטרה, אשר מגדיל את מספר הנוירונים שתועדו.
כדי למקסם את יחס האות לרעש עבור השינויים הקטנים מאוד במידת ספיגת אור VSD הנובעים מפוטנציאל פעולה, חיוני להשיג אור כמעט רווי באמצעות ההכנה ל- PDA, ובמקביל למזער את ההלבנה של הצבע. כדי לכך, אנו עובדים בדרך כלל ב 3-4 V של עוצמת אור במנוחה, כפי שנמדד עם מתג רווח לוח הבקרה של מחשב כף היד במיקום 1x (464 המגברים של מחשב כף היד רוויים ב 10 V של אור). במהלך רכישת נתונים גורם רווח זה משתנה ל- 100x. קבלת מספיק אור כדי להגיע 3-4 V כפי שנמדד על ידי מחשב כף היד יכול להתבצע במספר דרכים. ראשית, השתמש במקור תאורת LED אולטרה-רייט המספק אורך גל המתאים למאפייני הספיגה של צבע הספיגה בשימוש. בהתאם לכך, נעשה שימוש במנורה קולימת LED 735-nm, החופפת לאורכי הגל האופטימליים של RH155 ו- RH482. שנית, במידת הצורך, השתמש במכנס תת-הבמה ההפוך שמרכז את האור ממקור תאורת ה-LED לאזור קטן יותר. שלישית, כווננו את גובה המעיבוי כדי להשיג תאורת קולר, המבטיקה בהירות גבוהה, אפילו לאיכות תמונה מרבית. רביעית, ודא שאין מסנני חום במסלול האופטי, שיכולים להחליק את אורך הגל של מנורת ה- LED 735 ננומטר. חמישית, להסיר מפזר, אם יש צורך יותר אור, מן המסלול האופטי. שישית, השתמש במטרות NA גבוהות, המספקות רזולוציה מרחבית גבוהה, ומאפשרות רמות מספיקות של אור כדי להגיע מחשב כף היד בעוצמות מנורה נמוכות יותר. זה איפשר לנו למזער את ההלבנה עד כדי כך שנוכל להשיג מספר קבצי רכישה של משך של 10-20 דקות לכל הכנה באמצעות אותה עוצמת אור בכל הקבצים וללא אובדן משמעותי של משרעת האות או הצורך בהכתמה מחדש. באופן מכריע, אם הנסיין רוצה לעקוב אחר נוירונים על פני קבצים ארוכים אלה, להבטיח כי מישור המוקד אינו משתנה, וכי ההכנה אינה זזה. לבסוף, דרך נוספת לנתב מספיק אור אל מחשב כף היד היא להשתמש בבעלי חיים צעירים יותר, שיש להם גרעים דקים יותר, ולכן פחות אטומים.
מעת לעת אנו מוצאים כי יחס האות לרעש של האותות האופטיים מתדרדר ו / או מקצבי תוכנית המנוע הם תת-אופטימליים (למשל, איטיים או לא תקינים). כאשר זה מתחיל להתרחש באופן עקבי, אנו מערבבים פתרונות טריים של VSD. Aliquots של VSD בדרך כלל להישאר קיימא במשך כ 6 חודשים במקפיא -20 °C .. בהקשר זה, ראוי לציין כי עבור ברגיה, התוצאות הטובות ביותר הושגו עד כה עם ספיגה VSD RH482. כמו RH482 הוא ליפופילי יותר מאשר RH155, זה עשוי להכתים טוב יותר את הנוירונים הקטנים יחסית של ברגיה או להישאר בממברנות העצביות בצורה יעילה יותר בטמפרטורת המלח הקלטה גבוהה יותר המשמשת למין טרופיזה.
מגבלה אחת של הדמיה מבוססת PDA של פעילות עצבית מתייחסת צימוד AC של אותות המתח בחומרה לפני שלב ההפללה מראש 100x: למרות שזה מייצג תכונה הכרחית כדי להסיר את היסט DC הגדול המיוצר על ידי רמת האור במנוחה גבוהה הנדרשת על ידי טכניקה זו, צימוד AC מהותי PDA מונע את מדידת שינויים איטיים בפוטנציאל הממברנה, כגון אלה המשויכים לכניסות סינפטיות. אם יש צורך בהקלטת שינויים פוטנציאליים איטיים או יציבים, ניתן להשתמש במערכת הדמיית מצלמות CMOS מצמיד DC כדי ללכוד פעילות תת-קרקעית. ביירן ועמיתיו השתמשו לאחרונה במערך כזה עם RH155 כדי לדמיין את הפעילות של נוירונים בגנגליון buccal של אפלזיה17,18. השתמשנו בשתי המערכות ומצאנו כי מצלמת CMOS, בשל צפיפות הגלאים הגבוהה בהרבה שלה (128 x 128), מייצרת קבצי נתונים גדולים פי 50 לאותו זמן הדמיה7. הקבצים הקטנים יותר של מחשב כף היד מאפשרים עיבוד וניתוח מהירים יותר. זה גם מאפשר הקלטות ניסיון יחיד מורחבות (איור 4) ומחקרים של למידה, שבהם נתונים מניסויים מרובים ממוסמרים לקובץ אחד גדול לפני מיון ספייק, ומאפשר ארגון רשת להיות במעקב כמולמידה מתפתחת 19.
בחקירות אחרות המבוססות על מצלמה, VSDs פלואורסצנטי שימשו את קריסטן ועמיתיו כדי לבחון את תפקוד הרשת בגרעינים המגזריים של העלוקה. במחקר משפיע אחד זה הוביל לזיהוי של נוירון המעורב בהחלטה של החיה לשחות או לזחול20. במחקר אחר, קריסטן ואח ' בחנו את המידה שבה התנהגויות השחייה והזחילה של העלוקה מונעות על ידי מעגלים רב תכליתיים לעומת מעגלים ייעודיים21. לאחרונה, Wagenaar ועמיתיו השתמשו במיקרוסקופ דו-צדדי להדמיית מתח המאפשר להם להקליט כמעט מכל הנוירונים בגנגליון מגזרי עלוקה22. בניגוד לשיטות הדמיה רבות המבוססות על מצלמה, יתרון שיטת ההדמיה מבוססת ה-PDA שלנו הוא מיון ספייק מהיר ובלתי משוחד על ידי ICA, צורה של הפרדת מקור עיוורת שלא כוללת החלטות לגבי גבולות עצביים לעיבוד תוצאות.
לגבי הבחירה של VSDs, יתרון אחד של צבעי הספיגה RH155 ו RH482 הוא פוטוטוקסיה קטנה עד לא הקשורה אליהם23,24, המאפשר זמני הקלטה ארוכים יותר מהרגיל עבור VSDscent פלואורסצנטי. יתר על כן, VSDs ספיגה מהירה אנו משתמשים מתאימים היטב להקלטת פוטנציאל פעולה סומטית overshooting בתכשירי גסטרופוד, שהם בדרך כלל 80 mV משרעת. כפי שמוצג באיור 3G, השיטה האופטית שלנו יכולה לתעד חבטות פוטנציאליות לפעולה (אף אחת מההקלטות שלנו אינה ממוצעת מעקב): הדבר מצביע על כך שה-VSDs שאנו משתמשים בהם אמורים להיות מסוגלים להבחין בפוטנציאל פעולה במערכות מודל אחרות שמחליפות במידה מסוימת ולכן אינן מגזימות עד שהן מגיעות לסומה. עם זאת, הגישה האופטית שלנו לא יכול להיות אידיאלי עבור מינים הידועים להפגין פוטנציאל פעולה מופחת מאוד כאשר נרשם סומה.
מחקר עדכני רב על רשתות עצביות מתמקד במספר קטן של מינים מהונדסים מעצב. עם זאת, מדעי המוח נהנים ממחקר של מגוון רחב של מינים שונים מבחינה פילוגנטית. חקר מינים רבים ושונים מספק תובנות על האופן שבו מעגלים מתפתחים25,26, ומאיר עקרונות של תפקוד הרשת שעשויים להיות נפוצים על פני פילה1,2,3,4,27. עד כה יישמנו את שיטת ההדמיה שלנו על מספר מינים של גסטרופודים, כולל אפליה קליפורניקה8,11,12,13,14,28, טריטוניה דיומדאה8,9,11,14,19,28, טריטוניה פסטיבה28, Pleurobranchaea californica (נתונים שלא פורסמו), ולאחרונה ברגיה סטפניאה (איור 5). ערעור של גישה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם בקלות על מינים רבים, ללא צורך בבעלי חיים מהונדסים. אנו רוצים להכיר בכך שהשימוש שלנו בהדמיית VSD עם צבעי ספיגה מהירה ו- PDA הולך בעקבות עבודה חלוצית שהשיגה זאת בהכנות נבאנקס29 ואפילזיה30. הדגש שלנו על מהירות הגישה שלנו הוא בחלקו תשובה לחששות כי חוקרים רבים עשויים להיות יותר ויותר מסרבים ליזום מחקרי רשת במינים חדשים בשל חשש כי שנים של מחקר יהיה צורך לאפיין ארגון רשת בסיסי לפני שיוכלו לחקור שאלות מדעיות עניין רחב למדעי המוח31. בהתאם לכך, המטרה שלנו כאן היא להדגים טכניקה שמזרזת מאוד את התהליך – עד כדי כך שניתן לקבל תובנות משמעותיות באותו יום על ארגון הרשת מהכנות בודדות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NSF 1257923 ו- NIH 1U01NS10837. המחברים מבקשים להכיר בסיועו של ז'אן וונג במעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
| Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
| Digital camera | Optronics | S97808 | |
| Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
| Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
| Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
| Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
| Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
| Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
| Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
| Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
| NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
| Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
| PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
| Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
| Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
| Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
| RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
| RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
| Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
| Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |
References
- Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
- Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
- Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
- Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
- Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
- Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
- Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
- Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
- Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
- Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
- Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
- Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
- Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
- Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
- Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
- Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
- Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
- Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
- Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
- Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
- Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
- Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
- London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
- Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
- Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).
