Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Визуализация кальция у свободно ведущих себя caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией

Published: April 29, 2021 doi: 10.3791/61626
* These authors contributed equally

Summary

Здесь сообщается о системе визуализации кальция у свободно ведущих себя Caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией. Эта система позволяет исследователям вызывать нелокализованные вибрации с хорошо контролируемыми свойствами при наномасштабном смещении и количественно оценивать токи кальция во время реакций C. elegans на колебания.

Abstract

Нелокализованные механические силы, такие как вибрации и акустические волны, влияют на широкий спектр биологических процессов от развития до гомеостаза. Животные справляются с этими раздражителями, изменяя свое поведение. Понимание механизмов, лежащих в основе такой поведенческой модификации, требует количественной оценки нейронной активности во время интересующего поведения. Здесь мы сообщаем о методе визуализации кальция при свободном поведении Caenorhabditis elegans с нелокализованной вибрацией определенной частоты, смещения и продолжительности. Этот метод позволяет производить хорошо контролируемую, нелокализованную вибрацию с использованием акустического преобразователя и количественно определять вызванные реакции кальция при одноэлементном разрешении. В качестве доказательства принципа показан кальциевая реакция одного интернейрона, AVA, во время реакции выхода C. elegans на вибрацию. Эта система облегчит понимание нейронных механизмов, лежащих в основе поведенческих реакций на механические раздражители.

Introduction

Животные часто подвергаются воздействию нелокализованных механических раздражителей, таких как вибрации или акустические волны 1,2. Поскольку эти стимулы влияют на гомеостаз, развитие и размножение, животные должны изменить свое поведение, чтобы справиться с ними 3,4,5. Однако нейронные цепи и механизмы, лежащие в основе такой поведенческой модификации, плохо изучены.

Механосенсорное поведение у нематоды, Caenorhabditis elegans, представляет собой простую поведенческую парадигму, в которой черви обычно изменяют поведение от движения вперед к обратной реакции побега, когда они сталкиваются с нелокализованной вибрацией6. Нейронная цепь, лежащая в основе этого поведения, состоит в основном из пяти сенсорных нейронов, четырех пар интернейронов и нескольких типов двигательных нейронов 7,8. Кроме того, черви привыкают к таким механическим раздражителям после интервальной тренировки, включающей повторную стимуляцию 9,10,11. Таким образом, эта простая поведенческая реакция представляет собой идеальную систему для исследования нейронных механизмов, лежащих в основе как нелокализованного вибрационного поведения, так и памяти. Проиллюстрирован протокол визуализации кальция у свободно ведущих себя червей под воздействием нелокализованных колебаний. По сравнению с ранее сообщенными системами, эта система проста тем, что не требует дополнительной камеры для слежения; однако это позволяет нам изменять частоту, смещение и продолжительность нелокализованной вибрации. Поскольку активация интернейронов AVA индуцирует обратную реакцию побега, черви, совместно экспрессирующие GCaMP, индикатор кальция, и TagRFP, нечувствительный к кальцию флуоресцентный белок, под контролем AVA-специфического промотора были использованы в качестве примера (см. Таблицу материалов для деталей). Протокол демонстрирует активацию нейронов AVA, когда червь переключается с движения вперед на движение назад. Этот протокол облегчает понимание механизма нейронной цепи, лежащего в основе механосенсорного поведения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культивирование червей до получения кальциевой визуализации

  1. За четыре дня до эксперимента по визуализации кальция переместите двух взрослых червей ST12 на новую пластину среды роста нематод (NGM) (Таблица материалов), на которой Escherichia coli OP50 имеют полосы в квадратном рисунке (примерно 4 мм х 4 мм) с помощью клеточного распространителя, чтобы червь проводил большую часть времени в бактериях во время визуализации кальция12.
  2. Инкубируйте эту пластину NGM в течение 4 дней при 20 °C в инкубаторе (Таблица материалов).

2. Настройка оборудования

  1. Подготовьте микроскоп, оснащенный пьезоэлектрическим устройством для стимуляции13, объективом 2x, высокоскоростной камерой sCMOS, оптикой для разделения изображения, моторизованной ступенью x-y, светодиодным источником света для возбуждения и компьютером (рисунок 1). Основные характеристики камеры sCMOS включают 2560 x 2160 активных пикселей, размером 6,5 мкм, с 10-касательной связью камеры в качестве опции интерфейса. Основные характеристики моторизованной ступени X-Y включают диапазон хода 110 мм x 75 мм, максимальную скорость 250 мм / с, максимальное ускорение 2000 мм / с2 и однонаправленную повторяемость 0,25 мкм.
  2. Включите компьютер и контроллер моторизованной ступени x-y.
  3. Включите усилитель и установите для регулятора громкости значение 10, а для регуляторов низких и высоких частот — значение 8.
  4. Чтобы возбудить GCaMP и TagRFP, включите индикаторы светодиодного источника света 488 нм и 560 нм. Установите датчики 470 нм и 550 нм модуля управления в источнике света на 5%, чтобы интенсивность светодиодного света подходила для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этой интенсивности светодиодов фотоотбеливание флуоресценции GCaMP и TagRFP не происходит во время записи.

3. Настройка программного обеспечения для визуализации кальция

  1. Загрузите и установите три пакета программного обеспечения в Windows: программное обеспечение для макросов мыши, программное обеспечение для управления свойством вибрации, программное обеспечение для запуска программного обеспечения отслеживания и программное обеспечение для анализа данных (Таблица материалов).
  2. Дважды щелкните файл программного обеспечения для отслеживания.
  3. Нажмите кнопку Run и подождите 5 минут, чтобы стабилизировать программное обеспечение (рисунок 2A).
  4. Предоставьте информацию о времени экспозиции и биннинге. Время экспозиции 0,033 с при биннинге 2 x 2 обеспечивает плавное получение изображения (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толькокаждое 10-е полученное изображение отображается для того, чтобы уменьшить нагрузку на память.
  5. Предоставьте информацию для получения изображения (рисунок 2C). Например, если 500 изображений записываются дважды с интервалом 10 с, введите 1 000 в поле «Всего изображений », 500 в поле «Изображения » и 10 в поле «Интервал(ы »).
  6. Включите кнопку Acquisition (рисунок 2D).
  7. Разделение флуоресцентного изображения с помощью оптики разделения изображения и двух изображений (канал GCaMP, 500-525 нм (рисунок 2E); Каналы TagRFP, 584-676 нм (рисунок 2F)) проецируются на две половины камеры sCMOS. Откалибруйте координаты каналов GCaMP и TagRFP (рисунок 2G). Сохраните настройки программного обеспечения.
  8. Установите каталог для вывода файла данных (рисунок 2H).
  9. Отключите кнопку «Получение» (рисунок 2D).
  10. Дважды щелкните по программному обеспечению макросистемы мыши (рисунок 3A) и установите свойства вибрации (рисунок 3B). Прочитайте файл Assay.txt с помощью макросистемы мыши, чтобы курсор мыши управлялся на основе координат и расписания в этом файле (рисунок 3A). Установите координаты курсора мыши (пурпурные квадраты на рисунке 3A) и дождитесь стимуляции после начала записи (пурпурный на рисунке 3A). Установите значения частоты и амплитуды в программном обеспечении для контроля вибрации (рисунок 3B).

4. Подготовка червей к кальциевой визуализации

  1. Перенесите одного червя, экспрессирующего как GCaMP, так и TagRFP, из инкубированной пластины в новую свежую пластину NGM, на которой была нанесена E. coli OP50.
  2. Прикрепите пластину NGM к пьезоэлектрическому акустическому преобразователю с помощью прозрачной клейкой ленты (рисунок 4). Не прижимайте пластину к приводу, так как это изменяет частоту вибрации.

5. Кальциевая визуализация под контролем специфических вибрационных свойств

  1. Включите кнопку Acquisition (рисунок 2D).
  2. Найдите червя под ярким светом и светом возбуждения (488 нм и 560 нм).
  3. Установите значение масштаба микроскопии равным 2,5x. Поле зрения составляет 1,1 мм x 1,1 мм с разрешением 2,6 мкм/пиксель.
  4. Выключите яркий свет и включите кнопку самонаведения (рисунок 2I), чтобы отслеживать флуоресцентное пятно червя. Эта кнопка самонаведения запускает движение ступени X-Y, чтобы сохранить область максимальной интенсивности червя в середине поля зрения на изображении TagRFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С точки зрения промотора flp-18 , флуоресцентная интенсивность нейронов AVA является самой сильной, а нейроны из других нейронов слабы или не обнаруживаются. Поэтому система низкого увеличения не требуется для отслеживания, и сцена перемещается по всей записи.
  5. Убедитесь, что значения полос интенсивности на рисунках 2E и 2F составляют приблизительно 1000. Если это не так, настройте датчики 470 нм и 550 нм модуля управления в источнике света.
  6. Нажмите кнопку Run в макросистеме мыши, чтобы разрешить управление курсором мыши по расписанию, описанному на рисунке 3A. Это начинает записываться с помощью программного обеспечения отслеживания и стимулировать с помощью программного обеспечения волновых генов при отслеживании червя.
  7. Проверьте, правильно ли создан выходной BMP-файл.

6. Анализ данных

  1. Создайте папку на рабочем столе и назовите ее CalciumImaging.
  2. Создайте папку внутри папки CalciumImaging и назовите ее CIResult для выходных файлов результатов.
  3. Дважды щелкните файл DualViewImaging.nb , написанный в программном обеспечении для анализа данных для Windows.
  4. Вставьте путь к файлу в папку CIResult (например, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (рисунок 5).
  5. Вставьте путь к папке, включая BMP-файл (например, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (рисунок 5), в котором XXX обозначает имя папки, включая файлы BMP.
  6. Одновременно нажмите клавиши Shift и Return , чтобы начать автоматический анализ. В этом анализе используется значение области максимальной интенсивности поля зрения на изображении TagRFP (см. легенду рисунка 6 для подробной процедуры расчета в программе).
  7. Проверьте, правильно ли созданы следующие выходные файлы в папке CIResult.
    XXX-GCaMP.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы интенсивности GCaMP для всех изображений)
    XXX-GCaMP.xls (файл электронной таблицы со списком интенсивностей GCaMP во всех изображениях)
    XXX-TagRFP.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы интенсивности TagRFP для всех изображений)
    XXX-TagRFP.xls (файл электронной таблицы со списком интенсивностей TagRFP на всех изображениях)
    XXX-Ratio.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы значения соотношения для всех изображений)
    XXX-Ratio.xls (файл электронной таблицы со значением соотношения во всех изображениях)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь червь, экспрессирующий как GCaMP, так и TagRFP под контролем интернейрон-специфического промотора AVA, используется в качестве примера визуализации кальция у свободно ведущих себя C. elegans. Данные каналов GCaMP и TagRFP были получены в виде серии изображений, некоторые из которых показаны на рисунке 6 и в виде фильма (Дополнительный фильм 1). Смещение пластины Петри, вызванное нашей нелокализованной вибрационной системой (рисунок 7), также было количественно определено. Смещением можно управлять, установив значение амплитуды в программном обеспечении для контроля вибрации (рисунок 3B) и регулятор громкости в усилителе (рисунок 4), тогда как частота регулируется путем установки значения частоты в программном обеспечении (рисунок 4). В успешных экспериментах наблюдался переходный кальциевый ответ нейронов AVA при стимуляции вибрациями, имеющими частоту 630 Гц и смещение примерно 4,5 мкм в течение 1 с, что указывает на то, что нейрон AVA был активирован во время обратной реакции червя на нелокализованную стимуляцию (рисунок 6). Исходные линии сигналов GCaMP и TagRFP также показали, что во время записи почти не происходило фотоотбеливания.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая конфигурация системы. Пластина NGM, по которой свободно перемещается червь, удерживается на акустическом преобразователе. Свет возбуждения (488 нм и 560 нм) излучается от светодиодного источника света. Флуоресцентные излучения GCaMP и TagRFP разделяются оптикой для разделения изображения, так что каждое флуоресцентное излучение проецируется на половину камеры sCMOS. Программное обеспечение для отслеживания управляет моторизованной ступенью x-y для отслеживания флуоресцентного пятна червя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Снимок экрана программного обеспечения для отслеживания флуоресцентного пятна червя. (A) Кнопка Run для активации программного обеспечения. (B) Блоки для настройки цикла отображения изображения, времени экспозиции (ов) и биннинга в каждом канале. (C) Коробки для предоставления информации о цикле получения изображений. (D) Кнопка «Приобретение » для начала потоковой передачи в реальном времени. (E) Изображение GCaMP. (F) Изображение TagRFP. (G) Панель для калибровки координат между изображениями GCaMP и TagRFP. (H) Поле для установки пути к файлу. (I) Кнопка самонаведения для запуска отслеживания червей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Фото макросистемы мыши и программного обеспечения для управления вибрацией. (A) Пурпурный квадрат указывает координаты курсора мыши. Значение каждой строки письма объясняется пурпурными буквами. (B) Графический интерфейс пользователя (GUI) программного обеспечения для управления вибрацией. Значения частоты и амплитуды вибрации контролируются с помощью этого графического интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фото пластины NGM, удерживаемой на акустическом преобразователе с использованием прозрачной клейкой ленты. Только один червь движется по тарелке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Фотография программного обеспечения для анализа данных. Пурпурные и синие подчеркивания обозначают пути к папке CIResult и папке, включающей файлы BMP, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Следы интенсивности флуоресценции GCaMP (A) и TagRFP (B) и изменение соотношения (C,D). (А -C) Репрезентативные следы для сигнала GCaMP, сигнала TagRFP и изменения соотношения одного червя. Изменение соотношения вычисляется с помощью файла DualViewImaging.nb следующим образом. Координата, в которой интенсивность флуоресценции TagRFP максимальна после вычитания фона, извлекается для каждого изображения. Этот сигнал TagRFP служит для компенсации изменений фокусировки, вызванных движением животного. Максимальная интенсивность флуоресценции GCaMP в пределах извлеченной координатной ±10 пикселей рассчитывается как интенсивность сигнала GCaMP для каждого изображения. Для ратиометрии вычисляется ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG), в котором IGCaMP и ITagRFP являются сигналами GCaMP и TagRFP от нейрона AVA соответственно, а IGCaMP_BG и ITagRFP_BG являются фоновыми сигналами соответственно. Этот процесс расчета был применен ко всем изображениям для количественной оценки изменения соотношения в событии разворота. Вертикальная линия на 5 с во всех следах указывает на период стимуляции. (D) Среднее соотношение изменяется для 15 червей. Панель ошибок указывает на SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Связь между параметрами. (A) Замены измерялись каждые 100 Гц с помощью лазерного доплеровского виброметра, в котором значение амплитуды в программном обеспечении и значение регулятора ГРОМКОСТИ в усилителе были зафиксированы на 0 и 10, соответственно. Резонансная частота наблюдалась между 100-200 Гц, что было аналогично значению, описанному в спецификации акустического преобразователя. (B) Частоты и смещения контролировались программным обеспечением (диапазон; от 100 до 1000 Гц) и усилителем (диапазон: 1-10), соответственно, и измерялись с помощью лазерного доплеровского виброметра. Значение амплитуды, выбранное программным обеспечением, указывается для каждой частоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный фильм 1: Репрезентативный фильм о переходных процессах кальция в интернейроне AVA свободно ведущего себя червя в ответ на нелокализованную вибрацию 630 Гц. Стимуляция вызывалась через 5 с после начала записи. GFP также экспрессировался в кишечнике червя в качестве маркера совместной инъекции для GCaMP. Эта флуоресценция GFP не влияет на интенсивность сигнала GCaMP. Шкала также указана на первом изображении. Направление червя указывается вверху справа после первого изображения. Проигрыватель Windows Media подходит для воспроизведения файла AVI, но его также можно воспроизводить с помощью некоторых бесплатно загруженных медиаплееров, таких как медиаплеер VLC на Mac. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как правило, количественная оценка нейронной активности требует введения зонда и / или ограничений на движение тела животного. Однако для исследований механосенсорного поведения инвазивное введение зонда и сами ограничения представляют собой механические раздражители. C. elegans предоставляет систему для обхода этих проблем, потому что ее особенности прозрачны и потому что она имеет простую, компактную нейронную цепь, состоящую только из 302 нейронов. Сочетая эти преимущества с ранее разработанным методом вызова нелокализованных колебаний наноразмерного смещения13, здесь проиллюстрирован метод неинвазивной кальциевой визуализации неограниченных C. elegans , реагирующих на контролируемую вибрацию.

Свойства механических раздражителей определяются несколькими параметрами, такими как частота, смещение и продолжительность. В последнее время биотремология стала новой областью исследований1. Основной целью таких исследований является понимание механизмов, лежащих в основе производства, дисперсии и приема механических колебаний организмами, и влияния этих вибраций на поведение. Многие животные, включая человека, используют вибрационные и акустические волны для мониторинга окружающей среды. Например, скорпионы обнаруживают добычу через субстратную вибрацию14. Поэтому вибрация является инструментом коммуникации с окружающей средой. Метод, описанный здесь, может быть использован для управления входными параметрами и для количественной оценки нейронных реакций на уровне одного нейрона, что приводит к созданию фазовой диаграммы, описывающей отношение «вход-выход». На основе таких фазовых диаграмм мы можем получить представление о том, какие параметры влияют на конкретные нейронные цепи, и с помощью каких механизмов животные справляются с механическими колебаниями.

С 2007года было разработано несколько систем для визуализации кальция с одним нейроном у свободно движущихся C. elegans. Эти системы в основном сосредоточены на нейронных реакциях на температуру15,16, одоранты16,17 и сенсорные стимулы17. Что касается нелокализованных вибраций, метод постукивания по пластине Петри уже давно применяется для количественной оценки поведенческих реакций. Однако постукивание по пластине Петри на моторизованной ступени x-y привело к тому, что флуоресцентное пятно покинуло поле зрения, что привело к неспособности отслеживать свободно ведущего себя червя. Поэтому в систему слежения был встроен пьезоэлектрический акустический преобразователь, который вызывает нелокализованную вибрацию по оси Z. Этот метод позволяет проводить воспроизводимые эксперименты для количественной оценки нейронных реакций на нелокализованную вибрацию.

Продемонстрированные методы также предлагают возможность дальнейшего методологического расширения. Поскольку текущий протокол может захватывать ответы только одного нейрона в двух измерениях, система автофокусировки должна быть оснащена в будущем, чтобы предотвратить потерю фокуса. С другой стороны, поскольку в последнее время было разработано несколько методов объемной визуализации с использованием C. elegans 18,19,20,21, расширение подхода к объемной визуализации должно позволить неинвазивную количественную оценку нескольких нейронов22 или даже всего мозга 18,19,20,21 , в ответ на вибрацию, обладающую контролируемыми свойствами. Такая система может быть применена к недавно созданной системе для исследования механизмов, лежащих в основе коллективного поведения23. Таким образом, дальнейшие биологические приложения и расширения метода, вероятно, позволят нам понять нейронные механизмы, лежащие в основе механосенсорного поведения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis за предоставление штаммов, используемых в этом исследовании. Эта публикация была поддержана JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), по инновационным направлениям проекта «Наука о мягких роботах» (Грант No. JP18H05474), PRIME от Японского агентства медицинских исследований и разработок (номер гранта 19gm6110022h001) и фонда Shimadzu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Data anaylsis software
DualViewImaging.nb author For analysis of acquired data
Mathematica12 Wolfram For running data anaysis software DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) strain Caenorhabditis Genetics Center KG1180 Light-insensitive mutant
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter author ST12 lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometer Polytec Japan IVS-500 For quantifying  frequency and displacement generated by the accoustic transducer
Mouse macro system
Assay.txt Author Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows
HiMacroEx Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html Free download software for controling mouse cursor based on a script
Nematode growth media plate
Agar purified, powder Nakarai tesque 01162-15 For preparation of NGM plates
Bacto pepton Becton Dickinson 211677 For preparation of NGM plates
Calcium chloride Wako 036-00485 For preparation of NGM plates
Cholesterol Wako 034-03002 For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate Nakarai tesque 28727-95 For preparation of NGM plates
LB broth, Lennox Nakarai tesque 20066-95 For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous TGI M1890 For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate Nakarai tesque 28720-65 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Nakarai tesque 31320-05 For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm) Nunc 150270 For preparation of NGM plates
Nonlocalized vibration device
Amplifier LEPY LP-A7USB For stimulation with controllable vibration
Acoustic transducer MinebeaMitsumi LVC25 For stimulation with controllable vibration
WaveGene Ver. 1.5 Thrive http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html Free download software for controling vibration property
Noninvasive calcium imaging
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller Thorlabs BBD202 Compatible controller for MLS203-1 stages
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter Semrock FF01-479/585-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter Semrock FF505/606-Di01-25x36 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-512/25-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-630/92-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
Computer Dell Precision T7600 Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
High-speed x-y motorized stage Thorlabs MLS203-1 Fast XY scannning stage
Image splitting optics Hamamatsu photonics A12801-01 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics
LED light source CoolLED pE-4000 For generating 470 nm and 560 nm excitation light
Microscope Olympus MVX10
sCMOS camera Andor Zyla
x 2 Objective lens Olympus MVPLAPO2XC Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 plasmid author pKDK66 Co-injection marker
pTAK83 plasmid author pTAK83 Plasmid for expression of TagRFP under the control of  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmid author pTAK144 Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of  the flp-18 promoter
Tracking software
homingback.vi author SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage
LabVIEW National instruments For running tracking software
Zyla Control ver.2.6CI.vi author For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
  2. Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
  4. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
  5. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
  6. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  7. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  8. Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
  9. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  10. Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
  11. Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
  14. Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
  15. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
  16. Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
  17. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
  18. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
  19. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
  21. Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
  23. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).

Tags

Поведение Выпуск 170 C. elegans визуализация кальция нелокализованная вибрация механосенсорное поведение нейронная цепь
Визуализация кальция у свободно ведущих себя <em>caenorhabditis elegans</em> с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi,More

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter