Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med välkontrollerad, icke-lokaliserad vibration

Published: April 29, 2021 doi: 10.3791/61626
* These authors contributed equally

Summary

Rapporterat här är ett system för kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med välkontrollerad, icke-lokal vibration. Detta system gör det möjligt för forskare att framkalla icke-lokaliserade vibrationer med välkontrollerade egenskaper vid förskjutning i nanoskala och att kvantifiera kalciumströmmar under C. elegans svar på vibrationerna.

Abstract

Icke-lokaliserade mekaniska krafter, såsom vibrationer och akustiska vågor, påverkar en mängd olika biologiska processer från utveckling till homeostas. Djur hanterar dessa stimuli genom att ändra sitt beteende. Att förstå mekanismerna bakom sådan beteendemodifiering kräver kvantifiering av neural aktivitet under beteendet av intresse. Här rapporterar vi en metod för kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med icke-lokal vibration av specifik frekvens, förskjutning och varaktighet. Denna metod möjliggör produktion av välkontrollerade, icke-lokaliserade vibrationer med användning av en akustisk givare och kvantifiering av framkallade kalciumsvar vid encellsupplösning. Som ett principbevis demonstreras kalciumsvaret hos en enda interneuron, AVA, under C. elegans flyktrespons på vibrationer. Detta system kommer att underlätta förståelsen av neurala mekanismer som ligger till grund för beteendemässiga svar på mekaniska stimuli.

Introduction

Djur utsätts ofta för icke-lokaliserade mekaniska stimuli som vibrationer eller akustiska vågor 1,2. Eftersom dessa stimuli påverkar homeostas, utveckling och reproduktion måste djur ändra sina beteenden för att klara dem 3,4,5. De neurala kretsarna och mekanismerna som ligger till grund för sådan beteendemodifiering är emellertid dåligt förstådda.

Mekanosensoriskt beteende i nematoden, Caenorhabditis elegans, är ett enkelt beteendeparadigm, där maskar vanligtvis ändrar beteende från framåtrörelse till ett bakåtgående flyktsvar när de stöter på icke-lokal vibration6. Den neurala kretsen som ligger till grund för detta beteende består huvudsakligen av fem sensoriska neuroner, fyra par interneuroner och flera typer av motorneuroner 7,8. Dessutom vanor vanor till sådana mekaniska stimuli efter distanserad träning som involverar upprepad stimulering 9,10,11. Därför utgör detta enkla beteendemässiga svar ett idealiskt system för att undersöka neurala mekanismer som ligger till grund för både icke-lokaliserat vibrationsframmanerat beteende och minne. Ett protokoll för kalciumavbildning i fritt uppträdande maskar under påverkan av icke-lokaliserade vibrationer illustreras. Jämfört med tidigare rapporterade system är detta system enkelt eftersom det inte kräver en extra kamera för spårning; Det tillåter oss dock att ändra frekvensen, förskjutningen och varaktigheten av icke-lokal vibration. Eftersom aktivering av AVA-interneuronerna inducerar det bakåtriktade flyktsvaret användes maskar som samuttrycker GCaMP, en kalciumindikator och TagRFP, ett kalciumokänsligt fluorescerande protein, under kontroll av en AVA-specifik promotor som ett exempel (se Materialtabell för detaljer). Protokollet visar aktiveringen av AVA-neuroner när en mask växlar från framåt till bakåtrörelse. Detta protokoll underlättar förståelsen av den neurala kretsmekanismen som ligger till grund för mekanosensoriskt beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Odling av maskar tills kalciumavbildning

  1. Fyra dagar före ett kalciumavbildningsexperiment, överför två vuxna ST12-maskar till en ny nematodtillväxtmedium (NGM) -platta (Materialtabell) på vilken Escherichia coli OP50 är streckade i ett kvadratiskt mönster (cirka 4 mm x 4 mm) med hjälp av en cellspridare så att masken tillbringar större delen av tiden i bakterierna under kalciumavbildning12.
  2. Inkubera denna NGM-platta i 4 dagar vid 20 ° C i en inkubator (materialtabell).

2. Inställning av hårdvara

  1. Förbered ett mikroskop utrustat med en piezoelektrisk enhet för stimulering13, en 2x objektivlins, en höghastighets sCMOS-kamera, bilddelningsoptik, ett x-y motoriserat steg, en LED-ljuskälla för excitation och en dator (Figur 1). Viktiga specifikationer för sCMOS-kameran inkluderar 2560 x 2160 aktiva pixlar, 6,5 μm i storlek, med en 10-krans kameralänk som gränssnittsalternativ. Viktiga specifikationer för X-Y-motoriserade scenen inkluderar 110 mm x 75 mm körområde, 250 mm / s maxhastighet, 2 000 mm / s2 max acceleration och 0,25 μm enkelriktad repeterbarhet.
  2. Slå på datorn och x-y motoriserade scenregulatorn.
  3. Slå på förstärkaren och ställ in volymjusteraren på 10 och bas- och diskantjusterarna på 8.
  4. För att excitera GCaMP och TagRFP, slå på 488 nm och 560 nm lamporna på LED-ljuskällan. Ställ in mätarna på 470 nm och 550 nm på kontrollenheten i ljuskällan till 5% så att LED-ljusets intensitet är lämplig för bildbehandling.
    OBS: Vid denna LED-intensitet sker inte fotoblekning av GCaMP- och TagRFP-fluorescens under inspelning.

3. Programvaruinställning för kalciumavbildning

  1. Ladda ner och installera tre mjukvarupaket i Windows: musmakroprogramvara, programvara för att styra vibrationsegenskap, programvara för att köra spårningsprogramvara och programvara för dataanalys (Table of Materials).
  2. Dubbelklicka på spårningsprogramvarufilen.
  3. Tryck på knappen Kör och vänta i 5 minuter för att stabilisera programvaran (Figur 2A).
  4. Ange information om exponeringstid och binning. 0,033 s exponeringstid med 2 x 2 binning säkerställer smidig bildförvärv (figur 2B).
    OBS: Endast var 10: e bild som förvärvas visas för att minska minnesbelastningen.
  5. Ange information för bildförvärv (figur 2C). När till exempel 500 bilder spelas in två gånger med ett intervall på 10 s anger du 1 000 i rutan Totalt antal bilder , 500 i rutan Bilder och 10 i rutan Intervall .
  6. Slå på knappen Förvärv (figur 2D).
  7. Dela fluorescensbilden med hjälp av bilddelningsoptik och de två bilderna (GCaMP-kanal, 500-525 nm (figur 2E); TagRFP-kanal, 584-676 nm (figur 2F)) projiceras på två halvor av sCMOS-kameran. Kalibrera koordinaterna för GCaMP- och TagRFP-kanalerna (figur 2G). Spara programvaruinställningarna.
  8. Ställ in katalogen för att mata ut datafilen (Bild 2H).
  9. Stäng av knappen Förvärv (bild 2D).
  10. Dubbelklicka på musens makrosystemprogramvara (figur 3A) och ställ in vibrationsegenskaperna (figur 3B). Läs assay.txt-filen med musmakrosystemet så att muspekaren styrs baserat på koordinaterna och schemat i den filen (figur 3A). Ställ in muspekarens koordinater (magentarutor i figur 3A) och vänta tills stimuleringen har startats (magenta i figur 3A). Ställ in frekvens- och amplitudvärdena i programvaran för vibrationskontroll (figur 3B).

4. Beredning av maskar för kalciumavbildning

  1. Överför en enda mask som uttrycker både GCaMP och TagRFP från den inkuberade plattan till en ny färsk NGM-platta på vilken E. coli OP50 har streckats.
  2. Fäst NGM-plattan på den piezoelektriska akustiska givaren med transparent tejp (figur 4). Tryck inte plattan på ställdonet eftersom detta ändrar vibrationsfrekvensen.

5. Kalciumavbildning under kontroll av specifika vibrationsegenskaper

  1. Slå på knappen Förvärv (figur 2D).
  2. Hitta masken under starkt ljus och excitationsljus (488 nm och 560 nm).
  3. Ställ in zoomvärdet för mikroskopi på 2,5x. Synfältet är 1,1 mm x 1,1 mm med en upplösning på 2,6 μm/pixel.
  4. Stäng av det starka ljuset och slå på Homing-knappen (figur 2I) för att spåra en masks fluorescerande fläck. Denna homing-knapp startar rörelsen för X-Y-scenen för att hålla maskens maximala intensitetsområde mitt i synfältet i TagRFP-bilden.
    OBS: När det gäller flp-18-promotorn är den fluorescerande intensiteten hos AVA-neuronerna starkast och de från andra neuroner är svaga eller inte detekterade. Därför krävs inte det låga förstoringssystemet för spårning och scenen rör sig under hela inspelningen.
  5. Se till att värdena för intensitetsstaplarna i figur 2E och 2F är cirka 1 000. Om de inte är det, finjustera mätarna på 470 nm och 550 nm på kontrollenheten i ljuskällan.
  6. Tryck på knappen Kör i musmakrosystemet för att tillåta muspekarstyrning enligt ett schema som beskrivs i figur 3A. Detta börjar spela in med hjälp av spårningsprogramvaran och stimuleras av våggenprogramvara medan du spårar masken.
  7. Kontrollera om den utgående BMP-filen har skapats på rätt sätt.

6. Dataanalys

  1. Skapa en mapp på skrivbordet och ge den namnet CalciumImaging.
  2. Skapa en mapp i mappen CalciumImaging och ge den namnet CIResult för utdataresultatfilerna.
  3. Dubbelklicka på filen DualViewImaging.nb skriven i dataanalysprogramvara för Windows.
  4. Infoga filsökvägen i CIResult-mappen (t.ex. DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figur 5).
  5. Infoga filsökvägen till mappen inklusive BMP-filen (t.ex. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figur 5), där XXX anger mappnamnet inklusive BMP-filer.
  6. Tryck på Skift - och Retur-tangenterna samtidigt för att starta en automatisk analys. Denna analys använder värdet av en maximal intensitetsregion i synfältet i TagRFP-bilden (se förklaringen till figur 6 för detaljerad beräkningsprocedur i programmet).
  7. Kontrollera om följande utdatafiler har skapats på rätt sätt i CIResult-mappen.
    XXX-GCaMP.tif (bildfil som illustrerar spår av GCaMP-intensiteter för alla bilder)
    XXX-GCaMP.xls (kalkylarksfil med GCaMP-intensiteter i alla bilder)
    XXX-TagRFP.tif (bildfil som illustrerar spår av intensiteter i TagRFP för alla bilder)
    XXX-TagRFP.xls (kalkylbladsfil som listar TagRFP-intensiteter i alla bilder)
    XXX-Ratio.tif (bildfil som illustrerar spår av förhållandet för alla bilder)
    XXX-Ratio.xls (kalkylarksfil som visar förhållandet i alla bilder)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här används en mask som uttrycker både GCaMP och TagRFP under kontroll av AVA-interneuronspecifik promotor som ett exempel på kalciumavbildning i fritt uppträdande C. elegans. GCaMP- och TagRFP-kanaldata erhölls som en serie bilder, varav några visas i figur 6 och som en film (kompletterande film 1). Förskjutningen av Petriplattan inducerad av vårt icke-lokaliserade vibrationssystem (figur 7) kvantifierades också. Förskjutningen kan styras genom att ställa in amplitudvärdet i programvaran för vibrationskontroll (figur 3B) och volymjusteraren i förstärkaren (figur 4), medan frekvensen regleras genom att ställa in frekvensvärdet i programvaran (figur 4). I de framgångsrika experimenten observerades ett övergående kalciumsvar hos AVA-neuroner vid stimulering med vibrationer med en frekvens av 630 Hz och en förskjutning på cirka 4,5 μm i 1 s, vilket indikerar att AVA-neuronen aktiverades under en masks bakåtriktade svar på den icke-lokaliserade stimuleringen (Figur 6). Baslinjer för både GCaMP- och TagRFP-signaler visade också att nästan ingen fotoblekning inträffade under inspelningen.

Figure 1
Bild 1: En schematisk systemkonfiguration. En NGM-platta på vilken en mask rör sig fritt hålls på en akustisk givare. Excitationsljus (488 nm och 560 nm) avges från en LED-ljuskälla. GCaMP- och TagRFP-fluorescerande utsläpp delas upp av bilddelande optik, så att varje fluorescerande utsläpp projiceras på hälften av en sCMOS-kamera. Spårningsprogramvara styr x-y-motoriserade scenen för att spåra maskens fluorescerande fläck. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Skärmdump av programvaran för att spåra en fluorescerande fläck av en mask. (A) Kör-knappen för att aktivera programvaran. (B) Rutor för inställning av bildvisningscykel, exponeringstid (er) och binning i varje kanal. (C) Rutor för tillhandahållande av information om bildinsamlingscykeln. (D) Knappen Förvärv för att initiera livestreaming. (E) GCaMP-bild. (F) TagRFP-bild. (G) En panel för kalibreringskoordinater mellan GCaMP- och TagRFP-bilder. (H) Ruta för inställning av filsökväg. (I) Homing-knappen för att starta maskspårning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Foto av musmakrosystemet och programvara för att styra vibrationer. (A) Magenta-kvadraten anger koordinaterna för muspekaren. Betydelsen av varje skriptrad förklaras med magenta bokstäver. (B) GUI (grafiskt användargränssnitt) för programvara för kontroll av vibrationer. Vibrationsfrekvens- och amplitudvärden styrs med hjälp av detta GUI. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Foto av NGM-plattan som hålls på den akustiska givaren med transparent tejp. Endast en enda mask rör sig på plattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Foto av dataanalysprogramvaran. Magenta och blå understrykningar anger sökvägarna till CIResult-mappen respektive mappen inklusive BMP-filer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Spår av intensiteterna av GCaMP (A) och TagRFP (B) fluorescens och förhållandet förändring (C,D). (Ett -C) De representativa spåren för GCaMP-signal, TagRFP-signal och förhållandeförändringar för en enda mask. Förhållandeändringen beräknas med hjälp av filen DualViewImaging.nb enligt följande. Koordinaten där intensiteten för TagRFP-fluorescens är maximal efter att bakgrundssubtraktion extraherats för varje bild. Denna TagRFP-signal tjänar till att kompensera för fokusförändringar som orsakas av djurets rörelse. Den maximala fluorescensintensiteten för GCaMP inom den extraherade koordinaten ±10 pixlar beräknas som GCaMP-signalintensiteten för varje bild. För ratiometri beräknas ((IGCaMP - IGCaMP_BG) − (ITagRFP - ITagRFP_BG)) / (ITagRFP - ITagRFP_BG), där IGCaMP och ITagRFP är GCaMP- respektive TagRFP-signalerna från AVA-neuronen, och jagGCaMP_BG och jagTagRFP_BG är bakgrundssignalerna. Denna beräkningsprocess tillämpades på alla bilder för att kvantifiera förhållandeförändringen i en återföringshändelse. Den vertikala linjen vid 5 s i alla spår indikerar stimuleringsperioden. (D) Det genomsnittliga förhållandet ändras för 15 maskar. Felfältet indikerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Förhållandet mellan parametrar. (A) Ersättningar mättes var 100 Hz med hjälp av en laserdoplervibrometer, där amplitudvärdet i programvaran och VOLYMJUSTERINGSVÄRDET i förstärkaren fixerades till 0 respektive 10. Resonansfrekvensen observerades mellan 100-200 Hz, vilket liknade det värde som beskrivs i specifikationen för den akustiska givaren. (B) Frekvenser och förskjutningar styrdes av programvaran (intervall; 100 till 1000 Hz) respektive förstärkaren (intervall: 1-10) och mättes med hjälp av en laserdipplervibrometer. Amplitudvärdet som valts av programvaran anges för varje frekvens. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande film 1: En representativ film för kalciumtransienter i en AVA-interneuron av en fritt uppträdande mask som svar på en 630 Hz icke-lokal vibration. Stimulering framkallades 5 s efter att inspelningen startats. GFP uttrycktes också i maskens tarm som en saminjektionsmarkör för GCaMP. Denna GFP-fluorescens påverkar inte signalintensiteten för GCaMP. Skalstången anges också i den första bilden. Maskens riktning anges längst upp till höger efter den första bilden. Windows mediaspelare är lämplig för att spela AVI-filen, men den kan också spelas med några gratis nedladdade mediaspelare, till exempel VLC mediaspelare i Mac . Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I allmänhet kräver kvantifieringen av neural aktivitet införande av en sond och / eller begränsningar av djurkroppsrörelser. För studier av mekanosensoriskt beteende utgör emellertid den invasiva introduktionen av en sond och begränsningar själva mekaniska stimuli. C. elegans tillhandahåller ett system för att kringgå dessa problem, eftersom dess egenskaper är transparenta och eftersom den har en enkel, kompakt neural krets som endast omfattar 302 neuroner. Genom att kombinera dessa fördelar med den tidigare utvecklade metoden för att framkalla icke-lokaliserade vibrationer avnanoskalaförskjutning 13, illustreras här en metod för icke-invasiv kalciumavbildning av obegränsad C. elegans som svarar på kontrollerad vibration.

Egenskaper hos mekaniska stimuli definieras av flera parametrar, såsom frekvens, förskjutning och varaktighet. Nyligen har biotremologi vuxit fram som ett nytt forskningsfält1. Huvudsyftet med sådana studier är att förstå mekanismer som ligger till grund för produktion, spridning och mottagning av mekaniska vibrationer av organismer och påverkan av dessa vibrationer på beteende. Många djur, inklusive människor, använder vibrationer och akustiska vågor för att övervaka den omgivande miljön. Skorpioner upptäcker till exempel byte genom substratburen vibration14. Därför är vibrationer ett verktyg för kommunikation med den omgivande miljön. Metoden som beskrivs här kan användas för att styra ingångsparametrar och för att kvantifiera neurala svar på en-neuronnivå, vilket leder till skapandet av ett fasdiagram som beskriver förhållandet mellan ingång och utgång. Baserat på sådana fasdiagram kan vi få insikt i vilka parametrar som påverkar specifika neurala kretsar och med vilka mekanismer djur klarar av mekaniska vibrationer.

Sedan 200715 har flera system utvecklats för kalciumavbildning med en neuron i fritt rörlig C. elegans. Dessa system har främst fokuserat på neuronala svar på temperatur 15,16, luktämnen16,17 och beröringsstimuli17. När det gäller icke-lokaliserade vibrationer har metoden att knacka på en petriplatta länge tillämpats för att kvantifiera beteendemässiga svar. Att knacka på en Petri-platta på ett motoriserat x-y-stadium fick emellertid den fluorescerande platsen att lämna synfältet, vilket ledde till misslyckande med att spåra en fritt uppträdande mask. Därför var den piezoelektriska akustiska givaren inbäddad, som framkallar icke-lokal vibration över z-axeln, i spårningssystemet. Denna metod möjliggör utförande av reproducerbara experiment för kvantifiering av neuronala svar på icke-lokaliserad vibration.

De demonstrerade metoderna ger också möjlighet till ytterligare metodologisk utvidgning. Eftersom det nuvarande protokollet kan fånga svar från endast en enda neuron i två dimensioner, bör autofokussystemet utrustas i framtiden för att förhindra förlust av fokus. Å andra sidan, eftersom flera volymetriska avbildningsmetoder nyligen har utvecklats med C. elegans 18,19,20,21, bör utvidgning av tillvägagångssättet för volymetrisk avbildning möjliggöra icke-invasiv kvantifiering av flera neuroner 22 eller till och med hela hjärnan 18,19,20,21 , som svar på vibrationer som har kontrollerbara egenskaper. Ett sådant system skulle kunna tillämpas på det nyligen etablerade systemet för att undersöka mekanismer som ligger till grund för kollektivt beteende23. Därför kommer ytterligare biologiska tillämpningar och utvidgningar av metoden sannolikt att göra det möjligt för oss att förstå neurala mekanismer som ligger till grund för mekanosensoriska beteenden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center för att tillhandahålla de stammar som används i denna studie. Denna publikation stöddes av JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant nr. JP18H02483), om projektet Innovativa områden "Science of Soft Robot" (Bidrag nr. JP18H05474), PRIME från Japan Agency for Medical Research and Development (bidragsnummer 19gm6110022h001) och Shimadzu-stiftelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Data anaylsis software
DualViewImaging.nb author For analysis of acquired data
Mathematica12 Wolfram For running data anaysis software DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) strain Caenorhabditis Genetics Center KG1180 Light-insensitive mutant
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter author ST12 lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometer Polytec Japan IVS-500 For quantifying  frequency and displacement generated by the accoustic transducer
Mouse macro system
Assay.txt Author Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows
HiMacroEx Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html Free download software for controling mouse cursor based on a script
Nematode growth media plate
Agar purified, powder Nakarai tesque 01162-15 For preparation of NGM plates
Bacto pepton Becton Dickinson 211677 For preparation of NGM plates
Calcium chloride Wako 036-00485 For preparation of NGM plates
Cholesterol Wako 034-03002 For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate Nakarai tesque 28727-95 For preparation of NGM plates
LB broth, Lennox Nakarai tesque 20066-95 For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous TGI M1890 For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate Nakarai tesque 28720-65 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Nakarai tesque 31320-05 For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm) Nunc 150270 For preparation of NGM plates
Nonlocalized vibration device
Amplifier LEPY LP-A7USB For stimulation with controllable vibration
Acoustic transducer MinebeaMitsumi LVC25 For stimulation with controllable vibration
WaveGene Ver. 1.5 Thrive http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html Free download software for controling vibration property
Noninvasive calcium imaging
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller Thorlabs BBD202 Compatible controller for MLS203-1 stages
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter Semrock FF01-479/585-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter Semrock FF505/606-Di01-25x36 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-512/25-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-630/92-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
Computer Dell Precision T7600 Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
High-speed x-y motorized stage Thorlabs MLS203-1 Fast XY scannning stage
Image splitting optics Hamamatsu photonics A12801-01 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics
LED light source CoolLED pE-4000 For generating 470 nm and 560 nm excitation light
Microscope Olympus MVX10
sCMOS camera Andor Zyla
x 2 Objective lens Olympus MVPLAPO2XC Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 plasmid author pKDK66 Co-injection marker
pTAK83 plasmid author pTAK83 Plasmid for expression of TagRFP under the control of  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmid author pTAK144 Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of  the flp-18 promoter
Tracking software
homingback.vi author SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage
LabVIEW National instruments For running tracking software
Zyla Control ver.2.6CI.vi author For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
  2. Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
  4. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
  5. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
  6. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  7. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  8. Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
  9. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  10. Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
  11. Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
  14. Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
  15. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
  16. Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
  17. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
  18. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
  19. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
  21. Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
  23. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).

Tags

Beteende Utgåva 170 C. elegans kalciumavbildning icke-lokal vibration mekanosensoriskt beteende neural krets
Kalciumavbildning i fritt uppträdande <em>Caenorhabditis elegans</em> med välkontrollerad, icke-lokaliserad vibration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi,More

Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter