Summary
Qui è riportato un sistema per l'imaging del calcio nel comportamento libero di Caenorhabditis elegans con vibrazioni ben controllate e non localizzate. Questo sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento su scala nanometrica e di quantificare le correnti di calcio durante le risposte di C. elegans alle vibrazioni.
Abstract
Le forze meccaniche non localizzate, come le vibrazioni e le onde acustiche, influenzano un'ampia varietà di processi biologici dallo sviluppo all'omeostasi. Gli animali affrontano questi stimoli modificando il loro comportamento. Comprendere i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale richiede la quantificazione dell'attività neurale durante il comportamento di interesse. Qui, riportiamo un metodo per l'imaging del calcio nel comportamento libero caenorhabditis elegans con vibrazione non localizzata di frequenza, spostamento e durata specifici. Questo metodo consente la produzione di vibrazioni ben controllate e non localizzate utilizzando un trasduttore acustico e la quantificazione delle risposte calciche evocate a risoluzione a singola cellula. Come prova di principio, viene dimostrata la risposta al calcio di un singolo interneurone, AVA, durante la risposta di fuga di C. elegans alle vibrazioni. Questo sistema faciliterà la comprensione dei meccanismi neurali alla base delle risposte comportamentali agli stimoli meccanici.
Introduction
Gli animali sono spesso esposti a stimoli meccanici non localizzati come vibrazioni o onde acustiche 1,2. Poiché questi stimoli influenzano l'omeostasi, lo sviluppo e la riproduzione, gli animali devono modificare i loro comportamenti per affrontarli 3,4,5. Tuttavia, i circuiti neurali e i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale sono poco compresi.
Il comportamento meccanosensoriale nel nematode, Caenorhabditis elegans, è un semplice paradigma comportamentale, in cui i vermi di solito cambiano comportamento dal movimento in avanti a una risposta di fuga all'indietro quando incontrano la vibrazione non localizzata6. Il circuito neurale alla base di questo comportamento è composto principalmente da cinque neuroni sensoriali, quattro coppie di interneuroni e diversi tipi di motoneuroni 7,8. Inoltre, i vermi si abituano a tali stimoli meccanici dopo un allenamento distanziato che comporta una stimolazione ripetuta 9,10,11. Pertanto, questa semplice risposta comportamentale costituisce un sistema ideale per studiare i meccanismi neurali alla base sia del comportamento evocato dalla vibrazione non localizzata che della memoria. Viene illustrato un protocollo per l'imaging del calcio in vermi che si comportano liberamente sotto l'influenza di vibrazioni non localizzate. Rispetto ai sistemi precedentemente segnalati, questo sistema è semplice in quanto non richiede una telecamera aggiuntiva per il tracciamento; tuttavia, ci consente di modificare la frequenza, lo spostamento e la durata della vibrazione non localizzata. Poiché l'attivazione degli interneuroni AVA induce la risposta di fuga all'indietro, i vermi che co-esprimono GCaMP, un indicatore di calcio, e TagRFP, una proteina fluorescente insensibile al calcio, sotto il controllo di un promotore specifico dell'AVA sono stati usati come esempio (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). Il protocollo dimostra l'attivazione dei neuroni AVA mentre un worm passa dal movimento in avanti a quello all'indietro. Questo protocollo facilita la comprensione del meccanismo del circuito neurale alla base del comportamento meccanosensoriale.
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Protocol
1. Coltivazione di vermi fino all'imaging del calcio
- Quattro giorni prima di un esperimento di imaging del calcio, trasferire due vermi ST12 adulti in una nuova piastra del mezzo di crescita del nematode (NGM) (Table of Materials) su cui Escherichia coli OP50 sono striati in uno schema quadrato (circa 4 mm x 4 mm) utilizzando uno spargitore cellulare in modo che il verme trascorra la maggior parte del tempo nei batteri durante l'imaging del calcio12.
- Incubare questa piastra NGM per 4 giorni a 20 °C in un incubatore (Tabella dei materiali).
2. Configurazione hardware
- Preparare un microscopio dotato di un dispositivo piezoelettrico per la stimolazione13, una lente obiettivo 2x, una fotocamera sCMOS ad alta velocità, ottica di divisione delle immagini, uno stadio motorizzato x-y, una sorgente luminosa a LED per l'eccitazione e un computer (Figura 1). Le specifiche essenziali della fotocamera sCMOS includono 2560 x 2160 pixel attivi, dimensioni 6,5 μm, con un collegamento fotocamera a 10 tocchi come opzione di interfaccia. Le specifiche chiave dello stadio motorizzato X-Y includono un intervallo di corsa di 110 mm x 75 mm, una velocità massima di 250 mm/s, un'accelerazione massima di 2.000 mm/s2 e una ripetibilità unidirezionale di 0,25 μm.
- Accendere il computer e il controller dello stage motorizzato x-y.
- Accendere l'amplificatore e impostare il regolatore di volume su 10 e i regolatori di bassi e alti su 8.
- Per entusiasmare GCaMP e TagRFP, accendi le luci a 488 nm e 560 nm della sorgente luminosa a LED. Impostare gli indicatori di 470 nm e 550 nm del pod di controllo nella sorgente luminosa al 5% in modo che l'intensità della luce LED sia adatta per l'imaging.
NOTA: a questa intensità del LED, la fotosbiancamento della fluorescenza GCaMP e TagRFP non si verifica durante la registrazione.
3. Configurazione del software per l'imaging del calcio
- Scarica e installa tre pacchetti software in Windows: software macro del mouse, software per il controllo della proprietà delle vibrazioni, software per l'esecuzione del software di tracciamento e software per l'analisi dei dati (Tabella dei materiali).
- Fare doppio clic sul file del software di tracciamento.
- Premere il pulsante Esegui e attendere 5 minuti per stabilizzare il software (Figura 2A).
- Fornire le informazioni sul tempo di esposizione e sul binning. Il tempo di esposizione di 0,033 s con binning 2 x 2 garantisce un'acquisizione fluida delle immagini (Figura 2B).
NOTA: viene visualizzata solo ogni10a immagine acquisita per ridurre il carico di memoria. - Fornire le informazioni per l'acquisizione delle immagini (Figura 2C). Ad esempio, quando 500 immagini vengono registrate due volte con un intervallo di 10 s, immettere 1.000 nella casella Totale immagini, 500 nella casella Immagini e 10 nella casella Intervallo (s).
- Attivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Dividere l'immagine di fluorescenza utilizzando l'ottica di scissione dell'immagine e le due immagini (canale GCaMP, 500-525 nm (Figura 2E); Il canale TagRFP, 584-676 nm (Figura 2F)) viene proiettato su due metà della telecamera sCMOS. Calibrare le coordinate dei canali GCaMP e TagRFP (Figura 2G). Salvare le impostazioni del software.
- Impostare la directory per l'output del file di dati (Figura 2H).
- Disattivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Fare doppio clic sul software di sistema macro del mouse (Figura 3A) e impostare le proprietà di vibrazione (Figura 3B). Leggere il file Assay.txt con il sistema macro del mouse in modo che il cursore del mouse sia controllato in base alle coordinate e alla pianificazione in tale file (Figura 3A). Impostare le coordinate del cursore del mouse (quadrati magenta nella Figura 3A) e attendere il tempo fino alla stimolazione dopo l'avvio della registrazione (magenta nella Figura 3A). Impostare i valori di frequenza e ampiezza nel software per il controllo delle vibrazioni (Figura 3B).
4. Preparazione di vermi per l'imaging del calcio
- Trasferire un singolo verme che esprime sia GCaMP che TagRFP dalla piastra incubata a una nuova piastra NGM fresca su cui E. coli OP50 è stato striato.
- Fissare la piastra NGM al trasduttore acustico piezoelettrico utilizzando nastro adesivo trasparente (Figura 4). Non premere la piastra sull'attuatore perché questo altera la frequenza di vibrazione.
5. Imaging del calcio sotto il controllo di specifiche proprietà di vibrazione
- Attivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Trova il verme sotto luce intensa e luce di eccitazione (488 nm e 560 nm).
- Impostare il valore di zoom della microscopia su 2,5x. Il campo visivo è di 1,1 mm x 1,1 mm con una risoluzione di 2,6 μm/pixel.
- Spegnere la luce intensa e attivare il pulsante Homing (Figura 2I) per tracciare il punto fluorescente di un worm. Questo pulsante di homing avvia il movimento dello stadio X-Y per mantenere la regione di massima intensità del worm al centro del campo visivo nell'immagine TagRFP.
NOTA: In termini di promotore flp-18 , l'intensità fluorescente dei neuroni AVA è più forte e quelli di altri neuroni sono deboli o non rilevati. Pertanto, il sistema a basso ingrandimento non è necessario per il tracciamento e il palco si muove durante la registrazione. - Assicurarsi che i valori delle barre di intensità nelle Figure 2E e 2F siano circa 1.000. In caso contrario, mettere a punto i calibri da 470 nm e 550 nm del pod di controllo nella sorgente luminosa.
- Premere il pulsante Esegui nel sistema di macro del mouse per consentire il controllo del cursore del mouse in base a una pianificazione descritta nella Figura 3A. Questo inizia a registrare utilizzando il software di tracciamento e stimolare il software del gene dell'onda durante il monitoraggio del worm.
- Verificare se il file BMP di output è stato creato in modo appropriato.
6. Analisi dei dati
- Creare una cartella sul desktop e denominarla CalciumImaging.
- Creare una cartella all'interno della cartella CalciumImaging e denominarla CIResult, per i file dei risultati di output.
- Fare doppio clic sul file DualViewImaging.nb scritto nel software di analisi dei dati per Windows.
- Inserire il percorso del file nella cartella CIResult (ad esempio, Nome Directory[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figura 5).
- Inserire il percorso del file nella cartella, incluso il file BMP (ad esempio, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figura 5), in cui XXX indica il nome della cartella, inclusi i file BMP.
- Premere contemporaneamente i tasti Maiusc e Invio per avviare un'analisi automatica. Questa analisi utilizza il valore di una regione di intensità massima del campo visivo nell'immagine TagRFP (vedere la legenda della Figura 6 per la procedura di calcolo dettagliata nel programma).
- Verificare se i seguenti file di output sono stati creati in modo appropriato nella cartella CIResult.
XXX-GCaMP.tif (file immagine che illustra le tracce delle intensità GCaMP per tutte le immagini)
XXX-GCaMP.xls (file di foglio di calcolo che elenca le intensità GCaMP in tutte le immagini)
XXX-TagRFP.tif (file immagine che illustra tracce di intensità di TagRFP per tutte le immagini)
XXX-TagRFP.xls (file di foglio di calcolo che elenca le intensità TagRFP in tutte le immagini)
XXX-Ratio.tif (file immagine che illustra le tracce del valore del rapporto per tutte le immagini)
XXX-Ratio.xls (file di foglio di calcolo che elenca il valore del rapporto in tutte le immagini)
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Representative Results
Qui, un worm che esprime sia GCaMP che TagRFP sotto il controllo del promotore specifico dell'interneurone AVA viene utilizzato come esempio di imaging del calcio nel comportamento libero di C. elegans. I dati dei canali GCaMP e TagRFP sono stati ottenuti come una serie di immagini, alcune delle quali sono mostrate nella Figura 6 e come filmato (Filmato supplementare 1). È stato anche quantificato lo spostamento della piastra di Petri indotto dal nostro sistema di vibrazione non localizzato (Figura 7). Lo spostamento può essere controllato impostando il valore di ampiezza nel software per il controllo delle vibrazioni (Figura 3B) e il regolatore di volume nell'amplificatore (Figura 4), mentre la frequenza è regolata impostando il valore di frequenza nel software (Figura 4). Negli esperimenti di successo, una risposta transitoria al calcio dei neuroni AVA è stata osservata dopo la stimolazione con vibrazioni aventi una frequenza di 630 Hz e uno spostamento di circa 4,5 μm per 1 s, indicando che il neurone AVA è stato attivato durante la risposta all'indietro di un verme alla stimolazione non localizzata (Figura 6). Le linee di base di entrambi i segnali GCaMP e TagRFP hanno anche mostrato che quasi nessun fotosbiancamento si è verificato durante la registrazione.
Figura 1: Configurazione di sistema schematica. Una piastra NGM su cui si muove liberamente un verme è tenuta su un trasduttore acustico. La luce di eccitazione (488 nm e 560 nm) viene emessa da una sorgente luminosa a LED. Le emissioni fluorescenti GCaMP e TagRFP sono suddivise da ottiche di divisione delle immagini, in modo tale che ogni emissione fluorescente venga proiettata su metà di una telecamera sCMOS. Il software di tracciamento controlla lo stadio motorizzato x-y per tracciare il punto fluorescente del worm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Screenshot del software per il tracciamento di un punto fluorescente di un worm. (A) Il pulsante Esegui per l'attivazione del software. (B) Caselle per l'impostazione del ciclo di visualizzazione dell'immagine, del tempo di esposizione e del binning in ciascun canale. (C) Caselle per fornire informazioni sul ciclo di acquisizione delle immagini. (D) Il pulsante Acquisizione per avviare lo streaming live. (E) Immagine GCaMP. (F) Immagine TagRFP. (G) Un pannello per le coordinate di calibrazione tra le immagini GCaMP e TagRFP. (H) Casella per l'impostazione del percorso del file. (I) Il pulsante Homing per avviare il worm tracking. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Foto del sistema macro del mouse e software per il controllo delle vibrazioni. (A) Il quadrato magenta indica le coordinate per il cursore del mouse. Il significato di ogni riga di script è spiegato in lettere magenta. (B) La GUI (interfaccia utente grafica) del software per il controllo delle vibrazioni. I valori di frequenza e ampiezza delle vibrazioni sono controllati utilizzando questa GUI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Foto della piastra NGM tenuta sul trasduttore acustico utilizzando nastro adesivo trasparente. Solo un singolo verme si muove sul piatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Foto del software di analisi dei dati. Le sottolineature magenta e blu indicano rispettivamente i percorsi della cartella CIResult e della cartella che include i file BMP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Tracce delle intensità della fluorescenza GCaMP (A) e TagRFP (B) e della variazione del rapporto (C,D). (A) -C) Le tracce rappresentative per il segnale GCaMP, il segnale TagRFP e le variazioni di rapporto di un singolo worm. La modifica del rapporto viene calcolata utilizzando il file DualViewImaging.nb, come indicato di seguito. La coordinata in cui l'intensità della fluorescenza TagRFP è massima dopo l'estrazione della sottrazione dello sfondo per ogni immagine. Questo segnale TagRFP serve a compensare i cambiamenti di messa a fuoco causati dal movimento dell'animale. L'intensità massima di fluorescenza di GCaMP all'interno della coordinata estratta ±10 pixel viene calcolata come intensità del segnale GCaMP per ogni immagine. Per la ratiometry, ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG) viene calcolato, in cui IGCaMP e ITagRFP sono rispettivamente i segnali GCaMP e TagRFP dal neurone AVA, e IGCaMP_BG e ITagRFP_BG sono i segnali di fondo, rispettivamente. Questo processo di calcolo è stato applicato a tutte le immagini per quantificare la variazione del rapporto in un evento di inversione. La linea verticale a 5 s in tutte le tracce indica il periodo di stimolazione. (D) Il rapporto medio cambia per 15 worm. La barra di errore indica SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Relazione tra parametri. (A) Le sostituzioni sono state misurate ogni 100 Hz utilizzando un vibrometro doppler laser, in cui il valore di ampiezza nel software e il valore di regolazione VOLUME nell'amplificatore sono stati fissati rispettivamente a 0 e 10. La frequenza di risonanza è stata osservata tra 100-200 Hz, che era simile al valore descritto nella specifica del trasduttore acustico. (B) Le frequenze e gli spostamenti sono stati controllati rispettivamente dal software (intervallo; da 100 a 1000 Hz) e dall'amplificatore (intervallo: 1-10) e misurati utilizzando un vibrometro laser doppler. Il valore di ampiezza selezionato dal software è indicato per ogni frequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film supplementare 1: Un filmato rappresentativo per transienti di calcio in un interneurone AVA di un verme che si comporta liberamente in risposta a una vibrazione non localizzata a 630 Hz. La stimolazione è stata evocata 5 s dopo aver iniziato la registrazione. La GFP è stata anche espressa nell'intestino del verme come marcatore di co-iniezione per GCaMP. Questa fluorescenza GFP non influisce sull'intensità del segnale GCaMP. La barra della scala è indicata anche nella prima immagine. La direzione del worm è indicata in alto a destra dopo la prima immagine. Il lettore multimediale Windows è adatto per la riproduzione del file AVI, ma può anche essere riprodotto utilizzando alcuni lettori multimediali scaricati gratuitamente, come VLC media player nel Mac. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Generalmente, la quantificazione dell'attività neurale richiede l'introduzione di una sonda e/o restrizioni sul movimento del corpo animale. Tuttavia, per gli studi sul comportamento meccanosensoriale, l'introduzione invasiva di una sonda e le restrizioni stesse costituiscono stimoli meccanici. C. elegans fornisce un sistema per aggirare questi problemi, perché le sue caratteristiche sono trasparenti e perché ha un circuito neurale semplice e compatto che comprende solo 302 neuroni. Combinando questi vantaggi con il metodo precedentemente sviluppato di evocare vibrazioni non localizzate di spostamento su scala nanometrica13, illustrato qui è un metodo per l'imaging non invasivo del calcio di C. elegans sfrenati che rispondono alle vibrazioni controllate.
Le proprietà degli stimoli meccanici sono definite da diversi parametri, come frequenza, spostamento e durata. Recentemente, la biotremologia è emersa come un nuovo campo di ricerca1. Lo scopo principale di tali studi è comprendere i meccanismi alla base della produzione, della dispersione e della ricezione delle vibrazioni meccaniche da parte degli organismi e l'influenza di tali vibrazioni sul comportamento. Molti animali, compresi gli esseri umani, usano vibrazioni e onde acustiche per monitorare l'ambiente circostante. Ad esempio, gli scorpioni rilevano la preda attraverso la vibrazione trasmessa dal substrato14. Pertanto, la vibrazione è uno strumento di comunicazione con l'ambiente circostante. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per controllare i parametri di input e per quantificare le risposte neurali a livello di singolo neurone, portando alla creazione di un diagramma di fase che descrive la relazione input-output. Sulla base di tali diagrammi di fase, possiamo ottenere informazioni su quali parametri influenzano specifici circuiti neurali e con quali meccanismi gli animali affrontano le vibrazioni meccaniche.
Dal 2007 sono stati sviluppati15 sistemi per l'imaging del calcio a neurone singolo in C. elegans in movimento libero. Questi sistemi si sono concentrati principalmente sulle risposte neuronali alla temperatura15,16, sugli odoranti16,17 e sugli stimoli tattili17. Per quanto riguarda le vibrazioni non localizzate, il metodo di toccare una piastra di Petri è stato a lungo applicato per quantificare le risposte comportamentali. Tuttavia, toccando una piastra di Petri su uno stadio x-y motorizzato, il punto fluorescente usciva dal campo visivo, portando alla mancata tracciabilità di un verme che si comporta liberamente. Pertanto, il trasduttore acustico piezoelettrico è stato incorporato, che evoca vibrazioni non localizzate attraverso l'asse z, nel sistema di tracciamento. Questo metodo consente l'esecuzione di esperimenti riproducibili per quantificare le risposte neuronali alle vibrazioni non localizzate.
I metodi dimostrati offrono anche la possibilità di un'ulteriore estensione metodologica. Poiché l'attuale protocollo può catturare le risposte di un solo neurone in due dimensioni, il sistema di messa a fuoco automatica dovrebbe essere equipaggiato in futuro per prevenire la perdita di messa a fuoco. D'altra parte, poiché diversi metodi di imaging volumetrico sono stati recentemente sviluppati utilizzando C. elegans 18,19,20,21, l'estensione dell'approccio all'imaging volumetrico dovrebbe consentire la quantificazione non invasiva di più neuroni 22 o anche dell'intero cervello 18,19,20,21 , in risposta a vibrazioni con proprietà controllabili. Un tale sistema potrebbe essere applicato al sistema recentemente istituito per indagare i meccanismi alla base del comportamento collettivo23. Pertanto, ulteriori applicazioni biologiche ed estensioni del metodo probabilmente ci consentiranno di comprendere i meccanismi neurali alla base dei comportamenti meccanosensoriali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center per aver fornito i ceppi utilizzati in questo studio. Questa pubblicazione è stata sostenuta da JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sul progetto "Science of Soft Robot" delle aree innovative (Grant no. JP18H05474), il PRIME dell'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (numero di sovvenzione 19gm6110022h001) e la fondazione Shimadzu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
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