Summary
ここで報告されたのは、よく制御された非局在振動を有する 自由に行動するCaenorhabditis elegans におけるカルシウムイメージングのためのシステムである。このシステムにより、研究者はナノスケールの変位で十分に制御された特性を持つ非局在振動を呼び起こし、振動に対する C. elegans の応答中のカルシウム電流を定量化することができます。
Abstract
振動や音波などの非局在的な機械的力は、発生から恒常性まで、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えます。動物は行動を変えることによってこれらの刺激に対処します。このような行動修正の根底にあるメカニズムを理解するには、関心のある行動中の神経活動の定量化が必要です。ここでは、特定の周波数、変位、および持続時間の非局在振動を有する カエノラブディティス・エレガンス を自由に行動させる際のカルシウムイメージングの方法を報告する。この方法は、音響トランスデューサを使用して十分に制御された非局在振動を生成し、単一細胞分解能で誘発されたカルシウム応答を定量化することを可能にする。原理の証明として、振動に対する C.エレガンスの 脱出応答の間、単一の介在ニューロンAVAのカルシウム応答が実証される。このシステムは、機械的刺激に対する行動応答の根底にある神経メカニズムの理解を容易にする。
Introduction
動物はしばしば、振動や音響波などの非局在的な機械的刺激にさらされる1,2。これらの刺激は恒常性、発達、生殖に影響を与えるため、動物はそれらに対処するために行動を変えなければなりません3,4,5。しかし、そのような行動改変の根底にある神経回路およびメカニズムは、ほとんど理解されていない。
線虫のメカノセンティック行動、Caenorhabditis elegansは単純な行動パラダイムであり、ワームは通常、非局在的な振動に遭遇すると、前方の動きから後方の脱出応答に行動を変える6。この挙動の根底にある神経回路は、主に5つの感覚ニューロン、4対の介在ニューロン、および数種類の運動ニューロン7、8から構成される。さらに、ワームは、反復刺激9、10、11を含む間隔をあけた訓練の後、そのような機械的刺激に慣れる。したがって、この単純な行動応答は、非局在的な振動誘発行動と記憶の両方の根底にある神経メカニズムを調査するための理想的なシステムを構成する。非局在振動の影響下で自由に行動するワームにおけるカルシウムイメージングのためのプロトコルが示されている。以前に報告されたシステムと比較して、このシステムは追跡のために追加のカメラを必要としないという点で簡単です。ただし、非局在振動の周波数、変位、および持続時間を変更することができます。AVA介在ニューロンの活性化は後方脱出応答を誘導するため、AVA特異的プロモーターの制御下でカルシウム指示薬GCaMPとカルシウム非感受性蛍光タンパク質TagRFPを共発現するワームを例に挙げた(詳細は材料表参照)。このプロトコルは、ワームが前方から後方への移動に切り替える際のAVAニューロンの活性化を示しています。このプロトコルは、メカノ感覚行動の根底にある神経回路メカニズムの理解を容易にする。
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Protocol
1. カルシウムイメージングまでのワームの培養
- カルシウムイメージング実験の4日前に、2匹の成虫ST12ワームを、エシェリヒア・コリOP50が正方形のパターン(約4mm x 4mm)に縞模様になっている新しい線虫増殖培地(材料表)に移し、細胞スプレッダーを用いて、ワームがカルシウムイメージング中に細菌にほとんどの時間を費やすようにする12。
- このNGMプレートをインキュベーター内で20°Cで4日間インキュベートする(材料表)。
2. ハードウェアのセットアップ
- 刺激用圧電デバイス13、2倍対物レンズ、高速sCMOSカメラ、画像分割光学系、x-y電動ステージ、励起用LED光源、コンピュータを搭載した顕微鏡を用意する(図1)。sCMOSカメラの必須仕様には、2560 x 2160アクティブピクセル、6.5μmのサイズ、インターフェースオプションとして10タップカメラリンクが含まれます。X-Y電動ステージの主な仕様には、110 mm x 75 mmの走行範囲、250 mm/秒の最大速度、2,000 mm/秒の2 つの最大加速度、および0.25 μmの一方向再現性が含まれます。
- コンピュータと x-y 電動ステージコントローラの電源を入れます。
- アンプの電源を入れ、 音量 アジャスターを 10 に、 低音 と 高音 アジャスターを 8 に設定します。
- GCaMP と TagRFP を励起するには、LED 光源の 488 nm および 560 nm のライトをオンにします。光源のコントロールポッドの470nmと550nmのゲージを5%に設定して、LEDライトの強度がイメージングに適するようにします。
注:このLED強度では、GCaMPおよびTagRFP蛍光のフォトブリーチングは記録中に発生しません。
3. カルシウムイメージングのためのソフトウェアセットアップ
- Windowsでは、マウスマクロソフト、振動特性制御ソフト、トラッキングソフト実行ソフト、データ解析ソフトの3つのソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします(材料表)。
- トラッキングソフトウェアファイルをダブルクリックします。
- Runボタンを押し、5分間待ってからソフトウェアを安定させます(図2A)。
- 露光時間とビニングに関する情報を提供します。0.033秒の露光時間を2 x 2ビニングで行い、スムーズな画像取得を保証します(図2B)。
メモ:メモリ負荷を軽減するために、取得した10番目の 画像のみが表示されます。 - 画像取得用の情報を入力します(図2C)。たとえば、10 秒間隔で 500 枚の画像を 2 回記録する場合、[ 画像の合計 ] ボックスに 1,000 個、[ 画像 ] ボックスに 500 個、[ 間隔] ボックスに 10 と入力します。
- 集録ボタンをオンにします(図2D)。
- 蛍光画像を分割光学系を用いて分割し、2つの画像(GCaMPチャネル、500〜525nm(図2E)とする。TagRFPチャンネル、584-676nm(図2F))は、sCMOSカメラの2つの半分に投影されます。GCaMP チャネルと TagRFP チャネルの座標を較正します(図 2G)。ソフトウェア設定を保存します。
- データファイルを出力するディレクトリを設定します(図2H)。
- 集録ボタンをオフにします(図2D)。
- マウスマクロシステムソフトウェア(図3A)をダブルクリックし、振動プロパティを設定します(図3B)。マウスマクロシステムでAssay.txtファイルを読み込み、そのファイル内の座標とスケジュールに基づいてマウスカーソルが制御されるようにします(図3A)。マウスカーソルの座標(図3Aのマゼンタ四角)と、記録開始後の刺激までの待ち時間(図3Aのマゼンタ)を設定します。振動制御用のソフトウェアで周波数と振幅の値を設定します(図3B)。
4. カルシウムイメージングのためのワームの準備
- GCaMPとTagRFPの両方を発現する単一のワームを、インキュベートプレートから 、大腸菌 OP50がストリークされた新しい新鮮なNGMプレートに移す。
- 透明粘着テープを使用してNGMプレートを圧電音響変換器に取り付けます(図4)。プレートをアクチュエータに押し付けると振動周波数が変わるため、押し付けないでください。
5. 特定の振動特性を制御したカルシウムイメージング
- 集録ボタンをオンにします(図2D)。
- 明るい光と励起光(488 nmと560 nm)の下でワームを見つけます。
- 顕微鏡のズーム値を 2.5x に設定します。視野は1.1 mm x 1.1 mmで、解像度は2.6 μm/ピクセルです。
- 明るいライトをオフにし、ホーミングボタン(図2I)をオンにして、ワームの蛍光スポットを追跡します。このホーミングボタンは、X-Yステージの動きを開始し、ワームの最大強度領域をTagRFP画像の視野の中央に保ちます。
注: flp-18 プロモーターに関しては、AVAニューロンの蛍光強度が最も強く、他のニューロンからの蛍光強度はかすか、または検出されない。したがって、低倍率システムはトラッキングに必要ではなく、ステージは記録中を移動します。 - 図 2E および 2F の強度バーの値が約 1,000 であることを確認します。そうでない場合は、光源のコントロールポッドの470 nmおよび550 nmゲージを微調整します。
- マウス・マクロ・システムの「 実行」 ボタンを押すと、 図 3A で説明したスケジュールに従ってマウス・カーソルを制御できます。これは、追跡ソフトウェアを使用して記録を開始し、ワームを追跡しながら波動遺伝子ソフトウェアによって刺激します。
- 出力 BMP ファイルが適切に作成されているかどうかを確認します。
6. データ解析
- デスクトップ上にフォルダを作成し、 CalciumImagingという名前を付けます。
- CalciumImaging フォルダ内にフォルダを作成し、出力結果ファイル用に CIResult という名前を付けます。
- Windows用のデータ分析ソフトウェアで書かれた DualViewImaging.nb ファイルをダブルクリックします。
- ファイルパスをCIResultフォルダに挿入します(例:DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf])。
- BMP ファイルを含むフォルダ (例: SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) へのファイル パスを挿入します (図 5) 。 XXX は BMP ファイルを含むフォルダ名を示します。
- Shift キーと Return キーを同時に押して、自動解析を開始します。この解析では、TagRFP画像内の最大強度視野領域の値を使用します(プログラム内の詳細な計算手順については、図6の凡例を参照してください)。
- CIResult フォルダーに次の出力ファイルが適切に作成されているかどうかを確認します。
XXX-GCaMP.tif (すべての画像の GCaMP 強度の痕跡を示す画像ファイル)
XXX-GCaMP.xls (すべての画像の GCaMP 強度をリストしたスプレッドシートファイル)
XXX-TagRFP.tif (すべての画像に対する TagRFP の強度の痕跡を示す画像ファイル)
XXX-TagRFP.xls (すべての画像の TagRFP 強度をリストしたスプレッドシートファイル)
XXX-Ratio.tif (すべての画像の比率値のトレースを示す画像ファイル)
XXX-Ratio.xls (すべての画像の比率値をリストしたスプレッドシートファイル)
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Representative Results
ここでは、AVAインターニューロン特異的プロモーターの制御下でGCaMPとTagRFPの両方を発現するワームを、自由に振る舞う C.エレガンスにおけるカルシウムイメージングの一例として用いている。GCaMPおよびTagRFPチャネルデータは、一連の画像として得られ、その一部は 図6 およびムービーとして示されている(補足ムービー1)。当社の非局在振動システム(図7)によって誘導されるペトリプレートの変位も定量化されました。変位は、振動制御用のソフトウェア(図3B)とアンプの ボリューム アジャクタ(図4)で振幅値を設定することによって制御できますが、周波数はソフトウェア(図4)で周波数値を設定することによって調整されます。成功した実験では、周波数630Hzの振動と1秒間約4.5μmの変位を有する振動による刺激時にAVAニューロンの一過性カルシウム応答が観察され、非局在刺激に対するワームの後方応答中にAVAニューロンが活性化されたことが示された(図6)。GCaMP信号とTagRFP信号の両方のベースラインも、記録中にフォトブリーチングがほとんど発生しないことを示した。
図1:概略的なシステム構成 ワームが自由に動くNGMプレートを音響トランスデューサに保持します。励起光(488nmおよび560nm)は、LED光源から放出される。GCaMPとTagRFPの蛍光放射は、各蛍光発光がsCMOSカメラの半分に投影されるように、画像分割光学系によって分割されます。トラッキングソフトウェアは、x-y電動ステージを制御して、ワームの蛍光スポットを追跡します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ワームの蛍光スポットを追跡するためのソフトウェアのスクリーンショット 。(A) ソフトウェアをアクティブ化するための [ファイル名を指定して実行 ] ボタン。(B)各チャンネルの画像表示サイクル、露光時間、ビニングを設定するためのボックス。(c)画像取得サイクルに関する情報を提供するためのボックス。(D) ライブ ストリーミングを開始するための [取得 ] ボタン。(E) GCaMP イメージ。(F) タグRFP 画像。(G) GCaMP 画像と TagRFP 画像の間の座標を校正するためのパネル。(H) ファイルパスを設定するためのボックス。(I) ワームの追跡を開始するためのホ ーミング ボタン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスマクロシステムと振動を制御するためのソフトウェアの写真。 (A) マゼンタの正方形はマウスカーソルの座標を示す。各スクリプト行の意味はマゼンタ文字で説明されています。(B)振動を制御するためのソフトウェアのGUI(グラフィカルユーザーインターフェイス)。振動周波数と振幅値は、このGUIを使用して制御されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:透明粘着テープを用いて音響変換器に保持したNGM板の写真。 プレート上で動いているのは1匹のワームだけです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ解析ソフトの写真 マゼンタと青い下線は、それぞれ CIResult フォルダーへのパスと、BMP ファイルを含むフォルダーを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:GCaMP(A)、およびTagRFP(B)蛍光の強度の痕跡、および比変化(C、D)。(A-C) 単一のワームのGCaMP信号、TagRFP信号、および比率変化の代表的なトレース。比率の変化は、次のように DualViewImaging.nb ファイルを使用して計算されます。背景減算後のTagRFP蛍光の強度が最大となる座標を画像ごとに抽出する。このTagRFP信号は、動物の動きによって引き起こされる焦点の変化を補償するのに役立つ。抽出された座標±10画素以内のGCaMPの最大蛍光強度は、各画像のGCaMP信号強度として算出される。レシオメトリーの場合、((I GCaMP − I GCaMP_BG) −(I TagRFP − I TagRFP_BG)))/(I TagRFP − ITagRFP_BG)が計算され、そこではIGCaMPおよびI TagRFPはそれぞれAVAニューロンからのGCaMPおよびTagRFP信号であり、I GCaMP_BGおよびITagRFP_BGはそれぞれバックグラウンド信号である。この計算プロセスをすべての画像に適用して、反転イベントにおける比率変化を定量化しました。全ての痕跡において5秒の縦線は刺激期間を示す。(D) 15匹のワームの平均比率が変化する。エラー バーは SEM を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:パラメータ間の関係 (A)交換品は、ソフトウェアの振幅値とアンプのVOLUMEアジャスター値をそれぞれ0と10に固定したレーザードップラー振動計を使用して100Hzごとに測定しました。共振周波数は100〜200Hzの間で観察され、これは音響トランスデューサの明細書に記載されている値に類似していた。(B)周波数と変位をソフトウェア(範囲;100〜1000Hz)とアンプ(範囲:1〜10)によってそれぞれ制御し、レーザードップラー振動計を用いて測定した。ソフトウェアによって選択された振幅値は、周波数ごとに示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:630Hzの非局在振動に応答して自由に行動するワームのAVAインターニューロンにおけるカルシウム過渡現象の代表的なムービー。刺激は、記録を開始してから5秒後に誘発された。GFPはまた、GCaMPの共注射マーカーとしてワームの腸内で発現した。このGFP蛍光はGCaMPのシグナル強度に影響を及ぼさない。スケールバーは、最初の画像にも示されています。ワームの方向は、最初の画像の右上に示されています。WindowsメディアプレーヤーはAVIファイルの再生に適していますが、MacのVLCメディアプレーヤーなど、無料でダウンロードしたメディアプレーヤーを使用して再生することもできます 。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
一般に、神経活動の定量化には、プローブの導入および/または動物の身体運動に対する拘束が必要である。しかし、機械感覚行動の研究のために、プローブおよび拘束の侵襲的な導入自体が機械的刺激を構成する。 C. elegansは 、その特徴が透明であり、302個のニューロンのみからなる単純でコンパクトな神経回路を有するため、これらの問題を回避するシステムを提供する。これらの利点を、ナノスケール変位13の非局在振動を呼び起こす以前に開発された方法と組み合わせることは、制御された振動に応答する無拘束 C.エレガンスの 非侵襲的カルシウムイメージングのための方法である。
機械的刺激の特性は、周波数、変位、持続時間などのいくつかのパラメータによって定義されます。近年、生体動学が新たな研究分野として浮上しています1。このような研究の主な目的は、生物による機械的振動の生成、分散、受容の根底にあるメカニズムと、それらの振動が行動に及ぼす影響を理解することです。人間を含む多くの動物は、振動や音波を使って周囲の環境を監視しています。例えば、サソリは、基質媒介振動14を介して獲物を検出する。したがって、振動は周囲の環境とのコミュニケーションのツールです。ここで説明する方法は、入力パラメータを制御し、単一ニューロンレベルで神経応答を定量化するために使用でき、入出力関係を記述する位相図の作成につながります。このような相図に基づいて、どのパラメータが特定の神経回路に影響を与えるのか、そして動物がどのようなメカニズムによって機械的振動に対処するかについての洞察を得ることができます。
200715年以来、自由に動くC. elegansにおける単一ニューロンカルシウムイメージングのためにいくつかのシステムが開発されてきた。これらのシステムは、主に、温度15、16、匂い物質16、17、および触覚刺激17に対するニューロン応答に焦点を当てている。非局在振動に関しては、ペトリプレートを叩く方法は、行動応答を定量化するために長い間適用されてきました。しかし、電動のx-yステージでペトリプレートを叩くと、蛍光スポットが視野から出てしまい、自由に振る舞うワームの追跡に失敗しました。したがって、z軸を横切って非局在的な振動を呼び起こす圧電音響トランスデューサが追跡システムに埋め込まれました。この方法は、非局在振動に対するニューロン応答を定量化するための再現性のある実験の実施を可能にする。
実証された方法はまた、さらなる方法論的拡張の可能性を提供する。現在のプロトコルは、単一のニューロンのみの応答を2次元でキャプチャできるため、オートフォーカスシステムは、フォーカスの喪失を防ぐために将来装備する必要があります。一方、C. elegans 18,19,20,21を用いていくつかの体積画像化方法が最近開発されているため、体積画像化へのアプローチの拡張は、複数のニューロン22または脳全体18,19,20,21の非侵襲的定量を可能にするはずである。は、振動に応答して制御可能な性質を有する。このようなシステムは、集団行動23の根底にあるメカニズムを調査するために最近確立されたシステムに適用され得る。したがって、この方法のさらなる生物学的応用と拡張により、メカノセンタリー行動の根底にある神経メカニズムを理解することができる可能性があります。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は、この研究で使用された株を提供してくれた Caenorhabditis Genetics Centerに感謝する。本誌は、日本学術振興会科学研究費補助金(基盤研究(B)の助成を受けて行われました(Grant no.JP18H02483)、革新的領域「ソフトロボットの科学」プロジェクト(助成金番号。JP18H05474)、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(助成番号19gm6110022h001)、島津製作所よりPRIMEを運営。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
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