Summary
דווח כאן על מערכת להדמיית סידן בדלקת אלגנס המתנהגת באופן חופשי עם רטט מבוקר היטב, שאינו לוקלי. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לעורר תנודות לא-לוקליות בעלות תכונות מבוקרות היטב בתזוזה בקנה מידה ננומטרי ולכמת זרמי סידן במהלך תגובות של C. elegans לתנודות.
Abstract
כוחות מכניים לא-לוקליים, כגון תנודות וגלים אקוסטיים, משפיעים על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים מהתפתחות ועד הומאוסטזיס. בעלי חיים מתמודדים עם גירויים אלה על ידי שינוי התנהגותם. הבנת המנגנונים העומדים בבסיס שינוי התנהגותי כזה דורשת כימות של הפעילות העצבית במהלך התנהגות העניין. כאן, אנו מדווחים על שיטה להדמיית סידן בהתנהגות חופשית של Caenorhabditis elegans עם רטט לא-לוקלי של תדירות, תזוזה ומשך ספציפיים. שיטה זו מאפשרת ייצור של רטט מבוקר היטב, לא-לוקליזציה באמצעות מתמר אקוסטי וכימות של תגובות סידן מעוררות ברזולוציה של תא יחיד. כהוכחה עקרונית, מודגמת תגובת הסידן של אינטרנורון יחיד, AVA, במהלך תגובת הבריחה של C. elegans לרטט. מערכת זו תאפשר הבנה של מנגנונים עצביים העומדים בבסיס התגובות ההתנהגותיות לגירויים מכניים.
Introduction
בעלי חיים נחשפים לעתים קרובות לגירויים מכניים לא לוקליים כגון תנודות או גלים אקוסטיים 1,2. מכיוון שגירויים אלה משפיעים על הומאוסטזיס, התפתחות ורבייה, בעלי חיים חייבים לשנות את התנהגותם כדי להתמודד איתם 3,4,5. עם זאת, המעגלים העצביים והמנגנונים העומדים בבסיס שינוי התנהגותי כזה אינם מובנים היטב.
התנהגות מכנית בנמטודה, Caenorhabditis elegans, היא פרדיגמה התנהגותית פשוטה, שבה תולעים בדרך כלל משנות התנהגות מתנועה קדימה לתגובת בריחה לאחור כאשר הן נתקלות ברטט לא לוקלי6. המעגל העצבי העומד בבסיס התנהגות זו מורכב בעיקר מחמישה נוירונים חושיים, ארבעה זוגות של אינטרנורונים ומספר סוגים של נוירונים מוטוריים 7,8. בנוסף, תולעים רגילות לגירויים מכניים כאלה לאחר אימון מרווח הכולל גירוי חוזרונשנה 9,10,11. לכן, תגובה התנהגותית פשוטה זו מהווה מערכת אידיאלית לחקר מנגנונים עצביים העומדים בבסיס הן התנהגות מעוררת רטט לא-לוקליזציה והן זיכרון. מודגם פרוטוקול להדמיית סידן בתולעים המתנהגות בחופשיות בהשפעת תנודות לא לוקליות. בהשוואה למערכות שדווחו בעבר, מערכת זו פשוטה בכך שהיא אינה דורשת מצלמה נוספת למעקב; עם זאת, הוא מאפשר לנו לשנות את התדירות, התזוזה והמשך של רטט לא-לוקלי. מאחר שהפעלת האינטרנורונים של ה-AVA גורמת לתגובת הבריחה לאחור, תולעים המבטאות במשותף את GCaMP, מחוון סידן, ו-TagRFP, חלבון פלואורסצנטי חסר רגישות לסידן, תחת שליטתו של מקדם ספציפי ל-AVA שימשו כדוגמה (ראו טבלת חומרים לפרטים). הפרוטוקול מדגים את ההפעלה של נוירוני AVA כאשר תולעת עוברת מתנועה קדימה לתנועה לאחור. פרוטוקול זה מאפשר להבין את מנגנון המעגל העצבי העומד בבסיס ההתנהגות המכנוזנסורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול תולעים עד הדמיית סידן
- ארבעה ימים לפני ניסוי הדמיית סידן, העבירו שתי תולעי ST12 בוגרות לצלחת חדשה של מדיום גדילת נמטודה (NGM) (טבלת חומרים) שעליה Escherichia coli OP50 מפוספסות בתבנית מרובעת (כ-4 מ"מ x 4 מ"מ) באמצעות מפזר תאים, כך שהתולעת מבלה את רוב הזמן בחיידקים במהלך הדמיית סידן12.
- דגירה של צלחת NGM זו למשך 4 ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס באינקובטור (טבלת חומרים).
2. הגדרת חומרה
- הכינו מיקרוסקופ המצויד בהתקן פיאזואלקטרי לגירוי13, עדשת מטרה 2x, מצלמת sCMOS במהירות גבוהה, אופטיקה לפיצול תמונות, שלב ממונע x-y, מקור אור LED לעירור ומחשב (איור 1). מפרטים חיוניים של מצלמת sCMOS כוללים 2560 x 2160 פיקסלים פעילים, 6.5 מיקרומטר בגודל, עם קישור מצלמה של 10 הקשות כאפשרות ממשק. המפרטים העיקריים של השלב הממונע X-Y כוללים טווח נסיעה של 110 מ"מ x 75 מ"מ, מהירות מרבית של 250 מ"מ לשנייה, תאוצה מרביתשל 2,000 מ"מ לשנייה ו-0.25 מיקרומטר יכולת חזרה חד כיוונית.
- הפעל את המחשב ואת בקר הבמה הממונעת x-y.
- הפעילו את המגבר והגדירו את כוונון עוצמת הקול ל-10 ואת כוונוני הבס והטרבל ל-8.
- כדי לעורר GCaMP ו- TagRFP, הפעל את האורות של 488 ננומטר ו- 560 ננומטר של מקור תאורת ה- LED. הגדר את המדדים של 470 ננומטר ו-550 ננומטר של תרמיל הבקרה במקור האור ל-5% כך שעוצמת נורת ה-LED תתאים להדמיה.
הערה: בעוצמת LED זו, הלבנת תמונות של GCaMP ו- TagRFP פלואורסצנציה אינה מתרחשת במהלך ההקלטה.
3. הגדרת תוכנה להדמיית סידן
- הורד והתקן שלוש חבילות תוכנה ב- Windows: תוכנת מאקרו של עכבר, תוכנה לשליטה במאפיין רטט, תוכנה להפעלת תוכנת מעקב ותוכנה לניתוח נתונים (טבלת חומרים).
- לחץ פעמיים על קובץ תוכנת המעקב.
- לחצו על כפתור ההפעלה והמתינו 5 דקות כדי לייצב את התוכנה (איור 2A).
- ספק את המידע על זמן החשיפה ועל ההצמדה. זמן חשיפה של 0.033 שניות עם חיבור של 2 x 2 מבטיח רכישת תמונה חלקה (איור 2B).
הערה: רק כל תמונה 10שנרכשה מוצגת על מנת להפחית את עומס הזיכרון. - ספק את המידע לרכישת תמונה (איור 2C). לדוגמה, כאשר 500 תמונות מוקלטות פעמיים במרווח של 10 שניות, הזן 1,000 בתיבה 'סה"כ תמונות', 500 בתיבה 'תמונות' ו-10 בתיבה 'מרווח' (s).
- הפעל את לחצן 'רכישה' (איור 2D).
- פיצול התמונה הפלואורסצנטית באמצעות אופטיקה של פיצול תמונה, ושתי התמונות (ערוץ GCaMP, 500-525 ננומטר (איור 2E); ערוץ TagRFP, 584-676 ננומטר (איור 2F)) מוקרנים על שני חצאים של מצלמת ה-sCMOS. כייל את הקואורדינטות של ערוצי GCaMP ו-TagRFP (איור 2G). שמור את הגדרות התוכנה.
- הגדר את הספריה לפלט קובץ הנתונים (איור 2H).
- כבו את לחצן 'רכישה' (איור 2D).
- לחץ פעמיים על תוכנת מערכת המאקרו של העכבר (איור 3A) והגדר את מאפייני הרטט (איור 3B). קרא את קובץ הבדיקה.txt עם מערכת המאקרו של העכבר כך שסמן העכבר נשלט על סמך הקואורדינטות ולוח הזמנים בקובץ זה (איור 3A). הגדר את הקואורדינטות של סמן העכבר (ריבועי מגנטה באיור 3A) והמתן זמן עד לגירוי לאחר תחילת ההקלטה (magenta באיור 3A). הגדר את ערכי התדר ואת ערכי המשרעת בתוכנה לבקרת רעידות (איור 3B).
4. הכנת תולעים להדמיית סידן
- העבר תולעת בודדת המבטאת גם את GCaMP וגם את TagRFP מהצלחת המדגרת לצלחת NGM חדשה וטרייה שעליה הוצב E. coli OP50.
- חברו את לוחית ה-NGM למתמר האקוסטי הפיאזואלקטרי באמצעות סרט הדבקה שקוף (איור 4). אין ללחוץ על הלוחית על המפעיל מכיוון שהדבר משנה את תדר הרטט.
5. הדמיית סידן תחת שליטה של תכונות רטט ספציפיות
- הפעל את לחצן 'רכישה' (איור 2D).
- מצא את התולעת תחת אור בהיר ואור עירור (488 ננומטר ו- 560 ננומטר).
- הגדר את ערך הזום של מיקרוסקופיה ל- 2.5x. שדה הראייה הוא 1.1 מ"מ x 1.1 מ"מ ברזולוציה של 2.6 מיקרומטר לפיקסל.
- כבו את האור הבהיר והפעילו את כפתור הביות (איור 2I) כדי לעקוב אחר הנקודה הפלואורסצנטית של התולעת. לחצן ביות זה מתחיל את התנועה של שלב X-Y כדי לשמור על אזור העוצמה המרבית של התולעת במרכז שדה הראייה בתמונת TagRFP.
הערה: במונחים של מקדם flp-18 , העוצמה הפלואורסצנטית של נוירוני AVA היא החזקה ביותר ואלה מתאי עצב אחרים הם קלושים או לא מזוהים. לכן, מערכת ההגדלה הנמוכה אינה נדרשת למעקב והבמה נעה לאורך כל ההקלטה. - ודא שערכי סרגלי העוצמה באיור 2E ו-2F הם כ-1,000. אם הם לא, כוונו את המדדים של 470 ננומטר ו-550 ננומטר של תרמיל הבקרה במקור האור.
- לחצו על הלחצן 'הפעל ' במערכת המאקרו של העכבר כדי לאפשר שליטה בסמן העכבר בהתאם ללוח הזמנים המתואר באיור 3A. זה מתחיל להקליט באמצעות תוכנת המעקב ולעורר על ידי תוכנת גנים גלים תוך כדי מעקב אחר התולעת.
- בדוק אם קובץ BMP הפלט נוצר כראוי.
6. ניתוח נתונים
- צור תיקיה בשולחן העבודה וקרא לה סידן הדמיה.
- צור תיקיה בתוך התיקיה CalciumImaging וקרא לה CIResult, עבור קבצי תוצאות הפלט.
- לחץ פעמיים על הקובץ DualViewImaging.nb שנכתב בתוכנת ניתוח נתונים עבור Windows.
- הוסף את נתיב הקובץ לתיקיה CIResult (לדוגמה, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (איור 5).
- הוסף את נתיב הקובץ לתיקיה, כולל קובץ BMP (לדוגמה, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (איור 5), שבו XXX מציין את שם התיקיה כולל קבצי BMP.
- לחץ על המקשים Shift ו - Return בו-זמנית כדי להתחיל ניתוח אוטומטי. ניתוח זה משתמש בערך של אזור שדה ראייה בעוצמה מרבית בתמונת TagRFP (ראה את המקרא של איור 6 להליך חישוב מפורט בתוכנית).
- בדוק אם קבצי הפלט הבאים נוצרים כראוי בתיקיה CIResult.
XXX-GCaMP.tif (קובץ תמונה הממחיש עקבות של עוצמות GCaMP עבור כל התמונות)
XXX-GCaMP.xls (קובץ גיליון אלקטרוני המפרט עוצמות GCaMP בכל התמונות)
XXX-TagRFP.tif (קובץ תמונה הממחיש עקבות של עוצמות של TagRFP עבור כל התמונות)
XXX-TagRFP.xls (קובץ גיליון אלקטרוני המפרט את עוצמות TagRFP בכל התמונות)
XXX-Ratio.tif (קובץ תמונה הממחיש עקבות של ערך היחס עבור כל התמונות)
XXX-Ratio.xls (קובץ גיליון אלקטרוני המפרט את ערך היחס בכל התמונות)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, תולעת המבטאת הן GCaMP והן TagRFP תחת שליטה של מקדם ספציפי ל- AVA interneuron משמשת כדוגמה להדמיית סידן ב- C. elegans המתנהגים בחופשיות. נתוני ערוץ GCaMP ו-TagRFP התקבלו כסדרה של תמונות, שחלקן מוצגות באיור 6 כסרט (סרט משלים 1). גם התזוזה של לוחית הפטרי המושרה על-ידי מערכת הרטט הלא-לוקלית שלנו (איור 7) כומתה. ניתן לשלוט בתזוזה על-ידי הגדרת ערך המשרעת בתוכנה לבקרת רעידות (איור 3B) ובמתאם עוצמת הקול במגבר (איור 4), בעוד שהתדר מווסת על-ידי הגדרת ערך התדר בתוכנה (איור 4). בניסויים המוצלחים נצפתה תגובת סידן חולפת של נוירוני AVA עם גירוי עם תנודות בעלות תדר של 630 הרץ ותזוזה של כ-4.5 מיקרומטר במשך שנייה אחת, מה שמצביע על כך שהנוירון AVA הופעל במהלך התגובה לאחור של התולעת לגירוי הלא-לוקלי (איור 6). קווי בסיס של אותות GCaMP ו-TagRFP הראו גם שכמעט ולא התרחשה הלבנת תמונות במהלך ההקלטה.
איור 1: תצורת מערכת סכמטית. צלחת NGM שעליה נעה תולעת בחופשיות מוחזקת על מתמר אקוסטי. נורית עירור (488 ננומטר ו-560 ננומטר) נפלטת ממקור אור LED. הפליטות הפלואורסצנטיות של GCaMP ו-TagRFP מפוצלות על ידי אופטיקה מפוצלת תמונה, כך שכל פליטה פלואורסצנטית מוקרנת על מחצית ממצלמת sCMOS. תוכנת מעקב שולטת בשלב המנוע x-y כדי לעקוב אחר הנקודה הפלואורסצנטית של התולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: צילום מסך של התוכנה למעקב אחר נקודה פלואורסצנטית של תולעת. (B) תיבות להגדרת מחזור תצוגת תמונה, זמן חשיפה (ים) וחיבור בכל ערוץ. (C) תיבות למתן מידע על מחזור רכישת התמונה. (ד) כפתור הרכישה כדי ליזום סטרימינג בשידור חי. (E) תמונת GCaMP. (F) תמונת TagRFP. (G) פאנל לקואורדינטות כיול בין תמונות GCaMP ו- TagRFP. (ח) תיבה להגדרת נתיב קובץ. (I) כפתור ביות להתחלת מעקב אחר תולעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תמונה של מערכת המאקרו של העכבר ותוכנה לשליטה ברטט. (A) ריבוע המג'נטה מציין את הקואורדינטות של סמן העכבר. המשמעות של כל שורת כתב מוסברת באותיות מג'נטה. (B) ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של תוכנה לשליטה ברטט. ערכי תדר הרטט והמשרעת נשלטים באמצעות ממשק משתמש גרפי זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונה של לוחית ה-NGM המוחזקת על המתמר האקוסטי באמצעות סרט הדבקה שקוף. רק תולעת אחת נעה על הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונה של תוכנת ניתוח הנתונים. קווים תחתונים מסוג Magenta ו-Blue מציינים את הנתיבים לתיקיית CIResult ולתיקיה הכוללת קבצי BMP, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: עקבות העוצמות של פלואורסצנציה של GCaMP (A) ו-TagRFP (B) ושינוי היחס (C,D). (א -C) העקבות הייצוגיים עבור אות GCaMP, אות TagRFP ושינויי יחס של תולעת בודדת. שינוי היחס מחושב באמצעות הקובץ DualViewImaging.nb, כדלקמן. הקואורדינטות שבה עוצמת הפלואורסצנציה של TagRFP היא מקסימלית לאחר חילוץ חיסור הרקע עבור כל תמונה. אות TagRFP זה משמש לפיצוי על שינויי מיקוד הנגרמים על ידי תנועת החיה. עוצמת הפלואורסצנציה המרבית של GCaMP בתוך הקואורדינטות שחולצו ±10 פיקסלים מחושבת כעוצמת האות GCaMP עבור כל תמונה. עבור ratiometry, ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG) מחושב, שבו IGCaMP ו- I TagRFP הם אותות GCaMP ו- TagRFP מהנוירון AVA, בהתאמה, ואניGCaMP_BG ואניTagRFP_BG הם אותות הרקע, בהתאמה. תהליך חישוב זה הוחל על כל התמונות כדי לכמת את שינוי היחס באירוע היפוך. הקו האנכי ב-5 שניות בכל העקבות מציין את תקופת הגירוי. (D) היחס הממוצע משתנה עבור 15 תולעים. סרגל השגיאות מציין SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: הקשר בין הפרמטרים. (A) ההחלפות נמדדו כל 100 הרץ באמצעות ויברומטר דופלר לייזר, שבו ערך המשרעת בתוכנה וערך מתאם הנפח במגבר נקבעו ל-0 ו-10, בהתאמה. תדר התהודה נצפה בין 100-200 הרץ, שהיה דומה לערך המתואר במפרט של המתמר האקוסטי. (B) התדרים והתזוזות נשלטו על ידי התוכנה (טווח; 100 עד 1000 הרץ) והמגבר (טווח: 1-10), בהתאמה ונמדדו באמצעות ויברומטר דופלר לייזר. ערך המשרעת שנבחר על ידי התוכנה מצוין עבור כל תדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרט משלים 1: סרט מייצג עבור חולפי סידן ב-AVA interneuron של תולעת שמתנהגת בחופשיות בתגובה לרטט לא-לוקלי של 630 הרץ. הגירוי עורר 5 שניות לאחר תחילת ההקלטה. GFP התבטא גם במעי של התולעת כסמן להזרקה משותפת עבור GCaMP. פלואורסצנציה זו של GFP אינה משפיעה על עוצמת האות של GCaMP. סרגל קנה המידה מצוין גם בתמונה הראשונה. כיוון התולעת מצוין בחלק העליון מיד לאחר התמונה הראשונה. נגן המדיה של Windows מתאים להפעלת קובץ ה- AVI, אך ניתן גם להפעיל אותו באמצעות כמה נגני מדיה שהורדו בחינם, כגון נגן המדיה VLC ב- Mac. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באופן כללי, כימות הפעילות העצבית דורש הכנסת בדיקה ו/או ריסון על תנועת גוף בעלי החיים. עם זאת, עבור מחקרים על התנהגות מכנית, ההקדמה הפולשנית של בדיקה ומעצורים עצמם מהווים גירויים מכניים. C. elegans מספק מערכת לעקיפת בעיות אלה, משום שתכונותיו שקופות ומשום שיש לו מעגל עצבי פשוט וקומפקטי הכולל רק 302 נוירונים. שילוב של יתרונות אלה עם השיטה שפותחה בעבר של גירוי תנודות לא-לוקליות של תזוזה ננומטרית13, המומחשת כאן היא שיטה להדמיית סידן לא פולשנית של C. elegans חסרי מעצורים המגיבים לרטט מבוקר.
תכונות של גירויים מכניים מוגדרות על ידי מספר פרמטרים, כגון תדירות, תזוזה ומשך. לאחרונה, הביוטרמולוגיה התפתחה כתחום מחקר חדש1. המטרה העיקרית של מחקרים כאלה היא להבין את המנגנונים העומדים בבסיס הייצור, הפיזור והקליטה של תנודות מכניות על ידי אורגניזמים, ואת ההשפעה של תנודות אלה על ההתנהגות. בעלי חיים רבים, כולל בני אדם, משתמשים ברטט ובגלים אקוסטיים כדי לנטר את הסביבה. לדוגמה, עקרבים מזהים טרף דרך רטט הנישא על ידי מצע14. לכן, רטט הוא כלי תקשורת עם הסביבה הסובבת. ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כאן כדי לשלוט בפרמטרים של קלט ולכמת תגובות עצביות ברמת הנוירון הבודד, מה שמוביל ליצירת דיאגרמת פאזה המתארת את יחסי הקלט-פלט. בהתבסס על דיאגרמות פאזה כאלה, אנו יכולים לקבל תובנות לגבי אילו פרמטרים משפיעים על מעגלים עצביים ספציפיים, ועל ידי אילו מנגנונים בעלי חיים מתמודדים עם תנודות מכניות.
מאז 200715, פותחו מספר מערכות להדמיית סידן של נוירון יחיד ב- C. elegans הנעים בחופשיות. מערכות אלה התמקדו בעיקר בתגובות עצביות לטמפרטורה15,16, לחומרי ריח16,17 ולגירויים למגע17. לגבי תנודות לא-לוקליות, השיטה של הקשה על צלחת פטרי מיושמת זה מכבר לכימות תגובות התנהגותיות. עם זאת, הקשה על לוחית פטרי על שלב x-y ממונע גרמה לנקודה הפלואורסצנטית לצאת משדה הראייה, מה שהוביל לכישלון במעקב אחר תולעת שמתנהגת בחופשיות. לכן, הוטבע המתמר האקוסטי הפיאזואלקטרי, מה שמעורר רטט לא-לוקלי על פני ציר ה-z, במערכת המעקב. שיטה זו מאפשרת ביצוע של ניסויים הניתנים לשחזור לכימות תגובות עצביות לרטט לא-לוקלי.
השיטות המודגמות מציעות גם אפשרות להרחבה מתודולוגית נוספת. מכיוון שהפרוטוקול הנוכחי יכול ללכוד תגובות של נוירון יחיד בלבד בשני ממדים, מערכת המיקוד האוטומטי צריכה להיות מצוידת בעתיד כדי למנוע אובדן מיקוד. מצד שני, מכיוון שכמה שיטות הדמיה נפחיות פותחו לאחרונה באמצעות C. elegans 18,19,20,21, הרחבת הגישה להדמיה נפחית אמורה לאפשר כימות לא פולשני של מספר נוירונים22 או אפילו של המוח כולו 18,19,20,21 בתגובה לרטט בעל תכונות הניתנות לשליטה., מערכת כזו עשויה להיות מיושמת על המערכת שהוקמה לאחרונה כדי לחקור מנגנונים העומדים בבסיס ההתנהגות הקולקטיבית23. לכן, יישומים ביולוגיים נוספים והרחבות של השיטה ככל הנראה יאפשרו לנו להבין מנגנונים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מכניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למרכז הגנטיקה של Caenorhabditis על אספקת הזנים המשמשים במחקר זה. פרסום זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI מענק-סיוע למחקר מדעי (B) (מענק מס' JP18H02483), על תחומים חדשניים "מדע הרובוט הרך" פרויקט (מענק מס' JP18H05474), ראש הממשלה מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (מענק מספר 19gm6110022h001), וקרן שימאדזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
