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Biology

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61651
Automatic Translation
1, 2
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Abstract

Culex-Moskitos sind die Hauptvektoren mehrerer Krankheiten, die sich negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken, einschließlich west-Nil-Virus und Krankheiten, die durch filariale Nematoden wie Hundeherzwurm und Elefantenasis verursacht werden. Vor kurzem wurde CRISPR / Cas9-Genom-Editing verwendet, um ortsgerichtete Mutationen zu induzieren, indem ein Cas9-Protein, das mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert wurde, in frisch gelegte Embryonen mehrerer Insektenarten injiziert wurde, einschließlich Moskitos, die zu den Gattungen Anopheles und Aedesgehören. Die Manipulation und Injektion von Culex-Moskitos ist etwas schwieriger, da diese Moskitos ihre Eier aufrecht in Flößen ablegen und nicht einzeln wie andere Mückenarten. Hier beschreiben wir, wie man gRNAs entwirft, sie mit Cas9-Protein komplexiert, weibliche Moskitos von Culex pipiens dazu bringt, Eier zu legen, und wie man neu gelegte Embryonen für die Mikroinjektion mit Cas9 / gRNA vorbereitet und injiziert. Wir beschreiben auch, wie man injizierte Moskitos auf die gewünschte Mutation rückt und abschirmt. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass diese Technik verwendet werden kann, um ortsgerichtete Mutationen im Genom von Culex-Moskitos zu induzieren und mit leichten Modifikationen auch bei anderen Mückenarten Nullmutanten zu erzeugen.

Introduction

Culex-Moskitos sind in den gemäßigten und tropischen Regionen der Welt verbreitet und übertragen mehrere tödliche Viren, darunter West-Nil-Virus1,St. Louis-Enzephalitis2 sowie filariale Nematoden, die Hundeherzwurm3 und Elephantiasis4verursachen. Mitglieder des Culex pipiens-Komplexes, zu dem Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens und Cx. pipiens molestusgehören , zeigen auffällige Variationen in vielen Aspekten ihrer Biologie. Zum Beispiel, während Cx. quinquefasciatus und Cx. pipiens molestus nicht in der Lage sind, in eine überwinternde Ruhephase5,6, Cx. pipiens pipiens zeigen robuste saisonale Reaktionen und treten in die Diapause als Reaktion auf kurze Tage7,8ein. Darüber hinaus neigen Cx. pipiens molestus dazu, anthropophiler zu sein, während Cx. pipiens und Cx. quinquefasciatus zoophiler sind6. In den Vereinigten Staaten und an vielen anderen Orten der Welt kreuzen sich diese Arten jedoch, was starke Auswirkungen auf die Krankheitsübertragung hat, da Hybriden der Cx. pipiens pipiens und Cx. pipiens molestus opportunistische Feeder sind und sowohl Vögel als auch Menschenbeißen 9und somit als Brückenvektoren für das West-Nil-Virus dienen. Das Studium dieser und anderer faszinierender Aspekte der Biologie von Culex-Moskitos wurde zum Teil behindert, weil Culex-Moskitos im Labor etwas schwieriger zu züchten sind als Aedes-Moskitos, die ruhe- und austrocknungsresistente Eier produzieren10 und weil funktionelle molekulare Werkzeuge für Culex-Arten nicht so gut entwickelt sind.

CRISPR / Cas9 Genom-Editing ist eine leistungsstarke Technologie, die verwendet wurde, um die Biologie mehrerer wichtiger Mückenarten11,12,13, einschließlich der Südlichen Hausmücke, Culex quinquefasciatus14,15,16. Diese von Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier entwickelte Technologie nutzt eine natürliche bakterielle Abwehr gegen Viren durch bakteriell abgeleitete, CRISPR-assoziierte Endonukleasen (Cas-Proteine; siehe Review von Van der Oost et al.17). Bei der Injektion in tierische Embryonen können die Cas9-Proteine in Kombination mit einer geeigneten Leit-RNA doppelsträngige Brüche im Genom erzeugen. Dies geschieht am häufigsten durch die Verwendung des Cas9-Proteins, das mit Leit-RNAs komplexiert ist, die die Endonukleaseaktivität auf eine bestimmte Region des Genoms lenken. Nachdem das Cas9-Protein einen ortsspezifischen Doppelstrangbruch erzeugt hat, versucht die zelluläre Maschinerie, den Bruch mit einem von zwei Mechanismen zu reparieren. Die erste beinhaltet die Ligatur der beiden Enden durch nicht-homologe End-Joining (NHEJ), die fehleranfällig ist und oft Out-Frame-Insertionen und Deletionen im Genom erzeugt, die zu nicht-funktionellen Proteinen führen können, wodurch eine Knock-out-Mutation erzeugt wird. Alternativ kann die zelluläre Maschinerie die homologiegerichtete Reparatur (HDR) verwenden, indem sie ähnliche Sequenzen findet, um den Bruch korrekt zu reparieren. Die ähnliche Sequenz kann durch das zweite Chromosom im Organismus bereitgestellt werden (siehe Review18). Wenn die reparierte Sequenz jedoch genau mit der ursprünglichen Sequenz übereinstimmt, kann das Cas9-Protein die DNA erneut schneiden. Alternativ können Forscher auch ein Spenderplasmid einschließen, das homologe Sequenzen auf beiden Seiten der Schnittstelle der Zielsequenz mit einer alternativen Reparatursequenz enthält - oft ein fluoreszierendes Markerprotein, eine modifizierte Version des ursprünglichen Gens oder eine andere Modifikation -, die kopiert und in das Genom eingefügt oder "eingeklopft" werden kann.

Das Timing ist bei der Injektion von Embryonen entscheidend, und dies ist insbesondere der Fall, wenn CRISPR / Cas9-Genom-Editing verwendet wird, um Mutationen bei Insekten zu erzeugen. Dies liegt daran, dass das Cas9-Protein und gRNAs die größte Fähigkeit haben, Mutationen nur dann zu erzeugen, wenn sich der Embryo in seinem synzytialen Zustand befindet, bevor sich Zellmembranen gebildet haben und wenn mehrere Kerne im Embryo zugänglich sind. Bei Moskitos erreichen die Kerne die Peripherie ~ 2-4 Stunden nach der Eiablage, abhängig von der Temperatur19, und daher muss vor dieser Zeit eine erfolgreiche Mikroinjektion erfolgen. Darüber hinaus schneidet das Cas9-Protein jede Kern-DNA, auf die es zugreifen kann, so dass das Individuum, das aus der Injektion resultiert, ein Mosaik von Zellen enthält, von denen einige die gewünschte Mutation aufweisen und andere nicht. Damit diese Mutationen erfolgreich vererbt werden können, muss das Cas9-Protein DNA schneiden, die sich in der Keimbahn befindet und die zukünftigen Eier und Spermien hervorbringt. Um sicherzustellen, dass Mutationen in der Keimbahn erzeugt werden, ist es am besten, alle Materialien in der Nähe der Position der Polzellen im Embryo zu injizieren, die die Vorläufer der Insektenkeimbahn sind. Die Polzellen befinden sich in der Nähe des hinteren Endes der Culex-Embryonen 20. Neben der Injektion von Embryonen ist es unerlässlich, einen sorgfältigen Plan für die Kreuzung und das Screening von Nachkommen zu entwickeln, um die gewünschte Mutation zu erkennen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie gRNAs erzeugt und mit Cas9-Protein komplexiert werden, um Injektionsmischungen herzustellen, sowie wie weibliche Moskitos von Culex pipiens dazu veranlasst werden, Eier zu legen und wie diese Eier für die CRISPR / Cas9-vermittelte Genombearbeitung vorbereitet und injiziert werden. Darüber hinaus beschreiben wir, wie injizierte Embryonen und ihre Nachkommen aufgezogen, gekreuzt und gescreent werden, um zu bestätigen, dass die gewünschte Mutation erhalten wurde. Mit diesem Protokoll generierten wir Nullmutationen für ein Gen von Interesse, Zyklus,im Buckeye-Stamm von Culex pipiens. Dieser Stamm wurde ursprünglich 2013 aus feldgesammelten Moskitos in Columbus, Ohio, entwickelt und wird vom Meuti-Labor gepflegt. Dieses Protokoll kann für zusätzliche Studien verwendet werden, die eine CRISPR/Cas9-Genombearbeitung bei Culex-Moskitos sowie anderen Mückenarten erfordern, und ist im Allgemeinen für die Verwendung von CRISPR/Cas9-Genom-Editing bei jeder Insektenart relevant.

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Protocol

In den meisten Forschungseinrichtungen muss ein genehmigtes Biosicherheitsprotokoll vorhanden sein, bevor transgene Insekten erzeugt oder gepflegt werden, um sicherzustellen, dass genetisch veränderte Organismen nicht entweichen oder aus der Laboreinrichtung entfernt werden. Möglicherweise gelten auch zusätzliche staatliche Vorschriften. Bevor Sie ein Projekt dieser Art beginnen, überprüfen Sie alle institutionellen Richtlinien und Verfahren, um festzustellen, welche Dokumente und Genehmigungen erforderlich sind.

1. Entwicklung von gRNAs und Herstellung von Injektionsmischungen

  1. Entwerfen Sie 2-5 gRNAs für jedes Zielgen, da einige gRNAs besser funktionieren als andere. gRNAs, die auf ein Gen von Interesse abzielen, können entweder manuell entworfen oder kostenlose Programme wie Chop-Chop verwendet werden.
  2. Entwerfen und bestellen Sie Primer, die 100-200 bp-Fragmente um jede gRNA verstärken. Idealerweise sollte sich die Schnittstelle etwa im mittleren Drittel bis zur Hälfte des PCR-Produkts befinden. Beachten Sie, wie viele bp an jeder Stelle des Schnitts produziert werden.
  3. Erhalten Sie gRNAs.
    1. Kaufen Sie gRNAs von kommerziellen Unternehmen wie Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript und anderen. Dies ist die einfachste Option.
    2. Alternativ können Sie gRNAs im Labor mithilfe der PCR-Amplifikation erstellen, um die Vorlagen für die anschließende isotherme Synthese zu generieren. Siehe das protokoll, das von Port et al.21 und Kistler et al.22beschrieben wird.
    3. Stellen Sie gRNAs über Plasmid zur Verfügung, das in Embryonen injiziert wird. In diesem Fall sollte die gRNA vom U6-Promotor angetrieben werden (siehe 23,24 für Details).
  4. Erhalten Sie das Cas9-Protein.
    1. Bestellen Sie Cas9 kommerziell bei mehreren Unternehmen, darunter Fisher Scientific. Dies ist die einfachste Option.
    2. Cas9-Protein herstellen und im Labor nach Basu et al.25 und Kistler et al.22reinigen.
    3. Injizieren Sie Cas9 mRNA in Embryonen, wo sie später in aktives Cas9-Protein übersetzt wird. Cas9 mRNA kann entweder im Labor mit In-vitro-Transkription22 synthetisiert oder von Anbietern wie Sigma gekauft werden.
      HINWEIS: Das übersetzte Cas9-Protein muss ein nukleares Lokalisationssignal (NLS) auf dem C-Terminus enthalten, und daher muss das NLS auch in der injizierten Cas9-mRNA vorhanden sein.
    4. Express Cas9 Protein in vivo durch plasmidbasierte Expression. In diesem Fall ist es am besten, die Expression von Cas9 auf dem Plasmid von einem embryonalen Promotor angetrieben zu haben, der in der Zielspezies gut charakterisiert wurde.
      HINWEIS: Bis heute wurden embryonale Promotoren bei Culex-Moskitos nicht gut charakterisiert, und daher wird empfohlen, gereinigtes Protein oder Cas9-mRNA zu injizieren.
  5. Komplexieren Sie die gRNAs mit dem Cas9-Protein, adaptiert von Kistler et al.22.
    1. Wenn Sie Cas9-Protein mit der gRNA zusammen injizieren (empfohlen), stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen des Cas9-Proteins 300 ng / μL und die Endkonzentration einer einzelnen gRNA 80 μg / μL beträgt. Mischen Sie das Protein und eine einzelne gRNA in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen.
    2. Inkubieren Sie für 20 Minuten auf Eis.
  6. Testen von gRNAs mit einem In-vitro-Assay (z. B. Guide-it sgRNA Screening Kit).
    1. Verstärken Sie die Fragmente um die Schnittstelle für jede gRNA mit PCR.
    2. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem Gel aus, um sicherzustellen, dass sie die richtige Größe haben. Reinigen Sie dann PCR-Produkte und sequenzieren Sie sie, um sicherzustellen, dass sie auf die richtige Genregion abzielen.
    3. Mischen Sie 200 ng des übrig gebliebenen gereinigten PCR-Produkts mit 1 μL Cas9-Reaktionspuffer, 1 μL BSA, 1,5 μL komplexiertem Cas9:gRNA und bringen Sie das Gesamtreaktionsvolumen auf 15 μL. Inkubieren Sie für 5 min bei 37 °C.
    4. Führen Sie das Produkt erneut auf einem Gel aus. Wenn das Cas9-Protein das PCR-Produkt erfolgreich geschnitten hat, sollte das primäre Band schwächer erscheinen und zusätzliche kleinere Bänder sollten vorhanden sein. Beachten Sie die Verkleinerung des ursprünglichen PCR-Produkts und berechnen Sie, falls gewünscht, die Verringerung der Bandintensität, um die Schnitteffizienz anzunähern.
  7. Vorbereitung der endgültigen Injektionsmischung
    1. Mischen Sie für jede gRNA, die ihr Ziel-PCR-Produkt erfolgreich geschnitten hat, volumen jedes Cas9 und jeder gRNA in ein 0,5-ml-Röhrchen, so dass das endvolumen 300 ng / μL Cas9-Protein und 80 ng / μL jeder gRNA bleibt.
    2. Lagern Sie die komplexen Cas9 und gRNAs bei -80 °C, bis sie für die Injektion benötigt werden.

2. Ziehen und Anfasen von Nadeln

HINWEIS: Erfolgreiche Injektionen und das Überleben von Embryonen erfordern scharfe Nadeln (Abbildung 1).

  1. Verwenden Sie entweder Borosilikat- oder Quarzglas-Mikrokapillaren mit einem Außendurchmesser. Silikonisieren Sie die Mikrokapillaren in einem chemischen Abzug, bevor Sie gezogen werden.
    1. Kurz gesagt, 3 ml Sigmacote in ein Glasbecherglas geben und für mindestens 4 h in ein zweites Becherglas ziehen, das die Glasmikrokapillaren enthält, so dass die Silikonisierungslösung verdampfen und sich auf allen Oberflächen der Mikrokapillaren absetzen kann.
    2. Lassen Sie anschließend die Vakuumkammer langsam auf den Umgebungsdruck ausgleichen, indem Sie das Absperrventil allmählich öffnen und Luft in die Kammer zurückkehren lassen. Die Nadeln sind dann bereit zum Ziehen.
    3. Lesen Sie vor Gebrauch immer die Bedienungsanleitung der Nadelzieher.
      HINWEIS: In den folgenden Anweisungen wird beschrieben, wie Sie einen P-2000 Laser Needle Puller zum Ziehen von Glasnadeln verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass alle Nadelzieher, auch der gleichen Marke, nicht kalibriert sind, um genau die gleiche Nadel über verschiedene Einheiten zu ziehen. Der Schlüssel zu guten Nadeln besteht darin, bei einem bestimmten Satz von Parametern zu beginnen und dann Nadeln mit Parametern zu ziehen, die über und unter diesen Werten liegen. Testen Sie die Nadeln bei jedem dieser Parameter, indem Sie bewerten, wie gut die Nadel Embryonen durchstochen hat und wie gut die Injektionsmischung aus der Nadel fließt. Verfeinern Sie die Parameter, bis eine Nadel erhalten wird, die leicht zu öffnen oder abzuschränkt ist, die Embryonen reibungslos durchbohrt und die Injektionsmischung leicht liefert.
  2. Ziehen von Nadeln mit dem Lasernadelzieher P-2000
    1. Schalten Sie den Lasernadelzieher ein und lassen Sie den Laser vor dem ersten Zug 15 Minuten lang aufwärmen.
    2. Programmieren Sie die Maschine für den Typ des Mikrokapillarrohrs aus Glas (Denken Sie daran, dass alle Nadelzieherparameter ein Ausgangspunkt sind, da Nadelzieher nicht kalibriert sind, um die gleiche Nadel über alle Abzieher hinweg zu erzeugen):
      Quarz: Wärme = 730; Fil = 4; Vel = 40; Entf = 122; Pul = 156
    3. Nachdem Sie den Nadelzieher programmiert haben, laden Sie eine Mikrokapillarie und klemmen Sie sie an Ort und Stelle, wobei Sie darauf achten, nur das Ende des Mikrokapillarrohrs zu berühren und nicht den Bereich, der vom Laser erwärmt wird.
    4. Nachdem Sie die Mikrokapillar geklemmt haben, legen Sie Daumen und Zeigefinger auf die Fingerstangen und lösen Sie dann die Zugstangen, indem Sie die Federauslöser nacheinander drücken.
    5. Drücken Sie Daumen und Zeigefinger, um die Stäbe vollständig zusammenzuziehen.
    6. Positionieren Sie die andere Seite des Mikrokapillarrohrs in seiner Klemme so, dass sich ein kleiner Teil des Rohres von beiden Seiten erstreckt. Ziehen Sie die Klemmen fest und stellen Sie sicher, dass beide Klemmen fingerfest sind und die "Zugstangen" fest an Ort und Stelle halten.
    7. Schließen Sie die Schutzhülle am Abzieher.
    8. Drücken Sie die Pull-Taste und der Laser beginnt, das Glas zu erhitzen, was durch das rote "Laser auf" -Licht unter dem Gehäuse angezeigt wird. Der Zug ist abgeschlossen, wenn die Zugstangen vollständig getrennt sind, begleitet von einem metallischen Schlag.
    9. Stellen Sie sicher, dass das "Laser auf"-Licht nicht beleuchtet ist, bevor Sie das Gehäuse anheben.
    10. Halten Sie das kleine Ende des Mikrokapillarrohrs, das über die Klemme hinausragt, mit Daumen und Zeigefinger und lösen Sie die Klemme. Heben Sie dann das Mikrokapillarrohr aus der Klemme.
    11. Verwenden Sie eine Zette, um das Mikrokapillarrohr vorsichtig in eine quadratische Petrischale zu legen, die mit doppelseitigem Klebeband ausgekleidet ist. Stellen Sie beim Einsetzen der Nadel in die Haltebox sicher, dass sich das hintere Ende der Nadel zuerst berührt und die Nadel vorsichtig abgesenkt wird, damit die scharfe Spitze nicht beschädigt wird.
  3. Ziehen von Nadeln mit einem PC-10/PC-100 Nadelzieher
    1. Stellen Sie den PC-10-Abzieher mit 4 Gewichten auf und stellen Sie die Temperatur auf 50,4 °C für einen einstufigen Zug ein.
    2. Legen Sie eine Mikrokapillare aus Borosilikatglas in die obere Klemme. Heben Sie dann die gewichtete Bodenklemme in Position und klemmen Sie den unteren Teil der Mikrokapillare, um sicherzustellen, dass die Kapillare in der Lage ist, zwei gute Nadeln zu ziehen. Dies ist ein ziemlich langer Zugzyklus, aber es produziert gute Nadeln zum Abfasen.
  4. Fasen von Nadeln.
    HINWEIS: Diese Methode des Nassfasens gibt Echtzeit-Feedback über die relative Öffnungsgröße der Nadel.
    1. Montieren Sie die Schleifplatte und den Haltering der Nadelfase. Stellen Sie sicher, dass die graue Seite der Schleifplatte zwischen dem oberen und unteren Haltering nach oben ausgerichtet ist. Ziehen Sie die Schrauben am Haltering an und wechseln Sie von Schraube zu Schraube, um sicherzustellen, dass jede Schraube gleichmäßig angezogen wird. Die Schleifplatte und die Halteringe werden im Folgenden als Schleifbaugruppe bezeichnet.
    2. 13 Tropfen (~ 520 μL) Sockelöl auf die optisch flache Oberfläche geben und dann die Schleifeinheit auf die Platte legen. Legen Sie die Baugruppe unter ein Seziermikroskop und schalten Sie dann die Fasen ein. Es wird etwas mehr Öl im Vergleich zu Sutters Empfehlung verwendet, da sich die Schleifplatte in Verbindung mit dieser Nassfasionsmethode länger dreht.
    3. Fügen Sie 1% Photo-Flo-Lösung auf die Schleiffläche hinzu und bewegen Sie den Docht in Position, so dass er in die Photo-Flo-Lösung eingetaucht ist.
    4. Schalten Sie die Luft an der Hauptquelle ein. Dann legen Sie eine gezogene Borosilikatnadel in den Halter und ziehen Sie den Haltering fest. Schalten Sie die Luft am Regler ein und erhöhen Sie, bis der Druck 26 PSI erreicht hat.
    5. Beobachten Sie von der Seite, senken Sie die Nadel mit dem groben Einstellknopf, bis sie fast die Photo-Flo Flüssige oberfläche berührt.
    6. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass die Nadel im Sichtfeld lokalisiert wird. Beginnen Sie mit der niedrigsten Vergrößerung und erhöhen Sie die Vergrößerung. Passen Sie die Position der Nadel mit dem groben Einstellknopf vorsichtig an, bis sie nur noch die Oberfläche der Photo-Flo-Flüssigkeit berührt.
    7. Mit dem groben Einstellknopf und weiter unter das Mikroskop schauen, senken Sie die Nadel, bis sie sich in der Nähe der abrasiven Oberfläche befindet, sie aber nicht berührt.
    8. Senken Sie die Nadel mit dem Feineinstellungsknopf vorsichtig und langsam ab, wobei Sie genau auf die Nadel und den Schatten achten, den sie auf der abrasiven Oberfläche der Fase hinterlässt. Wenn die Nadel und ihr Schatten so aussehen, als würden sie die abrasive Oberfläche berühren, senken Sie die Nadel noch langsamer und vorsichtiger ab.
    9. Wechseln Sie zwischen dem "Abschrägung" der Nadel, indem Sie sie auf die abrasive Oberfläche absenken lassen und dann anheben. Bevor Sie die Nadel anheben, notieren Sie schnell die Einstellung auf dem Mikrometer am Feineinstellknopf, damit die Nadel in die gleiche Position oder gegebenenfalls in eine etwas niedrigere Position abgesenkt werden kann. Denken Sie daran, die Nadel unter der Photo-Flo-Flüssigkeitsschicht zu halten. Sobald die Nadel über die abrasive Oberfläche gehoben wurde, stoppen Sie schnell die Rotation der Fasen, um nach Blasen zu suchen. Wenn die Nadel ausreichend abgeschrächt wurde, sollten Luftblasen aus der Nadel in den Photo-Flo strömen. Wenn die Platte nicht gestoppt wird, werden Blasen wahrscheinlich erst sichtbar, wenn die Nadelöffnung zu groß ist.
    10. Wenn keine Blasen auftreten, wenn die Nadel über die Schleiffläche gehoben wird und der Fasen gestoppt wurde, wiederholen Sie den Abschrägungsvorgang, senken Sie die Nadel auf eine etwas niedrigere Position auf dem Mikrometer auf dem Feineinstellungsknopf, heben Sie die Nadel an, stoppen Sie die Fasenplatte und überprüfen Sie auf Luftblasen. Wiederholen Sie, bis ein kleiner, aber stetiger Strom von Blasen erscheint.
    11. Sobald Luftblasen vorhanden sind, überprüfen Sie die relative Öffnungsgröße, indem Sie die Schleifplatte stoppen und den Luftdruck senken, wobei Sie den PSI notieren, bei dem die Blasenbildung aufhört, da dies ein relativer Hinweis auf die Größe der Öffnung der abgeschrächten Nadeln ist. Je niedriger der Druck, bei dem die Luft nicht mehr aus der Nadelspitze entweicht, desto größer ist die Nadelöffnung. Nadeln, die bis zu dem Punkt abgeschrägt sind, an dem Blasen bei 18-20 PSI nicht mehr aus der Nadel entweichen, weisen darauf hin, dass die Nadel eine relativ kleine Öffnung hat und einen Embryo bei Mikroinjektionen minimal schädigen sollte.
    12. Erhöhen Sie nach der Überprüfung der Nadelöffnung den Luftdruck auf 26 PSI, um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Nadel gelangt. Heben Sie dann die Nadel mit dem groben Einstellknopf nach oben und aus der Photo-Flo-Schicht heraus. Es ist wichtig zu beachten, dass, solange Luft aus der Nadel strömt, das Photo-Flo nicht in die Nadel eindringt und daher das Innere der Nadel vor Verunreinigungen geschützt ist.
    13. Sobald die Nadel aus dem Photo-Flo ist, schalten Sie die Luft aus und entfernen Sie die Nadel aus dem Nadelhalter.
    14. Legen Sie die neu abgeschrächte Nadel mit einer Zette in eine Petrischale, die entweder doppelseitiges Klebeband oder Modelliermasse enthält, um sie an Ort und Stelle zu halten. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 10-20 abgeschrächte Nadeln hergestellt wurden.

3. Blutfütterung der elterlichen Generation von Moskitos

  1. Hintere Larven von Cx. pipiens-Mücken unter eindeutigen Langtagsbedingungen (>13 h Licht/Tag) bei 25-27 °C, um sicherzustellen, dass Moskitos nicht in ihre überwinternde Ruhephase oder Diapause gelangen.
  2. Sieben bis zehn Tage nach dem Spitzenauftreten von Erwachsenen bereiten Sie das Hemotek-Membran-Fütterungssystem vor, indem Sie die Heizeinheiten an die Stromversorgung anschließen. Stellen Sie die Temperatur jedes Geräts mit der Einstellschraube auf der Oberseite des Geräts auf 37 °C (innere Körpertemperatur des Menschen) oder 41 °C (Innere Körpertemperatur des Huhns) ein. Stellen Sie sicher, dass die richtige Temperatur mit einem elektrischen Thermometer erreicht wurde.
  3. Bereiten Sie das Blutmehlreservoir für die Fütterung vor.
    1. Schneiden Sie ein Quadrat Parafilm für jeden Blutfütterungszylinder und reiben Sie Parafilm gegen nackte Füße. Dies liefert Düfte, die für die Moskitos attraktiv sind.
    2. Dehnen Sie den Parafilm so dünn wie möglich und wickeln Sie die Ränder fest um das Mahlzeitenreservoir. Falls gewünscht, mit einem Gummi-O-Ring befestigen.
    3. Etwa 200 μL 0,1 m ATP-Lösung werden zu 15 ml frischem oder aufgetautem, mit Natriumcitrat behandeltem Hühnerblut hinzugefügt. Das ATP hilft, die Bluternährung zu stimulieren, und Natriumcitrat verhindert, dass das Blut gerinnt.
    4. Halten Sie das Reservoir so, dass die Parafilmseite nach unten zeigt, und verwenden Sie vorsichtig eine Einwegpipette, um das Reservoir zu füllen. Jedes Reservoir fasst ~ 3 ml Blut. Verschließen Sie die Füllöffnungen mit Kunststoffstopfen.
    5. Schrauben Sie die Mahlzeitenbehälter in die Heizeinheiten und legen Sie sie auf den Mückenkäfig, so dass die Parafilmseite nach unten zeigt und die Moskitos durch das Netz fressen können.
  4. Bedecken Sie die Käfige mit schwarzen Müllsäcken, um die Dämmerung zu simulieren, und blasen Sie kräftig in jeden Käfig, da die erhöhte CO2-Konzentration die Blutfütterung stimuliert.
  5. Halten Sie den Feeder für 2-8 h auf dem Käfig, um die Blutfütterung zu maximieren. Überprüfen Sie regelmäßig und notieren Sie den Anteil der Frauen, die eine Blutmahlzeit eingenommen haben (erkennbar an ihrem roten und aufgeblähten Bauch).

4. Induzierung der Eiablage bei erwachsenen Moskitos

  1. Vier bis fünf Tage nach der Blutfütterung bereiten Sie einen 50 ml konischen Schlauch für die Eiablage der Mücke vor.
    1. Erzeugen Sie ein ~20 mm Loch in der Nähe des Bodens des konischen Rohres.
    2. Bedecken Sie das Loch mit zwei Quadraten (35 mm2)aus Dentaldammgummi, eines mit einem horizontalen Schlitz und ein anderes mit einem vertikalen Schlitz. Verwenden Sie Klebeband, um die Quadrate des Zahndamms am konischen Rohr zu befestigen.
    3. Legen Sie ein 4,25 cm großes Stück Filterpapier auf eine 35 mm x 10 mm große Petrischale und befeuchten Sie das Filterpapier mit 750 μL destilliertem Wasser.
    4. Kehren Sie das konische Rohr auf das Filterpapier um und drehen Sie es einige Male hin und her, um sicherzustellen, dass es sicher ist.
  2. Verwenden Sie einen Mundsauger, um ~ 10 Weibchen von Cx. pipiens vorsichtig aus ihrem Käfig zu entfernen und sie in das vorbereitete konische Rohr zu übertragen.
  3. Legen Sie einen undurchsichtigen Zylinder über das konische Rohr, um den Moskitos Dunkelheit zu verleihen, da dies die Eiablage stimuliert, und warten Sie 20-25 Minuten.

5. Mikromanipulierende frisch gelegte Culex-Eier

  1. Bereiten Sie den Objektträger für die Befestigung der Moskitoembryonen für die Mikroinjektion vor.
    1. Befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an der Breite eines Deckglases.
    2. Befestigen Sie einen dünnen Streifen transparenten medizinischen Verbandes (z. B. Tegaderm, 2-3 mm breit) an dem doppelseitigen Klebeband, so dass es parallel zum kurzen Ende des Deckglases verläuft und etwa 5 mm vom Ende des Deckglases entfernt positioniert ist.
    3. Entfernen Sie überschüssiges doppelseitiges Klebeband mit einer scharfen Rasierklinge und entfernen Sie 2-3 mm medizinischen Verband und doppelseitiges Klebeband von jedem Ende des Deckglases. Dadurch kann eine Ölschicht auf dem Objektträger verbleiben, nachdem die Eier am Deckglas befestigt wurden.
    4. Zeichnen Sie mit einem Wachsstift eine "D" -Form um das doppelseitige Klebeband und den Streifen des medizinischen Verbandes. Dies wird als Barriere dienen, um das Wasser nach der Injektion um die Eier zu halten.
  2. Nachdem der Objektträger vorbereitet wurde und 20-25 Minuten vergangen sind, entfernen Sie den undurchsichtigen Schlauch und stellen Sie fest, ob die Moskitos Eier gelegt haben oder nicht.
    1. Wenn nicht, decken Sie sie für weitere 5-10 Minuten ab.
    2. Wenn die Moskitos Eier gelegt haben, heben Sie vorsichtig, aber schnell den konischen Schlauch an und bedecken Sie mit einer Kappe. Legen Sie die Moskitos in einen separaten Käfig und notieren Sie die Zeit, zu der Eier gesammelt wurden, in einer Tabelle. Dann 50-100 μL DI-Wasser in das Filterpapier geben, das die Eierflöße enthält.
  3. Unter einem Seziermikroskop reihen sich die Eier aus.
    1. Positionieren Sie ein Stück Filterpapier (10 mm x 30 mm Rechtecke aus grobem Filterpapier mit schneller Durchflussrate) unter einem 24 mm x 40 mm Deckglas, so dass das Deckglas 50-60% der linken Seite des Filterpapiers bedeckt.
    2. Befeuchten Sie das Filterpapier mit 50 μL DI-Wasser. Das Wasser breitet sich langsam unter dem Deckglas aus und schafft ein Reservoir, um das Filterpapier und die Eier während der Mikromanipulation nass zu halten. Zwischen dem Deckglas und dem Filterpapier bildet sich ein Meniskus, wenn die richtige Wassermenge aufgetragen wird.
    3. Trennen Sie die Eier mit einem feinen Pinsel von ihren Eierflößen und positionieren Sie sie so, dass das schmale, hintere Ende des Embryos das Deckglas berührt (links) und das breitere, vordere Ende rechts ist.
    4. Richten Sie die Eier für 20 Minuten aus und beobachten Sie sorgfältig die Veränderung ihrer Farbe von einem milchigen Weiß zu einem sehr hellen Grau. Überprüfen Sie routinemäßig den Wasserfilm unter dem Deckglas, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Wassermenge vorhanden ist. Wenn die Eier auszutrocknen scheinen, fügen Sie eine kleine Menge DI-Wasser (20-30 μL) in das Filterpapier hinzu.
    5. Nach 20 Minuten alle verbleibenden Eier entsorgen.
  4. Übertragen Sie die Eizellen auf den Mikroinjektionsschieber.
    1. Verwenden Sie ein kleines Stück (10 mm x 30 mm) grobes Filterpapier, um Wasser von der Seite des gesättigten Filterpapiers abtransportieren, und entfernen Sie das dochtierende Filterpapier mit einer Zette. Wiederholen Sie 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass das Filterpapier mit den Eiern so trocken wie möglich ist.
    2. Legen Sie ein frisches, trockenes Rechteck aus Filterpapier und halten Sie es mit einer Zange fest. Ziehen Sie vorsichtig das Deckglas nach links weg, weg von den ausgerichteten Eiern.
    3. Trocknen Sie das überschüssige Wasser auf der Bühne, ohne das kleine Filterpapier zu stören, das die ausgerichteten Eier enthält. Trocknen Sie das nasse Filterpapier mit den Eiern noch einige Male weiter und drücken Sie mit Daumen und/oder Einer Zette auf die kleinen Rechtecke des Filterpapiers, um sicherzustellen, dass die Eier so trocken wie möglich sind, bevor Sie sie auf den Injektionsträger übertragen.
    4. Entfernen Sie mit einer Zette den Papierrücken vom Streifen des medizinischen Verbandes vom Montageschieber.
    5. Halten Sie den Montageschieber mit Daumen und Mittelfinger und den freiliegenden medizinischen Verband nach unten und senken Sie ihn in einem Winkel von 45 ° auf die Linie der ausgerichteten Eier. Positionieren Sie den Schlitten so, dass das breitere, vordere Ende der Eier (links) leicht vom Ende des medizinischen Verbandes hängt, da dies die Fähigkeit der Culex-Larven verbessert, erfolgreich aus den montierten Eiern zu schlüpfen.
    6. Drücken Sie den Zeigefinger auf die Unterseite des Deckglases, während Sie das Deckglas weiterhin zwischen Daumen und Mittelfinger halten, um sicherzustellen, dass alle ausgerichteten Eier fest mit dem medizinischen Verband verbunden sind.
    7. Kehren Sie sofort das Deckglas um, so dass die Eier nach oben gerichtet sind, und tragen Sie eine dünne Schicht Halocarbonöl (2-3 Tropfen; ~ 20 μL) auf die Eier auf. Dies verhindert, dass die Eier während der Mikroinjektion austrocknen. Entfernen Sie alle Eier, die nicht am medizinischen Verband befestigt sind oder nicht mit dem Öl bedeckt sind.
    8. Legen Sie die Glasabdeckung mit den montierten Eiern nach oben in eine quadratische Petrischale mit einem großen Quadrat aus Nassfilterpapier für den Transport zur Mikroinjektion.

6. Injektion von Culex-Embryonen

  1. Rückbefüllung der Injektionsnadeln mit der Injektionsmischung
    1. Wählen Sie einen Nadelfüller oder eine Gelladespitze, die leicht in das hintere Ende der ausgewählten Injektionsnadel passt und etwas Platz zwischen dem Ende des Nadelfüllers und der Injektionsnadel hat.
    2. Legen Sie vorsichtig einen einzelnen und kleinen Tropfen Injektionsmischung (~ 0,5-1 μL) in die Injektionsnadel und verwenden Sie den Nadelfüller, um die Nadel zurückzufüllen. Platzieren Sie den Tropfen der Injektionsmischung in der Nähe der Stelle, an der sich die Injektionsnadel zu verjüngen beginnt.
  2. Befestigen Sie die Injektionsnadel am Mikroinjektor.
  3. Legen Sie den Objektträger mit den Embryonen auf die Stufe des Mikroskops.
  4. Öffnen der Nadel
    HINWEIS: Bei Verwendung von abgeschränkten Nadeln ist dies nicht erforderlich.
    1. Verwenden Sie einen Startinjektionsdruck von ~ 30 PSI und passen Sie ihn nach Bedarf an, um ein angemessenes Volumen an Injektionsmischung zu liefern.
    2. Positionieren Sie unter einem Seziermikroskop die Nadel über dem Embryo und verwenden Sie vorsichtig den Mikromanipulator, um die Nadel auf den Embryo zu senken. Sobald die Nadel den Embryo kaum berührt, bewegen Sie den Embryo schnell senkrecht zur langen Achse der Nadel.
    3. Um festzustellen, ob die Nadel erfolgreich geöffnet wurde, drücken Sie den Injektionsauslöser und sehen Sie, ob Blasen / Injektionsmischung aus der Nadel entweichen. Wenn nicht, wiederholen Sie das Bewegen des Embryos gegen die Nadel, bis die Nadel geöffnet ist und die Injektionsmischung entweicht, wenn der Auslöser gedrückt wird.
  5. Injektion der Embryonen
    1. Positionieren Sie den ersten Embryo in einer Linie in der Mitte der Ansicht im Mikroskop und stellen Sie sicher, dass er im Fokus ist.
    2. Legen Sie die Nadel über das erste Ei, ebenfalls in der Mitte des Sichtfeldes innerhalb des Mikroskops.
    3. Erhöhen Sie schrittweise die Vergrößerung am Mikroskop und senken Sie die Nadel vorsichtig, um sie knapp über dem ersten Embryo zu halten, zentriert und im Fokus. Fahren Sie fort, bis das Mikroskop seine höchste Vergrößerung erreicht hat und sowohl der Embryo als auch die Nadel im Fokus sind.
    4. Bewegen Sie den Embryo auf der Bühne vorsichtig leicht nach links und senken Sie die Nadel leicht ab, so dass sich die Nadel und der Embryo nun in der gleichen Sichtebene befinden.
    5. Verwenden Sie das Mikroskop, um den Embryo zu bewegen, berühren Sie den Embryo vorsichtig und sanft bis zur Nadelspitze. Das schmale, hintere Ende des Embryos sollte leicht ablenken. Stellen Sie die Höhe der Nadel ein, wenn sie zu hoch oder zu niedrig ist.
    6. Bewegen Sie mit dem Mikroskop das hintere Ende des Embryos auf die Nadel und beobachten Sie, wie die Nadel in das Chorion des Moskitoies eindringt. Die Nadel sollte nur die Membran an der ungefähren Position der Polzellen in Culex-Embryonen durchdringen. Sobald dies geschieht, ziehen Sie den Injektionsauslöser 1-3 Mal, um injektionsgemischt in den Embryo zu schießen. Liefern Sie eine kleine Menge Injektionsmischung, gerade genug, dass eine kleine Lichtung im Embryoplasma erkannt werden kann.
    7. Bewegen Sie den Embryo mit dem Stadium nach rechts, weg und von der Nadelspitze. Wenn die Injektion gut verlief, sollte wenig bis keine Flüssigkeit aus dem Embryo austreten.
    8. Bewegen Sie das Stadium nach unten, so dass der nächste Embryo in der Linie vor der Nadel positioniert wird. Bewegen Sie dann wieder die Stufe nach links, positionieren Sie den Embryo auf der Injektionsnadel und ziehen Sie den Injektionsauslöser.
    9. Wenn die Injektionsmischung nicht herauszukommen scheint und/oder wenn nach dem Entfernen der Nadel eine große Menge Flüssigkeit aus dem Embryo entweicht, ersetzen Sie die Injektionsnadel und beginnen Sie erneut.
    10. Zerstören Sie alle nicht injizierten oder beschädigten Eier.
  6. Pflege der Embryonen nach der Injektion
    1. Nachdem alle Embryonen auf dem Objektträger injiziert wurden, waschen Sie das Halogenkohlenstofföl ab, indem Sie Umkehrosmosewasser mit einer Spritzflasche auftragen, so dass der Wasserstrahl auf die Oberseite des Glasdecklappens über den injizierten Embryonen geleitet wird und das Wasser den Abdeckungsrutsch hinunter und über die Embryonen fließen kann, um das Öl wegzuspülen. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstrahl nicht direkt auf die Embryonen leitet, da dies sie beschädigen oder vom medizinischen Verband lösen kann. Dieser Prozess entfernt den größten Teil, aber nicht das gesamte Halocarbon-Öl.
    2. Decken Sie die Rutsche mit 150 μL DI-Wasser ab.
    3. Legen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen auf nasses Filterpapier in eine quadratische Petrischale.
    4. Legen Sie die Petrischale mit den injizierten Embryonen in eine Umweltkammer, die auf 25-27 °C, 70-80% RH mit einer langen Tagesphotoperiode (>13 h Licht/Tag) eingestellt ist.

7. Aufzucht injizierter Embryonen (F0)bis zum Erwachsenenalter und Aufstellen von Kreuzen

  1. Untersuchen Sie täglich die Objektträger der injizierten Embryonen und erwarten Sie, dass1. Instar-Larven 1,5 Tage nach der Injektion auftauchen sollten.
  2. Zählen Sie die Anzahl der1. Instar-Larven und legen Sie 100-200 Larven in einen schuhkartongroßen Tupperware-Behälter mit 450 ml DI-Wasser und 50 mg gemahlenem Fischfutter. Erstellen Sie zu diesem Zeitpunkt 1-5 mal mehr Behälter mit Wildtyp- oder nicht injizierten Larven, die zur Kreuzung mit den injizierten Moskitos verwendet werden.
  3. Füttern Sie die Larven täglich und erhöhen Sie die Menge an Nahrung, die sie jeden Tag erhalten, bis sie am 6. Tag des Larvenlebens300-500 mg erreichen.
  4. Sobald Puppen erscheinen, verwenden Sie eine Transferpipette, um eine Puppe in eine 2 ml Mikrozentrifuge zu legen, die zu 50-75% mit DI-Wasser gefüllt ist. Wiederholen Sie dies für alle Puppen, sowohl die Puppen, die als Embryonen injiziert wurden, als auch für uninjizierte Wildtyp-Puppen. Drücken Sie die Deckel vorsichtig so, dass sie leicht ajar sind, um zu verhindern, dass die Moskitos entkommen, aber immer noch eine kleine Menge Gasaustausch ermöglicht.
  5. Sobald die erwachsenen Moskitos in ihren Mikrozentrifugenröhren auftauchen, geben Sie injizierte weibliche Moskitos in einen Käfig mit jungfräulichen männlichen Wildtypmücken frei und erreichen Sie ein Verhältnis von mindestens 1 Wildtyp-Männchen für jedes injizierte Weibchen. In ähnlicher Weise werden injizierte männliche Moskitos in einen Käfig mit jungfräulichen Wildtyp-Weibchen entlassen, wobei ein Verhältnis von etwa 5-10 jungfräulichen Wildtyp-Weibchen für jedes injizierte Männchen erreicht wird. Ein höheres Verhältnis von Wildtyp-Weibchen zu injizierten Männchen wird empfohlen, da sich jede männliche Mücke mehrmals paaren kann. Daher erhöht eine höhere Anzahl von Wildtyp-Weibchen, die sich mit injizierten Männchen paaren, die Anzahl der F1-Nachkommen, die produziert werden können.

8. Gewinnung und Aufzucht von F1-Moskitos und Screening auf Mutationen

  1. Sieben bis zehn Tage nach dem Auftauchen des Erwachsenen bieten Sie den Weibchen in jedem Käfig eine Blutmahlzeit an, wie oben beschrieben (Schritt 3).
  2. Vier Tage nach der Blutfütterung Eiablagewasser in jeden Käfig geben. Jedes Eierfloß repräsentiert die Nachkommen einer einzelnen weiblichen Mücke und sollte daher kurz nach der Eiablage in einen eigenen plastiken, schuhkartongroßen Aufzuchtbehälter gelegt werden. Kennzeichnen Sie jeden Behälter mit einem eindeutigen Identifikator und geben Sie auch an, dass die Larven zurF1-Generation für das interessierende Gen gehören, unabhängig davon, ob der männliche oder weibliche Elternteil injiziert wurde, das Datum, an dem die Pfanne hergestellt wurde, die Aufzuchtbedingungen und die Initialen des Experimentators.
  3. Überwachen Sie täglich die Pfannen von Larven. Sobald Larven in den Pfannen schlüpfen, stellen Sie 50 mg gemahlenes Fischfutter zur Verfügung. Erhöhen Sie die Nahrung täglich für 6 Tage wie oben beschrieben (Schritt 7.3).
  4. Einzelne Puppen in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1-1,5 ml DI-Wasser geben, jedes Röhrchen etikettieren und die Deckel knacken.
  5. Sobald die erwachsenen Moskitos auftauchen, öffnen Sie vorsichtig die 2-ml-Mikrozentrifugenröhre, die mit einem Zeigefinger bedeckt ist, und legen Sie mit der anderen Hand eine 3-Dram-Glasfläschchen über die Oberseite der Mikrozentrifugenröhre. Der natürliche Instinkt der Mücke sollte es sein, nach oben und in die Glasfläschchen zu fliegen. Sobald dies geschieht, schieben Sie einen Finger über die Öffnung der Glasfläschchen und drehen Sie sie schnell um, indem Sie einen kleinen Ball Baumwolle, der mit 10% Saccharoselösung leicht benetzt wurde, in die Oberseite der Durchstechflasche legen. Dies verhindert, dass die Mücke entkommt und bietet eine notwendige Nahrungs- und Wasserquelle.
  6. Kennzeichnen Sie sowohl die Tube mit der Puppenexuvia als auch die Glasfläschchen mit der erwachsenen Mücke, um die Larvenpfanne, aus der sie stammt, das Geschlecht der Mücke und die eindeutige Kennung für diese Person anzugeben. Beispiel: II.C.M32, wobei "II" dafür steht, dass der männliche Elternteil injiziert wurde, "C" für dasPfannen- / Eierfloß steht, aus dem das Individuum stammt, und "M32" bezeichnet, dass das 32. Männchen aus diesem Larvenaufzuchtbehälter hervorgegangen ist.
  7. Legen Sie erwachsene Moskitos in ihren einzelnen Glasfläschchen zurück in die Umweltkammer und fügen Sie täglich eine kleine Menge (~ 20 μL) 10% Saccharoselösung zu ihrer Baumwolle hinzu. Achten Sie darauf, die Baumwolle nicht zu überfüttern oder zu sättigen, da die Moskitos in der Saccharoselösung stecken bleiben und sterben.
  8. Screening von Moskitos auf die gewünschte Mutation
    1. Extrahieren Sie genomische DNA aus 5-10 Puppenexuvien aus jedem Eierfloß / jeder Larvenpfanne mit dem Phire Direct PCR Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers sowie 1-2 Wildtyp-Individuen, die als Kontrolle dienen.
      HINWEIS: Da die Nachkommen von jedem Floß wahrscheinlich volle Geschwister sind, wird das Screening von 5-10 Larven aus jeder Pfanne feststellen, ob die Mutation an die Nachkommen weitergegeben wurde. Wenn keine der gescreenten Larven aus einer Pfanne die gewünschte Mutation aufweist, screenen Sie keine zusätzlichen Erwachsenen. Wenn einige der Larven die Mutation haben, sollte jedes Individuum aus dieser Pfanne untersucht werden.
    2. Verstärken Sie mit den zuvor entwickelten PCR-Primern (Schritt 1.2) das Fragment um den vorhergesagten Ort Ihrer Mutation mit dem Phire PCR-Kit sowohl in der Wildtyp- als auch in der F1-Nachkommenschaft und führen Sie PCR-Fragmente auf einem 3-4% igen Agarosegel aus, um festzustellen, ob sichtbare Insertionen oder Deletionen (Indels) vorhanden sind.
      HINWEIS: Alle Personen, die die gewünschte Mutation haben, sind heterozygot und sollten 2 Bänder aufweisen, einen Wildtyp und einen entweder etwas kürzeren oder längeren an der gewünschten Position. Um diese zu unterscheiden, vergleichen Sie die Position und Dicke der Bänder der Wildtyp-Individuen mit denen in den Bändern der F1-Nachkommen. Idealerweise sind 2 diskrete Bänder sichtbar, aber wenn der Indel sehr klein ist, kann das Band breiter und / oder verschwommener erscheinen.
    3. Reinigen Sie das PCR-Produkt entweder durch Ausscheiden des Bandes, das die verdächtigen Indels enthält (empfohlen) oder durch Reinigen des verbleibenden PCR-Produkts, das nicht in das Gel geladen wurde. Reichen Sie die gereinigte PCR zur Sequenzierung ein, um festzustellen, ob die gewünschte Mutation vorhanden ist.

9. Gewinnung und Aufzucht vonF2- undF3-Mücken und Screening auf Mutationen

  1. Lassen Sie alle erwachsenen F 1-Moskitos frei, für die die gewünschte Mutation gefunden wurde, indem Sie ihre Puppenexuvia aus ihren einzelnen Glasfläschchen in einen Käfig mit wildartigen, nicht injizierten Moskitos des anderen Geschlechts untersuchen. Die Rückkreuzung für diese zweite Generation sollte alle schädlichen Auswirkungen von Injektion und Inzucht beseitigen.
  2. Blut speist die Käfige der mutierten F1-Moskitos und ihrer Wildtyp-Gegenstücke, wie zuvor beschrieben. Vier bis fünf Tage später sammeln Sie die resultierenden F 2-Eierflöße.
  3. Beschriften und züchten Sie die F2-Larven wie oben beschrieben und legen Sie jedes Eierfloß in einen separaten, beschrifteten Behälter. Trennen Sie nach der Verpuppung wieder einzelne Puppen in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie jeden Erwachsenen beim Auftauchen in separate Glasfläschchen, die mit saccharosegetränkter Baumwolle bedeckt sind. Dann screenen Sie die Puppenausuvie jedesF2-Individuums die gewünschte Mutation wie zuvor beschrieben (Schritte 8.5-8.8).
    HINWEIS: Hier sind alle Personen, die die gewünschte Mutation haben, heterozygot, und daher sollte das PCR-Produkt idealerweise 2 verschiedene Bänder produzieren, wenn es mit einem 3-4% igen Agarosegel betrieben wird.
  4. Sobald mutierte F2-Larven identifiziert wurden, legen Sie alle Männchen und Weibchen, die die Mutation haben, in denselben Käfig, um sich zu paaren. Blutfütterung 7-10 Tage nach dem Auftauchen des Erwachsenen und 4-5 Tage später, sammeln Sie die F3 Eierflöße.
  5. Legen Sie jedes F 3-Eierfloß in einen separaten Larvenaufzuchtbehälter und etikettieren und füttern Sie es wie oben beschrieben.
  6. Trennen Sie die F3 Puppen in einzelne 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Sobald Erwachsene auftauchen, geben Sie sie in einzelne Glasfläschchen, die mit 10% saccharosegetränkter Baumwolle bedeckt sind. Screenen Sie die Puppen-Exuvia wie zuvor beschrieben. Diesmal sollten etwa 25% der Nachkommen in jeder Pfanne homozygot für die Nullmutation sein. Legen Sie diese Individuen in einen einzigen Käfig und verwenden Sie sie, um die neu generierte mutierte Mückenlinie zu erstellen und zu pflegen.
    HINWEIS: Wenn eine geringe Anzahl homozygoter Moskitos vorhanden ist, können heterozygote F3-Männchen und -Weibchen miteinander gekreuzt werden, um zusätzliche homozygote Null-Moskitos in der F4-Generation zu erzeugen.

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Representative Results

Mit dem beschriebenen Protokoll konnten wir erfolgreich Embryonen von Cx. pipiensinjizieren und beobachteten eine hohe Überlebensrate unter den injizierten Embryonen (~ 55%, Abbildung 1). Frühere Studien hatten einen geringeren Prozentsatz des Überlebens, wahrscheinlich, weil der vordere Teil des Eifollikels am medizinischen Verbandsstreifen befestigt war, was verhinderte, dass Mückenlarven aus dem Chorion entweichen und erfolgreich ins Wasser schwammen. Die Sicherstellung, dass sich das vordere Ende über den Streifen des medizinischen Verbandes hinaus erstreckt, erhöhte das Überleben der Larven erheblich und führt zu qualitativ hochwertigen Nachkommen, die sich bis zum Erwachsenenalter entwickeln und vermehren können (Abbildung 2B).

Nachfolgende Experimente und Screening deuten darauf hin, dass die Nullmutation für den circadianen Uhr-Genzyklus (cyc; KM355981) schaffte es in die Keimbahn der injizierten Embryonen (Abbildung 3). Da unsere Primer eine große Region des Cyc-Gens in der Nähe der Cut-Sites amplifizierten, war es schwierig, zwei separate Bänder bei heterozygotenF1-Moskitos zu beobachten. Dies zeigt den Nutzen der Entwicklung von Primern, die Fragmente verstärken, die ~ 100-200 bp um die Schnittstelle herum sind, und auch die Bedeutung der Sequenzierung aller vermuteten mutierten Moskitos. Die Sequenzierung ergab, dass etwa 10% der gescreenten Moskitos eine kleine Insertion oder Deletion in der Nähe der Cas9-Schnittstelle der ersten von uns entworfenen Leit-RNA zeigten (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass es sich um eine hochwirksame gRNA handelte und dass wir die Polzellen während Mikroinjektionen erfolgreich anvisierten. DieF1-Individuen paarten sich erfolgreich und produzierten lebensfähige Nachkommen(F2-Generation), von denen einige auch die Mutation enthielten.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiel einer abgeschrächten Borosilikatnadel. Diese Nadel wurde aus einem silikonisierten Borosilikat-Mikrokapillarrohr hergestellt, mit einem vertikalen PC-10-Nadelzieher gezogen und dann auf einer BV-10-Fasen abgeschrägen. Die Nadel wird unter ~63-facher Vergrößerung betrachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Überleben der Generation F0 während ihrer Entwicklung. (A) Bild von 1. Instar-Larven, die aus 3 Objektträgern mit injizierten Embryonen geschlüpft sind. (B) Grafische Darstellung der Anzahl der Individuen in jeder Lebensphase. Von den 801 Embryonen, die injiziert wurden, schlüpften 441 1st Instar Larven, und von diesen 149 Individuen erreichten die Verpällung, was zu insgesamt 121 Erwachsenen (73 Männchen und 43 Weibchen) führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse, die die Übertragung der gewünschten Mutation zeigen. Die beiden obersten Sequenzen stellen die Sequenz des Zyklusgens in Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) und bei Wildtyp-Weibchen von Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Die folgenden Sequenzen stellen Sequenzen bei drei männlichen F1-Nachkommen dar (I.DM1; II.JM4; II.K10M). Das grüne Feld stellt die PAM-Sequenz dar, die vom Cas9-Protein (CGG) erkannt wird, während der grüne Pfeil darstellt, wo das Cas9-Protein genomische DNA gespalten hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass kurze Deletionen von 2 oder 4 Nukleotiden bei denF1-Männchen vererbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt Methoden vor, um spezifische Mutationen in das Genom von Culex-Moskitos einzuführen und kann verwendet werden, um auch das Genom anderer Moskitos zu bearbeiten. Das Protokoll ist insoweit von Bedeutung, als es nicht nur spezifische Details zur Vorbereitung der Injektionsmaterialien enthält, sondern auch einen detaillierten Videoüberblick darüber, wie Moskitos dazu veranlasst werden, Eier zu legen, sowie wie diese Eier zubereitet und injiziert werden. Wir fassen auch zusammen, wie man die Biologie der weiblichen Cx. pipiens nutzen kann, um Eier in einzelne Flöße zu legen und dadurch einen kleineren Anteil der Nachkommen von jedem Weibchen auf gewünschte Mutationen zu überprüfen. Die hier vorgestellten Methoden wurden für Cx. pipiens optimiert, können aber mit kleinen Anpassungen angepasst werden, um die Genome anderer Moskitos oder Insekten zu bearbeiten. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Mikromanipulations- und Mikroinjektionsprotokolle für die Injektion verschiedener Materialien in Insektenembryonen, einschließlich Transposons, dsRNA oder anderen Endonukleasen wie TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen, zulässig. Darüber hinaus erzeugt das Fasenprotokoll Mikroinjektionsnadeln mit variablen Öffnungsgrößen, wodurch Nadeln entstehen, die für die Injektion einer Vielzahl von Injektionsmaterialien verwendet werden können. Die offene Größe der Nadel kann abgeleitet werden, indem der Luftdruck nach dem Abfasen der Nadel langsam verringert und der Druck notiert wird, bei dem Luftblasen aufhören, von der Spitze der neu geöffneten Nadel zu strömen. Der geringere Luftdruck, der zur Erzeugung von Blasen benötigt wird, zeigt an, dass die Nadel eine größere Öffnungsgröße hat, und umgekehrt zeigen höhere Luftdrücke an, dass die Nadel eine kleinere Öffnungsgröße hat. Nadeln mit einer größeren Öffnungsgröße eignen sich besser für die Injektion größerer Partikel und viskoserer Materialien, verursachen jedoch wahrscheinlich größere Schäden am Embryo und verringern daher das Überleben.

Mikroinjektionsexperimente sind in vielerlei Hinsicht ein Wettlauf gegen die Zeit. Zuerst muss man einzelne Embryonen innerhalb der ersten 2 Stunden nach der Eiablage injizieren, bevor die Chorion verhärtet und die Blastodermbildung auftritt. Daher ist es unerlässlich zu beachten, wann die Moskitos zum ersten Mal in die Eiablagekammer gelegt wurden, wie lange es dauert, die Eier für die Injektion zu manipulieren (wir empfehlen nicht mehr als 20-30 Minuten) und wie lange es dauert, alle Embryonen zu injizieren. Die Zeit ist auch begrenzt, wenn erwachsene Moskitos auf Mutationen untersucht werden, da Cx. pipiens sehr empfindlich auf ihre Umgebung reagieren und Moskitos im Allgemeinen nur 3-5 Tage in einzelnen Glasfläschchen überleben. Daher ist es unerlässlich, Moskito-Puppen-Exuvia so schnell wie möglich zu screenen. Alternativ könnte man auch genomische DNA aus einem einzigen Mückenbein extrahieren14. Dazu sollten die Mücken jedoch zunächst auf Eis betäubt werden. Da wir es nicht mehr wussten, wie sich die Kältebehandlung und der Verlust von Gliedmaßen auf das Überleben der Mücken und ihre Fähigkeit, sich zu paaren und lebensfähige Eier zu legen, auswirken könnten, beschlossen wir, stattdessen die weggeworfene Puppenausuvie auf Mutationen zu überprüfen. Der gDNA-Spiegel in der Exuvia ist wahrscheinlich niedriger als in einem Mückenbein, und dies fügt zusätzlichen Aufwand und Zeit hinzu, um Moskitos im Puppenstadium zu trennen, stellt aber auch sicher, dass alle Erwachsenen nicht eingeatkt werden, wenn sie in ihre entsprechenden Käfige entlassen werden, was absolut wichtig ist. Wir sind der Meinung, dass sich die Ergebnisse lohnen, ermutigen aber andere, darüber nachzudenken, ob das Entfernen eines Beines eine bessere Vorgehensweise für ihre experimentellen Bedürfnisse sein könnte.

Der beste Weg, das Screening auf Mutationen zu beschleunigen, besteht darin, ein Plasmid zu injizieren, das einen genetischen Marker enthält, z. B. ein fluoreszierendes Protein, flankiert von homologen Sequenzen auf beiden Seiten der Schnittstelle. Die Raten von Knock-in-Mutationen unter Verwendung von Homology Directed-Repair (HDR) sind im Allgemeinen niedriger als nicht-homologe End-Joining (NHEJ), Knock-out-Mutationen (HDR = 0,71%; NHEJ=24,87%; 22). Daher wird das Einsetzen des Markers wahrscheinlich mit einer viel geringeren Frequenz erfolgen, aber die Zeitersparnis, die sich aus der Möglichkeit bietet, Mückenlarven unter einem Fluoreszenzmikroskop schnell zu screenen, kann je nach Projekt das Risiko wert sein. Darüber hinaus werden die Raten von HDR- und Knock-in-Mutationen erhöht, wenn man auch ein Plasmid injiziert, das die genetische Sequenz des Cas9-Proteins enthält, angetrieben von einem gut charakterisierten embryonalen Promotor und der gRNA, die vom U6-Promotor24,26angetrieben wird. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass zu Beginn der Embryonalentwicklung, wenn sich die Kerne schnell teilen (S-Phase des Zellzyklus), der fehleranfällige, aber zweckmäßige NHEJ-Mechanismus die bevorzugte Methode zur Reparatur doppelsträngiger Brüche zu sein scheint (überprüft18). Mit fortschreitender Embryogenese ist die zelluläre Maschinerie jedoch darauf vorbereitet, den genaueren HDR-Mechanismus zur Reparatur doppelsträngiger Brüche (späte S-Phase und G2-Phase) zu verwenden. Die Injektion eines Plasmids, das die Cas9-Sequenz zu Beginn der Embryonalentwicklung enthält, ermöglicht es dem Cas9-Protein, die meisten Zielzellen zu erreichen, während sich der Embryo noch in seinem synzytiellen Zustand befindet und bevor sich Zellmembranen gebildet haben, aber die leichte Verzögerung, die erforderlich ist, um das Cas9-Protein zu transkribieren und zu übersetzen, scheint die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Endonuklease zu einem Zeitpunkt aktiv ist, zu dem der sich entwickelnde Embryo eher HDR verwendet, um doppelsträngige Brüche in genomischer DNA genau zu reparieren. Zum Beispiel entdeckten Lin et al.27, dass die HDR-Raten auf ~ 33% erhöht wurden, wenn das mit gRNA komplexierte Cas9-Protein in menschliche Zelllinien injiziert wurde, die in der M-Phase des Zellzyklus gestoppt wurden. Ein zusätzlicher Vorteil der Abgabe von Cas9 und gRNAs auf Plasmiden besteht darin, dass sie weniger viskos sind und daher die Nadel während der Injektionen weniger wahrscheinlich verstopfen (R. Harrell, persönliche Beobachtung). Bis jedoch Embyron-Promotoren in Culex-Mücken charakterisiert und validiert sind, empfehlen wir, Cas9-Protein oder mRNA wie hier beschrieben zu injizieren.

Angesichts der Zeit, die man der Aufzucht und dem Screening von Moskitos widmen muss, empfehlen wir außerdem, mindestens einen Vollzeittechniker, Studenten oder Forscher für diese Aufgabe zu haben. Wir empfehlen auch, strategisch zu überlegen, wie viele Nullmutanten man für ein bestimmtes Experiment benötigt und wie wichtig die genetische Vielfalt innerhalb der Nulllinie ist. Während wir moskitos in den F1- undF2-Generationen identifizieren konnten, die die Mutation aufwiesen, überlebten nur eine Handvoll derF2-Moskitos bis ins Erwachsenenalter, die heterozygoten mutierten Moskitos konnten keine lebensfähigen Nachkommen produzieren. Wir denken, dass dies viel weniger mit der Mutation zu tun hat und eher auf die lange Zeit zurückzuführen ist, in der sowohl männliche als auch weibliche Moskitos auf Glasröhren beschränkt waren, während wir sie untersuchten. Diese längere Zeit der Isolation beeinträchtigte höchstwahrscheinlich ihre Fähigkeit, sich erfolgreich zu paaren und im Falle von Weibchen eine Blutmahlzeit zu erhalten und lebensfähige Eier zu legen. Die Auskreuzung für eine einzelne Generation und/oder optimierte Screening-Techniken sollten verhindern, dass dieses Problem in Zukunft auftritt. Daher sind wir zuversichtlich, dass die Forscher durch die Befolkung dieses Protokolls in der Lage sein werden, Nulllinien von Culex-Moskitos und mit geringfügigen Anpassungen zusätzliche Insekten erfolgreich zu erzeugen.

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Disclosures

RH arbeitet für die Insect Transformation Facility, die Dienstleistungen in der genetischen Veränderung von Insekten anbietet.

Acknowledgments

Wir danken Dr. David O'Brochta und allen Mitgliedern des Insect Genetic Technologies Coordination Research Network für die Hilfe und Schulung, die sie uns und anderen bei der Implementierung genetischer Technologien bieten. Wir danken Channa Aluvihare besonders für die Optimierung des Mikromanipulationsprotokolls, damit Culex-Embryonen injiziert und geschlüpft werden können. Wir danken auch Devante Simmons und Joseph Urso, Studenten, die im Meuti-Labor arbeiten, für ihre Unterstützung bei der Pflege und dem Screening transgener Moskitos und Zora Elmkami von der ITF für die Unterstützung bei der Aufzucht und Vorbereitung von Moskitos für die Injektion. Diese Arbeit wurde durch ein Interdisciplinary Seeds Grant des Infectious Diseases Institute der OSU unterstützt, das MEM zur Verfügung gestellt wurde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Membrane Feeder Hemotek SP5W1-3 Company location: Blackburn, UK
ATP Invitrogen 18330019 Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter World Precision Instruments 1B100-6 Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler Sutter Instruments BV-10-B Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm) Sigma Aldrich WHA1001125 Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL) Thermo Fisher Scientific 339652 Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate Thermo Fisher Scientific 09-800 Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm) Thermo Fisher Scientific 50-311-20 Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam Henry Schein Inc 1010171 Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape Thermo Fisher Scientific NC0879005 Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector Eppendorf 5252000021 Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram) Thermo Fisher Scientific 033401C Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil Sigma Aldrich H8898-50ML Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller Sutter Instruments P-2000/G Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm Thermo Fisher Scientific 50-998-944 Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller Narishige PC-100 This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F140WH Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%) Thermo Fisher Scientific 50-268-05 Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter Capillary Tube Supplies Limited QGCT 1.0 Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit Takara, Bio USA 632639 This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-100ML Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm) Thermo Fisher Scientific 50-190-0273 Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood Lampire biologicals 7201406 Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) Thermo Fisher Scientific FB0875711A Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm Henry Schein Inc. 7771180 Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food Tetramin N/A
Whatman filter paper Thermo Fisher Scientific 09-927-826 Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm Sigma Aldrich 1001-042 Company Location: St. Louis, MO, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 163 Designing guide RNAs Mikromanipulation Mikroinjektion Moskito-Embryo Mutationsscreening Nördliche Hausmücke Genom-Editing
Vorbereitung und Injektion von <em></em> Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9
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Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing… More

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (163), e61651, doi:10.3791/61651 (2020).

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