Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

Summary

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Abstract

Culexmuggen zijn de belangrijkste vectoren van verschillende ziekten die een negatieve invloed hebben op de gezondheid van mens en dier, waaronder het West-Nijlvirus en ziekten veroorzaakt door filariale nematoden zoals hondenhartworm en elephantasis. Onlangs is CRISPR/Cas9 genoombewerking gebruikt om site-gerichte mutaties te induceren door een Cas9-eiwit te injecteren dat is gecomplexeerd met een gids-RNA (gRNA) in vers gelegde embryo's van verschillende insectensoorten, waaronder muggen die behoren tot de geslachten Anopheles en Aedes. Het manipuleren en injecteren van Culex-muggen is iets moeilijker omdat deze muggen hun eieren rechtop in vlotten leggen in plaats van individueel zoals andere soorten muggen. Hier beschrijven we hoe we gRNAs kunnen ontwerpen, complexen met Cas9-eiwit, vrouwelijke muggen van Culex pipiens stimuleren om eieren te leggen en hoe ze nieuw gelegde embryo's kunnen bereiden en injecteren voor micro-injection met Cas9 / gRNA. We beschrijven ook hoe geïnjecteerde muggen kunnen worden achtergelaten en gescreend op de gewenste mutatie. De representatieve resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om site-gerichte mutaties in het genoom van Culex-muggen te induceren en, met kleine aanpassingen, kan worden gebruikt om ook null-mutanten bij andere muggensoorten te genereren.

Introduction

Culexmuggen worden verspreid over de gematigde en tropische regio's van de wereld en brengen verschillende dodelijke virussen over, waaronder West Nile virus^1,St. Louis encefalitis² en filariale nematoden die hondenhartworm³ en elephantiasis⁴veroorzaken. Leden van het Culex pipiens complex, waaronder Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens en Cx. pipiens molestus, vertonen opvallende variaties in vele aspecten van hun biologie. Bijvoorbeeld, terwijl Cx. quinquefasciatus en Cx. pipiens molestus niet in staat zijn om een overwinterende rust in te gaan^5,6, vertonen Cx. pipiens pipiens robuuste seizoensreacties en gaan diapause in als reactie op korte dagen^7,8. Bovendien zijn Cx. pipiens molestus meestal meer antropofiel, terwijl Cx. pipiens en Cx. quinquefasciatus meer zoöfiel zijn⁶. In de Verenigde Staten en op vele andere plaatsen in de wereld kruisten deze soorten echter, wat sterke implicaties heeft voor de overdracht van ziekten als hybriden van de Cx. pipiens pipiens en Cx. pipiens molestus zijn opportunistische feeders en zullen zowel vogels als mensen bijten⁹, waardoor ze dienen als brugvectoren voor het West Nile-virus. Het bestuderen van deze en andere fascinerende aspecten van de biologie van Culex-muggen is gehinderd, deels omdat Culex-muggen iets moeilijker op te eten zijn in het lab dan Aedes-muggen, die rustgevende en uitdrogingsbestendige eieren produceren¹⁰ en omdat functionele moleculaire gereedschappen niet zo goed zijn ontwikkeld voor Culex-soorten.

CRISPR/Cas9 genoombewerking is een krachtige technologie die is gebruikt om de biologie van verschillende belangrijke muggensoorten^{11 , 12,13}te evalueren , waaronder de zuidelijke huismug, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Deze technologie, ontwikkeld door Jennifer Doudna en Emmanuelle Charpentier, maakt gebruik van een natuurlijke bacteriële afweer tegen virussen door bacterieel afgeleide, CRISPR-geassocieerde endonucleases (Cas-eiwitten; zie recensie door Van der Oost et al.¹⁷). Wanneer ze in dierlijke embryo's worden geïnjecteerd, kunnen de Cas9-eiwitten in combinatie met een geschikte gids RNA dubbelstrengs breuken in het genoom veroorzaken. Dit wordt meestal gedaan door het Cas9-eiwit te gebruiken dat is gecomplexeerd met gids-RNA's, dat endonuclease-activiteit naar een specifiek gebied van het genoom leidt. Nadat het Cas9-eiwit een site-specifieke dubbelstrengs breuk heeft gecreëerd, probeert de cellulaire machine de breuk te repareren met behulp van een van de twee mechanismen. De eerste houdt in dat de twee uiteinden samen worden samengevoegd door niet-homologe eindvoeging (NHEJ), die foutgevoelig is en vaak out-frame inserties en deleties in het genoom produceert die kunnen resulteren in niet-functionele eiwitten, waardoor een knock-outmutatie wordt gegenereerd. Als alternatief kunnen de cellulaire machines homologie-gerichte reparatie (HDR) gebruiken door vergelijkbare sequenties te vinden om de breuk correct te repareren. De vergelijkbare sequentie kan worden geleverd door het tweede chromosoom in het organisme (zie review¹⁸). Als de gerepareerde sequentie echter precies overeenkomt met de oorspronkelijke sequentie, kan het Cas9-eiwit het DNA opnieuw snijden. Als alternatief kunnen onderzoekers ook een donorplasmide opnemen die homologe sequenties aan weerszijden van de snijplaats van de doelsequentie bevat met een alternatieve reparatiesequentie - vaak een fluorescerend marker-eiwit, een gewijzigde versie van het oorspronkelijke gen of een andere wijziging - die kan worden gekopieerd en ingevoegd in het genoom, of "knock-in".

Timing is van cruciaal belang bij het injecteren van embryo's, en dit is vooral het geval bij het gebruik van CRISPR / Cas9 genoombewerking om mutaties in insecten te creëren. Dit komt omdat het Cas9-eiwit en de gRNAs de grootste capaciteit hebben om mutaties alleen te genereren wanneer het embryo zich in zijn syncytiële toestand bevindt, voordat cellulaire membranen zich hebben gevormd en wanneer meerdere kernen toegankelijk zijn in het embryo. Voor muggen bereiken kernen de periferie ~ 2-4 uur na ovipositie, afhankelijk van temperatuur¹⁹, en daarom moet succesvolle micro-injection vóór deze tijd plaatsvinden. Bovendien snijdt het Cas9-eiwit elk nucleair DNA waar het toegang toe heeft, zodat het individu dat uit de injectie voortvloeit een mozaïek van cellen zal bevatten, sommige met de gewenste mutatie en anderen niet. Om deze mutaties met succes te kunnen erven, moet het Cas9-eiwit DNA snijden dat zich in de kiembaan bevindt dat aanleiding zal geven tot de toekomstige eieren en sperma. Om ervoor te zorgen dat mutaties in de kiembaan worden gegenereerd, is het het beste om alle materialen dicht bij de locatie van de poolcellen in het embryo te injecteren, die de voorlopers van de insectenkiembaan zijn. De poolcellen bevinden zich in de buurt van het achterste uiteinde van Culex-embryo's ²⁰. Naast het injecteren van embryo's is het noodzakelijk om een zorgvuldig plan te ontwikkelen voor het kruisen en screenen van nakomelingen om de gewenste mutatie te detecteren.

Dit protocol beschrijft hoe je gRNAs kunt genereren en complexen met Cas9-eiwitten om injectiemengsels te bereiden, evenals hoe vrouwelijke muggen van Culex-pipiens eieren kunnen leggen en hoe ze die eieren kunnen bereiden en injecteren voor CRISPR / Cas9-gemedieerde genoombewerking. Daarnaast beschrijven we hoe geïnjecteerde embryo's en hun nakomelingen kunnen worden grootgebracht, gekruist en gescreend om te bevestigen dat de gewenste mutatie is verkregen. Met behulp van dit protocol genereerden we null-mutaties voor een gen van belang, cyclus, in de Buckeye-stam van Culex pipiens. Deze soort werd oorspronkelijk opgericht in 2013 van in het veld verzamelde muggen in Columbus, Ohio en wordt onderhouden door het Meuti-lab. Dit protocol kan worden gebruikt voor aanvullende studies die CRISPR / Cas9 genoombewerking vereisen bij Culex-muggen, evenals andere muggensoorten, en, meer in het algemeen, is relevant voor het gebruik van CRISPR / Cas9-genoombewerking voor elke insectensoort.

Protocol

In de meeste onderzoeksinstellingen moet een goedgekeurd bioveiligheidsprotocol van kracht zijn voordat transgene insecten worden gegenereerd of onderhouden om ervoor te zorgen dat genetisch gemodificeerde organismen niet ontsnappen of uit de laboratoriumfaciliteit worden verwijderd. Er kunnen ook aanvullende overheidsvoorschriften van toepassing zijn. Voordat u met een dergelijke project begint, controleert u alle institutionele beleidslijnen en procedures om te bepalen welke documenten en goedkeuringen vereist zijn.

1. GRNAs ontwerpen en injectiemengsels bereiden

1. Ontwerp 2-5 gRNAs voor elk doelgen, omdat sommige GRNAs beter werken dan andere. gRNAs die zich richten op een gen van belang kunnen handmatig worden ontworpen of gratis programma's, zoals Chop-Chop, kunnen worden gebruikt.
2. Ontwerp en bestel primers die 100-200 bp fragmenten rond elk gRNA zullen versterken. Idealiter moet de snijplaats zich ongeveer in het middelste derde tot de helft van het PCR-product bevinden. Noteer hoeveel bp op elke plaats van de snede zal worden geproduceerd.
3. Verkrijg gRNAs.
   1. Koop gRNAs van commerciële bedrijven zoals Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript en anderen. Dit is de makkelijkste optie.
   2. U kunt ook gRNAs in het lab maken met behulp van PCR-versterking om de sjablonen voor volgende isotherme synthese te genereren. Zie het protocol beschreven door Port et al.²¹ en Kistler et al.²².
   3. Geef gRNAs via plasmide die in embryo's wordt geïnjecteerd. In dit geval moet de gRNA worden aangedreven door de U6-promotor (zie ^23,24 voor meer informatie).
4. Verkrijg het Cas9-eiwit.
   1. Bestel Cas9 commercieel bij verschillende bedrijven, waaronder Fisher Scientific. Dit is de makkelijkste optie.
   2. Maak Cas9 eiwit en zuiver in het lab volgens Basu et al.²⁵ en Kistler et al.²².
   3. Injecteer Cas9 mRNA in embryo's, waar het later zal worden vertaald in actief Cas9-eiwit. Cas9 mRNA kan in het lab worden gesynthetiseerd met behulp van in vitro transcriptie²² of worden gekocht bij leveranciers zoals Sigma.
      OPMERKING: Het vertaalde Cas9-eiwit moet een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) op het C-eindpunt bevatten en daarom moet het NLS ook aanwezig zijn in het geïnjecteerde Cas9 mRNA.
   4. Druk Cas9-eiwit in vivo uit door middel van plasmide-gebaseerde expressie. In dit geval is het het beste om de uitdrukking van Cas9 op het plasmide te hebben aangedreven door een embryonale promotor die goed is gekarakteriseerd in de doelsoort.
      OPMERKING: Tot op heden zijn embryonale promotors niet goed gekarakteriseerd bij Culex-muggen en daarom wordt het injecteren van gezuiverd eiwit of Cas9 mRNA aanbevolen.
5. Complex de gRNAs met het Cas9 eiwit, aangepast van Kistler et al.²².
   1. Als u Cas9-eiwit samen injecteert met het gRNA (aanbevolen), zorg er dan voor dat de uiteindelijke concentraties Cas9-eiwit 300 ng/μL zijn en de uiteindelijke concentratie van een enkel gRNA 80 μg/μL. Meng het eiwit en een individueel gRNA in een PCR-buis van 0,2 ml.
   2. Incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
6. Het testen van gRNAs met een in vitro test (bijv. Guide-it sgRNA Screening Kit).
   1. Versterk de fragmenten rond de snijplaats voor elke gRNA met behulp van PCR.
   2. Voer de PCR-producten uit op een gel om er zeker van te zijn dat ze de juiste maat hebben. Zuiver vervolgens PCR-producten en sequentieer ze om ervoor te zorgen dat ze zich richten op het juiste gengebied.
   3. Meng 200 ng van het overgebleven gezuiverde PCR-product met 1 μL Cas9-reactiebuffer, 1 μL BSA, 1,5 μL gecomplexeerd Cas9:gRNA en breng het totale reactievolume op 15 μL. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37°C.
   4. Voer het product opnieuw uit op een gel. Als het Cas9-eiwit het PCR-product met succes heeft gesneden, moet de primaire band zwakker lijken en moeten er extra kleinere banden aanwezig zijn. Noteer de vermindering van de grootte van het originele PCR-product en bereken, indien gewenst, de vermindering van de bandintensiteit om de snijefficiëntie te benaderen.
7. Voorbereiding van de uiteindelijke injectiemix
   1. Meng voor elk gRNA dat met succes zijn beoogde PCR-product heeft gesneden, de volumes van elke Cas9 en gRNA in een buis van 0,5 ml, zodat het uiteindelijke volume 300 ng/μL Cas9-eiwit en 80 ng/μL van elk gRNA blijft.
   2. Bewaar de gecomplexeerde Cas9 en gRNAs bij -80 °C totdat ze nodig zijn voor injectie.

2. Trekken en afschuinenaalden

OPMERKING: Succesvolle injecties en overleving van embryo's vereisen scherpe naalden (figuur 1).

1. Gebruik borosilicaat met een buitendiameter van 1 mm of microcapillairen van kwartsglas. Siliconiseer de microcapillaries in een chemische zuurkast voordat ze worden getrokken.
   1. Kortom, plaats 3 ml Sigmacote in een glazen bekerglas en vacuüm trek gedurende ten minste 4 uur in een tweede bekerglas met de glazen microcapillairen, zodat de siliciumoplossing kan verdampen en zich op alle oppervlakken van de microcapillairen kan nestelen.
   2. Laat daarna de vacuümkamer langzaam gelijktrekken aan de omgevingsdruk door de kraanklep geleidelijk te openen en lucht terug te laten keren naar de kamer. De naalden zijn dan klaar om getrokken te worden.
   3. Lees voor gebruik altijd de gebruiksaanwijzing van naaldtrekkers.
      OPMERKING: In de onderstaande instructies staat beschreven hoe u een P-2000 lasernaaldtrekker gebruikt om glazen naalden te trekken. Het is belangrijk op te merken dat alle naaldtrekkers, zelfs van hetzelfde merk, niet zijn gekalibreerd om precies dezelfde naald over verschillende eenheden te trekken. De sleutel tot het verkrijgen van goede naalden is om te beginnen bij een bepaalde set parameters en vervolgens naalden te trekken met behulp van parameters die boven en onder deze waarden liggen. Test de naalden op elk van deze parameters door te evalueren hoe goed de naald embryo's doorboort en hoe goed de injectiemix uit de naald stroomt. Verfijn de parameters totdat een naald wordt verkregen die gemakkelijk te openen of af te schuinen is, die embryo's soepel doorboort en die gemakkelijk injectiemix levert.
2. Naalden trekken met de P-2000 lasernaaldtrekker
   1. Schakel de lasernaaldtrekker in en laat de laser 15 minuten opwarmen voor de eerste trekkracht.
   2. Programmeer de machine voor het type glazen microcapillaire buis (Onthoud dat de parameters van de naaldtrekker een uitgangspunt zijn, omdat naaldtrekkers niet zijn gekalibreerd om dezelfde naald over alle trekkers te produceren):
      Kwarts: Warmte = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Na het programmeren van de naaldtrekker, laadt u een microcapillair en klemt u het op zijn plaats, waarbij u ervoor zorgt dat u alleen het uiteinde van de microcapillaire buis aanraakt en niet het gebied dat door de laser wordt verwarmd.
   4. Na het klemmen van het microcapillair plaatst u duim en wijsvinger op de vingerstangen en laat u vervolgens de trekstangen los door één voor één op de veerontgrendeling te drukken.
   5. Knijp duim en wijsvinger om staven volledig samen te trekken.
   6. Plaats de andere kant van de microcapillaire buis in de klem zodanig dat een klein deel van de buis zich van beide zijden uitstrekt. Draai de klemmen vast en zorg ervoor dat beide klemmen vingerdicht zijn en dat ze de "trekstangen" stevig op hun plaats houden.
   7. Sluit de beschermkap van de trekker.
   8. Druk op de pull-knop en de laser begint het glas te verwarmen, aangegeven door het rode "laser on"-lampje onder de lijkwade. De trekkracht wordt voltooid wanneer de trekstangen volledig zijn gescheiden, vergezeld van een metalen thud.
   9. Zorg ervoor dat het "laser on"-lampje niet brandt voordat u de lijkwade optilt.
   10. Houd het kleine uiteinde van de microcapillaire buis die zich met duim en wijsvinger voorbij de klem uitstrekt vast en maak de klem los. Til vervolgens de microcapillaire buis uit de klem.
   11. Gebruik de tang om de microcapillaire buis voorzichtig in een vierkante petrischaal te plaatsen die is bekleed met dubbelzijdige tape. Zorg er bij het plaatsen van de naald in de houderdoos voor dat de achterkant van de naald eerst raakt en dat de naald voorzichtig op zijn plaats wordt neergelaten, zodat de scherpe punt niet wordt beschadigd.
3. Naalden trekken met een PC-10/PC-100 naaldtrekker
   1. Stel de PC-10 trekker in met 4 gewichten en stel de temperatuur in op 50,4 °C voor een trekkracht in één stap.
   2. Plaats een borosilicaatglas microcapillair in de bovenste klem. Breng vervolgens de gewogen bodemklem op zijn plaats en klem het onderste deel van het microcapillair vast, zorg ervoor dat het capillair in positie is om twee goede naalden te trekken. Dit is een vrij lange trekcyclus, maar het produceert goede naalden voor het afschuinen.
4. Afschuine naalden.
   OPMERKING: Deze methode van nat afschuinen geeft realtime feedback over de relatieve openingsgrootte van de naald.
   1. Monteer de schuurplaat en de borgring van de naaldafschuining. Zorg ervoor dat de grijze kant van de schuurplaat naar boven is gericht tussen de bovenste en onderste borgring. Draai de schroeven op de borgring vast, afwisselend van schroef tot schroef om ervoor te zorgen dat elke schroef gelijkmatig wordt vastgedraaid. De schuurplaat en borgringen worden hierna de slijpassemblage genoemd.
   2. Plaats 13 druppels (~ 520 μL) voetstukolie op het optische vlakke oppervlak en plaats vervolgens de slijpeenheid op de plaat. Plaats het samenstel onder een ontleedmicroscoop en zet vervolgens de beveler aan. Een beetje extra olie in vergelijking met de aanbeveling van Sutter wordt gebruikt, omdat dit de schuurplaat langer laat draaien wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met deze natte afschuiningsmethode.
   3. Voeg 1% Photo-Flo-oplossing toe aan het slijpoppervlak en beweeg de lont in positie zodat deze wordt ondergedompeld in de Photo-Flo-oplossing.
   4. Zet de lucht aan bij de hoofdbron. Plaats vervolgens een getrokken borosilicaatnaald in de houder en draai de borgring vast. Zet de lucht bij de regelaar aan en verhoog tot de druk 26 PSI heeft bereikt.
   5. Vanaf de zijkant kijken, laat u de naald zakken met behulp van de grove instelknop totdat deze bijna het vloeibare oppervlak van Photo-Flo raakt.
   6. Pas de microscoop aan om de naald in het gezichtsveld te lokaliseren. Begin bij de laagste vergroting en verhoog de vergroting. Stel de positie van de naald voorzichtig in met behulp van de grove instelknop totdat deze net het oppervlak van de Photo-Flo vloeistof raakt.
   7. Gebruik de grove instelknop en blijf onder de microscoop kijken, laat de naald zakken totdat deze dicht bij het schuuroppervlak ligt, maar raak hem niet aan.
   8. Laat de naald voorzichtig en langzaam zakken met behulp van de fijnafstelknop, met goed aandacht voor de naald en de schaduw die deze achterlaat op het schurende oppervlak van de beveler. Wanneer de naald en de schaduw eruit zien alsof ze op het punt staan het schurende oppervlak aan te raken, blijft u de naald nog langzamer en voorzichtiger laten zakken.
   9. Wissel af tussen het laten "afschuinen" van de naald door deze op het schurende oppervlak te laten zakken en vervolgens op te heffen. Voordat u de naald optilt, moet u snel de instelling op de micrometer op de fijnafstelknop noteren, zodat de naald in dezelfde positie of, indien nodig, in een iets lagere positie kan worden neergelaten. Vergeet niet om de naald onder de Photo-Flo vloeistoflaag te houden. Zodra de naald boven het schuuroppervlak is opgetild, stopt u snel en start u de rotatie van de beveler opnieuw om te controleren op bellen. Als de naald voldoende is afgeschuind, moeten er luchtbellen uit de naald en in de Photo-Flo stromen. Als de plaat niet wordt gestopt, zullen bellen waarschijnlijk niet zichtbaar worden totdat de naaldopening te groot is.
   10. Als er geen bellen verschijnen wanneer de naald boven het schuuroppervlak wordt opgetild en de beveler is gestopt, herhaalt u de afschuiningsprocedure, laat u de naald iets lager op de micrometer op de fijnafstelknop zakken, verhoogt u de naald, stopt u de afschuiningsplaat en controleert u op luchtbellen. Herhaal dit totdat er een kleine maar gestage stroom bubbels verschijnt.
   11. Zodra er luchtbellen aanwezig zijn, controleert u de relatieve opening door de schuurplaat te stoppen en de luchtdruk te verlagen, waarbij u de PSI opmerkt waarbij de vorming van bellen stopt, omdat dit een relatieve indicatie is van de grootte van de opening van de afgeschuinde naalden. Hoe lager de druk waarbij lucht niet meer uit de naaldpunt ontsnapt, hoe groter de naaldopening. Naalden afgeschuind tot het punt waarop bellen stoppen te ontsnappen uit de naald bij 18-20 PSI geeft aan dat de naald een relatief kleine opening heeft en minimale schade aan een embryo moet veroorzaken bij gebruik voor micro-injections.
   12. Verhoog na het controleren van de naaldopening de luchtdruk tot 26 PSI om te voorkomen dat er vloeistof in de naald komt. Til vervolgens de naald op en uit de Photo-Flo laag met behulp van de grove instelknop. Het is belangrijk op te merken dat zolang er lucht uit de naald stroomt, de Photo-Flo niet in de naald komt en daarom de binnenkant van de naald wordt beschermd tegen verontreiniging.
   13. Zodra de naald uit de Photo-Flo is, schakelt u de lucht uit en verwijdert u de naald uit de naaldhouder.
   14. Plaats de nieuw afgeschuind naald met behulp van een tang in een petrischaal met dubbelzijdige tape of boetseerklei om deze op zijn plaats te houden. Herhaal het proces totdat 10-20 afgeschuinde naalden zijn geproduceerd.

3. Bloed voeden van de ouderlijke generatie muggen

1. Achterlarven van Cx. pipiens-muggen onder ondubbelzinnige lange dagomstandigheden (>13 uur licht / dag) bij 25-27 °C om ervoor te zorgen dat muggen hun overwinterende rust of diapause niet binnendringen.
2. Zeven tot tien dagen na de piek van volwassen opkomst, bereidt u het Hemotek Membraantoevoersysteem voor door de verwarmingseenheden in de voeding aan te sluiten. Stel de temperatuur van elke eenheid in op 37 °C (menselijke interne lichaamstemperatuur) of 41 °C (interne lichaamstemperatuur van de kip) met behulp van de stelschroef aan de bovenkant van het apparaat. Zorg ervoor dat de juiste temperatuur is bereikt met een elektrische thermometer.
3. Bereid het bloedmeelreservoir voor op voeding.
   1. Snijd een vierkant parafilm voor elke bloedvoedende cilinder en wrijf parafilm tegen blote voeten. Dit zorgt voor geuren die aantrekkelijk zijn voor de muggen.
   2. Rek de parafilm zo dun mogelijk uit en wikkel de randen stevig om het maaltijdreservoir. Indien gewenst op zijn plaats vastzetten met een rubberen O-ring.
   3. Voeg ongeveer 200 μL 0,1 M ATP-oplossing toe aan 15 ml vers of ontdooid geheel, met natriumcitraat behandeld kippenbloed. De ATP helpt de bloedtoevoer te stimuleren en natriumcitraat voorkomt dat het bloed stolt.
   4. Houd het reservoir zo vast dat de parafilmzijde naar beneden is gericht en gebruik voorzichtig een wegwerppipet om het reservoir te vullen. Elk reservoir bevat ~3 ml bloed. Sluit de vulpoorten af met plastic pluggen.
   5. Schroef de maaltijdreservoirs in de verwarmingsunits en plaats ze bovenop de muggenkooi, zodat de parafilmzijde naar beneden is gericht en de muggen zich door het gaas kunnen voeden.
4. Bedek de kooien met zwarte vuilniszakken om de schemering te simuleren en blaas krachtig in elke kooi omdat de verhoogde CO_{2-concentratie} de bloedtoevoer stimuleert.
5. Houd de feeder 2-8 uur op de kooi om de bloedtoevoer te maximaliseren. Controleer regelmatig en noteer het aandeel vrouwen dat een bloedmaaltijd heeft genomen (duidelijk te zien aan hun rode en opgezwollen buik).

4. Het opwekken van het leggen van eieren bij volwassen muggen

1. Vier tot vijf dagen na bloedvoeding, bereid een 50 ml conische buis voor muggenovipositie.
   1. Maak een gat van ~ 20 mm aan de onderkant van de conische buis.
   2. Bedek het gat met twee vierkanten (35 mm²) tanddamrubber, een met een horizontale spleet en een andere met een verticale spleet. Gebruik tape om de vierkanten van de tanddam aan de conische buis te bevestigen.
   3. Plaats een stuk filterpapier van 4,25 cm op een petrischaal van 35 mm x 10 mm en bevochtig het filterpapier met 750 μL gedestilleerd water.
   4. Draai de conische buis om op het filterpapier en draai een paar keer heen en weer om ervoor te zorgen dat deze veilig is.
2. Gebruik een mondaspirator om ~ 10 vrouwtjes Cx. pipiens voorzichtig uit hun kooi te verwijderen en ze over te brengen naar de voorbereide conische buis.
3. Plaats een ondoorzichtige cilinder over de conische buis om de muggen duisternis te geven, omdat dit het leggen van eieren stimuleert en wacht 20-25 minuten.

5. Micromanipuleerden van vers gelegde Culex-eieren

1. Bereid de dia voor op het bevestigen van de muggenembryo's voor micro-injection.
   1. Bevestig een stuk dubbelzijdige tape aan de breedte van een afdekglas.
   2. Bevestig een dunne strook transparant medisch verband (bijv. Tegaderm, 2-3 mm breed) aan de dubbelzijdige tape, zodat deze evenwijdig aan het korte uiteinde van het afdekglas loopt en ongeveer 5 mm van het uiteinde van het afdekglas wordt geplaatst.
   3. Verwijder overtollige dubbelzijdige tape met een scherp scheermesje en verwijder 2-3 mm medisch verband en dubbelzijdige tape van elk uiteinde van het afdekglas. Hierdoor kan een laag olie op de glijbaan blijven nadat de eieren op het afdekglas zijn gemonteerd.
   4. Teken met een waspotlood een "D"-vorm rond de dubbelzijdige tape en de strook medisch verband. Dit zal fungeren als een barrière om het water rond de eieren na injectie vast te houden.
2. Nadat de glijbaan is voorbereid en 20-25 minuten zijn verstreken, verwijdert u de ondoorzichtige buis en bepaalt u of de muggen al dan niet eieren hebben gelegd.
   1. Zo niet, bedek ze dan nog 5-10 minuten.
   2. Als de muggen eieren hebben gelegd, til dan voorzichtig maar snel de conische buis op en bedek met een dop. Plaats de muggen in een aparte kooi en noteer de tijd dat eieren zijn verzameld op een spreadsheet. Voeg vervolgens 50-100 μL DI-water toe aan het filterpapier met de eiervlotten.
3. Onder een ontledende microscoop lijn de eieren.
   1. Plaats een stuk filterpapier (rechthoeken van 10 mm x 30 mm gesneden uit grof filterpapier met een snel debiet) onder een afdekglas van 24 mm x 40 mm, zodat het afdekglas 50-60% van de linkerkant van het filterpapier bedekt.
   2. Bevochtig het filterpapier met 50 μL DI-water. Het water verspreidt zich langzaam onder het afdekglas, waardoor een reservoir ontstaat om het filterpapier en de eieren nat te houden tijdens micromanipulatie. Tussen het afdekglas en het filterpapier vormt zich een meniscus wanneer de juiste hoeveelheid water wordt aangebracht.
   3. Scheid de eieren van hun eiervlotten met een fijne verfborstel en plaats zo dat het smalle, achterste uiteinde van het embryo het afdekglas (links) raakt en het bredere, voorste uiteinde naar rechts is.
   4. Lijn eieren gedurende 20 minuten uit en observeer zorgvuldig de verandering van hun kleur van een melkachtig wit naar een zeer lichtgrijs. Inspecteer routinematig de waterfilm onder het afdekglas om er zeker van te zijn dat er voldoende water is. Als de eieren lijken uit te drogen, voeg dan een kleine hoeveelheid DI-water (20-30 μL) toe aan het filterpapier.
   5. Gooi na 20 minuten alle resterende eieren weg.
4. Breng de eieren over op de micro-injection slide.
   1. Gebruik een klein stuk grof filterpapier (10 mm x 30 mm) om water van de zijkant van het verzadigde filterpapier af te leiden en verwijder het wicking-filterpapier met een tang. Herhaal dit 2-3 keer om ervoor te zorgen dat het filterpapier met de eieren zo droog mogelijk is.
   2. Leg een verse, droge rechthoek van filterpapier en houd deze op zijn plaats met een tang. Trek het afdekglas voorzichtig naar links weg, weg van de uitgelijnde eieren.
   3. Droog het overtollige water op het podium zonder het kleine filterpapier dat de uitgelijnde eieren bevat te verstoren. Blijf het natte filterpapier nog een paar keer drogen met de eieren en druk met duimen en/of tang op de kleine rechthoeken van filterpapier om ervoor te zorgen dat de eieren zo droog mogelijk zijn voordat u ze naar de injectieschuif brengt.
   4. Verwijder met een tang de papierrug van de strip van medisch verband van de montageschuif.
   5. Houd de montageschuif met duim en middelvinger en het blootgestelde medische verband naar beneden en laat onder een hoek van 45° op de lijn van uitgelijnde eieren zakken. Plaats de glijbaan zodanig dat het bredere, voorste uiteinde van de eieren (links) iets aan het uiteinde van het medische verband hangt, omdat dit het vermogen van de Culex-larven verbetert om met succes uit de gemonteerde eieren te komen.
   6. Druk de wijsvinger naar de onderkant van het afdekglas, terwijl u het afdekglas tussen duim en middelvinger blijft houden, om ervoor te zorgen dat alle uitgelijnde eieren stevig aan het medische verband zijn bevestigd.
   7. Draai het afdekglas onmiddellijk om zodat de eieren naar boven gericht zijn en breng een dunne laag olie Halocarbon-olie (2-3 druppels; ~ 20 μL) aan op de eieren. Dit voorkomt dat de eieren uitdroogt tijdens micro-injectie. Verwijder eieren die niet aan het medische verband zijn bevestigd of niet door de olie zijn bedekt.
   8. Plaats het glazen deksel met de gemonteerde eieren naar boven in een vierkante Petrischaal met een groot vierkant nat filterpapier voor transport voor micro-injection.

6. Culex embryo's injecteren

1. Terugvullen van de injectienaalden met de injectiemix
   1. Kies een naaldvuller of gellaadtip die gemakkelijk in de achterkant van de geselecteerde injectienaald past en een beetje ruimte heeft tussen het uiteinde van de naaldvuller en de injectienaald.
   2. Plaats voorzichtig een enkele en kleine druppel injectiemix (~ 0,5-1 μL) in de injectienaald, met behulp van de naaldvuller om de naald terug te vullen. Plaats de druppel injectiemix in de buurt van de plaats waar de injectienaald begint af te taps toelopen.
2. Bevestig de injectienaald aan de micro-injector.
3. Plaats de dia met de embryo's op het podium van de microscoop.
4. Het openen van de naald
   OPMERKING: Bij gebruik van afgeschuinde naalden is dit niet nodig.
   1. Gebruik een startinjectiedruk van ~30 PSI en pas indien nodig aan om een geschikt volume injectiemix te leveren.
   2. Plaats de naald onder een dissectiemicroscoop boven het embryo en gebruik de micromanipulator voorzichtig om de naald op het embryo te laten zakken. Zodra de naald het embryo nauwelijks aanraakt, beweegt u het embryo snel loodrecht op de lange as van de naald.
   3. Om te bepalen of de naald met succes is geopend, drukt u op de injectietrigger en ziet u of er bellen/injectiemengsels uit de naald ontsnappen. Zo niet, herhaal dan het bewegen van het embryo tegen de naald totdat de naald open is en de injectiemix ontsnapt wanneer de trekker wordt ingedrukt.
5. Injecteren van de embryo's
   1. Plaats het eerste embryo in lijn in het midden van het zicht in de microscoop en zorg ervoor dat het scherp is.
   2. Plaats de naald over het eerste ei, ook in het midden van het gezichtsveld binnen de microscoop.
   3. Verhoog geleidelijk de vergroting op de microscoop en laat de naald voorzichtig zakken om deze net boven het eerste embryo te houden, gecentreerd en scherp. Ga door tot de microscoop zijn hoogste vergroting heeft bereikt en zowel het embryo als de naald scherp zijn.
   4. Beweeg het embryo op het podium voorzichtig iets naar links en laat de naald iets zakken, zodat de naald en het embryo zich nu in hetzelfde gezichtsveld bevinden.
   5. Gebruik het microscoopstadium om het embryo te verplaatsen, raak het embryo voorzichtig en voorzichtig aan op de punt van de naald. Het smalle, achterste uiteinde van het embryo moet enigszins afbuigen. Stel de hoogte van de naald in als deze te hoog of te laag is.
   6. Beweeg met behulp van het microscoopstadium het achterste uiteinde van het embryo op de naald en observeer de naald die het koraal van het muggenei penetreert. De naald moet gewoon het membraan binnendringen op de geschatte locatie van de poolcellen in Culex-embryo's. Zodra dit gebeurt, trekt u de injectietrigger 1-3 keer om de injectiemix in het embryo te schieten. Lever een kleine hoeveelheid injectiemix, net genoeg om een kleine opheldering in het embryoplasma te detecteren.
   7. Beweeg het embryo met behulp van het stadium naar rechts, weg en van de punt van de naald. Als de injectie goed ging, zou er weinig tot geen vloeistof uit het embryo moeten lekken.
   8. Beweeg het podium naar beneden zodat het volgende embryo in de lijn voor de naald wordt geplaatst. Verplaats vervolgens het stadium naar links, plaats het embryo op de injectienaald en trek de injectietrigger in.
   9. Als het injectiemengsel er niet uit lijkt te komen en/of als er een grote hoeveelheid vloeistof uit het embryo ontsnapt nadat de naald is verwijderd, vervang dan de injectienaald en begin opnieuw.
   10. Vernietig niet-geïnjecteerde of beschadigde eieren.
6. Verzorgen van de embryo's na injectie
   1. Nadat alle embryo's op de glijbaan zijn geïnjecteerd, spoelt u de Halocarbon-olie af door omgekeerde osmosewater aan te brengen met een spuitfles, zodat de stroom water op de bovenkant van de glazen afdeklip boven de geïnjecteerde embryo's wordt geleid en het water langs de afdeklip en over de embryo's kan stromen om de olie weg te spoelen. Zorg ervoor dat u de waterstroom niet rechtstreeks op de embryo's richt, omdat dit ze kan beschadigen of losmaken van het medische verband. Dit proces verwijdert de meeste, maar niet alle, halocarbonolie.
   2. Bedek de glijbaan met 150 μL DI-water.
   3. Plaats de glijbaan met de geïnjecteerde embryo's op nat filterpapier in een vierkante petrischaal.
   4. Plaats de petrischaal met de geïnjecteerde embryo's in een milieukamer van 25-27 °C, 70-80% RV met een lange dag fotoperiode (>13 uur licht/dag).

7. Opfok van geïnjecteerde embryo's (F₀) tot volwassenheid en het opzetten van kruisen

1. Onderzoek dagelijks de dia's van geïnjecteerde embryo's en verwacht dat 1^st instar larven 1,5 dagen na injectie tevoorschijn moeten komen.
2. Tel het aantal 1^st instar larven en plaats 100-200 larven in een Tupperware container ter grootte van een schoenendoos met 450 ml DI water en 50 mg gemalen visvoer. Maak op dit moment 1-5 keer meer containers met wilde of niet-geïnjecteerde larven die zullen worden gebruikt om te kruisen met de geïnjecteerde muggen.
3. Voer de larven dagelijks, waardoor de hoeveelheid voedsel die ze elke dag ontvangen enigszins toeneemt tot ze 300-500 mg bereiken op de^6e dag van het larveleven.
4. Zodra poppen verschijnen, gebruik dan een transferpipet om een pop in een 2 ml microcentrifugebuizen te plaatsen die 50-75% vol DI-water zijn gevuld. Herhaal dit voor alle poppen, zowel de poppen die als embryo's zijn geïnjecteerd als de niet-geïnjecteerde, wilde poppen. Druk de deksels voorzichtig zo in dat ze iets op een kier staan, zodat de muggen niet kunnen ontsnappen, maar toch een kleine hoeveelheid gas kunnen wisselen.
5. Zodra de volwassen muggen in hun microcentrifugebuizen verschijnen, laat je geïnjecteerde vrouwelijke muggen vrij in een kooi met maagdelijke wilde mannelijke muggen, waardoor een verhouding van ten minste 1 wild-type mannetje voor elk geïnjecteerd vrouwtje wordt bereikt. Op dezelfde manier, laat geïnjecteerde mannelijke muggen vrij in een kooi met maagdelijke wilde vrouwtjes, waardoor een verhouding van ongeveer 5-10 maagdelijke wilde vrouwtjes voor elk geïnjecteerd mannetje wordt bereikt. Een hogere verhouding van wilde vrouwtjes tot geïnjecteerde mannetjes wordt aanbevolen omdat elke mannelijke mug meerdere keren kan paren. Daarom verhoogt het hebben van hogere aantallen wilde vrouwtjes die paren met geïnjecteerde mannetjes het aantal F1-nakomelingen dat kan worden geproduceerd.

8. Verkrijgen en fokken van F_1-muggen en screenen op mutaties

1. Zeven tot tien dagen na de opkomst van volwassenen, bied een bloedmaaltijd aan de vrouwtjes in elke kooi zoals hierboven beschreven (stap 3).
2. Vier dagen na het bloeden, plaats ovipositie water in elke kooi. Elk eiervlot vertegenwoordigt het nageslacht van een enkele vrouwelijke mug en moet daarom kort na ovipositie in zijn eigen plastic, schoenendoosformaat opfokcontainer worden geplaatst. Label elke container met een unieke identificatie en geef ook aan dat de larven behoren tot de F_1-generatie voor het gen van belang, of de mannelijke of vrouwelijke ouder werd geïnjecteerd, de datum waarop de pan werd vastgesteld, de opfokomstandigheden en de initialen van de experimenteerder.
3. Bewaak dagelijks de pannen van larven. Zodra larven uitkomen in de pannen, zorg je voor 50 mg gemalen visvoer. Verhoog het voedsel dagelijks gedurende 6 dagen zoals hierboven beschreven (stap 7.3).
4. Breng individuele poppen over op 2 ml microcentrifugebuizen met tussen 1-1,5 ml DI-water, label elke buis en breek de deksels.
5. Zodra de volwassen muggen tevoorschijn komen, opent u voorzichtig de 2 ml microcentrifugebuis, bedekt met een wijsvinger, en plaatst u met de andere hand een glazen flacon van 3 dram over de bovenkant van de microcentrifugebuis. Het natuurlijke instinct van de mug zou moeten zijn om op en in de glazen flacon te vliegen. Zodra dit gebeurt, schuift u een vinger over de opening van de glazen flacon en draait u deze snel om en plaatst u een klein bolletje katoen dat enigszins is bevochtigd met 10% sacharose-oplossing in de bovenkant van de flacon. Dit voorkomt dat de mug ontsnapt en zorgt voor een noodzakelijke voedsel- en waterbron.
6. Label zowel de buis met de pop exuvia als de glazen flacon met de volwassen mug om de larvale pan aan te geven waaruit deze afkomstig is, het geslacht van de mug en de unieke identificatie voor die persoon. Bijvoorbeeld: II.C.M32, waarbij "II" aangeeft dat de mannelijke ouder is geïnjecteerd, "C" het pan/eivlot vertegenwoordigt waaruit het individu afkomstig is, en "M32" aangeeft dat het 32^e mannetje uit die larve-opfokcontainer kwam.
7. Plaats volwassen muggen in hun individuele glazen flacons terug in de milieukamer en voeg dagelijks een kleine hoeveelheid (~ 20 μL) 10% sacharoseoplossing toe aan hun katoen. Zorg ervoor dat u het katoen niet overvoert of verzadigt, omdat de muggen vast komen te zitten in de sacharose-oplossing en sterven.
8. Muggen screenen op de gewenste mutatie
   1. Haal genomisch DNA uit 5-10 pop exuvia uit elk eiervlot / pan larven met behulp van de Phire Direct PCR Kit volgens de instructies van de fabrikant, evenals 1-2 wilde individuen die als controle zullen dienen.
      OPMERKING: Aangezien de nakomelingen van elk vlot waarschijnlijk volle broers en zussen zijn, zal het screenen van 5-10 larven uit elke pan bepalen of de mutatie is doorgegeven aan het nageslacht. Als geen van de gescreende larven uit één pan de gewenste mutatie heeft, screen dan geen extra volwassenen. Als sommige larven de mutatie hebben, moet elk individu uit die pan worden gescreend.
   2. Met behulp van de eerder ontworpen PCR-primers (stap 1.2) versterkt u het fragment rond de voorspelde locatie van uw mutatie met behulp van de Phire PCR-kit in zowel het wildtype als het F1-nageslacht en voert u PCR-fragmenten uit op een 3-4% agarosegel om te bepalen of er zichtbare inserties of deleties (indels) zijn.
      OPMERKING: Alle personen met de gewenste mutatie zijn heterozygoot en moeten 2 banden, één wild type en één iets korter of langer op de gewenste positie weergeven. Om deze te onderscheiden, vergelijkt u de positie en dikte van de banden van de wilde type individuen met die in de banden in het F1-nageslacht. Idealiter zijn er 2 discrete banden zichtbaar, maar als de indel erg klein is, lijkt de band misschien breder en/of waziger.
   3. Zuiver het PCR-product door de band met de vermoedelijke ongelovigen te exciseren (aanbevolen) of door het resterende PCR-product te zuiveren dat niet in de gel is geladen. Dien de gezuiverde PCR in voor sequencing om te bepalen of de gewenste mutatie aanwezig is.

9. Verkrijgen en opfokken van F₂ en F₃ muggen en screenen op mutaties

1. Laat alle F 1 volwassen muggen vrij waarvoor de gewenste_mutatie werd gevonden door de popexuvia uit hun individuele glazen flesjes te screenen en in een kooi met wilde, niet-geïnjecteerde muggen van het andere geslacht. Backcrossing voor deze tweede generatie moet alle schadelijke effecten van injectie en inteelt verwijderen.
2. Bloed voedt de kooien van de mutante F_1-muggen en hun wilde tegenhangers zoals eerder beschreven. Vier tot vijf dagen later, verzamel de resulterende F₂ eiervlotten.
3. Label en kweek de F_2-larven zoals hierboven beschreven, waarbij elk eiervlot in een aparte, gelabelde container wordt geplaatst. Bij verpopping, opnieuw scheiden individuele poppen in individuele 2 ml microcentrifuge buizen, en breng elke volwassene in aparte glazen flacons bedekt met sucrose-doordrenkt katoen bij opkomst. Screen vervolgens de pop exuvia van elk F 2 individu de gewenste_mutatie zoals eerder beschreven (stappen 8.5-8.8).
   OPMERKING: Hier zullen alle personen met de gewenste mutatie heterozygoot zijn, en daarom zou het PCR-product idealiter 2 verschillende banden moeten produceren wanneer het op een 3-4% agarosegel wordt uitgevoerd.
4. Zodra mutante F_2-larven zijn geïdentificeerd, plaatst u alle mannetjes en vrouwtjes die de mutatie hebben in dezelfde kooi om te paren. Bloedtoevoer 7-10 dagen na volwassen opkomst en 4-5 dagen later, verzamel de F 3-eiervlotten.
5. Plaats elk F 3-eiervlot in een afzonderlijke larvale opfokcontainer en label en voer zoals hierboven beschreven.
6. Scheid de F₃ poppen in afzonderlijke 2 ml microcentrifugebuizen. Zodra volwassenen tevoorschijn komen, breng je ze over in individuele glazen flesjes bedekt met 10% met sacharose doordrenkt katoen. Screen de pop exuvia zoals eerder beschreven. Deze keer moet ongeveer 25% van de nakomelingen in elke pan homozygoot zijn voor de nulmutatie. Plaats deze individuen in een enkele kooi en gebruik ze om de nieuw gegenereerde mutantenlijn van muggen te creëren en te onderhouden.
   OPMERKING: Als er een laag aantal homozygote muggen aanwezig is, kunnen heterozygote F_3-mannetjes en -vrouwtjes met elkaar worden gekruist om extra homozygote-null-muggen in de F_4-generatie te genereren.

Representative Results

Met behulp van het beschreven protocol konden we met succes embryo's van Cx. pipiensinjecteren en een hoge overlevingskans waargenomen bij de geïnjecteerde embryo's (~ 55%, figuur 1). Eerdere proeven hadden een lager overlevingspercentage, waarschijnlijk omdat de voorste van de eifollikel aan de medische verbandstrook was bevestigd, waardoor muggenlarven niet uit het koraal konden ontsnappen en met succes in het water konden zwemmen. Ervoor zorgen dat het voorste uiteinde verder reikt dan de strook medisch verband, verhoogde de overleving van larven aanzienlijk en resulteert in nakomelingen van hoge kwaliteit die zich kunnen ontwikkelen tot volwassenheid en zich kunnen voortplanten (figuur 2B).

Latere experimenten en screening geven aan dat de nulmutatie voor de circadiane klokgencyclus (cyc; KM355981) kwam in de kiembaan van de geïnjecteerde embryo's terecht (figuur 3). Gezien het feit dat onze primers een groot deel van het cyc-gen in de buurt van de cut-sites versterkten, was het moeilijk om twee afzonderlijke banden in heterozygote, F_1-muggen te observeren. Dit toont het nut aan van het ontwerpen van primers die fragmenten van ~ 100-200 bp rond de snijplaats zullen versterken, en ook het belang van het sequentiëren van alle vermoedelijke mutante muggen. Sequencing onthulde dat ongeveer 10% van de gescreende muggen een kleine invoeging of verwijdering vertoonde in de buurt van de Cas9-snijplaats van de eerste gids-RNA die we hadden ontworpen (figuur 3), wat suggereert dat dit een zeer effectief gRNA was en dat we de poolcellen met succes hebben gericht tijdens micro-invoegingen. De F_1-individuen paren met succes en produceerden levensvatbare nakomelingen (F_{2-generatie),} waarvan sommige ook de mutatie bevatten.

Figuur 1: Voorbeeld van een afgeschuinde borosilicaatnaald. Deze naald werd vervaardigd uit een gesilicateerde borosilicaat microcapillaire buis, getrokken met behulp van een PC-10 verticale naaldtrekker, en vervolgens afgeschuind op een BV-10 Beveller. De naald wordt bekeken onder ~63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Overleving van de F_0-generatie in hun ontwikkeling. (A) Afbeelding van 1^st instar larven die uitkwamen uit 3 dia's met geïnjecteerde embryo's. (B) Grafische weergave van het aantal individuen in elke levensfase. Van de 801 embryo's die werden geïnjecteerd, kwamen 441 1^st instar larven uit, en van deze 149 individuen bereikten verpopping, wat resulteerde in een totaal van 121 volwassenen (73 mannetjes en 43 vrouwtjes). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Representatieve resultaten met de overdracht van de gewenste mutatie. De bovenste twee sequenties vertegenwoordigen de volgorde van het cyclusgen in Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) en bij wilde vrouwtjes van Cx. pipiens (WT. F; KM355981). De onderstaande sequenties vertegenwoordigen sequenties bij drie mannelijke F_{1-nakomelingen} (I.DM1; II.JM4; II.K10M). De groene doos vertegenwoordigt de PAM-sequentie die wordt herkend door het Cas9-eiwit (CGG), terwijl de groene pijl aangeeft waar het Cas9-eiwit genomisch DNA heeft gespleten. Deze resultaten tonen aan dat korte deleties van 2 of 4 nucleotiden werden geërfd bij de F 1-mannetjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Dit protocol presenteert methoden om specifieke mutaties in het genoom van Culex-muggen te introduceren en kan ook worden gebruikt om het genoom van andere muggen te bewerken. Het protocol is belangrijk omdat het specifieke details biedt over niet alleen hoe de injectiematerialen moeten worden bereid, maar ook een gedetailleerd video-overzicht van hoe muggen eieren kunnen leggen, evenals hoe die eieren te bereiden en te injecteren. We vatten ook samen hoe te profiteren van de biologie van vrouwelijke Cx. pipiens om eieren in individuele vlotten te leggen en daardoor een kleiner deel van de nakomelingen van elk vrouwtje te screenen op gewenste mutaties. De hier gepresenteerde methoden zijn geoptimaliseerd voor Cx. pipiens, maar kunnen met kleine aanpassingen worden aangepast om de genomen van andere muggen of insecten te bewerken. Bovendien zijn de hier beschreven micromanipulatie- en micro-injectieprotocollen vatbaar voor het injecteren van verschillende materialen in insectenembryo's, waaronder transposons, dsRNA of andere endonucleases zoals TALENs of Zinc-Finger nucleases. Bovendien genereert het afschuiningsprotocol micro-injectienaalden met variabele openingsgroottes, waardoor naalden ontstaan die kunnen worden gebruikt voor het injecteren van een breed scala aan injectiematerialen. De open grootte van de naald kan worden afgeleid door de luchtdruk langzaam te verlagen nadat de naald is afgeschuind en de druk op te zien waarbij luchtbellen niet meer uit de punt van de nieuw geopende naald stromen. Hoe minder luchtdruk nodig is om bellen te produceren, geeft aan dat de naald een grotere opening heeft, en omgekeerd geven hogere luchtdrukken aan dat de naald een kleinere openingsgrootte heeft. Naalden met een grotere opening zijn beter voor het injecteren van grotere deeltjes en meer stropende materialen, maar zullen waarschijnlijk grotere schade aan het embryo veroorzaken en daarom de overleving verminderen.

Micro-injectie experimenten zijn in veel opzichten een race tegen de klok. Ten eerste moet men individuele embryo's injecteren binnen de eerste 2 uur na ovipositie, voordat het koraal verhardt en blastodermvorming optreedt. Daarom is het noodzakelijk om op te merken wanneer de muggen voor het eerst in de ovipositiekamer zijn geplaatst, hoe lang het duurt om de eieren te manipuleren voor injectie (we raden niet meer dan 20-30 minuten aan) en hoe lang het duurt om alle embryo's te injecteren. De tijd is ook beperkt bij het screenen van volwassen muggen op mutaties als Cx. pipiens zijn vrij gevoelig voor hun omgeving en muggen overleven over het algemeen slechts 3-5 dagen in individuele glazen flesjes. Daarom is het noodzakelijk om muggenpuppy exuvia zo snel mogelijk te screenen. Als alternatief zou men ook genomisch DNA kunnen extraheren uit een enkele muggenpoot¹⁴. Om dit te doen, moeten de muggen echter eerst op ijs worden verdoofd. Omdat we moe waren van hoe de koude behandeling en het verlies van ledematen de overleving van muggen en hun vermogen om te paren en levensvatbare eieren te leggen zouden kunnen beïnvloeden, besloten we in plaats daarvan de afgedankte pop exuvia te screenen op mutaties. Het niveau van gDNA in de exuvia is waarschijnlijk lager dan in een muggenpoot, en dit voegt extra moeite en tijd toe om muggen in het popstadium te scheiden, maar zorgt er ook voor dat alle volwassenen ongematteerd zijn wanneer ze in hun geschikte kooien worden vrijgelaten, wat absoluut essentieel is. We zijn van mening dat de resultaten de moeite waard zijn, maar moedigen anderen aan om te overwegen of het verwijderen van een been een betere manier van handelen is voor hun experimentele behoeften.

De beste manier om de screening op mutaties te versnellen, is door een plasmide te injecteren die een genetische marker bevat, zoals een fluorescerend eiwit, geflankeerd door homologe sequenties aan weerszijden van de snijplaats. Het aantal knock-in mutaties met behulp van homology directed-repair (HDR) is over het algemeen lager dan niet-homologe end-joining (NHEJ), knock-out mutaties (HDR=0,71%; NHEJ=24,87%; ²²). Daarom zal het inbrengen van de marker waarschijnlijk met een veel lagere frequentie plaatsvinden, maar de tijdsbesparing die wordt geboden door muggenlarven snel onder een fluorescerende microscoop te kunnen screenen, kan het risico waard zijn, afhankelijk van het project. Bovendien worden de snelheden van HDR- en knock-inmutaties verbeterd wanneer men ook een plasmide injecteert die de genetische volgorde van het Cas9-eiwit bevat, aangedreven door de goed gekarakteriseerde embryonale promotor, en het gRNA aangedreven door de U6 promotor^24,26. Dit komt waarschijnlijk omdat vroeg in de embryonale ontwikkeling, wanneer kernen zich snel delen (S-fase van de celcyclus), het foutgevoelige maar opportunistische NHEJ-mechanisme de voorkeursmethode lijkt te zijn om dubbelstrengs breuken te herstellen (herzien¹⁸). Naarmate embryogenese vordert, is de cellulaire machine echter klaar om het nauwkeurigere HDR-mechanisme te gebruiken om dubbelstrengs breuken te repareren (late S-fase en G2-fase). Het injecteren van een plasmide die de Cas9-sequentie bevat vroeg in de embryonale ontwikkeling stelt het Cas9-eiwit in staat om de meeste doelcellen te bereiken terwijl het embryo nog in zijn syncytiële toestand is en voordat cellulaire membranen zich hebben gevormd, maar de lichte vertraging die nodig is om het Cas9-eiwit te transcriberen en te vertalen, lijkt de kans te vergroten dat het endonuclease actief zal zijn op een moment dat het zich ontwikkelende embryo waarschijnlijk HDR zal gebruiken om dubbelstrengs breuken in genomisch DNA nauwkeurig te herstellen. Lin et al.²⁷ ontdekten bijvoorbeeld dat de hdr-snelheden werden verhoogd tot ~ 33% toen het Cas9-eiwit gecomplexeerd met gRNA werd geïnjecteerd in menselijke cellijnen die werden gearresteerd in de M-fase van de celcyclus. Een bijkomend voordeel van het leveren van Cas9- en gRNAs op plasmiden is dat ze minder stroperig zijn en daarom minder kans hebben om de naald te verstoppen tijdens injecties (R. Harrell, persoonlijke observatie). Totdat embyronische promotors echter worden gekarakteriseerd en gevalideerd in Culex-muggen, raden we aan cas9-eiwit of mRNA te injecteren zoals hier beschreven.

Bovendien raden we, gezien de hoeveelheid tijd die men moet besteden aan het fokken en screenen van muggen, aan om ten minste één fulltime technicus, student of onderzoeker aan deze taak te besteden. We raden ook aan om strategisch na te denken over hoeveel null mutanten men nodig heeft voor een bepaald experiment en het belang van genetische diversiteit binnen de null-lijn. Hoewel we muggen konden identificeren in de F_1- en F_2-generaties die de mutatie hadden, overleefde slechts een handvol van de F_2-muggen tot volwassenheid dat de heterozygote mutante muggen geen levensvatbare nakomelingen konden produceren. We denken dat dit veel minder te maken heeft met de mutatie, en waarschijnlijker is het gevolg van de lange periode dat zowel mannelijke als vrouwelijke muggen werden opgesloten in glazen buizen terwijl we ze screenden. Deze langdurige periode van isolatie verstoorde hoogstwaarschijnlijk hun vermogen om met succes te paren en, in het geval van vrouwtjes, een bloedmaaltijd te verkrijgen en levensvatbare eieren te leggen. Outcrossing voor één generatie en/of het hebben van geoptimaliseerde screeningtechnieken moet voorkomen dat dit probleem zich in de toekomst voordoet. Daarom zijn we er door het volgen van dit protocol van overtuigd dat onderzoekers met succes nullijnen van Culex-muggen en, met kleine aanpassingen, extra insecten kunnen genereren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA