Forberedelse og injektion af embryoner af Culex-myg til generering af Null-mutationer ved hjælp af CRISPR/Cas9

Summary

CRISPR/Cas9 bruges i stigende grad til at karakterisere genfunktion i ikke-modelorganismer. Denne protokol beskriver, hvordan man genererer knock-out linjer af Culex pipiens, fra forberedelse af injektionsblandinger, til at opnå og injicere mygfostre, samt hvordan man opdrætter, krydser og screen injicerer myg og deres afkom til ønskede mutationer.

Abstract

Culex myg er de vigtigste vektorer af flere sygdomme, der har en negativ indvirkning på menneskers og dyrs sundhed, herunder West Nile virus og sygdomme forårsaget af filarial nematoder såsom hunde hjerteorm og elephantasis. For nylig er CRISPR/Cas9 genomredigering blevet brugt til at fremkalde stedstyrede mutationer ved at injicere et Cas9-protein, der er blevet komplekst med et guide RNA (gRNA) i frisklagte embryoner af flere insektarter, herunder myg, der tilhører slægterne Anopheles og Aedes. Manipulere og injicere Culex myg er lidt vanskeligere, da disse myg lægge deres æg oprejst i flåder i stedet for individuelt som andre arter af myg. Her beskriver vi, hvordan man designer gRNA'er, komplekser dem med Cas9-protein, fremkalder kvindelige myg af Culex pipiens til at lægge æg, og hvordan man forbereder og injicerer nylagte embryoner til mikroinjection med Cas9/ gRNA. Vi beskriver også, hvordan man opdrætter og screener injicerede myg for den ønskede mutation. De repræsentative resultater viser, at denne teknik kan bruges til at fremkalde stedsstyrede mutationer i Culex-myggenes genom og med små modifikationer også kan bruges til at generere null-mutanter i andre mygarter.

Introduction

Culex myg er fordelt over hele tempererede og tropiske regioner i verden og overføre flere dødelige vira, herunder West Nile virus^1,St. Louis encephalitis² samt filarial nematoder, der forårsager hunde hjerteorm³ og elephantiasis⁴. Medlemmer af Culex pipiens kompleks, som omfatter Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens og Cx. pipiens molestus, viser slående variationer i mange aspekter af deres biologi. For eksempel, mens Cx. quinquefasciatus og Cx. pipiens molestus er ude af stand til at indtaste en overvintrende dvale^5,6, Cx. pipiens pipiens vise robuste sæsonbestemte reaktioner og indtaste diapause som svar på korte dage^7,8. Derudover Cx. pipiens molestus tendens til at være mere antropofile, mens Cx. pipiens og Cx. quinquefasciatus er mere zoofile⁶. Men i USA og i mange andre steder i verden, disse arter interbreed, som har stærke konsekvenser for sygdomsoverførsel som hybrider af Cx. pipiens pipiens og Cx. pipiens molestus er opportunistiske feeders og vil bide både fugle og mennesker⁹, og dermed tjener som bro vektorer for West Nile virus. Studere disse og andre fascinerende aspekter af biologi Culex myg er blevet hæmmet, dels fordi Culex myg er lidt vanskeligere at bageste i laboratoriet end Aedes myg, der producerer hvilende og udtørring-resistente æg^10, og fordi funktionelle molekylære værktøjer ikke er så veludviklet til Culex arter.

CRISPR/Cas9 genomredigering er en kraftfuld teknologi, der er blevet brugt til at evaluere biologien hos flere vigtige mygarter^11,12,13, herunder det sydlige hus myg, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Denne teknologi, der er udviklet af Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier, udnytter et naturligt bakterielt forsvar mod vira ved bakterielt afledte, CRISPR-associerede endonukleaser (Cas-proteiner; se anmeldelse af Van der Oost et al.¹⁷). Når Cas9-proteinerne injiceres i dyreembryoner, kan de kombineret med et passende vejledende RNA producere dobbeltstrengede brud i genomet. Dette gøres oftest ved at bruge Cas9-proteinet, der er komplekst med guide-RNA'er, som dirigerer endonukleaseaktivitet til en bestemt region af genomet. Efter Cas9-proteinet har skabt en stedsspecifik dobbeltstrenget pause, forsøger de cellulære maskiner at reparere pausen ved hjælp af en af to mekanismer. Den første indebærer ligating de to ender sammen gennem ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ), som er fejlbehæftet og ofte producerer out-frame indsættelser og sletninger i genomet, der kan resultere i ikke-funktionelle proteiner, og dermed generere en knock-out mutation. Alternativt kan de cellulære maskiner bruge homologi-rettet reparation (HDR) ved at finde lignende sekvenser til korrekt reparation af pausen. Den tilsvarende sekvens kan tilvejebringes af det andet kromosom i organismen (se anmeldelse¹⁸). Men hvis den reparerede sekvens nøjagtigt matcher den oprindelige sekvens, vil Cas9-proteinet igen kunne skære DNA'et. Alternativt kan forskere også inkludere en donorplasmid, der indeholder homologe sekvenser på hver side af det udskårne sted i målsekvensen med en alternativ reparationssekvens - ofte et fluorescerende markørprotein, modificeret version af det oprindelige gen eller anden ændring - der kan kopieres og indsættes i genomet eller "bankes ind."

Timing er kritisk ved injektion af embryoner, og dette er især tilfældet, når du bruger CRISPR/Cas9 genomredigering til at skabe mutationer i insekter. Dette skyldes, at Cas9-proteinet og gRNA'erne kun har den største kapacitet til at generere mutationer, når embryoet er i synkron tilstand, før cellulære membraner er dannet, og når flere kerner er tilgængelige i embryoet. For myg når kerner periferien ~ 2-4 timer efter oviposition, afhængigt af temperatur¹⁹, og derfor skal der forekomme vellykket mikroinjection før denne gang. Derudover vil Cas9-proteinet skære ethvert nukleart DNA, som det kan få adgang til, således at individet som følge af injektionen vil indeholde en mosaik af celler, nogle har den ønskede mutation, og andre ikke. For at disse mutationer skal arves med succes, skal Cas9-proteinet skære DNA, der ligger i kimen, der vil give anledning til fremtidige æg og sædceller. For at sikre, at mutationer genereres i kønscellerne, er det bedst at injicere alle materialer tæt på placeringen af polcellerne i embryoet, som er forfædrene til insektkimlinjen. Stangcellerne er placeret nær den bageste ende af Culex embryoner²⁰. Ud over at injicere embryoner er det vigtigt at udvikle en omhyggelig plan for krydsning og screening af afkom for at opdage den ønskede mutation.

Denne protokol beskriver, hvordan man genererer gRNA'er og komplekser dem med Cas9-protein for at forberede injektionsblandinger, samt hvordan man fremkalder kvindelige myg af Culex pipiens til at lægge æg, og hvordan man forbereder og injicerer disse æg til CRISPR/Cas9-medieret genomredigering. Derudover beskriver vi, hvordan man opdrætter, krydser og screener injicerede embryoner og deres afkom for at bekræfte, at den ønskede mutation er opnået. Ved hjælp af denne protokol genererede vi null-mutationer for et gen af interesse, cyklus, i Buckeye-stammen af Culex pipiens. Denne stamme blev oprindeligt etableret i 2013 fra feltopsamlede myg i Columbus, Ohio og vedligeholdes af Meuti-laboratoriet. Denne protokol kan bruges til yderligere undersøgelser, der kræver CRISPR/Cas9-genomredigering i Culex-myg samt andre myggearter, og mere generelt er relevant for at anvende CRISPR/Cas9-genomredigering til enhver insektart.

Protocol

I de fleste forskningsinstitutioner skal der være en godkendt biosikkerhedsprotokol på plads, før transgene insekter genereres eller vedligeholdes for at sikre, at genetisk modificerede organismer ikke undslipper eller fjernes fra laboratoriefaciliteten. Yderligere statslige bestemmelser kan også gælde. Før du påbegynder et projekt af denne art, skal du kontrollere alle institutionelle politikker og procedurer for at afgøre, hvilke dokumenter og godkendelser der kræves.

1. Design af gRNA'er og forberedelse af injektionsblandinger

1. Design 2-5 gRNA'er for hvert målgen, da nogle gRNA'er fungerer bedre end andre. gRNA'er, der er målrettet mod et gen af interesse, kan enten designes manuelt eller gratis programmer, såsom Chop-Chop, kan bruges.
2. Design og bestil primere, der vil forstærke 100-200 bp fragmenter omkring hver gRNA. Ideelt set skal snitstedet placeres ca. i midten tredjedel til halvdelen af PCR-produktet. Bemærk, hvor mange bp på hvert sted af snittet vil blive produceret.
3. Hent gRNA'er.
   1. Køb gRNA'er fra kommercielle virksomheder som integrerede DNA-teknologier, Fisher Scientific, Genescript og andre. Dette er den nemmeste mulighed.
   2. Alternativt kan du oprette gRNA'er i laboratoriet ved hjælp af PCR-forstærkning for at generere skabelonerne til efterfølgende isotermisk syntese. Se protokollen fra Port et al.²¹ og Kistler et al.²².
   3. Giv gRNA'er via plasmid, der injiceres i embryoner. I dette tilfælde skal gRNA være drevet af U6-promotoren (se ^23,24 for detaljer).
4. Få Fat i Cas9-proteinet.
   1. Bestil Cas9 kommercielt fra flere virksomheder, herunder Fisher Scientific. Dette er den nemmeste mulighed.
   2. Gør Cas9 protein og rense i laboratoriet i henhold til Basu et al.²⁵ og Kistler et al.²².
   3. Injicere Cas9 mRNA i embryoner, hvor det senere vil blive oversat til aktivt Cas9 protein. Cas9 mRNA kan enten syntetiseres i laboratoriet ved hjælp af in vitro transskribering²² eller købes hos leverandører som Sigma.
      BEMÆRK: Det oversatte Cas9-protein skal indeholde et nukleart lokaliseringssignal (NLS) på C-endestationen, og derfor skal NLS også være til stede i det injicerede Cas9 mRNA.
   4. Express Cas9 protein in vivo gennem plasmid-baseret udtryk. I dette tilfælde er det bedst at have udtrykket Cas9 på plasmid drevet af en embryonal promotor, der er blevet godt karakteriseret i målarten.
      BEMÆRK: Til dato har embryonale promotorer ikke været godt karakteriseret i Culex myg, og derfor anbefales injektion af renset protein eller Cas9 mRNA.
5. Kompleks gRNA'erne med Cas9-proteinet, tilpasset fra Kistler et al.²².
   1. Hvis Cas9-proteinet indsprøjtes sammen med gRNA(anbefales), skal det sikres, at de endelige koncentrationer af Cas9-protein er 300 ng/μL, og at den endelige koncentration af et enkelt gRNA er 80 μg/μL. Bland proteinet og et individuelt gRNA i et 0,2 mL PCR-rør.
   2. Inkuber i 20 minutter på is.
6. Test gRNA'er med en in vitro-analyse (f.eks. Guide-it sgRNA Screening Kit).
   1. Forstærk fragmenterne omkring snitstedet for hvert gRNA ved hjælp af PCR.
   2. Kør PCR-produkterne på en gel for at sikre, at de har den rigtige størrelse. Derefter rense PCR-produkter og sekvensere dem for at sikre, at de er målrettet mod den korrekte genregion.
   3. 200 ng af det resterende rensede PCR-produkt blandes med 1 μL Cas9-reaktionsbuffer, 1 μL BSA, 1,5 μL komplekst Cas9:gRNA, og det samlede reaktionsvolumen bringes op på 15 μL. Inkubat i 5 min ved 37°C.
   4. Kør produktet på en gel igen. Hvis Cas9-proteinet skærer PCR-produktet med succes, skal det primære bånd se ud til at være mere svagt, og der skal være yderligere mindre bånd til stede. Bemærk reduktionen i størrelsen af det oprindelige PCR-produkt, og beregn om ønsket reduktionen i båndintensiteten for at tilnærme skæreeffektiviteten.
7. Forberedelse af den endelige injektionsblanding
   1. For hvert gRNA, der med succes skærer sit målrettede PCR-produkt, blandes mængderne af hvert Cas9- og gRNA i et 0,5 mL rør, således at det endelige volumen forbliver 300 ng/μL Cas9-protein og 80 ng/μL af hvert gRNA.
   2. De komplekse Cas9- og gRNA'er opbevares ved -80 °C, indtil de er nødvendige for injektionen.

2. Træk og facetåle

BEMÆRK: Vellykkede injektioner og overlevelse af embryoner kræver skarpe nåle (figur 1).

1. Brug enten 1 mm borosilikat med yderdiameter eller kvartsglasmikrokapillærer. Silikoner mikrokapillærerne i en kemisk røghætte, før de trækkes.
   1. Kort sagt, sted 3 ml Sigmacote i et glasbæger og vakuum trække ind i et andet bægerglas, der indeholder glasset mikrokapillærer i mindst 4 timer, så siliciumiseringsopløsningen kan fordampe og bosætte sig på alle overflader af mikrokapillærerne.
   2. Derefter skal vakuumkammeret langsomt kunne udlignes med omgivende tryk ved gradvist at åbne stophaneventilen og lade luften vende tilbage til kammeret. Nålene er derefter klar til at blive trukket.
   3. Læs altid brugsanvisningen for nåletrækere før brug.
      BEMÆRK: Instruktionerne nedenfor beskriver, hvordan du bruger en P-2000 Laser Needle Puller til at trække glasnåle. Det er vigtigt at bemærke, at alle nåletrækere selv af samme mærke ikke er kalibreret til at trække nøjagtig den samme nål på tværs af forskellige enheder. Nøglen til at få gode nåle er at starte på et givet sæt parametre og derefter trække nåle ved hjælp af parametre, der er over og under disse værdier. Test nålene på hver af disse parametre ved at vurdere, hvor godt nålen gennemborer embryoner, og hvor godt injektionsblandingen strømmer fra nålen. Forfin parametrene, indtil der opnås en nål, der er let at åbne eller facet, der gennemborer embryoner glat, og som leverer injektionsblanding let.
2. Trække nåle ved hjælp af P-2000 laser nål puller
   1. Tænd for lasernålens aftrækker, og lad laseren varme op i 15 minutter før det første træk.
   2. Programmer maskinen til typen af glasmikrocapillarrør (Husk, at eventuelle nåletrækparametre er et udgangspunkt, da nåletrækere ikke er kalibreret til at producere den samme nål på tværs af alle trækkere):
      Kvarts: Varme = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Efter programmering af nålen puller, indlæse en mikrocapillary og klemme det på plads, idet man sørger for kun at røre ved enden af mikrocapillary rør og ikke det område, der vil blive opvarmet af laseren.
   4. Efter fastspænding af mikrokapillæren skal du placere tommelfingeren og pegefingeren på fingerstængerne og derefter slippe trækstængerne ved at trykke på fjederudløserne en ad gangen.
   5. Klem tommelfingeren og pegefingeren for at trække stængerne helt sammen.
   6. Placer den anden side af mikrokapillærrøret i klemmen, så en lille del af røret strækker sig fra begge sider. Stram klemmerne og sørg for, at begge klemmer er fingertætte, og at de holder "trækstængerne" fast på plads.
   7. Luk det beskyttende ligklæde på aftrækkeren.
   8. Tryk på trækknappen, og laseren begynder at opvarme glasset, angivet med det røde "laser on"-lys, der er placeret under ligklædet. Trækket er afsluttet, når trækstængerne er helt adskilt, ledsaget af et metallisk bump.
   9. Sørg for, at "laser on"-lampen ikke lyser, før du løfter ligklædet.
   10. Hold den lille ende af mikrocapillary røret, der strækker sig ud over klemmen med tommelfinger og pegefinger og løsne klemmen. Løft derefter mikrocapillaryrøret ud af klemmen.
   11. Brug tang til forsigtigt at placere mikrocapillary røret i en firkantet Petri parabol foret med dobbeltsidet tape. Sørg for, når du placerer kanylen i opbevaringsboksen, at bagenden af nålen først rører ved, og at nålen forsigtigt sænkes på plads, så den skarpe spids ikke beskadiges.
3. Trække nåle ved hjælp af en PC-10/PC-100 nåle-puller
   1. Opsæt PC-10-aftrækkeren med 4 vægte, og sæt tempen til 50,4 °C for et enkelt trins træk.
   2. Placer en borosilikat glas mikrocapillary i den øverste klemme. Løft derefter den vægtede bundklemme på plads og klem den nederste del af mikrokapillæren, og sørg for, at kapillæren er i stand til at trække to gode nåle. Dette er en ret lang trækcyklus, men den producerer gode nåle til facet.
4. Skrånende nåle.
   BEMÆRK: Denne metode til våd facet giver feedback i realtid om nålens relative åbningsstørrelse.
   1. Saml slibepladen og fastholdelsesringen af nåleblænden. Sørg for, at den grå side af slibepladen er orienteret opad mellem den øverste og nederste fastholdelsesring. Skruerne på fastholdelsesringen strammes, skiftevis fra skrue til skrue for at sikre, at hver skrue strammes jævnt. Slibepladen og fastholdelsesringene vil herefter blive omtalt som slibesamlingen.
   2. Placer 13 dråber (~ 520 μL) piedestalolie på den optiske flade overflade, og placer derefter slibesamlingen oven på pladen. Placer samlingen under et dissekerende mikroskop, og tænd derefter facetten. Lidt ekstra olie i forhold til Sutters anbefaling bruges, da dette holder slibepladen spinding i en længere periode, når den bruges sammen med denne våde skråningsmetode.
   3. Tilsæt 1% Photo-Flo-opløsning til slibefladen, og flyt vægen på plads, så den er nedsænket i Photo-Flo-opløsningen.
   4. Tænd for luften ved hovedkilden. Placer derefter en trukket borosilikatnål i holderen og stram fastholdelsesringen. Tænd for luften ved regulatoren og øge, indtil trykket har nået 26 PSI.
   5. Når du ser på fra siden, skal du sænke nålen ved hjælp af den grove justeringsknap, indtil den næsten rører ved foto-flo-væskeoverfladen.
   6. Juster mikroskopet for at finde nålen i synsfeltet. Start ved den laveste forstørrelse, og forøg forstørrelsen. Juster forsigtigt nålens position ved hjælp af den grove justeringsknap, indtil den bare rører overfladen af Foto-Flo væsken.
   7. Brug den grove justeringsknap og fortsæt med at kigge under mikroskopet, sænk nålen, indtil den er tæt på den slibende overflade, men ikke rører ved den.
   8. Brug den fine justeringsknap, sænk forsigtigt og langsomt nålen, idet du er meget opmærksom på nålen og den skygge, den efterlader på den slibende overflade af facetten. Når nålen og dens skygge ser ud som om de er ved at røre ved den slibende overflade, skal du fortsætte med at sænke nålen endnu langsommere og forsigtigt.
   9. Skift mellem at lade nålen "facet" ved at sænke den på den slibende overflade og derefter hæve den. Før du hæver nålen, skal du hurtigt notere indstillingen på mikrometeret på den fine justeringsknap, så nålen kan sænkes til samme position eller om nødvendigt til en lidt lavere position. Husk at holde nålen under Foto-Flo væskelaget. Når nålen er hævet over slibefladen, skal du hurtigt stoppe og genstarte facettens rotation for at kontrollere, om der er bobler. Hvis nålen er blevet tilstrækkeligt facet, skal luftbobler strømme ud fra nålen og ind i Foto-Flo. Hvis pladen ikke stoppes, vil boblerne sandsynligvis ikke blive synlige, før nåleåbningen er for stor.
   10. Hvis der ikke opstår bobler, når nålen hæves over slibefladen, og facetten er stoppet, skal du gentage facetproceduren, sænke nålen til en lidt lavere position på mikrometeret placeret på den fine justeringsknap, hæve nålen, stoppe facetpladen og kontrollere for luftbobler. Gentag dette, indtil der vises en lille, men stabil strøm af bobler.
   11. Når luftbobler er til stede, skal du kontrollere den relative åbningsstørrelse ved at stoppe slibepladen og sænke lufttrykket og bemærke den PSI, hvor bobledannelsen stopper, da dette er en relativ indikation af størrelsen af åbningen af de skrå nåle. Jo lavere tryk, hvor luften holder op med at slippe ud af nålespidsen, jo større er nåleåbningen. Nåle, der er udstættet til det punkt, hvor bobler holder op med at slippe ud af nålen ved 18-20 PSI, indikerer, at nålen har en relativt lille åbning og bør forårsage minimal skade på et foster, når de anvendes til mikroinjections.
   12. Når nåleåbningen er kontrolleret, skal lufttrykket øges til 26 PSI for at forhindre væske i at trænge ind i nålen. Løft derefter nålen op og ud af Photo-Flo-laget ved hjælp af den grove justeringsknap. Det er vigtigt at bemærke, at så længe luften strømmer ud af nålen, kommer Photo-Flo ikke ind i nålen, og derfor er indersiden af nålen beskyttet mod forurening.
   13. Når nålen er ude af Photo-Flo, skal du slukke for luften og fjerne nålen fra nåleholderen.
   14. Brug pincet, placere den nyligt facetterede nål i en petriskål, der har enten dobbeltsidet tape eller modellering ler til at holde det på plads. Gentag processen, indtil der er produceret 10-20 facetterede nåle.

3. Blodfodring af forældregenerationen af myg

1. Baglarver af Cx. pipiens myg under utvetydige lange dagforhold (>13 timer lys /dag) ved 25-27 °C for at sikre, at myg ikke kommer ind i deres overvintrende dvale eller diapause.
2. Syv til ti dage efter peak voksen fremkomst, forberede Hemotek Membrane fodring system ved at tilslutte varmeenheder i strømforsyningen. Temperaturen på hver enhed justeres til 37 °C (menneskets indre kropstemperatur) eller 41 °C (kyllingens indre kropstemperatur) ved hjælp af justeringsskruen øverst på enheden. Sørg for, at den korrekte temperatur er nået ved hjælp af et elektrisk termometer.
3. Forbered blodmelsbeholderen til fodring.
   1. Skær en firkant af parafilm for hver blod-fodring cylinder, og gnid parafilm mod bare fødder. Dette giver dufte, der er attraktive for myg.
   2. Stræk parafilmen så tyndt som muligt, og pak kanterne tæt rundt om måltidsbeholderen. Hvis det ønskes, fastgøres på plads med en gummi O-ring.
   3. Der tilsættes ca. 200 μL 0,1 M ATP-opløsning til 15 ml frisk eller optøet hele, natriumcitratbehandlet kyllingeblod. ATP hjælper med at stimulere blodfodring, og natriumcitrat forhindrer blodet i at koagulere.
   4. Hold reservoiret, så parafilmsiden vender nedad, og brug forsigtigt en engangspipette til at fylde reservoiret. Hvert reservoir rummer ~ 3 mL blod. Luk påfyldningsportene med plastikstik.
   5. Skru måltidsreservoirerne ind i varmeenhederne og læg dem oven på myggeburet, så parafilmsiden vender nedad, og myggene kan fodre gennem masken.
4. Dæk burene med sorte affaldsposer for at simulere skumringen og blæse kraftigt ind i hvert bur, da den øgede CO_{2-koncentration} stimulerer blodfodring.
5. Hold føderen på buret i 2-8 timer for at maksimere blodfodring. Kontroller med jævne mellemrum og bemærk andelen af kvinder, der har taget et blodmåltid (tydeligt ved deres røde og udspilede maver).

4. Fremkalde æglægning hos voksne myg

1. Fire til fem dage efter blodfodring skal du forberede et 50 mL konisk rør til mygfår.
   1. Opret et ~ 20 mm hul nær bunden af det koniske rør.
   2. Dæk hullet med to firkanter (35 mm²⁾af dental dæmning gummi, en med en vandret slids og en anden med en lodret slids. Brug tape til at fastgøre kvadraterne af dental dæmningen til koniske rør.
   3. Læg et 4,25 cm stykke filterpapir på en 35 mm x 10 mm petriskål, og vådt filterpapiret med 750 μL destilleret vand.
   4. Vend det koniske rør på filterpapiret, og drej frem og tilbage et par gange for at sikre, at det er sikkert.
2. Brug en mund aspirator til forsigtigt at fjerne ~ 10 hunner af Cx. pipiens fra deres bur og overføre dem til den forberedte koniske rør.
3. Placer en uigennemsigtig cylinder over det koniske rør for at give mørke til myggene, da dette stimulerer æglægning og venter 20-25 minutter.

5. Mikro-manipulerende frisklagte Culex æg

1. Forbered diaset til fastgørelse af mygembryoner til mikroinjection.
   1. Fastgør et stykke dobbeltsidet tape til bredden af et dækglas.
   2. Fastgør en tynd strimmel gennemsigtig medicinsk dressing (f.eks. Tegaderm, 2-3 mm bred) til det dobbeltsidede bånd, så det løber parallelt med den korte ende af dækglasset og er placeret ca. 5 mm fra enden af dækglasset.
   3. Fjern overskydende dobbeltsidet tape med et skarpt barberblad, og fjern 2-3 mm medicinsk dressing og dobbeltsidet tape fra hver ende af dækglasset. Dette gør det muligt for et lag olie at forblive på diaset, efter at æggene er monteret på dækglasset.
   4. Brug en voks blyant, tegne en "D" form omkring dobbeltsidet tape og strimler af medicinsk dressing. Dette vil fungere som en barriere for at holde vandet omkring æggene efter injektion.
2. Når rutsjebanen er forberedt og 20-25 minutter er gået, skal du fjerne det uigennemsigtige rør og afgøre, om myggene har lagt æg eller ej.
   1. Hvis ikke, skal du dække dem i yderligere 5-10 minutter.
   2. Hvis myggene har lagt æg, skal du forsigtigt, men hurtigt løfte det koniske rør og dække med en hætte. Placer myggene i et separat bur, og optag den tid, æg blev indsamlet på et regneark. Derefter tilsættes 50-100 μL DI-vand til det filterpapir, der indeholder ægflåderne.
3. Under en dissekerende mikroskop linje op æggene.
   1. Placer et stykke filterpapir (10 mm x 30 mm rektangler skåret af groft filterpapir med hurtig strømningshastighed) under et 24 mm x 40 mm dækglas, således at dækglasset dækker 50-60% af filterpapirets venstre side.
   2. Våd filterpapiret med 50 μL DI-vand. Vandet spredes langsomt under dækglasset, hvilket skaber et reservoir for at holde filterpapiret og æggene våde under mikromanipulation. Der dannes en menisk mellem dækglasset og filterpapiret, når den korrekte mængde vand påføres.
   3. Adskil æggene fra deres ægflåder ved hjælp af en fin pensel, og position, så den smalle, bageste ende af embryoet rører dækglasset (til venstre) og den bredere, forreste ende er til højre.
   4. Juster æg i 20 minutter, og observere omhyggeligt ændringen af deres farve fra en mælkehvid til en meget lysegrå. Undersøg rutinemæssigt vandfilmen under dækglasset for at sikre, at der er tilstrækkelig mængde vand. Hvis æggene ser ud til at tørre ud, tilsættes en lille mængde DI-vand (20-30 μL) til filterpapiret.
   5. Efter 20 minutter skal du kassere alle resterende æg.
4. Overfør æggene til mikroinjection dias.
   1. Brug et lille (10 mm x 30 mm) stykke groft filterpapir til at transportere vand fra siden af det mættede filterpapir, og fjern det fugtspredende filterpapir med pincet. Gentag 2-3 gange for at sikre, at filterpapiret med æggene er så tørt som muligt.
   2. Læg et friskt, tørt rektangel af filterpapir og hold det på plads med et par pincet. Træk forsigtigt dækglasset væk til venstre, væk fra de justerede æg.
   3. Tør det overskydende vand på scenen uden at forstyrre det lille filterpapir, der indeholder de justerede æg. Fortsæt med at tørre det våde filterpapir med æggene flere gange, tryk på de små rektangler af filterpapir med tommelfingre og / eller pincet for at sikre, at æggene er så tørre som muligt, før de overføres til injektionsdiaset.
   4. Brug tang, fjerne papiret opbakning ud af strimlen af medicinsk dressing fra montering dias.
   5. Hold monteringsskredslen med en tommelfinger og langfinger og den udsatte medicinske forbinding nedad, og sænk i en 45° vinkel på linjen af justerede æg. Placer diaset således, at den bredere, forreste ende af æggene (til venstre) hænger lidt ud for enden af den medicinske dressing, da dette forbedrer Culex larvernes evne til at luge fra de monterede æg.
   6. Tryk pegefingeren på undersiden af dækglasset, mens du fortsætter med at holde dækglasset mellem tommelfingeren og langfingeren for at sikre, at alle de justerede æg er solidt fastgjort til den medicinske dressing.
   7. Vend straks dækglasset, så æggene vender mod, og påfør et tyndt lag olie Halocarbonolie (2-3 dråber; ~ 20 μL) på æggene. Dette forhindrer æggene i at udtørre under mikroinjection. Fjern eventuelle æg, der ikke er fastgjort til den medicinske dressing eller ikke er dækket af olien.
   8. Placer glasdækslet med de monterede æg vendt op inde i en firkantet petriskål med et stort kvadrat vådt filterpapir til transport til mikroinjection.

6. Injektion af Culex-embryoner

1. Udfyldning af injektionsnålene med injektionsblandingen
   1. Vælg et nålefyldstof eller gellæssespids, der let kan være i bagenden af den valgte injektionsnål, og som vil have lidt plads mellem enden af nålefyldsten og injektionsnålen.
   2. Placer forsigtigt en enkelt og lille dråbe injektionsblanding (~0,5-1 μL) i injektionsnålen ved hjælp af nålefyldstoffet til at fylde nålen igen. Placer dråbe injektionsblandingen i nærheden af, hvor injektionsnålen begynder at aftage.
2. Sæt injektionsnålen fast på mikroinjektoren.
3. Placer diaset med embryonerne på mikroskopets stadie.
4. Åbning af nålen
   BEMÆRK: Hvis du bruger facetterede nåle, er dette ikke nødvendigt.
   1. Brug et startinjektionstryk på ~30 PSI og juster efter behov for at levere en passende mængde injektionsblanding.
   2. Under et dissektionsmikroskop skal du placere nålen over embryoet og forsigtigt bruge mikromanipulatoren til at sænke nålen på embryoet. Når nålen knap nok rører embryoet, skal du hurtigt flytte embryoet vinkelret på nålens lange akse.
   3. For at finde ud af, om nålen er blevet åbnet med succes, skal du trykke på indsprøjtningsudløseren og se, om der kan slippe bobler/injektionsblandinger ud af nålen. Hvis ikke, skal du gentage, at du flytter embryoet mod nålen, indtil nålen er åben, og injektionsblandingen slipper ud, når der trykkes på aftrækkeren.
5. Injektion af embryoner
   1. Placer det første foster på linje i midten af synet i mikroskopet og sørg for, at det er i fokus.
   2. Placer nålen over det første æg, også inden for midten af synsfeltet inden for mikroskopet.
   3. Gradvist øge forstørrelsen på mikroskopet, omhyggeligt sænke nålen for at holde det lige over det første foster, centreret og i fokus. Fortsæt, indtil mikroskopet har nået sin højeste forstørrelse, og både embryoet og nålen er i fokus.
   4. Flyt forsigtigt embryoet på scenen lidt til venstre og sænk nålen lidt, så nålen og embryoet nu er i samme synsplan.
   5. Brug mikroskopet til at flytte embryoet, rør forsigtigt og forsigtigt embryoet til nålespidsen. Den smalle, bageste ende af embryoet skal afbøje lidt. Juster nålens højde, hvis den er for høj eller for lav.
   6. Brug mikroskopstadiet til at flytte embryoets bageste ende på nålen og observere nålen, der trænger ind i myggenets chorion. Nålen skal bare trænge ind i membranen i den omtrentlige placering af polcellerne i Culex embryoner. Når dette sker, skal du trække injektionsudløseren 1-3 gange for at skyde injektionsblandingen ind i embryoet. Levere en lille mængde injektion mix, lige nok til, at en lille clearing i embryoplasm kan påvises.
   7. Brug scenen til at flytte embryoet til højre, væk og væk fra nålespidsen. Hvis injektionen gik godt, skulle der lække lidt eller ingen væske fra embryoet.
   8. Flyt scenen ned, så det næste foster i linjen er placeret foran nålen. Derefter igen, flytte scenen til venstre, placere embryoet på injektionsnålen og trække injektionsudløseren.
   9. Hvis injektionsblandingen ikke ser ud til at komme ud, og/eller hvis en stor mængde væske slipper ud af embryoet, efter at nålen er fjernet, skal injektionsnålen udskiftes og starte forfra.
   10. Ødelæg alle æg, der ikke injiceres eller beskadiges.
6. Tendens til embryonerne efter injektion
   1. Når alle embryoner på rutsjebanen er blevet injiceret, skal du vaske Halocarbonolien af ved at påføre omvendt osmosevand med en sprøjteflaske, således at vandstrømmen ledes mod toppen af glasovertræksdråben over de injicerede embryoner og gør det muligt for vandet at strømme ned ad dækslet og over embryonerne for at skylle olien væk. Sørg for ikke at lede vandstrømmen direkte på embryonerne, da dette kan beskadige eller løsne dem fra den medicinske dressing. Denne proces fjerner de fleste, men ikke alle, halocarbonolie.
   2. Dæk rutsjebanen med 150 μL DI-vand.
   3. Placer diaset med de injicerede embryoner på vådt filterpapir inde i en firkantet petriskål.
   4. Petriskålen med de injicerede embryoner anbringes i et miljøkammer, der er indstillet til 25-27 °C, 70-80% RH med en lang dags fotoperiode (>13 timer lys/dag).

7. Opdræt af injicerede embryoner (F₀₎til voksenalderen og opsætning af kryds

1. Undersøg dagligt diasene af injicerede embryoner, og forventer, at 1^st instar larver skal dukke op 1,5 dage efter injektionen.
2. Tæl antallet af 1^st instar larver, og læg 100-200 larver i en skotøjsæske mellemstore Tupperware container med 450 mL DI vand, og 50 mg jord fiskefoder. På dette tidspunkt skal du oprette 1-5 gange flere beholdere, der indeholder vilde eller ikke-injicerede larver, der vil blive brugt til at krydse med de injicerede myg.
3. Foder larverne dagligt, lidt øge mængden af mad, de modtager hver dag, indtil de når 300-500 mg på den^6. dag i larvelivet.
4. Når pupper vises, skal du bruge en overførsel pipette til at placere en pupper i en 2 mL mikrocentrifuge rør fyldt 50-75% fuld af DI vand. Gentag for alle pupper, både pupper, der blev injiceret som embryoner samt uindsprøjtet, vild-type pupper. Tryk forsigtigt på lågene, så de er lidt på klem, hvilket forhindrer myggene i at undslippe, men stadig giver mulighed for en lille mængde gasudveksling.
5. Når de voksne myg dukker op inde i deres mikrocentrifugerør, frigives injicerede kvindelige myg i et bur, der indeholder jomfruelige vilde mandlige myg, og opnår et forhold på mindst 1 vildlignende mand for hver injiceret kvinde. Tilsvarende frigive injiceres mandlige myg i et bur, der indeholder jomfruelige vilde hunner, og opnår et forhold på ca. 5-10 jomfruelige vilde hunner for hver injiceret mand. Et højere forhold mellem vilde hunner og injicerede hanner anbefales, da hver mandlig myg kan parre flere gange. Derfor, at have et højere antal af vilde hunner, der parrer sig med injicerede mænd, øger antallet af F1-afkom, der kan produceres.

8. Anskaffelse og opdræt af F_1-myg og screening af dem for mutationer

1. Syv til ti dage efter voksen fremkomst tilbyder et blodmåltid til hunnerne i hvert bur som beskrevet ovenfor (trin 3).
2. Fire dage efter blodfodring skal du placere fårevand i hvert bur. Hver ægflåde repræsenterer afkom af en enkelt kvindelig myg, og bør derfor placeres i sin egen plast, skotøjsæske mellemstore opdræt beholder kort efter oviposition. Label hver beholder med en unik identifikator, og også angive, at larverne tilhører F₁ generation for genet af interesse, om den mandlige eller kvindelige forælder blev injiceret, den dato, hvor panden blev etableret, opdræt betingelser, og eksperimentatorens initialer.
3. Overvåg larvernes pander dagligt. Så snart larver lukker i panderne, skal du give 50 mg jordfiskefoder. Forøg maden dagligt i 6 dage som beskrevet ovenfor (trin 7.3).
4. Der overføres individuelle pupper til 2 mL mikrocentrifugerør, der indeholder mellem 1-1,5 mL DI-vand, mærke hvert rør og revne lågene.
5. Når de voksne myg opstår, skal du forsigtigt åbne 2 mL mikrocentrifugerøret, dække med en pegefinger og ved hjælp af den anden hånd placere et 3 dram glasglas over toppen af mikrocentrifugerøret. Myggens naturlige instinkt skal være at flyve op og ind i glasglasset. Når dette sker, skal du skubbe en finger over åbningen af glasglasset og hurtigt vende det og placere en lille kugle bomuld, der er blevet lidt fugtet med 10% saccharoseopløsning i toppen af hætteglasset. Dette forhindrer myggen i at undslippe og giver en nødvendig mad- og vandkilde.
6. Label både røret indeholder pupal exuvia og glas hætteglas, der indeholder den voksne myg til at angive larve pan, hvorfra det stammer, køn myg, og den unikke identifikator for denne person. Ex: II.C.M32, hvor "II" repræsenterer, at den mandlige forælder blev injiceret, "C" repræsenterer pan / æg tømmerflåde, hvorfra den enkelte stammer, og "M32" betegner, at var den 32.
7. Placer voksne myg i deres individuelle glasglas tilbage i miljøkammeret, og tilsæt en lille mængde (~ 20 μL) af 10% saccharoseopløsning til deres bomuld dagligt. Sørg for ikke at overfeede eller mætte bomulden, da myggene sidder fast i saccharoseopløsningen og dør.
8. Screening myg for den ønskede mutation
   1. Ekstrakt genomisk DNA fra 5-10 pupal exuvia fra hver ægflåde / gryde med larver ved hjælp af Phire Direct PCR Kit i henhold til producentens instruktioner samt 1-2 vilde individer, der vil tjene som kontrol.
      BEMÆRK: Da afkom fra hver flåde sandsynligvis er fulde søskende, vil screening af 5-10 larver fra hver gryde afgøre, om mutationen er blevet videregivet til afkommet. Hvis ingen af de screenede larver fra en gryde har den ønskede mutation, skal du ikke screene yderligere voksne. Hvis nogle af larverne har mutationen, skal hvert individ fra den gryde screenes.
   2. Brug af de tidligere designede PCR primere (trin 1.2), forstærke fragmentet omkring den forventede placering af din mutation ved hjælp af Phire PCR kit i både wild-type og F1 afkom og køre PCR fragmenter på en 3-4% agarose gel til at afgøre, om der er nogen synlige indsættelser eller sletninger (indels).
      BEMÆRK: Enhver person, der har den ønskede mutation, vil være heterozygotiske og bør vise 2 bånd, en vild type og en enten lidt kortere eller længere på den ønskede position. For at skelne mellem disse skal du sammenligne placeringen og tykkelsen af båndene af de vilde type individer med dem i båndene i F1-afkom. Ideelt set vil 2 diskrete bånd være synlige, men hvis indel er meget lille, kan båndet se ud til at være bredere og / eller sløret.
   3. Purificer PCR-produktet enten ved at excising båndet, der indeholder de formodede indels (anbefales) eller ved at rense det resterende PCR-produkt, der ikke blev indlæst i gelen. Indsend den rensede PCR til sekventering for at afgøre, om den ønskede mutation er til stede.

9. Anskaffelse og opdræt af myggene F₂ og F₃ og screening for mutationer

1. Slip alle F₁ voksne myg, for hvilke den ønskede mutation blev fundet ved at screene sin pupal exuvia fra deres individuelle glas hætteglas og ind i et bur, der indeholder vilde-type, un-injiceres myg af det modsatte køn. Backcrossing for denne anden generation bør fjerne alle skadelige virkninger af injektion og indavl.
2. Blod fodrer burene af mutant F₁ myg og deres vilde type modstykker som tidligere beskrevet. Fire til fem dage senere, indsamle den resulterende F₂ æg flåder.
3. Etiket og bag F₂ larverne som beskrevet ovenfor, placere hver ægflåde i en separat, mærket beholder. Ved hvalp, igen adskille individuelle pupper i individuelle 2 mL mikrocentrifuge rør, og overføre hver voksen i separate glas hætteglas udjævnet med saccharose-gennemblødt bomuld ved fremkomsten. Derefter screen pupal exuvia af hver F₂ individuelle den ønskede mutation som tidligere beskrevet (trin 8,5-8,8).
   BEMÆRK: Her vil alle personer, der har den ønskede mutation, være heterozygotiske, og derfor bør PCR-produktet ideelt set producere 2 forskellige bånd, når det køres på en 3-4% agarosegel.
4. Når mutant F₂ larver er blevet identificeret, skal du placere alle mænd og kvinder, der har mutationen i samme bur for at parre sig. Blodfoder 7-10 dage efter voksen fremkomst, og 4-5 dage senere samler F₃ ægflåder.
5. Placer hver F₃ æg tømmerflåde i en separat larve opdræt beholder, og etiket og foder som beskrevet ovenfor.
6. Adskil F_3-pupperne i individuelle 2 mL mikrocentrifugerør. Når voksne dukker op, overføres de til individuelle glasglas, der er begrænset med 10% saccharose-gennemblødt bomuld. Screen pupal exuvia som tidligere beskrevet. Denne gang, ca 25% af afkom i hver gryde bør homozygogous for null mutation. Placer disse personer i et enkelt bur, og brug dem til at skabe og vedligeholde den nyligt genererede mutantlinje af myg.
   BEMÆRK: Hvis et lavt antal homozygogous myg er til stede, heterozygous F₃ hanner og hunner kan krydses med hinanden for at generere yderligere homozygous-null myg i F₄ generation.

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne protokol var vi i stand til at injicere embryoner af Cx. pipiensog observerede en høj overlevelsesrate blandt de injicerede embryoner (~ 55%, figur 1). Tidligere forsøg havde en lavere procentdel af overlevelse, sandsynligvis fordi den forreste af æggesækken var fastgjort til den medicinske dressing strimmel, forhindrer myg larver i at flygte fra chorion og med succes svømme i vandet. Sikring af, at den forreste ende strækker sig ud over strimlen af medicinsk dressing i høj grad øget larve overlevelse, og resulterer i høj kvalitet afkom, der er i stand til at udvikle sig til voksenalderen og reproducere (Figur 2B).

Efterfølgende forsøg og screening viser, at null-mutationen for døgnrytmens klokkeursgencyklus (cyc; KM355981) kom ind i kimen til de injicerede embryoner (figur 3). I betragtning af at vores primere forstærkede en stor region af cyc-genet nær cut-sites, var det svært at observere to separate bånd i heterozygogous, F₁ myg. Dette viser nytten af at designe primere, der vil forstærke fragmenter, der er ~ 100-200 bp omkring cut site, og også vigtigheden af sekventering alle formodede mutant myg. Sekventering afslørede, at ca. 10% af de screenede myg viste en lille indsættelse eller sletning nær Cas9-snitstedet for det første guide-RNA, som vi havde designet (Figur 3), hvilket tyder på, at dette var et meget effektivt gRNA, og at vi med succes målrettede polcellerne under mikroinjections. F₁ individer parrede sig med succes og producerede levedygtige afkom (F₂ generation), hvoraf nogle også indeholdt mutationen.

Figur 1: Eksempel på en skrå borosilikatnål. Denne nål blev fremstillet af en silicium borosilicate mikrocapillary rør, trukket ved hjælp af en PC-10 lodret nål puller, og derefter facet på en BV-10 Beveller. Nålen ses under ~ 63x forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: F_{0-generationens} overlevelse på tværs af deres udvikling. (A) Billede af 1^st instar larver, der klækkede fra 3 dias indeholdende injicerede embryoner. (B) Grafisk repræsentation af antallet af individer i hvert livsstadium. Af de 801 embryoner, der blev injiceret, udklækkede 441 1^st instar larver, og af disse nåede 149 personer hvalp, hvilket resulterede i i alt 121 voksne (73 mænd og 43 kvinder). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Repræsentative resultater, der viser transmissionen af den ønskede mutation. De to øverste sekvenser repræsenterer sekvensen af cyklusgenet i Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) og hos vildtlevende hundyr af Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Sekvenserne nedenfor repræsenterer sekvenser i tre mandlige F₁ afkom (I.DM1; II.JM4; II.K10M). Den grønne boks repræsenterer PAM-sekvensen anerkendt af Cas9-proteinet (CGG), mens den grønne pil repræsenterer, hvor Cas9-proteinet kløvede genomisk DNA. Disse resultater viser, at korte sletninger af 2 eller 4 nukleotider blev arvet hos F₁ mænd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol præsenterer metoder til at indføre specifikke mutationer i genomet af Culex myg og kan også bruges til at redigere genomet af andre myg. Protokollen er vigtig, idet den giver specifikke detaljer om ikke kun, hvordan man forbereder injektionsmaterialerne, men også en detaljeret videooversigt over, hvordan man fremkalder myg til at lægge æg, samt hvordan man forbereder og injicerer disse æg. Vi opsummerer også, hvordan man drager fordel af biologien hos kvindelige Cx. pipiens til at lægge æg i individuelle flåder og derved screene en mindre andel af afkom fra hver kvinde for ønskede mutationer. De metoder, der præsenteres her, er blevet optimeret til Cx. pipiens, men kan tilpasses med små justeringer for at redigere genomerne af andre myg eller insekter. Derudover er de mikromanipulations- og mikroinjektionsprotokoller, der er beskrevet her, modtagelige for at injicere flere forskellige materialer i insektembryoner, herunder transposoner, dsRNA eller andre endonukleaser som TALEN'er eller zinkfingerkerner. Desuden genererer beveling-protokollen mikroinjektionsnåle med variable åbningsstørrelser, hvilket skaber nåle, der kan bruges til injektion af en bred vifte af injektionsmaterialer. Nålens åbne størrelse kan udledes ved langsomt at sænke lufttrykket, efter at nålen er blevet facet, og bemærke det tryk, hvormed luftbobler holder op med at strømme fra spidsen af den nyåbnede nål. Jo mindre lufttryk, der er nødvendigt for at producere bobler, indikerer, at nålen har en større åbningsstørrelse, og omvendt indikerer højere lufttryk, at nålen har en mindre åbningsstørrelse. Nåle med større åbningsstørrelser er bedre til injektion af større partikler og mere tyktflydende materialer, men vil sandsynligvis forårsage større skade på embryoet og dermed reducere overlevelsen.

Microinjection eksperimenter er på mange måder et kapløb mod uret. For det første skal man injicere individuelle embryoner inden for de første 2 timer efter oviposition, før chorion hærder og blastoderm dannelse opstår. Derfor er det vigtigt at bemærke, hvornår myggene først blev placeret i ovipositionskammeret, hvor lang tid det tager at manipulere æggene til injektion (vi anbefaler ikke mere end 20-30 minutter), og hvor lang tid det tager at injicere alle embryoner. Tiden er også begrænset, når screening voksne myg for mutationer som Cx. pipiens er ganske følsomme over for deres omgivelser og myg generelt kun overleve i 3-5 dage i de enkelte glas hætteglas. Derfor er det vigtigt at screene myg pupal exuvia så hurtigt som muligt. Alternativt kan man også udtrække genomisk DNA fra et enkelt mygben¹⁴. For at gøre det skal myggene dog først bedøves på is. Da vi var trætte af, hvordan den kolde behandling og tab af lemmer kan påvirke myg overlevelse og deres evne til at parre og lægge levedygtige æg, besluttede vi at i stedet screene kasserede pupal exuvia for mutationer. Niveauet af gDNA inden for exuvia er sandsynligvis lavere end inde i et mygben, og dette tilføjer ekstra indsats og tid til at adskille myg på pupalstadiet, men sikrer også, at alle voksne er umættede, når de frigives i deres passende bure, hvilket er helt afgørende. Vi mener, at resultaterne er det værd, men opfordrer andre til at overveje, om fjernelse af et ben kan være en bedre fremgangsmåde for deres eksperimentelle behov.

Den bedste måde at fremskynde screening for mutationer er at injicere et plasmid, der indeholder en genetisk markør, såsom et fluorescerende protein, flankeret af homologe sekvenser på hver side af det afskårne sted. Antallet af knock-in-mutationer ved hjælp af homologi directed-repair (HDR) er generelt lavere end ikke-homolog end-join (NHEJ), knock-out mutationer (HDR=0,71%; NHEJ=24,87%; ²²). Derfor vil indsættelsen af markøren sandsynligvis forekomme med en meget lavere frekvens, men de tidsbesparelser, der tilbydes ved hurtigt at screene myg larver under et fluorescerende mikroskop, kan være risikoen værd, afhængigt af projektet. Derudover øges antallet af HDR- og knock-in-mutationer, når man også injicerer et plasmid, der indeholder den genetiske sekvens af Cas9-proteinet, drevet af den velkaraktererede embryonale promotor og gRNA drevet af U6 promotor^24,26. Dette skyldes sandsynligvis, at den fejlbehæftede, men hensigtsmæssige NHEJ-mekanisme synes at være den foretrukne metode til reparation af dobbeltstrengede pauser (revideret^18),når kerner hurtigt deler sig (S-fasen i cellecyklussen). Men efterhånden som embryogenese skrider frem, er cellemaskineriet klar til at bruge den mere nøjagtige HDR-mekanisme til at reparere dobbeltstrengede pauser (sen S-fase og G2-fase). Injektion af en plasmid, der indeholder Cas9-sekvensen tidligt i embryonal udvikling, gør det muligt for Cas9-proteinet at nå de fleste målceller, mens embryoet stadig er i synkron tilstand, og før cellulære membraner er dannet, men den lille forsinkelse, der kræves for at transskribere og oversætte Cas9-proteinet, synes at øge sandsynligheden for, at endonuklease vil være aktiv på et tidspunkt, hvor det udviklende embryo er mere tilbøjelige til at bruge HDR til nøjagtigt at reparere dobbeltstrengede pauser i genomisk DNA. For eksempel opdagede Lin et al.^27, at antallet af HDR blev forbedret til ~ 33%, når Cas9 proteinet komplekst med gRNA blev injiceret i menneskelige cellelinjer anholdt i M fase af cellecyklussen. En yderligere fordel ved at levere Cas9 og gRNA'er på plasmider er, at de er mindre tyktflydende og derfor mindre tilbøjelige til at tilstoppe nålen under injektioner (R. Harrell, personlig observation). Men indtil embyronic promotorer er karakteriseret og valideret i Culex myg, anbefaler vi at injicere Cas9 protein eller mRNA som beskrevet her.

I betragtning af den tid, man skal afsætte til opdræt og screening af myg, anbefaler vi derudover at have mindst en fuldtidstekniker, studerende eller forsker afsat til denne opgave. Vi anbefaler også strategisk at overveje, hvor mange null-mutanter man har brug for til et givet eksperiment og betydningen af genetisk mangfoldighed inden for null-linjen. Mens vi var i stand til at identificere myg i F₁ og F₂ generationer, der havde mutationen, overlevede kun en håndfuld af F₂ myg til voksenalderen, at heterozygous mutant myg ikke producerede levedygtige afkom. Vi mener, at dette er meget mindre at gøre med mutationen, og mere sandsynligt er et resultat af den lange periode, at både mandlige og kvindelige myg var begrænset til glasrør, mens vi screenede dem. Denne langvarige isolationsperiode forstyrrede sandsynligvis deres evne til at parre sig med succes og, i tilfælde af kvinder, få et blodmåltid og lægge levedygtige æg. Outcrossing for en enkelt generation og / eller har optimeret screening teknikker på plads, bør forhindre dette problem i at opstå i fremtiden. Derfor er vi ved at følge denne protokol overbeviste om, at forskere med succes vil kunne generere null-linjer af Culex-myg og med mindre justeringer yderligere insekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA