Summary
여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.
Abstract
진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.
Introduction
동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.
선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에 습관화된다 9,10,11. 따라서이 간단한 행동 반응은 비 국소 진동 유발 행동과 기억의 기초가되는 신경 메커니즘을 조사하는 이상적인 시스템을 구성합니다. 비국소 진동의 영향으로 자유롭게 행동하는 웜에서 칼슘 이미징을위한 프로토콜이 설명됩니다. 이전에 보고된 시스템과 비교할 때, 이 시스템은 추적을 위해 추가 카메라가 필요하지 않다는 점에서 간단합니다. 그러나 이를 통해 비국부적 진동의 주파수, 변위 및 지속 시간을 변경할 수 있습니다. AVA 인터뉴런의 활성화는 후진 탈출 반응을 유도하기 때문에, GCaMP, 칼슘 지시약, 및 칼슘-민감하지 않은 형광 단백질인 TagRFP를 공동발현하는 웜을 AVA 특이적 프로모터의 제어 하에 예로 사용하였다(자세한 내용은 표 참조). 이 프로토콜은 웜이 전진에서 후진 운동으로 전환됨에 따라 AVA 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 것을 용이하게합니다.
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Protocol
1. 칼슘 이미징까지 웜 재배
- 칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다.
- 이 NGM 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 4일 동안 인큐베이션한다(표 재료).
2. 하드웨어 설정
- 자극용 압전 장치(13), 2x 대물렌즈, 고속 sCMOS 카메라, 이미지 분할 광학, xy 전동 스테이지, 여기를 위한 LED 광원 및 컴퓨터가 장착된 현미경을 준비합니다(그림 1). sCMOS 카메라의 필수 사양에는 인터페이스 옵션으로 10 탭 카메라 링크가 포함 된 2560 x 2160 활성 픽셀, 6.5 μm 크기. X-Y 전동 스테이지의 주요 사양에는 110mm x 75mm 이동 범위, 250mm/s 최대 속도, 2,000mm/s2 최대 가속도 및 0.25μm 단방향 반복성이 포함됩니다.
- 컴퓨터와 xy 전동 스테이지 컨트롤러를 켭니다.
- 앰프를 켜고 볼륨 조절기를 10으로 , 베이스 및 고음 조절기를 8로 설정합니다.
- GCaMP 및 TagRFP를 자극하려면 LED 광원의 488nm 및 560nm 조명을 켭니다. 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm의 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다.
참고: 이 LED 강도에서 GCaMP 및 TagRFP 형광의 광표백은 기록 중에 발생하지 않습니다.
3. 칼슘 이미징을 위한 소프트웨어 설정
- Windows에서 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 특성을 제어하는 소프트웨어, 추적 소프트웨어 실행을 위한 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어(자료 표)의 세 가지 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다.
- 추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오.
- 실행 단추를 누르고 5분 동안 기다렸다가 소프트웨어를 안정화합니다(그림 2A).
- 노출 시간 및 비닝에 대한 정보를 제공합니다. 0.033s 노출 시간과 2 x 2 비닝으로 원활한 이미지 수집이 보장됩니다(그림 2B).
참고: 메모리 로드를 줄이기 위해 획득한 10번째 이미지만 표시됩니다. - 이미지 수집을 위한 정보를 제공합니다(그림 2C). 예를 들어 10초 간격으로 500개의 이미지가 두 번 기록되는 경우 [이미지] 합계 상자에 1,000개, [이미지] 상자에 500개, 간격 상자에 10 개를 입력합니다.
- 획득 단추를 켭니다(그림 2D).
- 이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고, 두 개의 이미지 (GCaMP 채널, 500-525 nm (도 2E); TagRFP 채널, 584-676 nm (그림 2F))는 sCMOS 카메라의 두 반쪽에 투영됩니다. GCaMP 및 TagRFP 채널의 좌표를 보정합니다(그림 2G). 소프트웨어 설정을 저장합니다.
- 데이터 파일을 출력하도록 디렉토리를 설정합니다(그림 2H).
- 획득 단추를 끕니다(그림 2D).
- 마우스 매크로 시스템 소프트웨어(그림 3A)를 두 번 클릭하고 진동 속성을 설정합니다(그림 3B). 마우스 매크로 시스템에서 Assay.txt 파일을 읽어 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되도록 합니다(그림 3A). 마우스 커서의 좌표(그림 3A의 자홍색 사각형)를 설정하고 기록을 시작한 후 자극이 시작될 때까지 대기 시간(그림 3A의 마젠타)을 설정합니다. 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정합니다(그림 3B).
4. 칼슘 이미징을위한 웜의 제조
- GCaMP 및 TagRFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 대장균 OP50이 줄무늬가 있는 새로운 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다.
- 투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 압전 음향 트랜스듀서에 부착합니다(그림 4). 액추에이터 위로 플레이트를 누르지 마십시오. 이 경우 진동 주파수가 변경됩니다.
5. 특정 진동 특성의 제어하에 칼슘 이미징
- 획득 단추를 켭니다(그림 2D).
- 밝은 빛과 여기 빛 (488nm 및 560nm)에서 웜을 찾으십시오.
- 현미경의 확대/축소 값을 2.5배로 설정합니다. 시야각은 1.1mm x 1.1mm이며 해상도는 2.6μm/픽셀입니다.
- 밝은 빛을 끄고 호밍 버튼(그림 2I)을 켜서 웜의 형광 지점을 추적합니다. 이 호밍 버튼은 X-Y 스테이지의 이동을 시작하여 TagRFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다.
참고 : flp-18 프로모터의 관점에서 AVA 뉴런의 형광 강도는 가장 강하고 다른 뉴런의 형광 강도는 희미하거나 감지되지 않습니다. 따라서 저배율 시스템은 추적에 필요하지 않으며 스테이지는 녹음 전체에서 움직입니다. - 그림 2E 및 2F의 강도 막대 값이 약 1,000인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm 게이지를 미세 조정합니다.
- 마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 그림 3A에 설명된 일정에 따라 마우스 커서를 제어할 수 있도록 합니다. 이것은 추적 소프트웨어를 사용하여 기록하기 시작하고 웜을 추적하는 동안 파동 유전자 소프트웨어에 의해 자극됩니다.
- 출력 BMP 파일이 적절하게 작성되었는지 확인하십시오.
6. 데이터 분석
- 바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 CalciumImaging으로 지정합니다.
- CalciumImaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일에 대해 이름을 CIResult로 지정합니다.
- Windows 용 데이터 분석 소프트웨어로 작성된 DualViewImaging.nb 파일을 두 번 클릭하십시오.
- 파일 경로를 CIResult 폴더에 삽입합니다(예: DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]).
- BMP 파일(예: SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/])(그림 5)을 포함하는 폴더에 파일 경로를 삽입합니다. 여기서 XXX 는 BMP 파일을 포함하는 폴더 이름을 나타냅니다.
- Shift 키와 Return 키를 동시에 눌러 자동 분석을 시작합니다. 이 분석은 TagRFP 이미지에서 시야각의 최대 강도 영역의 값을 사용합니다 (프로그램의 자세한 계산 절차는 그림 6의 범례 참조).
- 다음 출력 파일이 CIResult 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오.
XXX-GCaMP.tif(모든 이미지에 대한 GCaMP 강도의 흔적을 보여주는 이미지 파일)
XXX-GCaMP.xls (모든 이미지에서 GCaMP 강도를 나열하는 스프레드 시트 파일)
XXX-TagRFP.tif(모든 이미지에 대한 TagRFP의 강도 추적을 보여주는 이미지 파일)
XXX-TagRFP.xls(모든 이미지에서 TagRFP 강도를 나열하는 스프레드시트 파일)
XXX-비율.tif(모든 이미지에 대한 비율 값의 흔적을 보여주는 이미지 파일)
XXX 비율.xls(모든 이미지의 비율 값을 나열하는 스프레드시트 파일)
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Representative Results
여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(그림 7)도 정량화되었다. 변위는 진동 제어를 위한 소프트웨어(그림 3B)와 증폭기의 볼륨 조절기(그림 4)의 진폭 값을 설정하여 제어할 수 있는 반면, 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조절됩니다(그림 4). 성공적인 실험에서, AVA 뉴런의 일시적인 칼슘 반응은 630Hz의 주파수와 1초 동안 약 4.5μm의 변위를 갖는 진동으로 자극할 때 관찰되었는데, 이는 AVA 뉴런이 비국소 자극에 대한 웜의 후진 반응 중에 활성화되었음을 나타낸다(그림 6). GCaMP 및 TagRFP 신호 모두의 기준선은 또한 기록 중에 거의 광표백이 발생하지 않았 음을 보여주었습니다.
그림 1: 회로도 시스템 구성 웜이 자유롭게 움직이는 NGM 플레이트는 음향 트랜스듀서에 고정되어 있습니다. 여기광(488nm 및 560nm)은 LED 광원에서 방출됩니다. GCaMP 및 TagRFP 형광 방출은 이미지 분할 광학에 의해 분할되어 각 형광 방출이 sCMOS 카메라의 절반에 투영됩니다. 추적 소프트웨어는 xy 전동 단계를 제어하여 웜의 형광 지점을 추적합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 웜의 형광 지점을 추적하기 위한 소프트웨어의 스크린샷 . (A) 소프트웨어를 활성화하기 위한 실행 버튼. (B) 각 채널에서 이미지 표시 주기, 노출 시간(들) 및 비닝을 설정하기 위한 박스. (c) 영상 획득 주기에 대한 정보를 제공하기 위한 박스. (D) 라이브 스트리밍을 시작하는 획득 버튼. (E) GCaMP 이미지. (F) TagRFP 이미지. (G) GCaMP와 TagRFP 이미지 사이의 보정 좌표를 위한 패널. (H) 파일 경로 설정을 위한 상자입니다. (I) 웜 추적을 시작하는 호밍 버튼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 진동을 제어하기 위한 마우스 매크로 시스템 및 소프트웨어의 사진. (A) 자홍색 사각형은 마우스 커서의 좌표를 나타냅니다. 각 스크립트 줄의 의미는 자홍색 문자로 설명됩니다. (B) 진동을 제어하기 위한 소프트웨어의 GUI(그래픽 사용자 인터페이스). 진동 주파수와 진폭 값은 이 GUI를 사용하여 제어됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 투명 접착 테이프를 사용한 음향 트랜스듀서에 보관된 NGM 플레이트의 사진. 단 하나의 웜 만이 플레이트에서 움직이고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 데이터 분석 소프트웨어의 사진. 마젠타와 파란색 밑줄은 각각 CIResult 폴더와 BMP 파일을 포함한 폴더의 경로를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: GCaMP(A) 및 TagRFP(B) 형광의 강도 및 비율 변화(C,D)의 흔적. (A -C) GCaMP 신호, TagRFP 신호 및 단일 웜의 비율 변화에 대한 대표적인 트레이스. 비율 변경은 다음과 같이 DualViewImaging.nb 파일을 사용하여 계산됩니다. 배경 뺄셈 후 TagRFP 형광의 강도가 최대가 되는 좌표가 각 이미지에 대해 추출됩니다. 이 TagRFP 신호는 동물의 움직임으로 인한 초점 변화를 보상하는 역할을합니다. 추출된 좌표 ±10 픽셀 내의 GCaMP의 최대 형광 강도는 각 이미지에 대한 GCaMP 신호 강도로서 계산된다. 비율 측정을 위해, ((I GCaMP -I GCaMP_BG) - (I TagRFP - I TagRFP_BG)) / (I TagRFP - I TagRFP_BG)가 계산되고, 여기서 I GCaMP 및 I TagRFP는 각각 AVA 뉴런으로부터의GCaMP 및TagRFP 신호이고, IGCaMP_BG 및 I TagRFP_BG은 각각 배경 신호이다. 이 계산 프로세스는 반전 이벤트의 비율 변화를 정량화하기 위해 모든 이미지에 적용되었습니다. 모든 트레이스에서 5초에서의 수직선은 자극 기간을 나타낸다. (D) 15 개의 웜에 대한 평균 비율이 변합니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 매개 변수 간의 관계 (A) 교체는 레이저 도플러 진동계를 사용하여 매 100Hz마다 측정되었으며, 여기서 증폭기의 소프트웨어 및 VOLUME 조절기 값은 각각 0과 10으로 고정되었다. 공진 주파수는 100-200Hz 사이에서 관찰되었으며, 이는 음향 변환기의 사양에 설명된 값과 유사하였다. (b) 주파수 및 변위는 소프트웨어 (범위; 100 내지 1000 Hz) 및 증폭기 (범위: 1-10)에 의해 각각 제어되고 레이저 도플러 진동계를 사용하여 측정되었다. 소프트웨어에 의해 선택된 진폭 값은 각 주파수에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 1 : 630Hz의 비 국소 진동에 반응하여 자유롭게 행동하는 웜의 AVA 인터뉴런에서 칼슘 과도 상태에 대한 대표적인 영화. 자극은 기록을 시작한 후 5 초를 불러 일으켰다. GFP는 또한 GCaMP에 대한 공동주사 마커로서 웜의 장에서 발현되었다. 이러한 GFP 형광은 GCaMP의 신호 강도에 영향을 미치지 않는다. 배율 표시줄은 첫 번째 이미지에도 표시됩니다. 웜의 방향은 첫 번째 이미지 바로 뒤의 맨 위에 표시됩니다. Windows 미디어 플레이어는 AVI 파일을 재생하는 데 적합하지만 Mac의 VLC 미디어 플레이어와 같은 무료 다운로드 미디어 플레이어를 사용하여 재생할 수도 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나노스케일 변위(13)의 국부적 진동을 불러일으키는 이전에 개발된 방법과 결합하여, 여기에 예시된 것은 제어된 진동에 반응하는 억제되지 않은 C. elegans 의 비침습적 칼슘 이미징을 위한 방법이다.
기계적 자극의 특성은 주파수, 변위 및 지속 시간과 같은 몇 가지 매개 변수에 의해 정의됩니다. 최근에, 생물 tremology는 새로운 연구 분야로 부상하고있다1. 이러한 연구의 주요 목적은 유기체에 의한 기계적 진동의 생산, 분산 및 수용의 기초가되는 메커니즘과 이러한 진동이 행동에 미치는 영향을 이해하는 것입니다. 인간을 포함한 많은 동물들이 주변 환경을 모니터링하기 위해 진동과 음향파를 사용합니다. 예를 들어, 전갈은 기질 매개 진동(14)을 통해 먹이를 검출한다. 따라서 진동은 주변 환경과의 의사 소통 도구입니다. 여기에 설명 된 방법은 입력 매개 변수를 제어하고 단일 뉴런 수준에서 신경 반응을 정량화하는 데 사용할 수 있으므로 입출력 관계를 설명하는 위상 다이어그램을 만들 수 있습니다. 이러한 위상 다이어그램을 기반으로 우리는 어떤 매개 변수가 특정 신경 회로에 영향을 미치는지, 그리고 동물이 기계적 진동에 대처하는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
2007년 15 이후, 자유롭게 움직이는 C. elegans에서 단일 뉴런 칼슘 이미징을위한 여러 시스템이 개발되었습니다. 이러한 시스템은 주로 온도15,16, 냄새 물질 16,17 및 터치 자극 17에 대한 신경 반응에 중점을 두었습니다. 비국부적 진동과 관련하여, 페트리 플레이트를 두드리는 방법은 행동 반응을 정량화하기 위해 오랫동안 적용되어 왔습니다. 그러나 전동식 xy 스테이지에서 페트리 플레이트를 두드리면 형광 스폿이 시야를 빠져 나와 자유롭게 행동하는 웜을 추적하지 못했습니다. 따라서 압전 음향 변환기가 내장되어 Z축을 가로질러 비국부적인 진동을 트래킹 시스템에 발생시킵니다. 이 방법은 비국소 진동에 대한 뉴런 반응을 정량화하기 위한 재현 가능한 실험의 수행을 가능하게 한다.
입증 된 방법은 또한 더 많은 방법 론적 확장의 가능성을 제공합니다. 현재 프로토콜은 두 가지 차원에서 단일 뉴런의 응답 만 캡처 할 수 있기 때문에 초점 손실을 방지하기 위해 자동 초점 시스템을 장착해야합니다. 한편, C. elegans 18,19,20,21을 사용하여 최근에 여러 가지 체적 이미징 방법이 개발되었기 때문에, 체적 영상화에 대한 접근법의 확장은 다중 뉴런(22) 또는 심지어 전체 뇌(18,19,20,21)의 비침습적 정량화를 허용해야 한다. 제어 가능한 특성을 갖는 진동에 대한 응답으로. 이러한 시스템은 집단 행동(23)의 기초가 되는 메커니즘들을 조사하기 위해 최근에 확립된 시스템에 적용될 수 있다. 따라서이 방법의 생물학적 적용과 확장은 우리가 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 메커니즘을 이해할 수있게 해줄 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 "소프트 로봇의 과학"프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
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