Summary
这里报道的是一个用于自由行为秀 丽隐杆线虫 的钙成像系统，具有良好控制的，非局部化的振动。该系统允许研究人员在纳米级位移下唤起具有良好控制特性的非局部振动，并在 秀丽隐杆线虫 对振动的反应期间量化钙电流。
Abstract
非局部化机械力，如振动和声波，影响从发育到稳态的各种生物过程。动物通过改变它们的行为来应对这些刺激。要了解这种行为修饰背后的机制，需要在感兴趣的行为期间量化神经活动。在这里，我们报告了一种在自由行为秀 丽隐杆线虫 中进行钙成像的方法，该隐杆线虫具有特定频率，位移和持续时间的非局部振动。该方法允许使用声学换能器产生控制良好的非局部振动，并在单细胞分辨率下量化诱发的钙反应。作为原理证明，在 秀丽隐杆线虫 对振动的逃逸反应期间，证明了单个中间神经元AVA的钙反应。该系统将有助于理解对机械刺激的行为反应背后的神经机制。
Introduction
动物经常暴露于非局部化的机械刺激，如振动或声波1，2。由于这些刺激影响体内平衡，发育和繁殖，动物必须改变其行为以应对它们3，4，5。然而，这种行为改变背后的神经回路和机制知之甚少。
线虫中的机械感觉行为，秀丽隐杆线虫，是一个简单的行为范式，其中蠕虫在遇到非局部振动时，通常从向前运动转变为向后逃逸反应6。这种行为背后的神经回路主要由五个感觉神经元，四对中间神经元和几种类型的运动神经元7，8组成。此外，蠕虫在涉及重复刺激的间隔训练9，10，11之后习惯于这种机械刺激。因此，这种简单的行为反应构成了研究非局部振动诱发行为和记忆背后的神经机制的理想系统。图中说明了在非局部振动影响下自由行为蠕虫的钙成像方案。与以前报告的系统相比，该系统很简单，因为它不需要额外的摄像头进行跟踪;但是，它允许我们改变非局部振动的频率，位移和持续时间。由于AVA中间神经元的活化诱导了向后逃逸反应，因此在AVA特异性启动子的控制下，以共表达GCaMP（钙指示剂）和TagRFP（一种对钙不敏感的荧光蛋白）的蠕虫为例（详见材料表）。该协议演示了当蠕虫从向前切换到向后移动时AVA神经元的激活。该协议有助于理解机械感觉行为背后的神经回路机制。
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Protocol
1. 蠕虫的培养直至钙成像
- 在钙成像实验前四天，将两个成年ST12蠕虫转移到新的线虫生长培养基（NGM）板（材料表）上，在该板上，大 肠杆菌 OP50使用细胞扩散器以方形模式（约4 mm x 4 mm）条纹，以便蠕虫在钙成像过程中将大部分时间花在细菌中12。
- 将此NGM板在培养箱中在20°C下孵育4天（材料表）。
2. 硬件设置
- 准备配备用于刺激的压电装置的显微镜13，2x物镜，高速sCMOS相机，图像分割光学元件，x-y电动载物台，用于激发的LED光源和计算机（图1）。sCMOS相机的基本规格包括2560 x 2160有效像素，尺寸为6.5 μm，10抽头相机链接作为接口选项。X-Y 电动载物台的主要规格包括 110 mm x 75 mm 行程范围、250 mm/s 最大速度、2，000 mm/s2 最大加速度和 0.25 μm 单向重复性。
- 打开计算机和 x-y 电动载物台控制器。
- 打开放大器并将 音量 调节器设置为 10，将 低音 和高 音 调节器设置为 8。
- 要激发 GCaMP 和 TagRFP，请打开 LED 光源的 488 nm 和 560 nm 灯。将光源中控制舱的470 nm和550 nm的规格设置为5%，以便LED光的强度适合成像。
注意：在此LED强度下，在记录过程中不会发生GCaMP和TagRFP荧光的光漂白。
3. 钙成像软件设置
- 在Windows中下载并安装三个软件包：鼠标宏软件，用于控制振动属性的软件，用于运行跟踪软件的软件以及用于数据分析的软件（材料表）。
- 双击跟踪软件文件。
- 按下 “运行 ”按钮并等待5分钟以稳定软件（图2A）。
- 提供有关曝光时间和分档的信息。0.033秒的曝光时间，2 x 2分档，确保图像采集流畅（图2B）。
注意：为了减少内存负载，仅显示每10个 获取的图像。 - 提供图像采集信息（图2C）。例如，当以 10 秒的间隔记录两次 500 张图像时，请在“ 图像总数 ”框中输入 1，000，在“ 图像 ”框中输入 500，在“ 间隔 ”框中输入 10。
- 打开 采集按钮 （图2D）。
- 使用图像分裂光学元件拆分荧光图像，并将两个图像（GCaMP通道，500-525nm（图2E）;TagRFP通道，584-676 nm（图2F））投射到sCMOS相机的两半上。校准 GCaMP 和 TagRFP 通道的坐标（图 2G）。保存软件设置。
- 设置目录以输出数据文件（图 2H）。
- 关闭 采集 按钮（图2D）。
- 双击鼠标宏系统软件（图3A）并设置振动属性（图3B）。使用鼠标宏系统读取 测定.txt 文件，以便根据该文件中的坐标和时间表控制鼠标光标（图3A）。设置鼠标光标的坐标（ 图3A中的洋红色正方形），并在开始记录后等待时间直到刺激（ 图3A中的洋红色）。在软件中设置频率和振幅值以进行振动控制（图3B）。
4. 用于钙成像的蠕虫的制备
- 将表达GCaMP和TagRFP的单个蠕虫从孵育板转移到新的新鲜NGM板上，该板上已经划线了 大肠杆菌 OP50。
- 使用透明胶带将NGM板连接到压电声传感器（图4）。请勿将板压在致动器上，因为这会改变振动频率。
5.特定振动特性控制下的钙成像
- 打开 采集按钮 （图2D）。
- 在强光和激发光（488 nm和560 nm）下找到蠕虫。
- 将显微镜的缩放值设置为 2.5x。视场为 1.1 mm x 1.1 mm，分辨率为 2.6 μm/像素。
- 关闭强光并打开归位按钮（图2I）以跟踪蠕虫的荧光点。该归位按钮启动X-Y载物台的移动，以将蠕虫的最大强度区域保持在TagRFP图像中视场的中间。
注意：就 flp-18 启动子而言，AVA神经元的荧光强度最强，而来自其他神经元的荧光强度微弱或未检测到。因此，跟踪不需要低放大倍率系统，舞台在整个录制过程中移动。 - 确保 图2E 和 2F 中的强度条值约为1，000。如果不是，请微调光源中控制舱的 470 nm 和 550 nm 规格。
- 按鼠标宏系统中 的 Run 按钮 ，允许根据 图 3A 中描述的计划控制鼠标光标。这开始使用跟踪软件进行记录，并在跟踪蠕虫时由波基因软件刺激。
- 检查是否正确创建了输出 BMP 文件。
6. 数据分析
- 在桌面上创建一个文件夹，并将其命名为 钙映像。
- 在钙映像文件夹中创建一个文件夹，并将其命名为 CIResult，用于输出结果文件。
- 双击写在Windows数据分析软件中的 DualViewImaging.nb 文件。
- 将文件路径插入 CIResult 文件夹（例如，DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]）（图 5）。
- 将文件路径插入到包含 BMP 文件的文件夹（例如，SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]）（图 5），其中 XXX 表示文件夹名称，包括 BMP 文件。
- 同时按下 Shift 键和 Return 键以开始自动分析。该分析使用TagRFP图像中视场的最大强度区域的值（有关程序中的详细计算过程，请参见 图6 的图例）。
- 检查是否在 CIResult 文件夹中正确创建了以下输出文件。
XXX-GCaMP.tif（图像文件，说明所有图像的GCaMP强度痕迹）
XXX-GCaMP.xls（电子表格文件列出了所有图像中的GCaMP强度）
XXX-TagRFP.tif（图像文件，说明所有图像的TagRFP强度痕迹）
XXX-TagRFP.xls（电子表格文件列出所有图像中的TagRFP强度）
XXX-Ratio.tif（图像文件，说明所有图像的比率值的痕迹）
XXX-Ratio.xls（电子表格文件，列出所有图像中的比率值）
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Representative Results
在这里，在AVA中间神经元特异性启动子的控制下表达GCaMP和TagRFP的蠕虫被用作自由行为 秀丽隐杆线虫钙成像的一个例子。GCaMP和TagRFP通道数据以一系列图像的形式获得，其中一些图像如图 6 所示，并显示为电影（补充电影1）。由我们的非局部振动系统引起的培养皿板的位移（图7）也被量化。位移可以通过在振动控制软件（图3B）和放大器中的 音量 调节器（图4）中设置幅度值来控制，而频率则通过设置软件中的频率值来调节（图4）。在成功的实验中，在频率为630 Hz且位移约为4.5μm的持续1 s的振动刺激下观察到AVA神经元的瞬时钙反应，表明AVA神经元在蠕虫对非局部化刺激的向后响应期间被激活（图6）。GCaMP和TagRFP信号的基线也显示，在记录过程中几乎没有发生光漂白。
图 1：系统配置示意图。 蜗杆自由移动的NGM板被固定在声学换能器上。激发光（488 nm 和 560 nm）从 LED 光源发射。GCaMP和TagRFP荧光发射通过图像分裂光学元件进行分割，使得每个荧光发射被投射到sCMOS相机的一半上。跟踪软件控制x-y电动载物台以跟踪蠕虫的荧光点。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于跟踪蠕虫荧光点的软件的屏幕截图。 （A） 用于激活软件的“ 运行 ”按钮。（B） 用于设置每个通道中的图像显示周期、曝光时间和分档的框。（C） 用于提供有关图像采集周期信息的盒子。（D） 用于启动实时流的 “采集 ”按钮。（E） GCaMP 图像。（F） TagRFP 图像。（G） 用于 GCaMP 和 TagRFP 图像之间校准坐标的面板。（H） 用于设置文件路径的框。（I） 用于启动蠕虫跟踪 的归位 按钮。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于控制振动的鼠标宏系统和软件的照片。 （A） 洋红色正方形表示鼠标光标的坐标。每个脚本行的含义以洋红色字母解释。（B） 用于控制振动的软件的 GUI（图形用户界面）。振动频率和振幅值使用此 GUI 进行控制。 请点击此处查看此图的大图。
图4：使用透明胶带固定在声换能器上的NGM板的照片。 只有一条蠕虫在盘子上移动。 请点击此处查看此图的大图。
图5：数据分析软件的照片。 洋红色和蓝色下划线分别表示 CIResult 文件夹和包含 BMP 文件的文件夹的路径。 请点击此处查看此图的大图。
图6：GCaMP（A）和TagRFP（B）荧光强度的痕量，以及比率变化（C，D）。（一-C）单个蠕虫的GCaMP信号，TagRFP信号和比率变化的代表迹线。比率更改是使用 DualViewImaging.nb 文件计算的，如下所示。提取每幅图像的背景减法后TagRFP荧光强度最大的坐标。该TagRFP信号用于补偿由动物运动引起的焦点变化。提取的坐标±10像素内GCaMP的最大荧光强度计算为每张图像的GCaMP信号强度。对于比率测量，计算（（IGCaMP − IGCaMP_BG） − （ITagRFP − ITagRFP_BG）） / （ITagRFP − ITagRFP_BG），其中IGCaMP 和ITagRFP 分别是来自AVA神经元的GCaMP和TagRFP信号，IGCaMP_BG 和ITagRFP_BG 分别是背景信号。将此计算过程应用于所有图像，以量化反转事件中的比率变化。所有迹线中5秒处的垂直线表示刺激期。（D）15只蠕虫的平均比率变化。错误栏指示 SEM。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 7：参数之间的关系。 （A） 使用激光多普勒测振仪每100 Hz测量一次更换，其中软件中的幅度值和放大器中的音量调节器值分别固定为0和10。观察到的谐振频率在100-200 Hz之间，这与声学换能器规格中描述的值相似。（B）频率和位移分别由软件（范围;100至1000 Hz）和放大器（范围：1-10）控制，并使用激光多普勒测振仪进行测量。软件选择的幅度值会针对每个频率进行指示。 请点击此处查看此图的大图。
补充影片 1：自由行为蠕虫的 AVA 中间神经元中钙瞬变的代表性影片，以响应 630 Hz 非局部振动。刺激在开始记录后5秒引起。GFP在蠕虫的肠道中也表达为GCaMP的共注射标志物。这种GFP荧光不影响GCaMP的信号强度。比例尺也显示在第一幅图像中。蠕虫的方向在第一幅图像之后的右上角指示。Windows媒体播放器适合播放AVI文件，但也可以使用一些免费下载的媒体播放器播放，例如Mac中的VLC媒体播放器 。
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Discussion
通常，神经活动的量化需要引入探针和/或限制动物身体运动。然而，对于机械感觉行为的研究，探针的侵入性引入和约束本身构成机械刺激。 秀丽隐杆线虫 提供了一个系统来规避这些问题，因为它的特征是透明的，并且因为它具有一个简单，紧凑的神经回路，仅包含302个神经元。将这些优点与先前开发的唤起纳米级位移的非局部振动的方法13相结合，这里说明了一种用于对无约束 秀丽隐杆线虫 响应受控振动的无创钙成像的方法。
机械刺激的性质由几个参数定义，例如频率，位移和持续时间。近来，生物边缘学已成为一个新的研究领域1。这些研究的主要目的是了解生物体产生，分散和接收机械振动的机制，以及这些振动对行为的影响。包括人类在内的许多动物使用振动和声波来监测周围环境。例如，蝎子通过基底振动14检测猎物。因此，振动是与周围环境沟通的工具。这里描述的方法可用于控制输入参数和量化单神经元水平的神经反应，从而创建描述输入 - 输出关系的相位图。基于这样的相图，我们可以深入了解哪些参数会影响特定的神经回路，以及动物通过什么机制来应对机械振动。
自2007年以来15，已经开发了几种系统，用于自由移动 秀丽隐杆线虫的单神经元钙成像。这些系统主要关注神经元对温度15，16，气味剂16，17和触摸刺激17的反应。关于非局部振动，敲击培养皿的方法长期以来一直用于量化行为反应。然而，在电动x-y载物台上点击培养皿会导致荧光点离开视野，导致无法跟踪自由行为的蠕虫。因此，压电声换能器被嵌入到跟踪系统中，该声换能器在z轴上引起非局部振动。该方法允许执行可重复的实验，以量化神经元对非局部振动的反应。
所演示的方法还提供了进一步的方法学扩展的可能性。由于目前的协议只能在二维空间中捕获单个神经元的反应，因此将来应该配备自动对焦系统以防止失焦。另一方面，由于最近已经使用秀丽隐杆线虫18，19，20，21开发了几种体积成像方法，因此扩展体积成像方法应允许对多个神经元22甚至整个大脑进行无创定量18，19，20，21，响应振动具有可控属性。这样的系统可以应用于最近建立的系统，以调查集体行为背后的机制23。因此，该方法的进一步生物学应用和扩展可能将使我们能够了解机械感觉行为背后的神经机制。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢 Caenorhabditis 遗传学中心提供本研究中使用的菌株。本出版物由JSPS KAKENHI科学研究补助金（B）（授予号为。JP18H02483），关于创新领域“软机器人科学”项目（授予号：JP18H05474），日本医学研究开发机构（拨款19gm6110022h001）和岛津基金会的PRIME。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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