Summary
Burada iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşime sahip serbestçe davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir sistem bildirilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların nano ölçekli yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarını ve C. elegans'ın titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımlarını ölçmelerini sağlar.
Abstract
Titreşimler ve akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik kuvvetler, gelişimden homeostaza kadar çok çeşitli biyolojik süreçleri etkiler. Hayvanlar, davranışlarını değiştirerek bu uyaranlarla baş ederler. Bu tür davranış değişikliğinin altında yatan mekanizmaları anlamak, ilgilenilen davranış sırasında nöral aktivitenin ölçülmesini gerektirir. Burada, spesifik frekans, yer değiştirme ve sürenin lokalize olmayan titreşimi ile serbest davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, akustik bir dönüştürücü kullanarak iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşimin üretilmesine ve uyarılmış kalsiyum tepkilerinin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesine izin verir. İlkenin bir kanıtı olarak, C. elegans'ın titreşime kaçış tepkisi sırasında tek bir internöron olan AVA'nın kalsiyum tepkisi gösterilmiştir. Bu sistem, mekanik uyaranlara davranışsal tepkilerin altında yatan nöral mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Hayvanlar genellikle titreşimler veya akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik uyaranlara maruz kalırlar 1,2. Bu uyaranlar homeostazı, gelişimi ve üremeyi etkilediğinden, hayvanlar onlarla başa çıkmak için davranışlarını değiştirmelidir 3,4,5. Bununla birlikte, bu tür davranış değişikliklerinin altında yatan nöral devreler ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.
Nematoddaki mekanosensoriyel davranış, Caenorhabditis elegans, solucanların genellikle lokalize olmayan titreşimle karşılaştıklarında davranışlarını ileri hareketten geriye doğru kaçış tepkisine değiştirdikleri basit bir davranışsal paradigmadır6. Bu davranışın altında yatan nöral devre öncelikle beş duyusal nöron, dört çift internöron ve çeşitli motor nöron tiplerinden oluşur 7,8. Ek olarak, solucanlar tekrarlanan stimülasyonu içeren aralıklı eğitimden sonra bu tür mekanik uyaranlara alışırlar 9,10,11. Bu nedenle, bu basit davranışsal tepki, hem lokalize olmayan titreşimle uyarılmış davranışın hem de hafızanın altında yatan nöral mekanizmaları araştırmak için ideal bir sistem oluşturur. Lokalize olmayan titreşimlerin etkisi altında serbestçe davranan solucanlarda kalsiyum görüntüleme için bir protokol gösterilmiştir. Daha önce bildirilen sistemlerle karşılaştırıldığında, bu sistem izleme için ek bir kamera gerektirmemesi açısından basittir; ancak, lokalize olmayan titreşimin frekansını, yer değiştirmesini ve süresini değiştirmemize izin verir. AVA internöronlarının aktivasyonu geriye doğru kaçış tepkisini indüklediğinden, bir kalsiyum göstergesi olan GCaMP'yi ve AVA'ya özgü bir promotörün kontrolü altında kalsiyuma duyarlı olmayan bir floresan proteini olan TagRFP'yi birlikte ifade eden solucanlar örnek olarak kullanılmıştır (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Protokol, bir solucan ileriden geriye doğru harekete geçerken AVA nöronlarının aktivasyonunu gösterir. Bu protokol, mekanosensoriyel davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamayı kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kalsiyum görüntülemeye kadar solucan yetiştiriciliği
- Bir kalsiyum görüntüleme deneyinden dört gün önce, iki yetişkin ST12 solucanını, Escherichia coli OP50'nin bir hücre yayıcı kullanılarak kare bir desende (yaklaşık 4 mm x 4 mm) çizgilendiği yeni bir nematod büyüme ortamı (NGM) plakasına (Malzeme Tablosu) aktarın, böylece solucan kalsiyum görüntüleme sırasında bakterilerde çoğu zaman geçirir12.
- Bu NGM plakasını bir inkübatörde 20 °C'de 4 gün boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosu).
2. Donanım kurulumu
- Stimülasyon13 için piezoelektrik bir cihaz, 2x objektif lens, yüksek hızlı bir sCMOS kamera, görüntü bölme optiği, x-y motorlu bir aşama, uyarma için bir LED ışık kaynağı ve bir bilgisayar ile donatılmış bir mikroskop hazırlayın (Şekil 1). sCMOS kameranın temel özellikleri arasında 2560 x 2160 aktif piksel, 6,5 μm boyutunda ve arabirim seçeneği olarak 10 dokunuşlu kamera bağlantısı bulunur. X-Y motorlu kademenin temel özellikleri arasında 110 mm x 75 mm hareket aralığı, 250 mm/s maksimum hız, 2.000 mm/s2 maksimum hızlanma ve 0,25 μm tek yönlü tekrarlanabilirlik bulunur.
- Bilgisayarı ve x-y motorlu kademe kontrolörünü açın.
- Amplifikatörü açın ve Ses ayarlayıcıyı 10'a, Bas ve Tiz ayarlayıcılarını 8'e ayarlayın.
- GCaMP ve TagRFP'yi heyecanlandırmak için LED ışık kaynağının 488 nm ve 560 nm ışıklarını açın. Işık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 nm ve 550 nm göstergelerini %5'e ayarlayın, böylece LED ışığının yoğunluğu görüntüleme için uygundur.
NOT: Bu LED yoğunluğunda, kayıt sırasında GCaMP ve TagRFP floresansının fotobeyazlatılması gerçekleşmez.
3. Kalsiyum görüntüleme için yazılım kurulumu
- Windows'ta üç yazılım paketi indirin ve yükleyin: fare makro yazılımı, titreşim özelliğini kontrol etmek için yazılım, izleme yazılımı çalıştırmak için yazılım ve veri analizi yazılımı (Malzeme Tablosu).
- İzleme yazılımı dosyasına çift tıklayın.
- Çalıştır düğmesine basın ve yazılımı stabilize etmek için 5 dakika bekleyin (Şekil 2A).
- Pozlama süresi ve ciltleme hakkında bilgi verin. 2 x 2 gruplama ile 0,033 s pozlama süresi sorunsuz görüntü yakalama sağlar (Şekil 2B).
NOT: Bellek yükünü azaltmak için yalnızca alınan her 10. görüntü görüntülenir. - Görüntü alma için bilgi sağlayın (Şekil 2C). Örneğin, 500 görüntü 10 sn aralıklarla iki kez kaydedildiğinde, Görüntü Toplam kutusuna 1.000, Görüntüler kutusuna 500 ve Aralık kutusuna 10 girin.
- Edinme düğmesini açın (Şekil 2B).
- Görüntü bölme optiklerini ve iki görüntüyü (GCaMP kanalı, 500-525 nm (Şekil 2E); TagRFP kanalı, 584-676 nm (Şekil 2F)) sCMOS kameranın iki yarısına yansıtılır. GCaMP ve TagRFP kanallarının koordinatlarını kalibre edin (Şekil 2G). Yazılım ayarlarını kaydedin.
- Veri dosyasının çıktısını almak için dizini ayarlayın (Şekil 2H).
- Edinme düğmesini kapatın (Şekil 2D).
- Fare makro sistemi yazılımına çift tıklayın (Şekil 3A) ve titreşim özelliklerini ayarlayın (Şekil 3B). Fare imlecinin koordinatlara ve dosyadaki zamanlamaya göre denetlenmesi için Assay.txt dosyasını fare makro sistemiyle okuyun (Şekil 3A). Fare imlecinin koordinatlarını ayarlayın (Şekil 3A'daki macenta kareleri) ve kayda başladıktan sonra uyarılana kadar bekleyin (Şekil 3A'da macenta). Titreşim kontrolü için yazılımdaki frekansı ve genlik değerlerini ayarlayın (Şekil 3B).
4. Kalsiyum görüntüleme için solucanların hazırlanması
- Hem GCaMP hem de TagRFP'yi eksprese eden tek bir solucanı, inkübe edilmiş plakadan, E. coli OP50'nin çizildiği yeni bir taze NGM plakasına aktarın.
- NGM plakasını şeffaf yapışkan bant kullanarak piezoelektrik akustik dönüştürücüye takın (Şekil 4). Plakayı aktüatöre bastırmayın, çünkü bu titreşim frekansını değiştirir.
5. Spesifik titreşim özelliklerinin kontrolü altında kalsiyum görüntüleme
- Edinme düğmesini açın (Şekil 2B).
- Solucanı parlak ışık ve uyarma ışığı (488 nm ve 560 nm) altında bulun.
- Mikroskopinin yakınlaştırma değerini 2,5x olarak ayarlayın. Görüş alanı 1,1 mm x 1,1 mm'dir ve 2,6 μm/piksel çözünürlüğe sahiptir.
- Parlak ışığı kapatın ve solucanın floresan noktasını izlemek için Homing düğmesini (Şekil 2I) açın. Bu yönlendirme düğmesi, solucanın maksimum yoğunluk bölgesini TagRFP görüntüsündeki görüş alanının ortasında tutmak için X-Y aşamasının hareketini başlatır.
NOT: Flap-18 promotörü açısından, AVA nöronlarının floresan yoğunluğu en güçlüdür ve diğer nöronlardan gelenler soluktur veya tespit edilmez. Bu nedenle, izleme için düşük büyütme sistemi gerekli değildir ve sahne alanı kayıt boyunca hareket eder. - Şekil 2E ve 2F'deki yoğunluk çubuklarının değerlerinin yaklaşık 1.000 olduğundan emin olun. Değilse, ışık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 nm ve 550 nm göstergelerine ince ayar yapın.
- Şekil 3A'da açıklanan bir zamanlamaya göre fare imleci denetimine izin vermek için fare makro sistemindeki Çalıştır düğmesine basın. Bu, izleme yazılımını kullanarak kayıt yapmaya başlar ve solucanı izlerken dalga gen yazılımı tarafından uyarılır.
- Çıktı BMP dosyasının uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin.
6. Veri analizi
- Masaüstünde bir klasör oluşturun ve CalciumImaging olarak adlandırın.
- CalciumImaging klasörünün içinde bir klasör oluşturun ve çıktı sonuç dosyaları için CIResult olarak adlandırın.
- Windows için veri analiz yazılımında yazılmış DualViewImaging.nb dosyasına çift tıklayın.
- Dosya yolunu CIResult klasörüne ekleyin (örneğin, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Şekil 5).
- Dosya yolunu, BMP dosyasını içeren klasöre ekleyin (örneğin, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Şekil 5), burada XXX, BMP dosyalarını içeren klasör adını gösterir.
- Otomatik bir analiz başlatmak için Shift ve Return tuşlarına aynı anda basın. Bu analiz, TagRFP görüntüsündeki görüş alanının maksimum yoğunluk bölgesinin değerini kullanır (Programdaki ayrıntılı hesaplama prosedürü için Şekil 6'nın göstergesine bakın).
- Aşağıdaki çıktı dosyalarının CIResult klasöründe uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin.
XXX-GCaMP.tif (tüm görüntüler için GCaMP yoğunluklarının izlerini gösteren görüntü dosyası)
XXX-GCaMP.xls (tüm resimlerdeki GCaMP yoğunluklarını listeleyen e-tablo dosyası)
XXX-TagRFP.tif (tüm görüntüler için TagRFP yoğunluklarının izlerini gösteren resim dosyası)
XXX-TagRFP.xls (tüm resimlerdeki TagRFP yoğunluklarını listeleyen elektronik tablo dosyası)
XXX-Ratio.tif (tüm görüntüler için oran değerinin izlerini gösteren görüntü dosyası)
XXX-Ratio.xls (tüm resimlerdeki oran değerini listeleyen e-tablo dosyası)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, AVA internörona özgü promotörün kontrolü altında hem GCaMP hem de TagRFP'yi eksprese eden bir solucan, serbestçe davranan C. elegans'ta kalsiyum görüntülemenin bir örneği olarak kullanılır. GCaMP ve TagRFP kanal verileri, bazıları Şekil 6'da ve bir film olarak gösterilen bir dizi görüntü olarak elde edilmiştir (Ek Film 1). Lokalize olmayan titreşim sistemimiz tarafından indüklenen Petri plakasının yer değiştirmesi de (Şekil 7) ölçülmüştür. Yer değiştirme, titreşim kontrolü için yazılımdaki genlik değeri (Şekil 3B) ve amplifikatördeki Hacim ayarlayıcısı (Şekil 4) ayarlanarak kontrol edilebilirken, frekans, yazılımdaki frekans değeri ayarlanarak düzenlenir (Şekil 4). Başarılı deneylerde, 630 Hz frekansa sahip titreşimlerle stimülasyon üzerine AVA nöronlarının geçici bir kalsiyum yanıtı gözlendi ve 1 s için yaklaşık 4.5 μm'lik bir yer değiştirme, AVA nöronun, bir solucanın lokalize olmayan stimülasyona geri tepkisi sırasında aktive olduğunu gösterdi (Şekil 6). Hem GCaMP hem de TagRFP sinyallerinin taban çizgileri, kayıt sırasında neredeyse hiç fotobeyazlatma gerçekleşmediğini gösterdi.
Şekil 1: Şematik bir sistem yapılandırması. Bir solucanın serbestçe hareket ettiği bir NGM plakası, akustik bir dönüştürücü üzerinde tutulur. Uyarma ışığı (488 nm ve 560 nm) bir LED ışık kaynağından yayılır. GCaMP ve TagRFP floresan emisyonları, görüntü bölücü optikler tarafından bölünür, böylece her floresan emisyonu bir sCMOS kameranın yarısına yansıtılır. İzleme yazılımı, solucanın floresan noktasını izlemek için x-y motorlu aşamayı kontrol eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir solucanın floresan noktasını izlemek için yazılımın ekran görüntüsü . (A) Yazılımı etkinleştirmek için Çalıştır düğmesi. (B) Her kanalda görüntü görüntüleme döngüsünü, pozlama sürelerini ve ciltlemeyi ayarlamak için kutular. (C) Görüntü yakalama döngüsü hakkında bilgi sağlayan kutular. (D) Canlı yayını başlatmak için Edinme düğmesi. (E) GCaMP görüntüsü. (F) TagRFP görüntüsü. (G) GCaMP ve TagRFP görüntüleri arasındaki kalibrasyon koordinatları için bir panel. (H) Dosya yolunu ayarlamak için kutu. (I) Solucan izlemeyi başlatmak için Homing düğmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare makro sisteminin ve titreşimi kontrol etme yazılımının fotoğrafı. (A) Macenta kare, fare imlecinin koordinatlarını gösterir. Her senaryo satırının anlamı eflatun harflerle açıklanmaktadır. (B) Titreşimi kontrol etmek için yazılımın GUI'si (grafik kullanıcı arayüzü). Titreşim frekansı ve genlik değerleri bu GUI kullanılarak kontrol edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Şeffaf yapışkan bant kullanılarak akustik dönüştürücü üzerinde tutulan NGM plakasının fotoğrafı. Plaka üzerinde sadece tek bir solucan hareket ediyor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Veri analiz yazılımının fotoğrafı. Macenta ve mavi alt çizgiler sırasıyla CIResult klasörüne ve BMP dosyalarını içeren klasöre giden yolları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: GCaMP (A) ve TagRFP (B) floresan yoğunluklarının ve oran değişiminin (C,D) izleri. (A -C) GCaMP sinyali, TagRFP sinyali ve tek bir solucanın oran değişimlerini temsili olarak izler. Oran değişikliği, aşağıdaki gibi DualViewImaging.nb dosyası kullanılarak hesaplanır. Her görüntü için arka plan çıkarma işlemi çıkarıldıktan sonra TagRFP floresansının yoğunluğunun maksimum olduğu koordinat. Bu TagRFP sinyali, hayvanın hareketinden kaynaklanan odak değişikliklerini telafi etmeye yarar. Çıkarılan koordinat ±10 piksel içindeki GCaMP'nin maksimum floresan yoğunluğu, her görüntü için GCaMP sinyal yoğunluğu olarak hesaplanır. Oranölçer için, (I GCaMP − IGCaMP_BG) − (I TagRFP − I TagRFP_BG)) / (I TagRFP − I TagRFP_BG) hesaplanır, burada I GCaMP ve I TagRFP sırasıyla AVA nöronundanGCaMP veTagRFP sinyalleridir ve ben sırasıyla arka plan sinyalleriGCaMP_BG ve ben TagRFP_BG. Bu hesaplama işlemi, tersine çevirme olayındaki oran değişimini ölçmek için tüm görüntülere uygulandı. Tüm izlerde 5 s'deki dikey çizgi, stimülasyon süresini gösterir. (D) Ortalama oran 15 solucan için değişir. Hata çubuğu SEM'i gösterir. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Parametreler arasındaki ilişki. (A) Değiştirmeler, yazılımdaki genlik değerinin ve amplifikatördeki VOLUME ayarlayıcı değerinin sırasıyla 0 ve 10'a sabitlendiği bir lazer doppler vibrometre kullanılarak her 100 Hz'de ölçülmüştür. Rezonans frekansı, akustik dönüştürücünün spesifikasyonunda açıklanan değere benzer olan 100-200 Hz arasında gözlendi. (B) Frekanslar ve yer değiştirmeler sırasıyla yazılım (aralık; 100 ila 1000 Hz) ve amplifikatör (aralık: 1-10) tarafından kontrol edildi ve bir lazer doppler vibrometre kullanılarak ölçüldü. Yazılım tarafından seçilen genlik değeri her frekans için gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film 1: 630 Hz lokalize olmayan titreşime yanıt olarak serbestçe davranan bir solucanın AVA internöronundaki kalsiyum geçicileri için temsili bir film. Kayda başladıktan sonra stimülasyon 5 s uyarıldı. GFP ayrıca solucanın bağırsağında GCaMP için bir ko-enjeksiyon belirteci olarak ifade edildi. Bu GFP floresansı, GCaMP'nin sinyal yoğunluğunu etkilemez. Ölçek çubuğu da ilk görüntüde belirtilmiştir. Solucanın yönü, ilk görüntüden sonra sağ üstte belirtilmiştir. Windows medya oynatıcı AVI dosyasını oynatmak için uygundur, ancak Mac'teki VLC medya oynatıcı gibi bazı ücretsiz indirilen medya oynatıcılar kullanılarak da oynatılabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genel olarak, nöral aktivitenin nicelleştirilmesi, bir probun ve / veya hayvan vücudunun hareketine kısıtlamalar getirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, mekanosensoriyel davranış çalışmaları için, bir probun ve kısıtlamaların invaziv olarak sokulması mekanik uyaranları oluşturur. C. elegans , bu problemleri atlatmak için bir sistem sağlar, çünkü özellikleri şeffaftır ve sadece 302 nörondan oluşan basit, kompakt bir sinir devresine sahiptir. Bu avantajları, nano ölçekli yer değiştirme13'ün lokalize olmayan titreşimlerini uyandırmak için daha önce geliştirilmiş yöntemle birleştirerek, burada gösterilen, kontrollü titreşime yanıt veren kısıtlanmamış C. elegans'ın invaziv olmayan kalsiyum görüntülemesi için bir yöntemdir.
Mekanik uyaranların özellikleri, frekans, yer değiştirme ve süre gibi çeşitli parametrelerle tanımlanır. Son zamanlarda, biyotremoloji yeni bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır1. Bu tür çalışmaların temel amacı, mekanik titreşimlerin organizmalar tarafından üretilmesinin, dağılmasının ve alınmasının altında yatan mekanizmaları ve bu titreşimlerin davranış üzerindeki etkisini anlamaktır. İnsanlar da dahil olmak üzere birçok hayvan, çevredeki çevreyi izlemek için titreşim ve akustik dalgalar kullanır. Örneğin, akrepler avını substrat kaynaklı titreşim yoluyla tespit eder14. Bu nedenle, titreşim çevredeki çevre ile bir iletişim aracıdır. Burada açıklanan yöntem, giriş parametrelerini kontrol etmek ve tek nöron düzeyinde nöral yanıtları ölçmek için kullanılabilir ve bu da giriş-çıkış ilişkisini tanımlayan bir faz diyagramının oluşturulmasına yol açar. Bu tür faz diyagramlarına dayanarak, hangi parametrelerin belirli sinir devrelerini etkilediğine ve hayvanların mekanik titreşimlerle hangi mekanizmalarla başa çıktıklarına dair içgörüler kazanabiliriz.
2007 yılından bu yana15, serbestçe hareket eden C. elegans'ta tek nöronlu kalsiyum görüntüleme için çeşitli sistemler geliştirilmiştir. Bu sistemler temel olarak sıcaklığa15,16, koku vericilere 16,17 ve dokunma uyaranlarına 17 nöronal tepkilere odaklanmıştır. Lokalize olmayan titreşimlerle ilgili olarak, davranışsal tepkileri ölçmek için bir Petri plakasına dokunma yöntemi uzun zamandır uygulanmaktadır. Bununla birlikte, motorlu bir x-y aşamasında bir Petri plakasına dokunmak, floresan noktanın görüş alanından çıkmasına neden oldu ve bu da serbestçe davranan bir solucanın izlenememesine neden oldu. Bu nedenle, piezoelektrik akustik dönüştürücü, z ekseni boyunca lokalize olmayan titreşimi uyandıran izleme sistemine gömüldü. Bu yöntem, lokalize olmayan titreşime nöronal tepkileri ölçmek için tekrarlanabilir deneylerin gerçekleştirilmesine izin verir.
Gösterilen yöntemler ayrıca daha fazla metodolojik genişleme imkanı sunmaktadır. Mevcut protokol iki boyutta sadece tek bir nöronun tepkilerini yakalayabildiğinden, otomatik odaklama sistemi gelecekte odak kaybını önlemek için donatılmalıdır. Öte yandan, yakın zamanda C. elegans 18,19,20,21 kullanılarak çeşitli hacimsel görüntüleme yöntemleri geliştirildiğinden, hacimsel görüntüleme yaklaşımının genişletilmesi, çoklu nöronların 22 veya hatta tüm beynin invaziv olmayan nicelleştirilmesine izin vermelidir 18,19,20,21 , kontrol edilebilir özelliklere sahip titreşime yanıt olarak. Böyle bir sistem, kolektif davranışın altında yatan mekanizmaları araştırmak için yeni kurulan sisteme uygulanabilir23. Bu nedenle, yöntemin daha ileri biyolojik uygulamaları ve uzantıları, mekanosensoriyel davranışların altında yatan nöral mekanizmaları anlamamızı sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne bu çalışmada kullanılan suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu yayın JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) tarafından desteklenmiştir (Hibe no. JP18H02483), Yenilikçi alanlar üzerine "Yumuşak Robot Bilimi" projesi (Hibe no. JP18H05474), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan PRIME (hibe numarası 19gm6110022h001) ve Shimadzu vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
