Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

تصوير الكالسيوم في سلوك حر Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد

Published: April 29, 2021 doi: 10.3791/61626
* These authors contributed equally

Summary

تم الإبلاغ هنا عن نظام لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد. يسمح هذا النظام للباحثين باستحضار الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة على نطاق النانو وتحديد تيارات الكالسيوم أثناء استجابات C. elegans للاهتزازات.

Abstract

تؤثر القوى الميكانيكية غير الموضعية ، مثل الاهتزازات والموجات الصوتية ، على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية من التطور إلى التوازن. الحيوانات تتعامل مع هذه المحفزات عن طريق تعديل سلوكها. يتطلب فهم الآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي تحديد كمية النشاط العصبي أثناء سلوك الاهتمام. هنا ، نبلغ عن طريقة لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي بتردد وإزاحة ومدة محددة. تسمح هذه الطريقة بإنتاج اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه جيدا باستخدام محول طاقة صوتي وتحديد كمية استجابات الكالسيوم المستحثة بدقة خلية واحدة. كدليل على المبدأ ، يتم إثبات استجابة الكالسيوم لخلية عصبية داخلية واحدة ، AVA ، أثناء استجابة هروب C. elegans للاهتزاز. سيسهل هذا النظام فهم الآليات العصبية الكامنة وراء الاستجابات السلوكية للمحفزات الميكانيكية.

Introduction

غالبا ما تتعرض الحيوانات لمحفزات ميكانيكية غير موضعية مثل الاهتزازات أو الموجات الصوتية 1,2. نظرا لأن هذه المحفزات تؤثر على التوازن والتنمية والتكاثر ، يجب على الحيوانات تعديل سلوكياتها للتعامل معها3،4،5. ومع ذلك ، فإن الدوائر العصبية والآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي غير مفهومة بشكل جيد.

السلوك الحسي الميكانيكي في الديدان الخيطية ، Caenorhabditis elegans ، هو نموذج سلوكي بسيط ، حيث عادة ما تغير الديدان السلوك من الحركة الأمامية إلى استجابة الهروب إلى الخلف عندما تواجه اهتزازا غير موضعي6. تتكون الدائرة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في المقام الأول من خمس خلايا عصبية حسية ، وأربعة أزواج من الخلايا العصبية الداخلية ، وعدة أنواع من الخلايا العصبية الحركية 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تعتاد الديدان على مثل هذه المحفزات الميكانيكية بعد التدريب المتباعد الذي ينطوي على التحفيز المتكرر9،10،11. لذلك ، تشكل هذه الاستجابة السلوكية البسيطة نظاما مثاليا للتحقيق في الآليات العصبية الكامنة وراء كل من السلوك والذاكرة غير الموضعية التي يستحدثها الاهتزاز. تم توضيح بروتوكول لتصوير الكالسيوم في الديدان التي تتصرف بحرية تحت تأثير الاهتزازات غير الموضعية. بالمقارنة مع الأنظمة التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، فإن هذا النظام بسيط من حيث أنه لا يتطلب كاميرا إضافية للتتبع ؛ ومع ذلك ، فإنه يسمح لنا بتغيير تردد وإزاحة ومدة الاهتزاز غير الموضعي. نظرا لأن تنشيط الخلايا العصبية الداخلية AVA يحفز استجابة الهروب إلى الوراء ، فقد تم استخدام الديدان التي تشارك في التعبير عن GCaMP ، وهو مؤشر الكالسيوم ، و TagRFP ، وهو بروتين فلوري غير حساس للكالسيوم ، تحت سيطرة مروج خاص ب AVA كمثال (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). يوضح البروتوكول تنشيط الخلايا العصبية AVA حيث تتحول الدودة من الحركة إلى الأمام إلى الخلف. يسهل هذا البروتوكول فهم آلية الدائرة العصبية الكامنة وراء السلوك الحسي الميكانيكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة الديدان حتى تصوير الكالسيوم

  1. قبل أربعة أيام من تجربة تصوير الكالسيوم، انقل اثنين من ديدان ST12 البالغة إلى صفيحة جديدة متوسطة النمو الخيطية (NGM) (جدول المواد) حيث يتم رسم الإشريكية القولونية OP50 في نمط مربع (حوالي 4 مم × 4 مم) باستخدام موزع الخلايا بحيث تقضي الدودة معظم الوقت في البكتيريا أثناء تصوير الكالسيوم12.
  2. احتضن لوحة NGM هذه لمدة 4 أيام عند 20 درجة مئوية في حاضنة (جدول المواد).

2. إعداد الأجهزة

  1. قم بإعداد مجهر مجهز بجهاز كهرضغطي للتحفيز13 ، وعدسة موضوعية 2x ، وكاميرا sCMOS عالية السرعة ، وبصريات تقسيم الصور ، ومرحلة x-y الآلية ، ومصدر ضوء LED للإثارة ، وجهاز كمبيوتر (الشكل 1). تشمل المواصفات الأساسية لكاميرا sCMOS 2560 × 2160 بكسل نشط ، بحجم 6.5 ميكرومتر ، مع رابط كاميرا 10 نقرات كخيار واجهة. تشمل المواصفات الرئيسية للمرحلة الآلية X-Y نطاق السفر 110 مم × 75 مم ، والسرعة القصوى 250 مم / ثانية ، و 2000 مم / ثانية2 أقصى تسارع ، و 0.25 ميكرومتر أحادية الاتجاه.
  2. قم بتشغيل الكمبيوتر ووحدة التحكم في المرحلة الآلية x-y.
  3. قم بتشغيل مكبر الصوت واضبط مستوى الصوت على 10 وضبط الجهير والثلاثي على 8.
  4. لإثارة GCaMP و TagRFP ، قم بتشغيل مصابيح 488 نانومتر و 560 نانومتر لمصدر ضوء LED. اضبط مقاييس 470 نانومتر و 550 نانومتر من جراب التحكم في مصدر الضوء على 5٪ بحيث تكون شدة ضوء LED مناسبة للتصوير.
    ملاحظة: في شدة LED هذه ، لا يحدث التبييض الضوئي لتألق GCaMP و TagRFP أثناء التسجيل.

3. إعداد البرامج لتصوير الكالسيوم

  1. قم بتنزيل وتثبيت ثلاث حزم برامج في Windows: برنامج ماكرو الماوس، وبرنامج التحكم في خاصية الاهتزاز، وبرنامج تشغيل برامج التعقب، وبرنامج تحليل البيانات (جدول المواد).
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف برنامج التتبع.
  3. اضغط على زر تشغيل وانتظر لمدة 5 دقائق لتحقيق الاستقرار في البرنامج (الشكل 2A).
  4. قدم معلومات عن وقت التعرض والضرب. يضمن وقت التعرض 0.033 ثانية مع 2 × 2 من التجديف الحصول على الصور بسلاسة (الشكل 2B).
    ملاحظة: يتم عرضكل صورة 10 عشر تم الحصول عليها فقط لتقليل حمل الذاكرة.
  5. توفير المعلومات للحصول على الصور (الشكل 2C). على سبيل المثال، عندما يتم تسجيل 500 صورة مرتين بفاصل زمني قدره 10 ثوان، أدخل 1000 في المربع إجمالي الصور، و500 في مربع الصور ، و10 في مربع الفاصل الزمني (الفترات الزمنية ).
  6. قم بتشغيل زر الاستحواذ (الشكل 2D).
  7. تقسيم الصورة الفلورية باستخدام بصريات تقسيم الصورة ، والصورتين (قناة GCaMP ، 500-525 نانومتر (الشكل 2E) ؛ يتم عرض قناة TagRFP ، 584-676 نانومتر (الشكل 2F)) على نصفين من كاميرا sCMOS. معايرة إحداثيات قنوات GCaMP و TagRFP (الشكل 2G). احفظ إعدادات البرنامج.
  8. اضبط الدليل لإخراج ملف البيانات (الشكل 2H).
  9. أوقف تشغيل زر الاكتساب (الشكل 2D).
  10. انقر نقرا مزدوجا فوق برنامج نظام الماكرو بالماوس (الشكل 3A) واضبط خصائص الاهتزاز (الشكل 3B). اقرأ ملف الفحص .txt باستخدام نظام الماكرو بالماوس بحيث يتم التحكم في مؤشر الماوس استنادا إلى الإحداثيات والجدول الزمني في هذا الملف (الشكل 3A). اضبط إحداثيات مؤشر الماوس (مربعات أرجوانية في الشكل 3A) وانتظر وقتا حتى التحفيز بعد بدء التسجيل (أرجواني في الشكل 3A). اضبط قيم التردد والسعة في برنامج التحكم في الاهتزاز (الشكل 3B).

4. إعداد الديدان لتصوير الكالسيوم

  1. انقل دودة واحدة تعبر عن كل من GCaMP و TagRFP من اللوحة المحتضنة إلى لوحة NGM جديدة جديدة تم خطها E. coli OP50.
  2. قم بتوصيل لوحة NGM بمحول الطاقة الصوتية الكهرضغطي باستخدام شريط لاصق شفاف (الشكل 4). لا تضغط على اللوحة على المحرك لأن هذا يغير تردد الاهتزاز.

5. تصوير الكالسيوم تحت سيطرة خصائص اهتزاز محددة

  1. قم بتشغيل زر الاستحواذ (الشكل 2D).
  2. ابحث عن الدودة تحت الضوء الساطع وضوء الإثارة (488 نانومتر و 560 نانومتر).
  3. اضبط قيمة التكبير/التصغير للفحص المجهري على 2.5x. مجال الرؤية هو 1.1 مم × 1.1 مم بدقة 2.6 ميكرومتر / بكسل.
  4. أطفئ الضوء الساطع وقم بتشغيل زر التوجيه (الشكل 2I) لتتبع بقعة الفلورسنت للدودة. يبدأ زر التوجيه هذا حركة مرحلة X-Y للحفاظ على منطقة الكثافة القصوى للدودة في منتصف مجال الرؤية في صورة TagRFP.
    ملاحظة: من حيث مروج flp-18 ، فإن كثافة الفلورسنت للخلايا العصبية AVA هي الأقوى وتلك الموجودة من الخلايا العصبية الأخرى باهتة أو غير مكتشفة. لذلك ، فإن نظام التكبير المنخفض غير مطلوب للتتبع وتتحرك المرحلة طوال التسجيل.
  5. تأكد من أن قيم أشرطة الشدة في الشكل 2E و2F تبلغ حوالي 1000. إذا لم تكن كذلك ، فقم بضبط مقاييس 470 نانومتر و 550 نانومتر لجراب التحكم في مصدر الضوء.
  6. اضغط على الزر تشغيل ( Run ) في نظام الماكرو بالماوس للسماح بالتحكم في مؤشر الماوس وفقا لجدول موضح في الشكل 3A. يبدأ هذا في التسجيل باستخدام برنامج التتبع والتحفيز بواسطة برنامج جين الموجة أثناء تتبع الدودة.
  7. تحقق مما إذا كان ملف BMP الناتج قد تم إنشاؤه بشكل مناسب.

6. تحليل البيانات

  1. قم بإنشاء مجلد على سطح المكتب وأطلق عليه اسم CalciumImaging.
  2. قم بإنشاء مجلد داخل مجلد CalciumImaging وقم بتسميته CIResult ، لملفات نتائج الإخراج.
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف DualViewImaging.nb المكتوب في برنامج تحليل البيانات لنظام التشغيل Windows.
  4. أدخل مسار الملف إلى مجلد CIResult (على سبيل المثال، DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (الشكل 5).
  5. أدخل مسار الملف إلى المجلد بما في ذلك ملف BMP (على سبيل المثال، SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (الشكل 5)، حيث يشير XXX إلى اسم المجلد بما في ذلك ملفات BMP.
  6. اضغط على مفتاحي Shift وReturn في وقت واحد لبدء التحليل التلقائي. يستخدم هذا التحليل قيمة منطقة الحد الأقصى للكثافة من مجال الرؤية في صورة TagRFP (انظر أسطورة الشكل 6 للحصول على إجراء حساب مفصل في البرنامج).
  7. تحقق مما إذا كانت ملفات الإخراج التالية قد تم إنشاؤها بشكل مناسب في مجلد CIResult.
    XXX-GCaMP.tif (ملف صورة يوضح آثار كثافة GCaMP لجميع الصور)
    XXX-GCaMP.xls (ملف جدول بيانات يسرد كثافة GCaMP في جميع الصور)
    XXX-TagRFP.tif (ملف صورة يوضح آثار كثافة TagRFP لجميع الصور)
    XXX-TagRFP.xls (ملف جدول بيانات يسرد كثافة TagRFP في جميع الصور)
    XXX-Ratio.tif (ملف صورة يوضح آثار قيمة النسبة لجميع الصور)
    XXX-Ratio.xls (ملف جدول بيانات يسرد قيمة النسبة في جميع الصور)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، يتم استخدام دودة تعبر عن كل من GCaMP و TagRFP تحت سيطرة المروج الخاص ب AVA interneuron كمثال على تصوير الكالسيوم في التصرف بحرية C. elegans. تم الحصول على بيانات قناة GCaMP و TagRFP كسلسلة من الصور ، بعضها موضح في الشكل 6 وكفيلم (فيلم تكميلي 1). كما تم تحديد إزاحة صفيحة بتري الناجمة عن نظام الاهتزاز غير الموضعي (الشكل 7). يمكن التحكم في الإزاحة عن طريق تعيين قيمة السعة في برنامج التحكم في الاهتزاز (الشكل 3B) وضابط مستوى الصوت في مكبر الصوت (الشكل 4) ، في حين يتم تنظيم التردد عن طريق تعيين قيمة التردد في البرنامج (الشكل 4). في التجارب الناجحة ، لوحظت استجابة كالسيوم عابرة للخلايا العصبية AVA عند التحفيز مع اهتزازات لها تردد 630 هرتز وإزاحة تبلغ حوالي 4.5 ميكرومتر ل 1 ثانية ، مما يشير إلى أن خلية AVA العصبية تم تنشيطها أثناء استجابة الدودة الخلفية للتحفيز غير الموضعي (الشكل 6). كما أظهرت خطوط الأساس لكل من إشارات GCaMP و TagRFP أنه لم يحدث أي تبييض ضوئي تقريبا أثناء التسجيل.

Figure 1
الشكل 1: تكوين نظام تخطيطي. يتم الاحتفاظ بلوحة NGM التي تتحرك عليها الدودة بحرية على محول صوتي. ينبعث ضوء الإثارة (488 نانومتر و 560 نانومتر) من مصدر ضوء LED. يتم تقسيم انبعاثات الفلورسنت GCaMP و TagRFP بواسطة بصريات تقسيم الصور ، بحيث يتم إسقاط كل انبعاث فلورسنت على نصف كاميرا sCMOS. يتحكم برنامج التتبع في المرحلة الآلية x-y لتتبع بقعة الفلورسنت للدودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لقطة شاشة للبرنامج لتتبع بقعة فلورسنت من دودة . (أ) زر التشغيل لتنشيط البرنامج. (ب) مربعات لإعداد دورة عرض الصورة ووقت (وقت) التعريض الضوئي والتجليد في كل قناة. (ج) صناديق لتوفير معلومات عن دورة الحصول على الصور. (د) زر الاستحواذ لبدء البث المباشر. (ه) صورة GCaMP. (و) صورة TagRFP. (ز) لوحة لإحداثيات المعايرة بين صور GCaMP و TagRFP. (H) مربع لإعداد مسار الملف. (I) زر التوجيه لبدء تتبع الدودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صورة لنظام الماكرو وبرنامج الماوس للتحكم في الاهتزاز. (أ) يشير المربع الأرجواني إلى إحداثيات مؤشر الماوس. يتم شرح معنى كل سطر نصي بأحرف أرجوانية. (ب) واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لبرامج التحكم في الاهتزاز. يتم التحكم في قيم تردد الاهتزاز والسعة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية هذه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صورة للوحة NGM المثبتة على محول الطاقة الصوتي باستخدام شريط لاصق شفاف. فقط دودة واحدة تتحرك على اللوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صورة لبرنامج تحليل البيانات. يشير التسطير الأرجواني والأزرق إلى المسارات المؤدية إلى مجلد CIResult والمجلد بما في ذلك ملفات BMP، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: آثار شدة تألق GCaMP (A) و TagRFP (B) ، وتغير النسبة (C ، D). (أ) -C) الآثار التمثيلية لإشارة GCaMP وإشارة TagRFP وتغيرات النسبة لدودة واحدة. يتم حساب تغيير النسبة باستخدام الملف DualViewImaging.nb، كما يلي. الإحداثيات التي تكون فيها شدة تألق TagRFP هي الحد الأقصى بعد استخراج طرح الخلفية لكل صورة. تعمل إشارة TagRFP هذه على التعويض عن تغيرات التركيز البؤري الناجمة عن حركة الحيوان. يتم حساب الحد الأقصى لشدة التألق ل GCaMP داخل الإحداثي المستخرج ±10 بكسل ككثافة إشارة GCaMP لكل صورة. لقياس النسب ، يتم حساب ((I GCaMP − I GCaMP_BG) − (I TagRFP − I TagRFP_BG)) / (I TagRFP − I TagRFP_BG) ، حيث I GCaMP و ITagRFP هما إشاراتGCaMP و TagRFP من الخلايا العصبية AVA ، على التوالي ، وأنا GCaMP_BG وأنا TagRFP_BG هي إشارات الخلفية ، على التوالي. تم تطبيق عملية الحساب هذه على جميع الصور لتحديد مقدار تغير النسبة في حدث انعكاس. يشير الخط الرأسي عند 5 ثانية في جميع الآثار إلى فترة التحفيز. (د) يتغير متوسط النسبة بالنسبة ل 15 ديدانا. يشير شريط الخطأ إلى SEM. يرجى النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: العلاقة بين المعلمات. (ألف) تم قياس عمليات الاستبدال كل 100 هرتز باستخدام مقياس اهتزاز دوبلر بالليزر، حيث تم تثبيت قيمة السعة في البرنامج الحاسوبي وقيمة ضابط مستوى الصوت في مكبر الصوت إلى 0 و10 على التوالي. لوحظ تردد الرنين بين 100-200 هرتز ، والذي كان مشابها للقيمة الموضحة في مواصفات محول الطاقة الصوتي. (ب) تم التحكم في الترددات والإزاحات بواسطة البرنامج (المدى؛ 100 إلى 1000 هرتز) ومكبر الصوت (النطاق: 1-10)، على التوالي وتم قياسهما باستخدام مقياس اهتزاز دوبلر بالليزر. يشار إلى قيمة السعة التي حددها البرنامج لكل تردد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي 1: فيلم تمثيلي لعابرات الكالسيوم في الخلايا العصبية الداخلية AVA لدودة تتصرف بحرية استجابة لاهتزاز غير موضعي 630 هرتز. تم استحضار التحفيز 5 ثانية بعد بدء التسجيل. تم التعبير عن GFP أيضا في أمعاء الدودة كعلامة حقن مشتركة ل GCaMP. لا يؤثر تألق GFP هذا على شدة إشارة GCaMP. يشار أيضا إلى شريط المقياس في الصورة الأولى. يشار إلى اتجاه الدودة في أعلى اليمين بعد الصورة الأولى. يعد مشغل وسائط Windows مناسبا لتشغيل ملف AVI ، ولكن يمكن أيضا تشغيله باستخدام بعض مشغلات الوسائط التي تم تنزيلها مجانا ، مثل مشغل وسائط VLC في Mac.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بشكل عام ، يتطلب التحديد الكمي للنشاط العصبي إدخال مسبار و / أو قيود على حركة جسم الحيوان. ومع ذلك ، بالنسبة لدراسات السلوك الحسي الميكانيكي ، فإن الإدخال الغازي للمسبار والقيود نفسها تشكل محفزات ميكانيكية. يوفر C. elegans نظاما للتحايل على هذه المشاكل ، لأن ميزاته شفافة ولأنه يحتوي على دائرة عصبية بسيطة ومدمجة تضم 302 خلية عصبية فقط. الجمع بين هذه المزايا والطريقة التي تم تطويرها سابقا لإثارة الاهتزازات غير الموضعية للإزاحة النانوية13 ، كما هو موضح هنا طريقة لتصوير الكالسيوم غير الغازي ل C. elegans غير المقيدة التي تستجيب للاهتزاز المتحكم فيه.

يتم تعريف خصائص المحفزات الميكانيكية من خلال عدة معلمات ، مثل التردد والإزاحة والمدة. في الآونة الأخيرة ، ظهر علم الهزائم الحيوية كمجال بحثي جديد1. الغرض الرئيسي من هذه الدراسات هو فهم الآليات الكامنة وراء إنتاج وتشتت واستقبال الاهتزازات الميكانيكية من قبل الكائنات الحية ، وتأثير تلك الاهتزازات على السلوك. تستخدم العديد من الحيوانات ، بما في ذلك البشر ، الموجات الاهتزازية والصوتية لمراقبة البيئة المحيطة. على سبيل المثال ، تكتشف العقارب الفريسة من خلال الاهتزاز الذي تحمله الركيزة14. لذلك ، الاهتزاز هو أداة للتواصل مع البيئة المحيطة. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة هنا للتحكم في معلمات الإدخال وتحديد الاستجابات العصبية على مستوى الخلية العصبية المفردة ، مما يؤدي إلى إنشاء مخطط مرحلي يصف العلاقة بين المدخلات والمخرجات. استنادا إلى مخططات الطور هذه ، يمكننا الحصول على رؤى حول المعلمات التي تؤثر على دوائر عصبية محددة ، والآليات التي تتعامل بها الحيوانات مع الاهتزازات الميكانيكية.

منذ عام 200715 ، تم تطوير العديد من الأنظمة لتصوير الكالسيوم أحادي الخلايا العصبية في C. elegans التي تتحرك بحرية. ركزت هذه الأنظمة بشكل أساسي على الاستجابات العصبية لدرجة الحرارة15,16 ، والروائح 16,17 ، ومحفزات اللمس 17. فيما يتعلق بالاهتزازات غير الموضعية ، تم تطبيق طريقة النقر على لوحة بتري منذ فترة طويلة لتحديد الاستجابات السلوكية. ومع ذلك ، فإن النقر على لوحة بتري على مرحلة x-y الآلية تسبب في خروج بقعة الفلورسنت من مجال الرؤية ، مما أدى إلى الفشل في تتبع دودة تتصرف بحرية. لذلك ، تم تضمين محول الطاقة الصوتية الكهرضغطية ، والذي يثير اهتزازا غير موضعي عبر المحور z ، في نظام التتبع. تسمح هذه الطريقة بإجراء تجارب قابلة للتكرار لتحديد الاستجابات العصبية للاهتزاز غير الموضعي.

وتتيح الأساليب المثبتة أيضا إمكانية مواصلة التوسع المنهجي. نظرا لأن البروتوكول الحالي يمكنه التقاط استجابات خلية عصبية واحدة فقط في بعدين ، فيجب تجهيز نظام التركيز البؤري التلقائي في المستقبل لمنع فقدان التركيز. من ناحية أخرى ، نظرا لأن العديد من طرق التصوير الحجمي قد تم تطويرها مؤخرا باستخدام C. elegans 18,19,20,21 ، فإن توسيع نهج التصوير الحجمي يجب أن يسمح بالقياس الكمي غير الغازي للخلايا العصبية المتعددة 22 أو حتى الدماغ بأكمله18,19,20,21 ، استجابة للاهتزاز الذي له خصائص يمكن التحكم فيها. ويمكن تطبيق مثل هذا النظام على النظام الذي أنشئ مؤخرا للتحقيق في الآليات الكامنة وراء السلوك الجماعي23. لذلك ، من المحتمل أن تمكننا التطبيقات البيولوجية الإضافية وامتدادات الطريقة من فهم الآليات العصبية الكامنة وراء السلوكيات الحسية الميكانيكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant No. JP18H02483)، بشأن مشروع "علم الروبوت الناعم" في المجالات المبتكرة (رقم المنحة. JP18H05474)، وPRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة 19gm6110022h001)، ومؤسسة شيمادزو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Data anaylsis software
DualViewImaging.nb author For analysis of acquired data
Mathematica12 Wolfram For running data anaysis software DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) strain Caenorhabditis Genetics Center KG1180 Light-insensitive mutant
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter author ST12 lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometer Polytec Japan IVS-500 For quantifying  frequency and displacement generated by the accoustic transducer
Mouse macro system
Assay.txt Author Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows
HiMacroEx Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html Free download software for controling mouse cursor based on a script
Nematode growth media plate
Agar purified, powder Nakarai tesque 01162-15 For preparation of NGM plates
Bacto pepton Becton Dickinson 211677 For preparation of NGM plates
Calcium chloride Wako 036-00485 For preparation of NGM plates
Cholesterol Wako 034-03002 For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate Nakarai tesque 28727-95 For preparation of NGM plates
LB broth, Lennox Nakarai tesque 20066-95 For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous TGI M1890 For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate Nakarai tesque 28720-65 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Nakarai tesque 31320-05 For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm) Nunc 150270 For preparation of NGM plates
Nonlocalized vibration device
Amplifier LEPY LP-A7USB For stimulation with controllable vibration
Acoustic transducer MinebeaMitsumi LVC25 For stimulation with controllable vibration
WaveGene Ver. 1.5 Thrive http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html Free download software for controling vibration property
Noninvasive calcium imaging
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller Thorlabs BBD202 Compatible controller for MLS203-1 stages
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter Semrock FF01-479/585-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter Semrock FF505/606-Di01-25x36 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-512/25-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-630/92-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
Computer Dell Precision T7600 Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
High-speed x-y motorized stage Thorlabs MLS203-1 Fast XY scannning stage
Image splitting optics Hamamatsu photonics A12801-01 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics
LED light source CoolLED pE-4000 For generating 470 nm and 560 nm excitation light
Microscope Olympus MVX10
sCMOS camera Andor Zyla
x 2 Objective lens Olympus MVPLAPO2XC Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 plasmid author pKDK66 Co-injection marker
pTAK83 plasmid author pTAK83 Plasmid for expression of TagRFP under the control of  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmid author pTAK144 Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of  the flp-18 promoter
Tracking software
homingback.vi author SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage
LabVIEW National instruments For running tracking software
Zyla Control ver.2.6CI.vi author For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
  2. Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
  4. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
  5. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
  6. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  7. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  8. Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
  9. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  10. Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
  11. Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
  14. Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
  15. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
  16. Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
  17. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
  18. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
  19. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
  21. Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
  23. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).

Tags

السلوك ، العدد 170 ، C. elegans ، تصوير الكالسيوم ، الاهتزاز غير الموضعي ، السلوك الحسي الميكانيكي ، الدائرة العصبية
تصوير الكالسيوم في سلوك <em>حر Caenorhabditis elegans</em> مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi,More

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter