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Biology

गैर-ट्रांसजेनिक अकशेरुकी में एकल-न्यूरॉन रिज़ॉल्यूशन के साथ रिकॉर्डिंग नेटवर्क डायनेमिक्स के लिए फोटोडिओड-आधारित ऑप्टिकल इमेजिंग

Published: July 9, 2020 doi: 10.3791/61623
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Cell Biology and Anatomy, Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Center for Brain Function and Repair, Rosalind Franklin University of Medicine and Science
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल अवशोषण वोल्टेज-संवेदनशील रंगों और एक फोटोडिओड सरणी का उपयोग करके गैर-ट्रांसजेनिक अकशेरुकी प्रजातियों में एकल-कोशिका संकल्प के साथ न्यूरोनल जनसंख्या गतिविधि इमेजिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण एक तेजी से कार्यप्रवाह को सक्षम बनाता है, जिसमें इमेजिंग और विश्लेषण को एक ही दिन के दौरान आगे बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

ट्रांसजेनिक अकशेरुकी तैयारी का विकास जिसमें न्यूरॉन्स के निर्दिष्ट सेट की गतिविधि को रिकॉर्ड किया जा सकता है और प्रकाश के साथ हेरफेर किया जा सकता है, व्यवहार के तंत्रिका आधार के अध्ययन के लिए एक क्रांतिकारी अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, इस विकास का एक नकारात्मक पक्ष जांचकर्ताओं को "डिजाइनर" जीवों (जैसे, सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला)की एक बहुत छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित करने की प्रवृत्ति है, संभावित रूप से कई प्रजातियों में तुलनात्मक अध्ययनों की खोज को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है, जो नेटवर्क फ़ंक्शन के सामान्य सिद्धांतों की पहचान करने के लिए आवश्यक है। वर्तमान लेख दिखाता है कि कैसे गैर-ट्रांसजेनिक गैस्ट्रोपॉड प्रजातियों के दिमाग में वोल्टेज-संवेदनशील रंगों के साथ ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग का उपयोग तेजी से किया जा सकता है (यानी, एकल प्रयोगों के समय पाठ्यक्रम के भीतर) एकल-सेल संकल्प के साथ उनके तंत्रिका नेटवर्क के कार्यात्मक संगठन की विशेषताओं को प्रकट करता है। हम कई गैस्ट्रोपोड प्रजातियों के सीएनएस में व्यवहार रूप से प्रासंगिक मोटर कार्यक्रमों के दौरान दर्जनों से ~ 150 न्यूरॉन्स तक कार्रवाई संभावित निशान प्राप्त करने के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा उपयोग किए जाने वाले विच्छेदन, धुंधला और रिकॉर्डिंग विधियों को विस्तार से रेखांकित करते हैं, जिसमें न्यूरोसाइंस के लिए एक नया - न्यूडिब्रांच बर्गिया स्टेफनी। इमेजिंग अवशोषण वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों और एक 464-तत्व फोटोडिओड सरणी के साथ किया जाता है जो 1,600 फ्रेम/सेकंड पर नमूने, रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स द्वारा उत्पन्न सभी कार्रवाई क्षमताओं को पकड़ने के लिए पर्याप्त तेजी से। कई कई मिनट की रिकॉर्डिंग तैयारी के अनुसार प्राप्त किया जा सकता है जिसमें कोई सिग्नल ब्लीचिंग या फोटोटॉक्सीसिटी नहीं है। वर्णित तरीकों के माध्यम से एकत्र किए गए कच्चे ऑप्टिकल डेटा का बाद में विभिन्न सचित्र तरीकों के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। हमारे ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण आसानी से गैर ट्रांसजेनिक प्रजातियों की एक किस्म में नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह अच्छी तरह से कैसे दिमाग व्यवहार उत्पंन के तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुकूल बना रही है ।

Introduction

ड्रोसोफिला और सी एलिगेंस जैसे अकशेरुकी लाइनों की ट्रांसजेनिक लाइनों के विकास ने शक्तिशाली प्रणालियां प्रदान की हैं जिनमें व्यवहार के तंत्रिका ठिकानों को ऑप्टिकल रूप से पूछताछ और हेरफेर किया जा सकता है। हालांकि, इन विशेष तैयारियों में गैर-ट्रांसजेनिक प्रजातियों के तंत्रिका सर्किट अध्ययन के लिए उत्साह को कम करने का नकारात्मक पक्ष हो सकता है, विशेष रूप से तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में नई प्रजातियों की शुरुआत के संबंध में। विशेष रूप से एक या दो मॉडल प्रणालियों पर ध्यान केंद्रित करना नेटवर्क फ़ंक्शन के सामान्य सिद्धांतों की खोज के लिए हानिकारक है, क्योंकि तुलनात्मक अध्ययन एक आवश्यक मार्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसके द्वारा ऐसे सिद्धांतों की खोज की जाती है1,2,3,4। यहां हमारा उद्देश्य तंत्रिका नेटवर्क समारोह के तुलनात्मक अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के प्रयास में गैस्ट्रोपॉड तंत्रिका नेटवर्क की कार्यात्मक संरचना में तेजी से अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए बड़े पैमाने पर इमेजिंग दृष्टिकोण प्रदर्शित करना है।

एपलिसिया, लिमनिया, ट्राइटोनिया, प्लूरेब्रांचिया और अन्य जैसे गैस्ट्रोपॉड मोलस्क का उपयोग लंबे समय से तंत्रिका नेटवर्क फ़ंक्शन के सिद्धांतों की जांच करने के लिए किया जाता है, क्योंकि उनके व्यवहार बड़े, अक्सर व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य न्यूरॉन्स द्वारा मध्यस्थता किए जाते हैं, जिससे वे रिकॉर्डिंग तकनीकों के लिए आसानी से सुलभ हो जाते हैं5।  1 9 70 के दशक में, प्लाज्मा झिल्ली में एकीकृत कर सकने वाले वोल्टेज-संवेदनशील रंग (वीएसडी) विकसित किए गए थे जो जल्द ही कई न्यूरॉन्स6द्वारा उत्पन्न एक्शन क्षमता की पहली इलेक्ट्रोड-मुक्त रिकॉर्डिंग को सक्षम करते थे। यहां, हम गैस्ट्रोपोड्स की कई प्रजातियों में नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए वीएसडी के अपने उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें न्यूरोसाइंस के लिए एक नया, बर्गिया स्टेफनी शामिलहै। इमेजिंग डिवाइस एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 464-तत्व फोटोडिओड सरणी (पीडीए) है जो 1,600 फ्रेम/सेकंड(चित्रा 1)पर नमूने है, जो तेजी से अवशोषित वीएसडी के साथ उपयोग किए जाने पर, सभी रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स7की कार्रवाई क्षमता का पता चलता है। सभी डायोड द्वारा दर्ज किए गए संकेतों को अधिग्रहण के तुरंत बाद प्रदर्शित किया जाता है और पीडीए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में गैंगलियन की छवि पर आरोपित किया जाता है, जिससे एक ही तैयारी8, 9में तेज इलेक्ट्रोड के साथ ब्याज के न्यूरॉन्स की जांच करना संभव होजाताहै।

कच्चे पीडीए डेटा में, कई डायोड अनावश्यक रूप से बड़े न्यूरॉन्स रिकॉर्ड करते हैं, और कई में कई न्यूरॉन्स से मिश्रित संकेत भी होते हैं। एक टर्निंग पॉइंट स्वतंत्र घटक विश्लेषण का उपयोग करके एक स्वचालित स्पाइक-छंटाई विधि का विकास था जो प्रत्येक कच्चे 464-चैनल पीडीए डेटा को तेजी से ट्रेस के एक नए सेट में सेट करता है, जिसमें हर दर्ज किए गए न्यूरॉन एक अलग ट्रेस में दिखाई देता है जिसमें सिर्फ इसकी कार्रवाई क्षमता10,11होती है।

इस लेख में हम एक फोटोडिओड सरणी और तेजी से अवशोषित वीएसडी के साथ गैस्ट्रोपॉड तंत्रिका तंत्र से बड़े पैमाने पर कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में शामिल आवश्यक कदमों की रूपरेखा तैयार करते हैं।  इसके अलावा हम विश्लेषणात्मक तरीकों को चित्रित करते हैं जिन्हें उनके कार्यात्मक कलाकारों के संबंध में ऑप्टिकल रूप से दर्ज न्यूरॉन्स को क्लस्टर और मैपिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है, और जनसंख्या-स्तर की विशेषताओं की विशेषता है जो अक्सर फायरिंग के सरल निरीक्षण के माध्यम से स्पष्ट नहीं होते हैं12,13।

Protocol

नोट: नीचे उल्लिखित कार्यप्रवाह चित्र 2में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।

1. कंपन को कम करें

  1. यदि संभव हो, तो यह सुनिश्चित करें कि रिग भूतल पर है, और एक वसंत-आधारित आइसोलेशन टेबल का उपयोग करता है, जो एयर टेबल की तुलना में कंपन आवृत्तियों की एक व्यापक श्रृंखला को गीला करता है।
  2. यदि वसंत-आधारित तालिका का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि यह तैर रहा है (इसे हर बार समायोजित करने की आवश्यकता होती है जब कोई कहता है या मेज से कुछ लेता है)।
  3. इमेजिंग रूम में जितना संभव हो कंपन-आधारित शोर को कम करें, यहां तक कि यदि आवश्यक हो तो इमेजिंग के दौरान एयरफ्लो को बंद करने की सीमा तक। परफ्यूजन सिस्टम में तरल पदार्थ अशांति से उपजी किसी भी कंपन को कम करें।
    नोट: तंत्रिका तैयारी अधिग्रहण के दौरान कदम नहीं होना चाहिए । किसी भी प्रकार के आंदोलन डायोड में विपरीत किनारों के बदलाव का उत्पादन करते हैं, जिससे विरूपण साक्ष्य संकेत होते हैं। यदि प्रक्रिया में अधिग्रहण के दौरान एक प्रोत्साहन शामिल है, तो इसे तैयारी आंदोलन को प्रेरित नहीं करना चाहिए।

2. पीडीए डेटा के साथ गैंगलियन तस्वीरों के उचित संरेखण को सक्षम करने के लिए पिनहोल परीक्षण चलाएं

  1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर इसमें 3 छोटे छेद के साथ एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा रखें। अपने परफोकल फोटोपोर्ट पर चढ़कर डिजिटल कैमरे के साथ तीन छेद की एक छवि लें।
  2. पीडीए के साथ आने वाले इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, एक छोटी फ़ाइल (जैसे, 5 एस) प्राप्त करें। अधिग्रहण के माध्यम से पार्टवे, कंपन कलाकृतियों को प्रेरित करने के लिए टेबल पर टैप करें जो पिनहोल के किनारों के आसपास बहुत दिखाई देगा, जिससे पिनहोल की छवि को ऑप्टिकल डेटा के साथ ठीक से गठबंधन किया जा सके।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में अतिरंजित समारोह का उपयोग करें, मेनू आइटम में पाया"प्रदर्शन | पेज अतिरंजित | अधिरोपन निशान w/बाहरी छवि | सुपरिम्पोज इमेज"पिनहोल की तस्वीर पर डायोड डेटा को ओवरले करने के लिए, और फिर फोटो के लिए एक्स, वाई और आवर्धन सेटिंग्स को तब तक समायोजित करें जब तक कि पिनहोल सीधे डायोड डेटा में पिनहोल कलाकृतियों के ऊपर नहीं बैठते।
    1. भविष्य के प्रयोगों में डायोड डेटा के साथ कैमरे के साथ ली गई तैयारी छवियों को संरेखित करने के लिए इन नंबरों को सहेजें।
      नोट: पीडीए के पिनहोल संरेखण को केवल एक बार पीडीए के माइक्रोस्कोप पर चढ़कर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, जब तक कि इसे घुमाया या हटाया न जाए, जिस समय इसे फिर से किया जाना चाहिए।

3. तीन समुद्री गैस्ट्रोपोड प्रजातियों के लिए विच्छेदन

  1. ट्राइटोनिया और एप्लिसियाजैसे बड़े आकार की प्रजातियों के लिए, छोटे व्यक्तियों के साथ शुरू होता है, जिनमें पतले, कम अपारदर्शी गैंगलिया होते हैं, इष्टतम सिग्नल-टू-शोर के लिए पर्याप्त प्रकाश प्राप्त करने में आसानी होती है।
  2. विच्छेदन और इमेजिंग प्रयोगों के लिए खारा के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार फ़िल्टर कृत्रिम समुद्री जल है।
    नोट: प्रोटोकॉल के बाद के सभी चरणों में, "खारा" कृत्रिम समुद्री जल को दर्शाता है।
  3. ट्राइटोनिया डायोमेडिया का विच्छेदन
    1. एक जानवर को फ्रिज में लगभग 20 मिनट के लिए रखें ताकि इसे एनेस्थेटाइज किया जा सके।
    2. बड़े जानवरों के लिए, एक हाथ में जानवर पकड़ कर मस्तिष्क का पर्दाफाश, सिर अंत तर्जनी पर कपड़ा देने के लिए "गर्दन का पर्दाफाश." छोटे जानवरों के लिए, मस्तिष्क को उजागर करने से पहले उन्हें एक मोम-लाइन वाले विच्छेदन पकवान में पृष्ठीय पक्ष पिन करें।
    3. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, जानवर के पृष्ठीय पक्ष पर 3-4 सेमी मिडलाइन चीरा बनाएं, बुक्कल द्रव्यमान के ऊपर (जिसे शरीर की दीवार के माध्यम से महसूस किया जा सकता है)।
      नोट: सीएनएस का आवश्यक हिस्सा, जिसमें फ्यूज्ड, द्विपक्षीय सेरेब्रोप्लेरल और पेडल गैंगलिया शामिल हैं, नारंगी और आसपास के ऊतकों से दिखने में अलग है; यह तुरंत राइनोफोरस के पीछे और बुक्कल द्रव्यमान के ऊपर स्थित है।
    4. उन नसों को तोड़कर सीएनएस को उत्पादित करें, जो संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके जानवर के शरीर को इनरवेट करते हैं, उन सभी नसों को केंद्रीय गंगलिया को जोड़ने वाले बरकरार रखते हैं। पेडल तंत्रिका 3 (PdN3) की एक लंबी लंबाई छोड़ दें, या जो भी तंत्रिका उत्तेजित हो जाएगा।
    5. आगे विच्छेदन के लिए एक खारा से भरे इलास्टोमर-लाइन वाले पकवान के नीचे सीएनएस को प्रत्यय करने के लिए मिन्यूटियन पिन का उपयोग करें। एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके प्रतिक्रिया नियंत्रित, इन-लाइन पेल्टियर कूलिंग सिस्टम के साथ वितरित नमकीन के साथ डिश को पेर्फसिंग करके तैयारी के तापमान को 11 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    6. संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करना, ध्यान से सीएनएस के आसपास से संयोजी ऊतक की शिथिल पालन परत को हटा दें। बारीक म्यान को बारीकी से गैंगेलिया का पालन करना छोड़ दें।
    7. संक्षेप में (~ 10 एस) खारा में 0.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के समाधान में गैंगलिया को डुबोएं। गंगलिया को नमकीन-perfused इलास्टोमर-लाइन वाले पकवान में वापस रखें, जिससे लवकुश को वीएसडी धुंधला होने से पहले ग्लूटारल्डिहाइड को धोने की अनुमति मिल सके।
      नोट: संयोजी ऊतक और उसकी आंतरिक मांसपेशियों के इस प्रकाश तय इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोकने में मदद मिलेगी ।
  4. एपलिसिया कैलिफॉर्निका का विच्छेदन
    1. वेंट्रल सतह (पैर) के माध्यम से शरीर में ~ 20 एमएल 350 एमएम एमजीसीएल2 का इंजेक्शन लगाकर लगभग 40 ग्राम जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
    2. एक मोम लाइन विच्छेदन पकवान में पशु वेंट्रल साइड की स्थिति के लिए पिन का उपयोग करें।
    3. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, पैर की सबसे पूर्वकाल सीमा के साथ 2-3 सेमी मिडलाइन चीरा बनाएं। सीएनएस और बुक्कल द्रव्यमान के हिस्से को प्रकट करने के लिए चीरा के दोनों ओर पैर के फ्लैप नीचे पिन करें।
      नोट: सीएनएस का आवश्यक हिस्सा, जिसमें फ्यूज्ड सेरेब्रल गैंगलिया शामिल है, और बारीकी से ऐपोस्ड, द्विपक्षीय प्ल्युरल और पेडल गैंगलिया, पीले-नारंगी और आसपास के ऊतकों से दिखने में अलग है; यह बल्बस पेशी बुक्कल द्रव्यमान के लिए पृष्ठीय और पोस्टरोलेटरल बैठता है।
    4. सेरेब्रल गैंगलिया का खुलासा करते हुए, बुक्कल द्रव्यमान को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
    5. उन नसों को तोड़कर सीएनएस को उत्पादित करें, जो संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके जानवर के शरीर को इनरवेट करते हैं, उन सभी नसों को केंद्रीय गंगलिया को जोड़ने वाले बरकरार रखते हैं। पेडल तंत्रिका 9 (PdN9) की एक लंबी लंबाई छोड़ दें, या जो भी तंत्रिका उत्तेजित हो जाएगा।
    6. नमकीन से भरे इलास्टोमर-लाइन वाले पकवान में सीएनएस को स्थान देने के लिए मिन्यूटियन पिन का उपयोग करें। एक पेल्टियर कूलिंग डिवाइस के माध्यम से गुजर नमकीन के साथ पकवान perfusing द्वारा 15-16 डिग्री सेल्सियस पर तैयारी के तापमान को बनाए रखें ।
    7. संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करना, सीएनएस से अत्यधिक संयोजी ऊतक को हटा दें, और गंगलियन या गैंगलिया पर म्यान के एक सतही हिस्से को चित्रित करने के लिए दूर करें। इस प्रक्रिया के दौरान सावधान रहें कि म्यान में छेद न करें, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स भीतर से बाहर निकल जाएंगे।
    8. संक्षेप में (~ 20 एस) खारा में 0.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के समाधान में गैंगलिया को डुबोएं। गंगलिया को नमकीन-perfused इलास्टोमर-लाइन वाले पकवान में वापस रखें, जिससे लवकुश को वीएसडी धुंधला होने से पहले ग्लूटारल्डिहाइड को धोने की अनुमति मिल सके।
  5. बर्गिया स्टेफनी का विच्छेदन
    1. एक जानवर को फ्रिज में लगभग 20 मिनट के लिए रखें ताकि इसे एनेस्थेटाइज किया जा सके।
    2. कमरे के तापमान खारा से भरा एक इलास्टोमर-लाइन डिश का उपयोग करना, सिर और पूंछ दोनों में मिन्यूटियन पिन रखें।
    3. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, सीएनएस को 5-7 मिमी पृष्ठीय चीरा सतही बनाएं।
      नोट: आंखें, काले धब्बे जो सीएनएस के बगल में जानवर के भीतर रहते हैं, आसानी से आवश्यक हिस्से सीएनएस की स्थिति को चिह्नित करते हैं, जिसमें द्विपक्षीय रूप से जुड़े सेरेब्रोप्लेर और पेडल गैंगलिया होते हैं और बुक्कल द्रव्यमान के ऊपर बैठते हैं।
    4. उन नसों को तोड़कर सीएनएस को उत्पादित करें जो संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके जानवर के शरीर को इनरवेट करते हैं। किसी भी तंत्रिका को सक्शन इलेक्ट्रोड के लिए पर्याप्त रूप से लंबे समय तक उत्तेजित किया जा रहा छोड़ दें।

4. एक वोल्टेज संवेदनशील डाई के साथ तैयारी दाग

  1. या तो RH155 (भी NK3041 के रूप में जाना जाता है) या RH482 (भी NK3630 या JPW1132 के रूप में जाना जाता है) के शेयर समाधान तैयार करते हैं ।
    1. RH155: 100% एटोह के 1 मिलील में 5.4 मिलीग्राम ठोस डाई को भंग करें, 34 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 29 माइक्रोएनएल को पाइपिंग करें। हवा के संपर्क में आने वाली प्रत्येक ट्यूब की सामग्री के साथ, उन्हें अंधेरे में रात भर सूखने दें। कैप करें और आरएच 155 के परिणामस्वरूप ठोस एलिकोट्स रखें, प्रत्येक में 0.15 मिलीग्राम, एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में।
    2. RH482: DMSO के 100 माइक्रोन में 2 मिलीग्राम ठोस डाई को भंग करें, समाधान को 5 माइक्रोन के 20 एलिकोट्स में विभाजित करें, प्रत्येक में 0.1 मिलीग्राम RH482 होता है, और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
      नोट: ट्राइटोनिया और एपलिसियाके लिए, या तो स्नान परफ्यूजन या दबाव आवेदन का उपयोग तैयारी में न्यूरॉन्स की झिल्ली में वीएसडी आरएच 155 को लोड करने के लिए किया जा सकता है। दबाव आवेदन सिर्फ गैंगलियन को उजागर करने का लाभ है वीएसडी के लिए छवि जा रहा है ।
  2. स्नान परफ्यूजन के लिए, ठोस RH155 और भंवर के उपरोक्त एलिकोट्स में से प्रत्येक में नमकीन के 5 एमएल को जोड़ते हैं, जिसमें 0.03 मिलीग्राम/एमएल आरएच 155 युक्त 10 एमएल का संयुक्त समाधान होता है।
    1. अंधेरे में परफयूज (फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए) 1 से 1.5 घंटे के लिए ट्राइटोनिया के लिए 11 डिग्री सेल्सियस पर और एपलिसियाके लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर। पेल्टियर कूलिंग सिस्टम के माध्यम से परफ्यूजन समाधान पारित करके तापमान बनाए रखें।
  3. दबाव आवेदन के लिए, RH155 के एक aliquot में 500 μL खारा जोड़ें, और भंवर 0.3 मिलीग्राम/
    1. एक हैंडहेल्ड माइक्रोडिस्पेंसर का उपयोग करके पॉलीथीन ट्यूबिंग में समाधान के लगभग 200 माइक्रोल को ड्रा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ट्यूब व्यास और गैंगलियन के व्यास के बीच एक अच्छा मैच है दागदार होना।
    2. लक्ष्य गैंगलियन पर ट्यूब के अंत को ध्यान से रखने के लिए एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें, इसे कम करें जब तक कि यह गैंगलियन पर एक सुखद सील न बना सके। गंगलिया को वांछित तापमान पर रखने के लिए ऊपर वर्णित कूलिंग सिस्टम के प्रकार का उपयोग करें।
    3. फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए कमरे की रोशनी को मंद करें और गैंगलियन पर अधिक डाई को मजबूर करने के लिए हर 5 मिनट में माइक्रोडिस्पनर एप्लिकेटर नॉब को चालू करें।
    4. 30 मिनट पर जांच की पुष्टि करने के लिए कि अच्छा धुंधला हो रहा है, और फिर के बारे में 1 घंटे के कुल धुंधला समय के लिए जारी है ।
  4. बर्गियामें धुंधला करने के लिए, RH482 के जमे हुए एलिकोट में नमकीन की 1 एमएल जोड़ें, और भंग करने के लिए भंवर।
    1. इस समाधान के 200 माइक्रोल को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 800 माइक्रोनल नमकीन और भंवर को समाधान में शामिल किया गया है, जिससे 0.1% डीएमएसओ के साथ नमकीन में 0.02 मिलीग्राम/मिलीलीटर आरएच482 का अंतिम धुंधला समाधान उत्पन्न होता है।
    2. पूरे सीएनएस को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें, फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब को लपेटकर, और लगभग 1 घंटे के लिए हर 5-6 मिनट हाथ से मिलाएं। फ्रिज में पहले समाधान के शेष 800 माइक्रोन स्टोर करें, और बाद की तैयारी को दाग देने के लिए 3 दिनों तक उपयोग करें।

5. तैयारी को समतल करें और तंत्रिका उत्तेजना के लिए स्थापित करें

नोट: इस खंड में चरणों को कम से कम रोशनी के तहत या हरी रोशनी के साथ किया जाना चाहिए ताकि फोटोब्लैचिंग को कम किया जा सके।

  1. धुंधला होने के बाद, इमेजिंग कक्ष के भीतर खारा में सीएनएस विसर्जित करें और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  2. सिलिकॉन के टुकड़े (ट्राइटोनिया या एप्लिसियाके लिए) या पेट्रोलियम जेली के ब्लॉब्स (बर्गियाके लिए) को गैंगलियन/गैंगलिया के बाईं और दाईं ओर इमेज्ड करने के लिए रखें ।
  3. इसे समतल करने की तैयारी पर एक गिलास या प्लास्टिक कवरलिप के उचित आकार के टुकड़े को दबाएं। मजबूती से दबाएं लेकिन न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचाने के लिए इतनी मेहनत नहीं करें।
    नोट: इस तरीके से तैयारी की उत्तल सतह को सपाट करने से बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स परफोकल हो जाएंगे, जिससे रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि होगी, और इसके अलावा इमेजिंग के दौरान तैयारी को स्थिर करने में मदद मिलेगी।
  4. यदि एक युक्ति मोटर कार्यक्रम प्रकाश में लाना करने के लिए एक तंत्रिका उत्तेजक, एक सक्शन इलेक्ट्रोड जिसका सामने टिप लगभग तंत्रिका व्यास के रूप में के रूप में व्यापक है तैयार करते हैं । ध्यान से एक लौ पर पीई-१०० पॉलीथीन ट्यूबिंग के एक खंड पिघलने से इसे पूरा करें, जबकि धीरे से टयूबिंग सेगमेंट के दोनों सिरों को खींच रहे हैं और फिर वांछित बिंदु पर परिणामी टेपर को काटते हैं।
    1. एक पॉलीथीन सक्शन इलेक्ट्रोड के पतला अंत के माध्यम से खारा की एक छोटी मात्रा ड्रा, तंत्रिका के अंत के बाद उत्तेजित किया जा करने के लिए, मोटी दीवारों की लंबाई संलग्न करके, लचीला बहुलक ट्यूबिंग इलेक्ट्रोड के पीछे के अंत में और मुंह सक्शन का उपयोग करने के लिए नकारात्मक दबाव लागू होते हैं ।
    2. पुष्टि करें कि इलेक्ट्रोड में नमकीन में बुलबुले की कमी है जो विद्युत चालन को बाधित कर सकता है।

6. इमेजिंग के लिए तैयारी और अनुकूलन

  1. इमेजिंग रिग के लिए कक्ष ले जाएँ। रिकॉर्डिंग कक्ष के माध्यम से खारा पर्फ्यूजन शुरू करें और तैयारी के पास तापमान जांच रखें। प्रजातियों के लिए वांछित तापमान के लिए तापमान नियंत्रक सेट करें (ट्राइटोनियाके लिए, 11 डिग्री सेल्सियस, एपलिसियाके लिए, 15-16 डिग्री सेल्सियस, या बर्गिया,26-27 डिग्री सेल्सियस के लिए)।
  2. सक्शन इलेक्ट्रोड के नीचे एक क्लोरिडेड सिल्वर वायर रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि यह इलेक्ट्रोड में खारा से संपर्क करता है, और सक्शन इलेक्ट्रोड के पास बाथ नमकीन में दूसरे एजी-एजीसीएल तार (वापसी पथ) डाल देता है।
  3. खारा में पानी विसर्जन लेंस कम करें। आधार डायाफ्राम को बंद करें, और फिर उप-चरण कंडेनसर को बढ़ाएं या कम करें और ध्यान को तब तक समायोजित करें जब तक कि डायाफ्राम के किनारे तेज फोकस में न हों, जिससे कोहलर रोशनी बन जाए।
    1. तैयार करने के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए छवि हो । पूर्वाग्रह बड़े लोगों पर छोटे न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित, के रूप में ऑप्टिकल बड़े न्यूरॉन्स में उद्भव संकेतों छोटे लोगों की तुलना में अधिक होने की संभावना है पंजीकृत होने के लिए भले ही वे थोड़ा ध्यान से बाहर हैं ।
    2. पैराफोकल डिजिटल कैमरे के साथ छवि के लिए गैंगलियन की तस्वीर लें।
    3. नियंत्रण कक्ष लाभ स्विच 1x करने के लिए सेट के साथ, "RLI"बटन पर क्लिक करके और डायोड के औसत RLI की जांच करके इमेजिंग सॉफ्टवेयर में आराम प्रकाश तीव्रता (RLI) का निरीक्षण करें। एक उत्तेजक से एलईडी लैंप बिजली की आपूर्ति के लिए भेजे गए वोल्टेज स्तर को समायोजित करें और औसत आरली स्तर की जांच जारी रखें जब तक कि यह वांछित सीमा (आमतौर पर लगभग 3-4 वी) में न हो जाए।
      नोट: पीडीए पर लगभग 3-4 वी के अनुरूप उच्च आरएलआई वांछनीय हैं। प्रकाश जितना अधिक होगा, ऑप्टिकल संकेतों का सिग्नल-टू-शोर अनुपात उतना ही बेहतर होगा, हालांकि, इसे उच्च आरएलआई पर फोटोब्लैचिंग की तेज दर के खिलाफ संतुलित किया जाना चाहिए। उच्च एनए उद्देश्य लेंस का उपयोग करके इस जोखिम को कम किया जाता है। उपयोग किए जाने वाले जल विसर्जन उद्देश्य लेंस 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA, और 40x/1.15 NA हैं ।
  4. रिकॉर्डिंग के लिए कंट्रोल पैनल गेन स्विच को 100x पर सेट करें।
  5. यदि एक तंत्रिका उत्तेजक, वांछित वोल्टेज, आवृत्ति, और अवधि से एक अलग उत्तेजक पर सेट करने के लिए प्रकाश स्तर सेट किया जाता है । पुष्टि करें कि नियंत्रण कक्ष और उत्तेजक के बीच टीटीएल ट्रिगर ठीक से कॉन्फ़िगर किया गया है।
    नोट: प्रत्येक प्रजाति में नमूना तंत्रिका उत्तेजना पैरामीटर इस प्रकार हैं: ट्राइटोनिया पीडीएन3, 2 एस, 10 हर्ट्ज पल्स ट्रेन 5 एमएस, 10 वी दालें; एपलिसिया PdN9, 2.5 एस, 20 हर्ट्ज पल्स ट्रेन 5 एमएस, 8 वी दालें; एक बर्गिया पेडल नर्व, 2 एस, 10 हर्ट्ज पल्स ट्रेन ऑफ 5 एमएस, 5 वी दालें।
  6. डबल-चेक करें कि स्प्रिंग या एयर टेबल तैर रहा है।

7. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग

  1. किसी भी ओवरहेड फ्लोरोसेंट प्रकाश सहित कमरे की रोशनी को बंद या मंद करें।
  2. वांछित फ़ाइल अवधि, मार्ग, और फ़ाइल नाम सेट करें, और फिर कंप्यूटर के उपलब्ध रैम की क्षमता तक फ़ाइलों को प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में"टेक डेटा"बटन पर क्लिक करें। ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के दौरान अभी भी रहें, क्योंकि छोटे कंपन ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग डेटा में बड़ी कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं।
    नोट: अधिग्रहण है कि कंप्यूटर के उपलब्ध रैम से अधिक होगा के लिए, एक कस्टम बनाया सी + + अधिग्रहण कार्यक्रम जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के डॉ जियान-युवा वू के माध्यम से उपलब्ध है ।
  3. अधिग्रहण के तुरंत बाद डेटा देखने के लिए, तैयारी7के पहले लिए गए गैंगलियन की छवि पर सभी 464 डायोड द्वारा एकत्र किए गए डेटा को अधिरोपित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में अतिरिपोज़ फ़ंक्शन का उपयोग करें। सॉफ्टवेयर में प्रतिनिधित्व किए गए किसी भी डायोड पर क्लिक करें जो उन्होंने एक अलग ट्रेस स्क्रीन पर दर्ज किया था।
    1. पहले पिनहोल परीक्षण द्वारा निर्धारित एक्स, वाई और आवर्धन कारकों में प्रवेश करके तैयारी के संबंध में डायोड का सटीक संरेखण प्राप्त करें।
    2. कार्रवाई की संभावित दृश्यता को अधिकतम करने और बाद में स्पाइक-छंटाई14के लिए न्यूरॉन यील्ड में सुधार करने के लिए, कम और उच्च आवृत्ति शोर दोनों को हटाने के लिए 5 हर्ट्ज और 100 हर्ट्ज कटऑफ (इमेजिंग सॉफ्टवेयर में उपलब्ध) के साथ एक बैंडपास बटरवर्थ फिल्टर लागू करें।
    3. एक वैज्ञानिक कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म में आगे के विश्लेषण के लिए एक पाठ फ़ाइल के रूप में फ़िल्टर ऑप्टिकल डेटा को बचाने के लिए, सबसे पहले इमेजिंग सॉफ्टवेयर में"पेज"स्क्रीन के नीचे"टीपी फिल्टर"बॉक्स का चयन करें। इसके बाद'आउटपुट'टैब से'सेव पेज एएससीआईआई'का चयन करें और मनचाए फाइलनेम को उस डायलॉग बॉक्स में डालें जो दिखाई देता है।

Representative Results

ट्राइटोनिया
अपने समुद्रीस्टार शिकारी के साथ त्वचा का संपर्क ट्राइटोनिया डायोमेडिया के भागने तैरने से चलाता है, जिसमें पूरे शरीर के फ्लेक्स की एक लयबद्ध श्रृंखला शामिल है जो इसे सुरक्षा(चित्रा 3 ए)के लिए दूर ले जाती है। अलग मस्तिष्क की तैयारी में, पेडल तंत्रिका 3 (PdN3) के लिए एक संक्षिप्त उत्तेजना इस व्यवहार के लिए लयबद्ध तैरना मोटर कार्यक्रम (एसएमपी) प्रकाश में लाना है, जो पेडल गैंगलिया से ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में आसानी से पहचानने योग्य है । चित्रा 3B एक VSD इमेजिंग प्रयोग के लेआउट को दर्शाया गया है जो बाएं ट्राइटोनिया पेडल गैंगलियन की पृष्ठीय सतह पर न्यूरॉन्स की फायरिंग गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिस पर पीडीए तैनात किया गया था, कॉन्ट्रालेट्रल (दाएं) पीडीए 3 एसएमपी को प्राप्त करता है। कच्चे और फ़िल्टर डेटा (बैंडपास बटरवर्थ फिल्टर, 5 और 100 हर्ट्ज कटऑफ) से पहले, के दौरान और PDN3 की उत्तेजना के बाद 20 डायोड रिकॉर्डिंग गतिविधि क्रमशः आंकड़े 3C, डी में दिखाए जाते हैं। तंत्रिका उत्तेजना 2 मिनट फ़ाइल में 20 एस दिया गया था । अधिग्रहण के तुरंत बाद, रिकॉर्डिंग सरणी के सभी 464 डायोड द्वारा मापा गया संकेत इमेजिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 3E)में तैयारी की छवि पर स्थलाकृतिक रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है। इस बिंदु पर, कई निशान एक ही न्यूरॉन्स से अनावश्यक रूप से दर्ज स्पाइक्स होते हैं, और कुछ निशान एक से अधिक न्यूरॉन से स्पाइक्स होते हैं । आईसीए के साथ फ़िल्टर किए गए डायोड निशान को स्पाइक-सॉर्ट करने से 53 अद्वितीय न्यूरोनल निशान मिले, जिनमें से 30 चित्रा 3Fमें दिखाए गए हैं। चित्रा 3Gमें व्यक्तिगत स्पाइक्स की गतिज की सराहना की जा सकती है, जो चित्रा 3F (लाल बॉक्स) से चार निशानों का एक अंश फैलता है; आईसीए स्पाइक-सॉर्टिंग एल्गोरिदम की सटीकता को पहले एक साथ तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग का उपयोग करके सत्यापित किया गया था, जिससे पता चला कि सॉर्ट किए गए निशान में सभी स्पाइक्स व्यक्तिगत न्यूरॉन्स11, 14से इंट्रासेलुलर रूप से दर्ज स्पाइक्स के अनुरूप हैं।

एपलिसिया
एपलिसिया कैलिफॉर्निका के लिए एक जोरदार अविवेकी पूंछ उत्तेजना एक टकसाली दो भाग लयबद्ध भाग प्रतिक्रिया15प्रकाश में लाना । प्रतिक्रिया का पहला चरण सिर के फेफड़ों और पूंछ खींचती है कि जानवर जल्दी से आगे बढ़ने के कई चक्रों की एक सरपट है । इसके बाद आम तौर पर रेंगने की अवधि होती है, जिसमें सिर से पूंछ वाले मांसपेशियों के संकुचन की दोहराई गई लहरें शामिल होती हैं जो जानवर को कई मिनटों(चित्रा 4A)के लिए धीमी गति से आगे बढ़ाती हैं। ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में इन एस्केप मोटर कार्यक्रमों को पकड़ने के लिए, पीडीए को एक अलग मस्तिष्क तैयारी में सही पेडल गैंगलियन की पृष्ठीय सतह पर केंद्रित किया गया था, और एक सक्शन इलेक्ट्रोड को कॉन्ट्रालेटरल (बाएं) पेडल तंत्रिका 9 (PdN9) पर रखा गया था। चित्रा 4B)। एक सतत 20 मिनट ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में एक मिनट(चित्रा 4C),PdN9 सरपट क्रॉल मोटर कार्यक्रम अनुक्रम प्रकाश में लाना करने के लिए प्रेरित किया गया था । सभी 81 दर्ज न्यूरॉन्स से संकेतों के संभाव्य गौसियन स्थानिक वितरण गैंगलियन(चित्रा 4 डी)पर मैप किए गए थे। पूर्ण रिकॉर्डिंग पर लागू आयामीता में कमी से पता चला है कि भागने के कार्यक्रम के सरपट (सियान) और क्रॉल (गहरे नीले) चरणों ने अलग-अलग क्षेत्रों पर कब्जा कर लिया और प्रमुख घटक अंतरिक्ष(चित्रा 4E)में क्रमशः विभिन्न प्रक्षेप पथ, सर्पिल और लूप-जैसे का गठन किया।

चित्रा 4 में चित्रित एपलिसिया रिकॉर्डिंग के आधार पर तीन वीडियो आगे प्रकार के विश्लेषण प्रदर्शित करते हैं जिन्हें ऐसे डेटा सेट पर किया जा सकता है। वीडियो 1 रिकॉर्डिंग की पूरी अवधि में सभी दर्ज न्यूरॉन्स की गोलीबारी उत्साहित करता है। एस्केप मोटर प्रोग्राम की प्रारंभिक पोस्ट-उत्तेजक अवधि को सरपट दौड़ाया गया था, जिसमें गैंगलियन में गतिविधि को विभिन्न कार्यात्मक समूहों(वीडियो 2)के बारी-बारी से चिह्नित किया गया था। सरपट बाद में एक क्रॉल करने के लिए संक्रमण, जिसमें न्यूरोनल समूहों में गतिविधि मोटे तौर पर चरणबद्ध रहे, लेकिन गैंगलियन(वीडियो 3)में एक प्रतिवर्तक घूर्णन प्रक्षेपवक्र ग्रहण किया । बाद के दो वीडियो में आम सहमति क्लस्टरिंग को भी शामिल किया गया है, जो अलग-अलग भागने की प्रतिक्रिया के सरपट और क्रॉल चरणों के लिए विभिन्न कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ियों की गोलीबारी और स्थानों का पता चलता है। ध्यान दें कि सरपट और क्रॉल दोनों चरणों में एक ही क्लस्टर को सौंपे गए कई न्यूरॉन्स ने गैंगलियन में एक-दूसरे के साथ शारीरिक निकटता का प्रदर्शन किया, जो पूर्व निष्कर्षों के अनुरूप12था।

बर्गिया
एओलिड न्यूडिब्रांच बर्गिया स्टेफनी (चित्रा 5A)न्यूरोसाइंस के लिए एक नई मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। एक ठेठ बर्गिया प्रयोग के लिए इमेजिंग सेटअप चित्रा 5Bमें दिखाया गया है । व्यापक तंत्रिका गतिविधि प्रकाश में लाना करने के लिए, एक सक्शन इलेक्ट्रोड सबसे प्रमुख बाएं पेडल तंत्रिका पर रखा गया था, और एक तंत्रिका उत्तेजना एक 2 मिनट रिकॉर्डिंग में 30 एस दिया गया था । आईसीए-प्रसंस्कृत निशान 55 न्यूरॉन्स(चित्रा 5C)में सहज और उत्तेजना पैदा गतिविधि दोनों से पता चला। आम सहमति क्लस्टरिंग के माध्यम से समुदाय का पता लगाने से दस अलग-अलग कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ी की पहचान की गई, जिन्हें नेटवर्क ग्राफ में और चित्रा 5E में चित्रित किया गया है, जो उनके क्लस्टरिंग असाइनमेंटके आधार पर चित्र 5 सी में दिखाए गए निशानों को पुनर्गठित करता है। सभी दर्ज न्यूरॉन्स से संकेतों के गॉसियन वितरण सभी 55 दर्ज न्यूरॉन्स की स्थिति को इंगित करने के लिए चित्रा 5F में तैयारी की एक छवि पर आरोपित कर रहे हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्टिकल इमेजिंग रिग और फोटोडिओड सरणी (पीडीए) के दृश्य। (A)ऑप्टिकल इमेजिंग रिग, पीडीए, डिजिटल कैमरा, माइक्रोस्कोप, और मंच की विशेषता । (ख)पीडीए का इंटरनल डिजाइन, जिसमें फाइबर ऑप्टिक्स इमेजिंग अपर्चर को 464 फोटोडिओड से कनेक्ट करते हैं। एम्पलीफायरों की एक पंक्ति फोटोडिओड्स के ऊपर स्थित है। (ग)इमेजिंग अपर्चर का षट्कोणीय चेहरा, जिस पर क्षेत्र को चित्रित किया जा रहा है, केंद्रित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में आवश्यक कार्यप्रवाह को दर्शाते हुए एक फ्लोचार्ट। इमेजिंग के विवरण के माध्यम से विच्छेदन और धुंधला होने से वीएसडी इमेजिंग प्रोटोकॉल में आवश्यक कदमों को इस प्रवाहकार्ट में चित्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ट्राइटोनिया डायोमेडियाके परिणाम, कच्चे, फ़िल्टरएड और स्पाइक-हल किए गए डेटा को दर्शाते हैं। (क) ट्राइटोनिया अपने तैरने के माध्यम से शिकारी समुद्री स्टार पाइकोपोडिया हेलीएंथोइड्स से बचने के लिए, जिसमें शरीर के बारी-बारी से पृष्ठीय और वेंट्रल फ्लेक्सेशन होते हैं । (ख)इमेजिंग सेटअप की योजनाबद्ध । सेरेब्रोप्लेरल गैंगलियन के सीई = सेरेब्रल पालि; Pl = सेरेब्रोल्युरल गैंगलियन का प्ल्युरल लोब; पीडी = पेडल गैंगलियन। (ग)20 फोटोडियोड से कच्चे डेटा, कॉन्ट्रालेट्रल पीडीएन 3 (तीर द्वारा इंगित उत्तेजना) की उत्तेजना के लिए बाएं पेडल गैंगलियन में गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। (घ) सी (5 और 100 हर्ट्ज बैंडपास बटरवर्थ फिल्टर) के समान डायोड से फ़िल्टर किए गए डेटा। (ई)इमेजिंग सॉफ्टवेयर आउटपुट जिसमें सभी 464 डायोड द्वारा एकत्र किए गए संकुचित निशान तैयारी की छवि पर स्थलाकृतिक रूप से आरोपित होते हैं। 20 डायोड जिनके निशान सी और डी में दिखाए गए हैं, की स्थिति लाल रंग में हाइलाइट की जाती है। (एफ)आईसीए के माध्यम से स्पाइक-छंटाई द्वारा उत्पन्न तीस चयनित एकल-न्यूरॉन निशान। (जी) एफमें लाल बॉक्स के अनुरूप चार एकल-न्यूरॉन निशान का एक विस्तारित दृश्य, उच्च लौकिक संकल्प पर उनकी कार्रवाई क्षमता प्रदर्शित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एपलिसिया कैलिफॉर्निकाके परिणाम, लंबी अवधि की रिकॉर्डिंग, सिग्नल मैपिंग और आयामीता में कमीको दर्शातेहैं। (A) एपलिसिया के अनुक्रमिक एस्केप मोटर प्रोग्राम के दो चरण, सरपट और क्रॉल । (ख)इमेजिंग सेटअप की योजनाबद्ध । सीई = सेरेब्रल गैंगलियन; Pl = प्ल्युरल गैंगलियन; पीडी = पेडल गैंगलियन। (ग)सही पेडल गैंगलियन में 81 न्यूरॉन्स की 20 मिनट की रिकॉर्डिंग कॉन्ट्रालेट्रल पीडीएन9 (तीर द्वारा इंगित) को उत्तेजना का जवाब देती है। निशान के नीचे हरे, सियान, और गहरे नीले रंग की सलाखों के पूर्व उत्तेजना अवधि, सरपट, और भागने मोटर कार्यक्रम के क्रॉल चरणों, क्रमशः संकेत मिलता है । (घ)आईसीए द्वारा पहचाने गए सभी 81 न्यूरोनल सिग्नल स्रोतों के स्थानों के मैप किए गए प्रोबैबिलिटी गॉसियन वितरण के साथ तैयारी की एक छवि। हरी रूपरेखा गैंगलियन के संबंध में पीडीए के षट्कोणीय चेहरे की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक गॉसियन पर संख्या सीमें ट्रेस नंबरों के अनुरूप है । (ई)20 मिनट की फाइल के दौरान एक दूसरे के खिलाफ पहले तीन प्रमुख घटकों की साजिश रचने वाले प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग करके आयामीता में कमी । पूर्व उत्तेजक बेसलाइन, सरपट, और क्रॉल युग क्रमशः हरे, सियान और गहरे नीले रंग में दिखाए जाते हैं। इस रिकॉर्डिंग के अनुरूप न्यूरोनल फायरिंग के एनिमेशन के लिए वीडियो 1-3 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बर्गिया स्टेफनी,तंत्रिका विज्ञान के लिए एक नई प्रजाति, नेटवर्क ग्राफिंग, कार्यात्मक क्लस्टरिंग,और द्विपक्षीय सिग्नल मैपिंगको चित्रित करने से परिणाम। (A)एक बर्गिया नमूना । (ख)इमेजिंग सेटअप की योजनाबद्ध । सीई = सेरेब्रल पालि सेरेब्रल गैंगलियन; Pl = सेरेब्रोल्युरल गैंगलियन का प्ल्युरल लोब; पीडी = पेडल गैंगलियन; आरएच = राइनोफोर गैंगलियन। (ग)सेरेब्रोप्लेरल गैंगलिया में 55 द्विपक्षीय न्यूरॉन्स की सहज और उत्तेजना पैदा गतिविधि को प्रदर्शित करने वाले निशान (उत्तेजना का वितरण तीर द्वारा इंगित किया जाता है)। (घ)दस कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ी को प्रदर्शित करने वाला एक नेटवर्क ग्राफ, प्रत्येक ने एक अनूठा रंग सौंपा, जिसकी पहचान आम सहमति क्लस्टरिंग के माध्यम से की गई है । इस साजिश में नोड्स न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां नेटवर्क अंतरिक्ष में दूरी कलाकारों की टुकड़ी के भीतर और बीच में फायरिंग सहसंबंध की डिग्री का प्रतिनिधित्व करती है। (ई) सी में निशान पुनर्व्यवस्थित और रंग कोडित कर रहे है (डीकी रंग योजना के बाद) कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ी में । (च)तैयारी की एक छवि हर दर्ज न्यूरॉन से संकेतों के मैप स्थानों को दिखाने, और सी और ई में ट्रेस संख्या है जो वे पत्राचार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: पूर्ण, 20 मिनट के Aplysia बच लोकोमोटर कार्यक्रमके एनीमेशन । सही पेडल गैंगलियन (बाएं पैनल) में 81 व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को ओवरली करते हुए सफेद आकृतियों की अस्पष्टता इसी न्यूरोनल निशान (दाएं पैनल) द्वारा संचालित की गई थी और औसत स्पाइक दर के एक समारोह के रूप में विभिन्न रैखिक रूप से (रिकॉर्डिंग में वास्तविक समय के प्रत्येक 0.61 एस के अनुसार) । प्रत्येक न्यूरॉन के लिए, पूर्ण अस्पष्टता रिकॉर्डिंग की अवधि में अपनी अधिकतम फायरिंग दर को सामान्यीकृत किया गया था। वीडियो में बीता समय का एक सेकंड वास्तविक समय के 12.2 एस का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार वास्तविक समय से मेल खाता है, हरे, सियान और गहरे नीले रंग की रेखाओं के साथ निशान के नीचे क्रमशः एस्केप लोकोमोटर कार्यक्रम के पूर्व-उत्तेजना बेसलाइन, सरपट और क्रॉल चरणों का संकेत देता है। सरपट चरण के चारों ओर पीले बक्से और क्रॉल चरण के एक हिस्से से पता चलता है कि वीडियो 2 और 3में एनिमेशन उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रिकॉर्डिंग अंश। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 2: एपलिसिया एस्केप लोकोमोटर कार्यक्रम के सरपट चरण का एनीमेशन। आम सहमति क्लस्टरिंग मोटर कार्यक्रम के सिर्फ सरपट चरण में सभी ८१ दर्ज न्यूरॉन्स पर किया गया था कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ी प्राप्त करने के लिए, दृष्टिकोण और वर्णित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और रेफरी12में उपलब्ध कराया । एस्केप कार्यक्रम के इस चरण के दौरान काफी हद तक टॉनिक या अनियमित फायरिंग पैटर्न का प्रदर्शन करने वाले न्यूरोनल कलाकारों को इस वीडियो से छोड़ दिया गया था। काले और जैतून-हरे कलाकारों की टुकड़ी से संबंधित न्यूरॉन्स की कार्रवाई क्षमता वीडियो के ऑडियो ट्रैक में सुना जा सकता है, इसी न्यूरॉन्स और निशान पर प्रकाश डाला के साथ । औसत स्पाइक दरों को वीडियो 1 के रूप में और समकक्ष समय बिनिंग के साथ सामान्यीकृत किया गया था; वीडियो में बीता समय का 1 एस वास्तविक समय के 6.1 एस से मेल खाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 3: एपलिसिया एस्केप लोकोमोटर कार्यक्रम के क्रॉल चरण का एनीमेशन। आम सहमति क्लस्टरिंग सभी 81 दर्ज न्यूरॉन्स पर मोटर कार्यक्रम के क्रॉल चरण में कार्यात्मक कलाकारों की टुकड़ी प्राप्त करने के लिए किया गया था। मोटर कार्यक्रम के इस चरण के दौरान काफी हद तक टॉनिक या अनियमित फायरिंग पैटर्न का प्रदर्शन कलाकारों की टुकड़ी इस वीडियो से लोप कर दिया गया । वीडियो 1 और 2 और समकक्ष समय बिनिंग के साथ औसत स्पाइक दरों को सामान्य बनाया गया था; वीडियो में बीता समय का 1 एस वास्तविक समय के लगभग 12.2 एस से मेल खाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Discussion

हमारे बड़े पैमाने पर वीएसडी इमेजिंग दृष्टिकोण को लागू करने में सबसे महत्वपूर्ण विवरणों में से एक कंपन को कम करना है, जो डायोड में विपरीत किनारों के आंदोलनों का उत्पादन करता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े विरूपण साक्ष्य संकेत होते हैं। क्योंकि अवशोषण VSDs कार्रवाई क्षमता के साथ प्रकाश तीव्रता में बहुत छोटे प्रतिशत परिवर्तन का उत्पादन, कंपन कलाकृतियों, अगर रोका नहीं, ब्याज के न्यूरोनल संकेतों अस्पष्ट कर सकते हैं । हम कंपन कलाकृतियों को कम करने के लिए कई तरीकों को नियोजित करते हैं। सबसे पहले, हमारा इमेजिंग रूम भूतल पर स्थित है, जो हवा से निपटने के उपकरण और कई अन्य स्रोतों के निर्माण से संबंधित कंपन से तैयारी को अलग करता है। दूसरा, एक स्प्रिंग-आधारित आइसोलेशन टेबल का उपयोग किया गया था, जिसे अन्य पीडीए उपयोगकर्ताओं ने पुष्टि की है कि अधिक आम एयर टेबल16की तुलना में बेहतर कंपन गीला होता है। तीसरा, जल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग किया गया था, जो सतह की लहर से उत्पन्न छवि के उतार-चढ़ाव को समाप्त करते हैं। चौथा, तैयारी को चित्रित किया जा रहा है हल्के से चैंबर कवरस्लिप नीचे और एक कवरस्लिप टुकड़ा ऊपर से नीचे दबाया है कि सिलिकॉन प्लग या पेट्रोलियम जेली द्वारा जगह में आयोजित किया जाता है, आगे तैयारी को स्थिर के बीच दबाया गया था । यह गैंगलियन या गैंगलिया की उत्तल सतह को भी सपाट कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप उद्देश्य के फोकस के विमान में अधिक न्यूरॉन्स होते हैं, जो दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या को बढ़ाते हैं।

एक कार्रवाई क्षमता के परिणामस्वरूप VSD प्रकाश अवशोषण की डिग्री में बहुत छोटे परिवर्तनों के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए, पीडीए को तैयारी के माध्यम से लगभग संतृप्त प्रकाश प्राप्त करना आवश्यक है, जबकि एक ही समय में डाई के फोटोब्लैचिंग को कम करना। इस उद्देश्य के लिए, हम आम तौर पर प्रकाश तीव्रता आराम के 3-4 वी पर काम करते हैं, जैसा कि 1x स्थिति में पीडीए नियंत्रण पैनल गेन स्विच के साथ मापा जाता है (पीडीए के 464 एम्पलीफायर प्रकाश के 10 वी पर संतृप्त होते हैं)। डेटा अधिग्रहण के दौरान यह लाभ कारक 100x में बदल जाता है। पीडीए द्वारा मापा गया 3-4 वी तक पहुंचने के लिए पर्याप्त प्रकाश प्राप्त करना कई तरीकों से पूरा किया जा सकता है। सबसे पहले, एक अल्ट्राब्राइट एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें जो उपयोग में अवशोषण डाई के अवशोषण गुणों के लिए उपयुक्त तरंगदैर्ध्य प्रदान करता है। तदनुसार, 735-एनएम एलईडी कोलिमेटेड लैंप का उपयोग किया गया था, जो आरएच 155 और आरएच 482 के इष्टतम अवशोषण तरंगदैर्ध्य के साथ ओवरलैप होता है। दूसरा, यदि आवश्यक हो, तो एक फ्लिप-टॉप सबस्टेज कंडेनसर का उपयोग करें जो एलईडी प्रकाश स्रोत से प्रकाश को छोटे क्षेत्र में केंद्रित करता है। तीसरा, कोहलर रोशनी को प्राप्त करने के लिए कंडेनसर ऊंचाई को समायोजित करें, जो उच्च, यहां तक कि चमक और अधिकतम छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करता है। चौथा, सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल पाथवे में कोई हीट फिल्टर नहीं है, जो एलईडी लैंप के 735-एनएम तरंगदैर्ध्य को कम कर सकता है। पांचवां, ऑप्टिकल पाथवे से, यदि अधिक प्रकाश की आवश्यकता है, तो डिफ्यूजर निकालें। छठा, उच्च-एनए उद्देश्यों का उपयोग करें, जो उच्च स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं, और कम दीपक तीव्रता पर पीडीए तक पहुंचने के लिए पर्याप्त स्तर की रोशनी की अनुमति देते हैं। इसने हमें इस हद तक फोटोब्लैचिंग को कम करने की अनुमति दी है कि हम सभी फाइलों में एक ही प्रकाश तीव्रता का उपयोग करके और सिग्नल आयाम के महत्वपूर्ण नुकसान या फिर से धुंधला करने की आवश्यकता के बिना तैयारी के प्रति 10-20 मिनट की अवधि की कई अधिग्रहण फाइलें प्राप्त कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यदि प्रयोगकर्ता इन लंबी फ़ाइलों में न्यूरॉन्स को ट्रैक करना चाहता है, तो यह सुनिश्चित करें कि फोकल प्लेन नहीं बदलता है, और तैयारी आगे नहीं बढ़ती है। अंत में, पीडीए के लिए पर्याप्त प्रकाश मार्ग करने के लिए एक अतिरिक्त तरीका छोटे जानवरों, जो पतले है, और इस तरह कम अपारदर्शी गैंगलिया का उपयोग करने के लिए है ।

समय-समय पर हम पाते हैं कि ऑप्टिकल संकेतों का सिग्नल-टू-शोर अनुपात खराब हो जाता है और/या मोटर प्रोग्राम लय उप-क्षातिमल (जैसे, धीमी या असामान्य) हैं । जब यह लगातार होना शुरू होता है, तो हम वीएसडी के ताजा समाधानों को मिलाते हैं। वीएसडी के अलीकोट आमतौर पर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लगभग 6 महीने तक व्यवहार्य रहते हैं। संबंधित रूप से, यह ध्यान देने योग्य है कि बर्गियाके लिए, अब तक अवशोषण वीएसडी आरएच 482 के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए गए हैं। चूंकि आरएच 482 आरएच 155 की तुलना में अधिक लिपोफिलिक है, इसलिए यह बर्गियाके तुलनात्मक रूप से छोटे न्यूरॉन्स को बेहतर ढंग से दाग सकता है या इस उष्णकटिबंधीय प्रजातियों के लिए उपयोग किए जाने वाले उच्च रिकॉर्डिंग खारे तापमान पर अधिक प्रभावी ढंग से न्यूरोनल झिल्ली में रह सकता है।

पीडीए की एक सीमा-तंत्रिका गतिविधि की इमेजिंग आधारित 100x प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण से पहले हार्डवेयर में वोल्टेज संकेतों के एसी युग्मन से संबंधित है: हालांकि यह इस तकनीक के लिए आवश्यक उच्च आराम प्रकाश स्तर द्वारा उत्पादित बड़े डीसी ऑफसेट को हटाने के लिए एक आवश्यक सुविधा का प्रतिनिधित्व करता है, पीडीए के लिए आंतरिक एसी युग्मन झिल्ली क्षमता में धीमी गति से परिवर्तन के माप को रोकता है, जैसे सिनैप्टिक इनपुट से जुड़े। यदि धीमी या स्थिर-राज्य संभावित परिवर्तनों को रिकॉर्ड करना वांछित है, तो डीसी-युग्मित सीएमओएस कैमरा इमेजिंग सिस्टम का उपयोग उपथरहोल्ड गतिविधि को कैप्चर करने के लिए किया जा सकता है। बायर्न और उनके सहयोगियों ने हाल ही में आरएच155 के साथ इस तरह के सेटअप का उपयोग एपलिसिया17,18के बुक्कल गैंगलियन में न्यूरॉन्स की गतिविधि को चित्रित करने के लिए किया था। हम दोनों प्रणालियों का इस्तेमाल किया है और पाया कि CMOS कैमरा, डिटेक्टरों के अपने बहुत अधिक घनत्व (१२८ x १२८) के कारण, एक ही इमेजिंग समय7के लिए 50x बड़ा डेटा फ़ाइलें उत्पन्न करता है । पीडीए की छोटी फाइलें तेजी से प्रसंस्करण और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। यह विस्तारित एकल परीक्षण रिकॉर्डिंग(चित्रा 4)और सीखने के अध्ययन को भी सक्षम बनाता है, जिसमें कई परीक्षणों के डेटा को स्पाइक-सॉर्टिंग से पहले एक बड़ी फ़ाइल में परिवर्तित किया जाता है, जिससे नेटवर्क संगठन को ट्रैक किया जा सकता है क्योंकि सीखनेमें 19विकसित होता है।

अन्य कैमरा आधारित जांचों में, फ्लोरोसेंट वीएसडी का उपयोग क्रिस्टन और सहयोगियों द्वारा जोंक के सेगमेंटल गैंगलिया में नेटवर्क फंक्शन की जांच करने के लिए किया गया है । एक प्रभावशाली अध्ययन में इससे जानवर के तैरने या20क्रॉल करने के निर्णय में शामिल न्यूरॉन की पहचान हुई। एक अन्य अध्ययन में, क्रिस्टन एट अल ने जांच की कि जोंक की तैराकी और रेंगने वाले व्यवहार बहुआयामी बनाम समर्पित सर्किट21से प्रेरित हैं। हाल ही में, वैगननार और उनके सहयोगियों ने वोल्टेज इमेजिंग के लिए दो तरफा माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जो उन्हें एक जोंक सेगमेंटल गैंगलियन22में लगभग सभी न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। कई कैमरा आधारित इमेजिंग विधियों के विपरीत, हमारे पीडीए-आधारित इमेजिंग विधि का एक लाभ आईसीए द्वारा तेजी से और निष्पक्ष स्पाइक-छंटाई है, जो अंधा स्रोत अलगाव का एक रूप है जिसमें परिणाम प्रसंस्करण के लिए न्यूरोनल सीमाओं के बारे में कोई निर्णय शामिल नहीं है।

वीएसडी की पसंद के संबंध में, अवशोषित रंगों का एक लाभ आरएच 155 और आरएच 482 उनके साथ23, 24से जुड़ा थोड़ा-से-कोई फोटोटॉक्सीसिटी है, जो फ्लोरोसेंटवीएसडीकी तुलना में लंबे समय तक रिकॉर्डिंग समय को सक्षम करता है। इसके अलावा, हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले तेजी से अवशोषित वीएसडी गैस्ट्रोपॉड तैयारी में ओवरशूटिंग दैहिक कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं, जो आमतौर पर आयाम में 80 एमवी होते हैं। जैसा कि चित्र 3जीमें दिखाया गया है, हमारी ऑप्टिकल विधि कार्रवाई क्षमता अंडरशूट रिकॉर्ड कर सकती है (हमारी कोई भी रिकॉर्डिंग ट्रेस-औसत नहीं है): इससे पता चलता है कि हम जिन वीएसडी का उपयोग करते हैं, वे अन्य मॉडल प्रणालियों में कार्रवाई क्षमता को समझने में सक्षम होना चाहिए जो कुछ हद तक क्षीण होते हैं और इस प्रकार वे सोमा तक पहुंचने के समय तक ओवरशूटिंग नहीं करते हैं। फिर भी, हमारा ऑप्टिकल दृष्टिकोण उन प्रजातियों के लिए आदर्श नहीं हो सकता है जो सोमा में दर्ज होने पर अत्यधिक तनु वाली कार्रवाई क्षमता प्रदर्शित करने के लिए जानी जाती हैं।

तंत्रिका नेटवर्क पर बहुत वर्तमान अनुसंधान डिजाइनर ट्रांसजेनिक प्रजातियों की एक छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित किया जा रहा है । हालांकि, तंत्रिका विज्ञान को विभिन्न प्रकार की फाइटो आनुवंशिक रूप से अलग प्रजातियों के अध्ययन से लाभ होता है। कई अलग - अलग प्रजातियों का अध्ययन करने से यह जानकारी होती है कि सर्किट25,26कैसे विकसित होते हैं और नेटवर्क कार्य के सिद्धांतों को रोशन करते हैं जो फिला 1 ,2,3 ,4,27में आम हो सकते हैं । हमने अब तक कई गैस्ट्रोपोड प्रजातियों के लिए अपनी इमेजिंग विधि लागू की है, जिनमें एपलिसिया कैलिफोर्निका8,11,12, 13,14,28, ट्राइटोनिया डायोमेडिया8,9,11,14,19,28, ट्रिटोनिया फेस्टिवा28, Pleurobranchaea californica (अप्रकाशित डेटा), और सबसे हाल ही में Berghia stephanieae (चित्रा 5)। इस दृष्टिकोण की एक अपील यह है कि इसे कई प्रजातियों पर आसानी से लागू किया जा सकता है, जिसमें ट्रांसजेनिक जानवरों की कोई आवश्यकता नहीं है। हम यह स्वीकार करना चाहते हैं कि तेजी से अवशोषित रंगों और पीडीए के साथ वीएसडी इमेजिंग का हमारा उपयोग अग्रणी कार्य के नक्शेकदम पर चलता है जिसने इसे अर्ध-अक्षुण्ण, नवांक्स29 और एपलिसिया30 तैयारी का व्यवहार किया। हमारे दृष्टिकोण की तेजी पर हमारा जोर चिंताओं का जवाब है कि कई जांचकर्ता इस आशंका के कारण नई प्रजातियों में नेटवर्क अध्ययन शुरू करने में तेजी से अनिच्छुक हो सकते हैं कि तंत्रिका विज्ञानकेलिए व्यापक रुचि के वैज्ञानिक प्रश्नों का पता लगाने में सक्षम होने से पहले बुनियादी नेटवर्क संगठन की विशेषता के लिए अध्ययन के वर्षों के लिए आवश्यक होगा । तदनुसार, हमारा लक्ष्य यहां एक तकनीक प्रदर्शित करना है जो प्रक्रिया को बहुत गति देता है - इस बिंदु पर कि नेटवर्क संगठन में महत्वपूर्ण समान-दिन की अंतर्दृष्टि एकल तैयारी से प्राप्त की जा सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनएसएफ 1257923 और एनआईएच 1U01NS10837 ने सपोर्ट किया । लेखक प्रयोगशाला में जीन वांग की सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Achromat 0.9 NA swing condenser Nikon N/A
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 with SC-20 Controls perfusion saline temperature
Chamber thermometer Physitemp BAT-12 with IT-18 microprobe
Digital camera Optronics S97808
Dissecting forceps Dumont #5
Dissecting scissors American Diagnostic Corp. ADC-3410Q
Imaging microscope Olympus BX51WIF
Imaging perfusion chamber Siskiyou PC-H
Instant Ocean Instant Ocean SS6-25 Makes 25 gallons at a time
Master-8 pulse stimulator A.M.P.I. Master-8
Microdispenser Drummond Scientific 3-000-752 Dye applicator for pressure staining
Microdissection scissors Moria 15371-92
Minutien pins (0.1 mm) Fine Science Tools NC9677548 For positioning and stabilizing CNS
Motorized microscope platform Thorlabs GHB-BX Gibraltar platform
NeuroPlex imaging software RedShirtImaging NeuroPlex Compatible with the WuTech photodiode array
Objective lenses Olympus XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340
PE-100 polyethylene tubing VWR 63018-726 Tubing to make suction electrodes
Perfusion pump Instech P720 with DBS062SDBSU tube set
Petroleum jelly Equate NDC 49035-038-54
Photodiode array with control panel WuTech Instruments 469-IV photodiode array Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information
RH155 Santa Cruz Biotechnology sc-499432 Voltage-sensitive dye
RH482 Univ of Conn. Health Center JPW-1132 Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow
Silicone earplugs Mack's Model 7 To be use for preparation compression
Staining PE tubing VWR 63018-xxx Different sizes depending on fit
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Thorlabs LED and driver Thorlabs M735L2-C1, DC2100 LED lamp and driver
Tygon tubing Fisher Scientific 14-171-xxx
Vibration isolation table Kinetic Systems MK26 Spring-based

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References

  1. Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
  2. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
  3. Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
  4. Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
  5. Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  6. Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
  7. Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
  8. Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
  9. Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
  10. Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
  11. Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
  12. Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
  13. Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
  14. Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
  15. Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
  16. Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
  17. Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
  18. Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
  19. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
  20. Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
  21. Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
  22. Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
  23. Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
  24. Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
  25. Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
  26. Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
  27. Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
  28. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
  29. London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
  30. Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
  31. Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).

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जीव विज्ञान अंक 161 ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंग बड़े पैमाने पर इमेजिंग ट्राइटोनिया, एपियासिया, बर्गिया
गैर-ट्रांसजेनिक अकशेरुकी में एकल-न्यूरॉन रिज़ॉल्यूशन के साथ रिकॉर्डिंग नेटवर्क डायनेमिक्स के लिए फोटोडिओड-आधारित ऑप्टिकल इमेजिंग
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