Summary
Wir beschreiben die Verfahren zur Isolierung wachsender Eizellen von Eierstockfollikel in frühen Entwicklungsstadien sowie den Aufbau eines In-vitro-Kultursystems, das das Wachstum und die Differenzierung bis in die ausgewachsene Phase unterstützen kann.
Abstract
Die begrenzte Reserve an reifen, befruchtbaren Eizellen stellt ein großes Hindernis für den Erfolg der assistierten Fortpflanzung bei Säugetieren dar. Wenn man bedenkt, dass während der Fortpflanzungszeit nur etwa 1% der Eizellen in einem Eierstock reifen und Eizellen entwickelt wurden, wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Ausbeutung der Eierstockreserve für die wachsende Bevölkerung von nicht-ovulatorischen Follikel zu erhöhen. Solche Technologien haben Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme in Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Das enorme Potenzial der Eierstockreserve ist jedoch noch weitgehend ungenutzt. Bei Kühen wurden beispielsweise einige Versuche unternommen, die In-vitro-Kultur der Eizellen in bestimmten Entwicklungsstadien zu unterstützen, aber es wurden noch keine effizienten und zuverlässigen Protokolle entwickelt. Hier beschreiben wir ein Kultursystem, das die physiologischen Bedingungen des entsprechenden Follikelstadiums reproduziert, definiert, um in vitro wachsende Eizellen zu entwickeln, die aus rinderfrühen Antralenfollikel gesammelt werden, bis zum ausgewachsenen Stadium, das dem medium antralen Follikel in vivo entspricht. Eine Kombination von Hormonen und einem Phosphodiesterase-3-Hemmer wurde verwendet, um eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern und die Differenzierung der Oozyten zu steuern.
Introduction
Während der Fortpflanzungsdauer wird nur ein minimaler Bruchteil der Eizellen, die in einem Eierstock reifen, in den Eileitern nach dem Eisprung freigesetzt und zur Befruchtung zur Verfügung gestellt und zu einem lebensfähigen Embryo1entwickelt. Auf der anderen Seite, die meisten der Eizellen innerhalb eines Eierstocks unterziehen Atresie und werden nie eigewellt. In-vitro-Embryoproduktion (IVP) Technologien haben versucht, die Ausbeutung der Eierstockreserve zu erhöhen2,3. Bisher haben solche Technologien Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme bei Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Dennoch verwenden die meisten Protokolle Eizellen, die im Grunde die Wachstumsphase innerhalb des antralen Ovarialfollikels abgeschlossen haben, und werden daher als ausgewachsene Eizellen bezeichnet. Bei Rindern, bei denen IVP-Technologien weit verbreitet sind, erreichen ausgewachsene Eizellen einen Enddurchmesser von ca. 120 m und werden aus Follikel mit einem Durchmesser von 2 bis 8 mm (mittlere Antraline)1gesammelt. Nach Isolierung von den Follikel werden solche Eizellen in vitro gereift und befruchtet. Die Zygoten werden dann bis zum Blastozystenstadium kultiviert und entweder in einen Empfänger übertragen oder kryokonserviert. Bei Rindern wie auch bei vielen anderen Arten hat sich die Zahl der in vitro produzierten Embryonen pro Kuh in den letzten 40 Jahren trotz des Potenzials von IVP nicht wesentlich verbessert. Dies ist zum Teil auf die begrenzte Anzahl ausgewachsener Eizellen zurückzuführen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt einen Eierstock bevölkern, der abgerufen und den Standard-IVP-Techniken4,5,6unterzogen werden kann.
Die in frühen Antradenfollikel eingeschlossenen Eizellen, d.h. die Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm, stellen eine potentielle Quelle dar, die in Fruchtbarkeitserhaltungsprogrammen7 verwendet werden kann, da ein Eierstock etwa 10-mal mehr frühe Anralfollikel enthält als mittlere Antral8 .8 Diese Eizellen befinden sich jedoch noch in der Wachstumsphase und haben noch nicht die ausgewachsene Stufe9erreicht. Als solche sind sie immer noch transkriptional aktiv, produzieren mRNAs, die für spätere Entwicklungsschritte gespeichert werden, und haben noch nicht alle Differenzierungsprozess erforderlich, um die Eizellen mit der Fähigkeit der spontanen Wiederaufnahme und Vervollständigung der Meiose ich einmal isoliert aus dem Follikulärfach10,11. Daher können sie nicht direkt den Standard-In-vitro-Reifungsprotokollen (IVM) unterzogen werden, aber sie erfordern eine zusätzliche Kulturperiode, die es ihnen ermöglichen würde, die Wachstumsphase abzuschließen und richtig zu differenzieren.
Der Übergang vom Anbau zum ausgewachsenen Stadium, der bei Rindern auftritt, wenn sich der Follikel vom frühen Antrale zum mittleren antralen Stadium entwickelt, ist einer der kritischen Schritte während der Eizellenentwicklung. Bei Rindern versuchten mehrere Studien, diese Ereignisse in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19zu rekapitulieren. Bisher wurden jedoch keine zuverlässigen Protokolle entwickelt und nur begrenzter Erfolg gemeldet. Nach früheren Studien20bilden diese wachsenden Eizellen eine homogene Population. Neben der Transkriptionsaktivität wird ihr Chromatin im Keimbläschen (GV) in einer Konfiguration mit dem Namen GV02,21verteilt. Umgekehrt ist die Population ausgewachsener Eizellen, die aus mittleren Antralenfolliken gewonnen werden, heterogener, ein Zustand, der sich in den verschiedenen Graden der Chromatinverdichtung (GV1, GV2 und GV3) widerspiegelt, die beobachtet werden können20. Unter diesen haben frühere Daten gezeigt, dass GV2 und GV3 Oozyten insgesamt durch eine bessere Qualität und höhere embryonale Entwicklungskompetenz gekennzeichnet sind20,21,22,23,24.
Ausgehend von den obigen Beobachtungen beschreiben wir hier ein 5 Tage langes Kultursystem von Eizellen (L-IVCO), das die Differenzierung von Eizellen ermöglicht, die als Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) von frühen antralen Follikel isoliert sind. Diese Kulturstrategie hat sich aus 10 Jahren langen Studien in unserem Labor entwickelt und wurzelt ihren Grund auf der zuvor entwickelten 24-48 Stunden In-vitro-Oozytenkultur (IVCO)2, Prämaturationssysteme23,25 und Zink-Supplementierung während der Oozytenkultur . Eine Kombination aus Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und einem Phosphodiesterase-3 (PDE3)-Hemmer, der in der Lage ist, die Cumulus-Oozyten-Kommunikation zu verbessern2, eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern2, und das Oozytenwachstum2 zu unterstützen, wurde verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eierstöcke wurden von 4 bis 8 Jahre alten Holsteiner Milchkühen gesammelt, die im örtlichen Schlachthof geborgen wurden (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Medienvorbereitung
HINWEIS: Alle Medien müssen mindestens vier Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden. Natriumbicarbonat-gepufferte Medien werden bei 38,5 °C und 5%CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit, inkubiert. HEPES-gepufferte Medien werden im Thermostatofen bei 38,5 °C gehalten.
- Lange In-vitro-Kultur von Eizellen (L-IVCO) Medium
- 15 ml des Grundkulturmediums vorbereiten (M199-B): Ergänzung M199 mit 2 mM Glutamin, 0,4% fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 mM Natriumpyruvat, 25 mM Natriumbicarbonat, 0,1 mM Cysteamin, 21,3 g/ml Phenolrot, 75 g/ml Kanamycin und 4% Polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 k Molekulargewicht).
- 3 ml des Haltemediums (M199-H) vorbereiten: Zu M199-B 5 m Cilostamid hinzufügen und in eine 35 mm Petrischale gießen.
- L-IVCO-Medium (M199-L) vorbereiten: Ergänzung M199-B mit 0,15 g/ml ZnSulfat, 10-4 I.E./ml FSH, 10 ng/ml Estradiol, 50 ng/ml Testosteron, 50 ng/ml Progesteron und 5 mM Cilostamid.
- Legen Sie 200 l M199-L Medium in jeden Brunnen der 96 gut beschichteten Platte. Füllen Sie die Brunnen in den vier Rändern der Platte mit sterilem Kulturwasser, um die Verdunstung zu kompensieren und eine angemessene Luftfeuchtigkeit während der Kultur zu erhalten.
- Inkubieren Sie die 96-Wellplatte und das M199-H-Medium im Inkubator bei 38,5 °C und 5%CO2 in luftiger Luft, maximale Luftfeuchtigkeit.
- Dissektionsmedium
- Vorbereiten des Dissektionsmediums (M199-D): Ergänzung M199 mit 0,4% BSA-Fraktion V, 0,164 mM Penicillin, 0,048 mM Streptomycin, 1790 Einheiten/L Heparin. M199-D kann in loser Schüttung hergestellt, in 20 ml Aliquots abgegeben und 6 Monate bei 4 °C gelagert werden. Bei Bedarf warm und ergänzen 1 aliquot.
- Bereiten Sie 20 ml M199-D vor, ergänzt durch 5 M Cilostamid (M199-D Cilostamid).
2. Ovarialsammlung und -verarbeitung
HINWEIS: Alle Eingriffe werden bei Raumtemperatur (26 °C) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- Die Eierstöcke im Schlachthof von Kühen wiederherstellen.
- Die Eierstöcke in steriler Salin (NaCl, 9 g/L) bei 26 – 28 °C mit Penicillin 100 U/mL und Streptomycin 0,1 mg/ml einzusetzen.
- Transportieren Sie die Organe in warmesterile Saline innerhalb von 4 h ins Labor.
- Waschen Sie die Eierstöcke 4x in steriler Salin, die bei 26 °C gehalten wird.
- Entfernen Sie alle mittelgroßen Antalfollikel, indem Sie alle Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 2 mm mit einer 18 G Nadel, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, mit einem Vakuumdruck von -28 mmHg anheben, und legen Sie die angesaugten Eierstöcke in einen Becher mit steriler Kochsaline bei 26 °C.
ANMERKUNG: Die Entfernung des Follikelgehalts > 2 mm ist ein entscheidender Schritt, um die Quelle ausgewachsener Eizellen, die das Experiment "kontaminieren" würden, so weit wie möglich zu entfernen. - Unter einer horizontalen laminaren Strömungshaube einen Eierstock auf ein steriles Polytetrafluorethylen-Schneidbrett legen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Klinge Nr. 22, die auf einem Skalpellgriff montiert ist, Scheiben des Eierstockhirns (den äußeren Teil des Eierstocks, der die Follikel enthält), 1,5 – 2 mm dick und parallel zur Hauptachse des Organs.
- Die Scheiben des Eierstock-Kortex in eine sterile Glas-Petrischale mit Seziermedium auf eine warme Platte bei 38,5 °C legen.
HINWEIS: Ab sofort werden alle Verfahren bei 38,5 °C mit einer warmen Platte durchgeführt.
3. Auswahl und Isolierung der Follikel und Abruf der COCs
- Legen Sie eine Eierstock-Kortex-Scheibe in eine 60 mm Glas Petrischale mit 2-3 ml M199-D.
- Wählen Sie mit einem Seziermikroskop die Follikel zwischen 0,5 – 2 mm mit einem mit Mikrometern ausgestatteten Okular aus.
- Identifizieren Sie die gesunden, nicht-atretischen Follikel unter dem Stereomikroskop. Beurteilen Sie die Follikelatresie, indem Sie morphologische Parameter, wie z. B. ein sehr klares transluzentes Erscheinungsbild, mit einem dunklen COC im Inneren beobachten. Entsorgen Sie die atretischen Follikel und verarbeiten Sie alle anderen.
- Mit einer chirurgischen Klinge Nr. 22 auf einem Skalpellgriff montiert entfernen Sie das Eierstockgewebe um den Follikel auf einer Seite, bis der Follikel auf einer Kante ausgesetzt ist.
- Mit einer 26G-Nadel, die auf einer Spritze montiert ist, stellen Sie vorsichtig einen Schlitz in der freiliegenden Follikelwand her. Diese Aktion wird den Follikelgehalt freisetzen, der die COC, Follikelflüssigkeit und Zellklumpen umfasst.
- Identifizieren Sie das COC unter dem Mikroskop und untersuchen Sie auf Cumulusintegrität, Zona-Pellucida-Integrität und Homogenität des Zytoplasmas. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, aspirieren Sie den COC mit einer P20-Pipette.
- Legen Sie das isolierte COC in M199-D Cilostamid.
- Fahren Sie mit dem Isolationsverfahren für 30 min fort.
4. Auswahl der COCs, die der In-vitro-Kultur unterzogen werden sollen
- Wählen Sie unter dem Seziermikroskop gesunde COCs nach den Kriterien in Schritt 3.6 aus.
- In einer 60 mm Petrischale 16 Tropfen von 20 l M199-D Cilostamid zubereiten und einen gesunden COC pro Tropfen platzieren (Abbildung 1A).
- Mit Hilfe eines invertierten Mikroskops, das an einer Kamera befestigt ist, messen Sie den Oozytendurchmesser, mit Ausnahme der Zona pellucida, mit der software, die mit der Kamera geliefert wird.
- Mit einer klaren Visualisierung der Eizelle, machen Sie zwei senkrechte Messungen ohne die Zona pellucida (Abbildung 1B).
- Stellen Sie sicher, dass der Mittelwert der Messung der beiden Eizellen, mit Ausnahme der Zona pellucida, in einem Bereich von 100 – 110 m liegt. Entsorgen Sie COCs mit nicht gerundeblich geformter Oozyte oder mit nicht messbaren Eizellen.
- Übertragen Sie die ausgewählten COCs in eine 35-mm-Schale mit M199-H-Medium und bewahren Sie sie im Inkubator bei 38,5 °C und 5 %CO2 in der Luft auf, maximale Luftfeuchtigkeit bis Schritt 5.1.
- Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 bis 4x. Die Gesamtarbeitszeit darf 2 h nicht überschreiten.
5. Lange In-vitro-Kultur der Eizellen (L-IVCO)
- Übertragen Sie einen COC pro Brunnen in der Mitte eines Brunnens der 96 Brunnenplatte, die in Schritt 1.1.5 vorbereitet werden soll.
- Inkubieren Sie die Platte für 5 Tage bei 38,5 °C und 5%CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit.
- Jeden zweiten Tag (Tag 2 und Tag 4) frische M199-L vorbereiten, wie in Schritt 1 beschrieben.
- Erneuern Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie 100 l Medium entfernen und durch 100 l frisch zubereitetes M199-L ersetzen. Führen Sie die mittlere Erneuerung unter dem Stereomikroskop durch und vermeiden Sie, die COCs in den Brunnen zu verschieben.
6. COC-Klassifizierung nach der Kultur
- Analysieren Sie am Ende des L-IVCO die Morphologie der COCs unter dem Seziermikroskop.
- Klassifizieren, wie in Abbildung 2dargestellt.
- Klassifizieren Sie als Klasse 1, wenn COCs eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen von Cumulusexpansion und Zelldegeneration aufweisen.
- Klassifizieren Sie als Klasse 2, wenn COCs eine kompakte Cumuluszellinvestition ohne Anzeichen von Cumulusexpansion und Zelldegeneration und mit antrumähnlicher Bildung in der Cumulusmasse aufweisen.
- Klassifizieren Sie als Klasse 3, wenn COCs mehrere Schichten von Cumuluszellen ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion und einige disaggregierte Zellen in der äußeren Schicht von Cumuluszellen und keine antrumartige Bildung aufweisen.
- Klassifizieren Sie als Klasse 4, wenn COCs einen reichlichen Verlust von Cumuluszellen aufweisen, die sich über mehr als 50 % der Eizellenoberfläche erstrecken, sowie Anzeichen einer Zelldegeneration und Zellablagerungen.
7. Bewertung der meiotischen Progression nach der Kultur
- Oocyte Denudation
- Legen Sie jeden COC in einen einzigen Brunnen einer Vier-Brunnen-Platte, die 400 l 199D pro Brunnen enthält.
- Entfernen Sie unter einem Seziermikroskop die Cumuluszellen vorsichtig mechanisch durch wiederholtePipettierung mit einer Pipette, die auf 130-140 l eingestellt ist.
- Sobald die Eizellen frei von der Cumulus-Investition sind, übertragen Sie sie in einen anderen Brunnen, der 199D enthält.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Eizellen vollständig denuded sind.
- Oocyte-Atomfärbung
HINWEIS: Von nun an werden alle Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt. Reagenzien sind bei Raumtemperatur.- Fixieren Sie die Eizellen in Paraformaldehyd 4% in Phosphatpuffer-Saline (PBS) für 1 h.
VORSICHT: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstungen beim Umgang mit Paraformaldehyd und entsorgen Sie kontaminierte Materialien gemäß den Richtlinien für die Entsorgung gefährlicher Abfälle. - Waschen Sie die Eizellen 3x für je 5 min in PBS mit 1% Polyvinylalkohol (PVA).
HINWEIS: Die Proben können sofort verarbeitet oder bei 4 °C für maximal eine Woche gelagert werden. - Legen Sie die Eizellen 10 min in PBS mit 0,1% Triton X.
- Waschen Sie die Eizellen 3x für je 5 min in PBS mit 1% PVA.
- Legen Sie die Eizellen einzeln in Tropfen von 5 l Antifade-Medium, ergänzt mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Dilaktat (1 g/ml) über eine Rutsche.
- Legen Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband entlang der langen Seiten der Rutsche, um eine übermäßige Abflachung der Eizellen zu vermeiden, wenn Sie den Deckelschlupf oben aufsetzen.
- Legen Sie den Deckelschlupf oben, lassen Sie es auf dem Band haften und halten Sie im Dunkeln, während die Verarbeitung aller Proben.
- Analysieren Sie die Eizellen mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop, das mit DAPI-Filtern (Erregung/Emission: 358/461) ausgestattet ist, um die meiotische Progression der Eizellen zu bewerten.
- Klassifizieren Sie die Eizellen nach ihrer meiotischen Progression: GV - Eizellen mit unterschiedlichen Graden der Chromatinkondensation innerhalb des GV; MI – Eizellen von GV, die in Metaphase I zerfallen; und degenerieren – Eizellen, die in keiner der vorherigen Stadien identifiziert werden konnten.
- Fixieren Sie die Eizellen in Paraformaldehyd 4% in Phosphatpuffer-Saline (PBS) für 1 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Am Ende des L-IVCO änderte sich die Bruttomorphologie der COCs und 4 Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert, wie in Abbildung 2dargestellt. Basierend auf den morphologischen Kriterien, die üblicherweise zur Auswahl gesunder COCs11,26,27, der Klasse 1, 2 und 3 gewählt wurden, wurden die Klasse 4, die deutliche Anzeichen einer Degeneration wie das Fehlen vollständiger Schichten von Cumuluszellen um die Eizellen herum zeigte, als stark gefährdet und ungeeignet angesehen, sich nachgelagerten Verfahren in einer prospektiven IVP-Einstellung zu unterziehen. Insgesamt wurden 74 Eizellen in 5 biologischen Repliken analysiert, von denen 9,45% in Klasse 4 waren und aus der weiteren Auswertung verworfen wurden.
Wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt, ergab die Beurteilung des meiotischen Stadiums am Ende des L-IVCO, dass ein deutlich höherer Anteil der Eizellen (78,57 ± 4,43 %) blieb in der unreifen Phase verhaftet, wobei das Chromatin noch im GV (daher auch GV-Stufe genannt) eingeschlossen blieb, ohne zu degenerieren. 59,43 % davon waren in einer GV2/3-Konfiguration. Ein kleiner Prozentsatz nahm die Meiose wieder auf, die die Metaphase I erreichte (13,76 ± 5,85%) (7,67 ± 4,61%). Insgesamt wurden 67 Eizellen in 5 biologischen Repliken analysiert. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die L-IVCO-Kultur die Eizellenlebensfähigkeit unterstützt und gleichzeitig die meiotische Wiederaufnahme für 5 Tage verhindert.
Abbildung 1: Umriss der Schale zur Messung des Oozytendurchmessers und repräsentatives Bild eines COC. (A) Schematische Darstellung einer 60 mm Petrischale mit 16 Tropfen von 20 l M199-D, die jeweils einen einzigen COC enthalten. (B) Repräsentatives Bild eines COC mit der Achse, die zur Messung des Durchmessers verwendet wird. Beachten Sie, dass die Zona pellucida nicht enthalten ist. Skala Bar 50 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von COCs zum Zeitpunkt der Sammlung und nach L-IVCO. (A, B, C, D) Die obere Zeile (Sammlung) stellt COCs zum Zeitpunkt des Abrufs dar. (A', B', C', d') Das gleiche COC wird 5 Tage später, am Ende von L-IVCO, abgebildet und wie in Schritt 6.1 gemeldet klassifiziert. Die untere Reihe (5 Tage) stellt COCs dar, die als: Klasse 1 klassifiziert sind und eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen von Expansion und Zelldegeneration zeigen (A'); Klasse 2, die eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen von Expansion und Zelldegeneration und mit antrumähnlicher Bildung (Pfeile) in der Cumulusmasse (B') zeigt; Klasse 3, die mehrere Schichten von Cumuluszellen ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion und einige disaggregierte Zellen in der äußeren Schicht von Cumuluszellen (C') zeigt; Klasse 4, die einen reichlichen Verlust von Cumuluszellen auf mehr als 50% der Eizellenoberfläche und Anzeichen von Zelldegeneration und Zellablagerungen (D') zeigt. Skala Bar 40 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder des meiotischen Fortschreitens. Die obere Reihe (DNA-Färbung) zeigt die DNA (blau) der repräsentativen Eizellen bei (A) der GV0-Stufe und (B) GV2-ähnliche Konfiguration, (C) MI-Stufe und (D) degenerierte Eizellen, (A) zum Zeitpunkt der Sammlung und (B, C, D) nach 5 Tagen L-IVCO. Die untere Zeile ist das entsprechende Bild im hellen Feld der Oozyte in der oberen Zeile. Der Pfeil zeigt die GV an. Skala Bar 20 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Meiotische Progression der Eizellen am Ende der Kultur. Das Balkendiagramm stellt die Verteilung der Eizellen auf der GV- und MI-Stufe und der degenerierten Eizellen am Ende des L-IVCO dar. Die bisher in Klasse 4 eingestuften Eizellen wurden ausgeschlossen. Die Daten wurden mit 1-Wege-ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest analysiert und Werte sind Mittel ± SEM (N=5; P<0.05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir ein Kultursystem für wachsende Eizellen, das die Eizellenentwicklung für 5 Tage fördert, indem es ihre Lebensfähigkeit unterstützt und die meiotische Wiederaufnahme verhindert. Dieser letztgenannte Aspekt ist von größter Bedeutung, um das kontinuierliche Wachstum und die Differenzierung zu ermöglichen, die notwendig sind, um die Eizelle mit meiotischer und embryonaler Entwicklungskompetenz2,20zu verleihen, die andernfalls durch eine vorzeitige Wiederaufnahme der meiotischen Teilung blockiert würde.
Bei der Entwicklung dieses Kultursystems haben wir mehrere Merkmale des physiologischen Wachstums und der Differenzierung berücksichtigt, die im Follikel auftreten. In diesem Abschnitt geben wir einen Überblick über die wichtigsten Aspekte, die wir bei der Entwicklung dieser Strategie berücksichtigt haben.
Zunächst dauert das Anwachsen von Eizellen in den frühen Antralinen von Rindern etwa 5 Tage, um den Übergang vom Wachsen zum ausgewachsenen Stadium in vivo8,19zu durchlaufen. Daher wurde die Länge der Kultur auf 5 Tage im Gegensatz zu früheren Versuchen in unserem Labor erhöht, wo die Eizellen für bis zu 24 h2kultiviert wurden.
Ein weiterer Faktor, den wir in die L-IVCO aufgenommen haben, war die erhöhte Viskosität des Mediums, in dem die COCs kultiviert werden, um die physiologische Viskosität der Follikelflüssigkeit nachzuahmen. Dies wurde durch Hinzufügen von 4% PVP neu erstellt und, zusammen mit der Verwendung von Kollagen I beschichtet Kulturoberfläche, förderte es die Bildung einer 3D-ähnlichen Kultur, wie in früheren Studien berichtet13.
Cilostamid, ein PDE3-Hemmer, wurde hinzugefügt, um Oozyten meiotisch im GV-Stadium zu halten, um eine frühkofaktische meiotische Wiederaufnahme zu verhindern, indem ein hohes Maß an zyklischen Nukleotiden in den Eizellen2,19,25,28,29gehalten wird. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine 5-tägige Behandlung mit Cilostamid keine groben Auswirkungen auf die Gesundheit der COCs hat, da nur ein kleiner Bruchteil der Komplexe degenerierte, auch in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Alam et al.19.
Die Aufnahme von Znsulfat und seine Konzentration wird durch jüngste Ergebnisse belegt, die zeigen, dass dieses Spurenelement eine Rolle bei der Unterstützung der Differenzierung und Transkriptionsaktivität von Rindern, die Eizellen in Kultur30anbauen, unterstützt.
Schließlich wurde eine Kombination von Hormonen eingeführt, um das physiologische hormonelle Milieu, das typisch für den frühen Antradenfollikel31,32,33ist, eng nachzuahmen. Zum Beispiel hat estradiol Aktivitäten bei der Unterstützung der Oozytenwachstum16,17,19 und die Verbindungen zwischen Granulosa-Zellen17, während auch die Förderung des Erwerbs von meiotic Kompetenz34. In ähnlicher Weise, Testosteron, abgesehen davon, ein Vorläufer von Estradiol, stimuliert auch follikuläres Wachstum und Entwicklung35, während Progesteron wurde hauptsächlich für seine antiapoptotische Aktivitäthinzugefügt 36.
Wichtig und in Übereinstimmung mit unserer vorherigen Studie2wurde die FSH-Konzentration in einer Konzentration gehalten, die für die Wachstumsphase physiologisch ist. Tatsächlich fördert eine niedrige FSH-Konzentration die Eizellenentwicklung, indem sie die Lücken-Kreuzung vermittelte Kommunikation zwischen der Oozyte und den begleitenden Cumuluszellen aufrechterhält und die Transkriptionsaktivität und Oozytendifferenzierung fördert, ohne meiotische Resumption2zu induzieren.
Unserer Erfahrung nach ist einer der Schlüssel zum Erfolg des L-IVCO die Auswahl einer homogenen Population gesunder COCs aus frühen Antraline. Nach Den Daten in der Literatur, 80% der Eizellen aus frühen antralen Follikel gesammelt sind durch Chromatin in einer Konfiguration als GV020organisiert gekennzeichnet. Diese Homogenität stellt einen Vorteil für die In-vitro-Kultur dar, da sie im Prinzip sicherstellt, dass sich die Zellen ähnlich verhalten, wenn sie der Kulturumgebung ausgesetzt sind. Vor diesem Hintergrund muss die COCs-Sammlung durchgeführt werden, um die "Kontamination" mit COCs aus weniger oder fortgeschrittenen Differenzierungsstadien zu minimieren. Aufgrund der Tatsache, dass die Verarbeitung der kortikalen Scheiben recht zeitaufwändig ist und in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden sollte, stellt der Sammel-/Auswahlschritt wahrscheinlich die kritischste Passage des L-IVCO dar. Um dies zu erreichen, sollten einige der wichtigsten Überlegungen Bart im Auge sein.
Zum Beispiel muss der Forscher/Techniker geschult werden, Follikel mit Anzeichen einer follikulären Atresie zu erkennen und zu entsorgen. In diesem Stadium können nur morphologische Parameter verwendet werden, um atretische Follikel zu erkennen, wie z. B. ein sehr klares transluzentes Aussehen und das Vorhandensein eines dunklen COC im Inneren. Alle anderen Follikel, in denen atretische Zeichen nicht eindeutig unterschieden werden können, sollten geöffnet werden und eine weitere Selektion auf der Grundlage der Morphologie der isolierten COCs sollte durchgeführt werden, um die gesunden 22,3,37,38,39zu identifizieren. Dies wird wiederum durch morphologische Beobachtungen wie das Vorhandensein von mindestens vier Schichten von Cumuluszellen, grob kugelförmige Form, intaktes Oolemma und homogenes und fein granuliertes Ooplasma11,26,27erreicht.
Die Isolierung und Manipulation von COCs stellt eine zusätzliche technische Herausforderung dar, die qualifiziertes Personal und die richtige Ausrüstung für die Mikrosektion unter dem Stereomikroskop und eine genaue Bestimmung des Eizellendurchmessers erfordert. Dieser letzte Schritt ist wesentlich, um eine einheitliche Population von Eizellen auszuwählen, wodurch jede mögliche Kontaminationsquelle mit COCs aus anderen Follikelstadien ausgeschlossen wird. Aus diesem Grund ist es wichtig, sicherzustellen, dass die in den abgerufenen COCs eingeschlossenen Eizellen einen Durchmesser zwischen 100 und 110 m2,40haben.
Neben der Unterstützung der Eizellenlebensfähigkeit und der Verhinderung der meiotischen Wiederaufnahme förderte der L-IVCO den Übergang der Chromatinkonfiguration von GV0 zu dem zunehmend kondensierten GV2 und GV3 in 59% der Eizellen. Insbesondere chromatin kondensation innerhalb des GV ist ein Marker des "Gewinns" der meiotischen und Entwicklungskompetenz in im Grunde alle Säugetier-Oozyten, die bisher untersucht wurden20. Dieses Ergebnis ist sehr vielversprechend, vor allem im Vergleich zu unserem vorherigen 24 Stunden IVCO System. In dieser Studie wurde der höchste Grad an Chromatinverdichtung innerhalb des GV nicht erreicht, und 22 % der Eizellen wurden mit einer GV1-Konfiguration2gefunden, einer Phase, die mit voller meiotischer Kompetenz verbunden ist, aber noch immer knappe Entwicklungskompetenz20. Selbst unter diesen Bedingungen waren die ansonsten inkompetent wachsenden Eizellen in der Lage, zu reifen und Embryonen zu produzieren, wenn auch in begrenzter Menge. Die im L-IVCO beobachtete konstante Zunahme der GV2/3-Stufen ist daher mit einem höheren Potenzial zur Erzeugung lebensfähiger Embryonen vereinbar. Wir sind dabei, diese Hypothese experimentell zu testen, indem wir COCs, die von L-IVCO abgeleitet wurden, den folgenden Schritten von IVP (In-vitro-Reifung, Befruchtung und Embryokultur bis zum Blastozystenstadium) unterwerfen. Sollte sich dies bestätigen, wird die L-IVCO einen Teil des noch ungenutzten Potenzials der Eierstockreserve freisetzen, mit wichtigen Auswirkungen auf mehrere Bereiche, die für die Erhaltung der weiblichen Fruchtbarkeit von Interesse sind. Zum Beispiel wird es die Quelle von befruchtbaren Gameten erhöhen, die in Erhaltungsprogrammen von Züchtern mit hohem genetischem Wert verwendet werden. Eine weitere Anwendung, die wir voraussehen, ist die genetische Bergung bedrohter Arten der Bovid-Familie sowie lokaler Rassen, die aufgrund der weit verbreiteten Verbreitung kosmohöflicher Rassen gefährdet sind oder von genetischer Erosion bedroht sind. Nicht zuletzt stellt L-IVCO ein Werkzeug für alle Wissenschaftler dar, die daran interessiert sind, die zellulären und molekularen Prozesse zu sezieren, die die Bildung einer kompetenten Gamete regulieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 und UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
