Summary
CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.
Abstract
Le zanzare Culex sono i principali vettori di diverse malattie che hanno un impatto negativo sulla salute umana e animale, tra cui il virus del Nilo occidentale e le malattie causate da nematodi filariali come la filaria canina e l'elefantiasi. Recentemente, l'editing del genoma CRISPR / Cas9 è stato utilizzato per indurre mutazioni dirette al sito iniettando una proteina Cas9 che è stata complessata con un RNA guida (gRNA) in embrioni appena deposti di diverse specie di insetti, comprese le zanzare che appartengono ai generi Anopheles e Aedes. Manipolare e iniettare zanzare Culex è leggermente più difficile in quanto queste zanzare depongono le uova in posizione verticale in zattere piuttosto che individualmente come altre specie di zanzare. Qui descriviamo come progettare gRNA, complessarli con la proteina Cas9, indurre le zanzare femmine di Culex pipiens a depostare le uova e come preparare e iniettare embrioni appena deposti per la microiniezione con Cas9 / gRNA. Descriviamo anche come allevare e schermare le zanzare iniettate per la mutazione desiderata. I risultati rappresentativi dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per indurre mutazioni site-directed nel genoma delle zanzare Culex e, con lievi modifiche, può essere utilizzata per generare mutanti nulli anche in altre specie di zanzare.
Introduction
Le zanzare Culex sono distribuite in tutte le regioni temperate e tropicali del mondo e trasmettono diversi virus mortali tra cui il virus del Nilo occidentale1, l'encefalitedi St. Louis2 e i nematodi filariali che causano la filaria canina3 e l'elefantiasi4. I membri del complesso Culex pipiens, che comprende Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus, mostrano variazioni sorprendenti in molti aspetti della loro biologia. Ad esempio, mentre Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus non sono in grado di entrare in una dormienza svernante5,6, Cx. pipiens pipiens mostrano robuste risposte stagionali ed entrano in diapausa in risposta ai giorni brevi7,8. Inoltre, Cx. pipiens molestus tendono ad essere più antropofili mentre Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus sono più zoofili6. Tuttavia, negli Stati Uniti e in molti altri luoghi del mondo, queste specie si incrociano, il che ha forti implicazioni per la trasmissione della malattia come ibridi di Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus sono alimentatori opportunistici e morderanno sia gli uccelli che gliesseriumani 9 , fungendo così da vettori ponte per il virus del Nilo occidentale. Lo studio di questi e altri aspetti affascinanti della biologia delle zanzare Culex è stato ostacolato, in parte, perché le zanzare Culex sono leggermente più difficili da allevare in laboratorio rispetto alle zanzare Aedes, che producono uova quiescenti e resistenti all'essiccazione10 e perché gli strumenti molecolari funzionali non sono così ben sviluppati per le specie Culex.
L'editing del genoma CRISPR/Cas9 è una potente tecnologia che è stata utilizzata per valutare la biologia di diverse importanti specie di zanzare11,12,13,tra cui la zanzara della casa meridionale, Culex quinquefasciatus14,15,16. Questa tecnologia, sviluppata da Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, sfrutta una difesa batterica naturale contro i virus da parte di endonucleasi associate a CRISPR di derivazione batterica (proteine Cas; vedi recensione di Van der Oost et al.17). Quando iniettate in embrioni animali, le proteine Cas9 in combinazione con un RNA guida appropriato possono produrre rotture a doppio filamento all'interno del genoma. Questo viene fatto più frequentemente utilizzando la proteina Cas9 che è complessata con RNA guida, che dirige l'attività dell'endonucleasi in una regione specifica del genoma. Dopo che la proteina Cas9 ha creato una rottura a doppio filamento site-specific, il macchinario cellulare tenta di riparare la rottura utilizzando uno dei due meccanismi. Il primo comporta la legatura delle due estremità insieme attraverso l'unione finale non omologa (NHEJ), che è soggetta a errori e spesso produce inserzioni e delezioni out-frame nel genoma che possono portare a proteine non funzionali, generando così una mutazione knock-out. In alternativa, il macchinario cellulare potrebbe utilizzare la riparazione diretta dall'omologia (HDR) trovando sequenze simili per riparare correttamente la rottura. La sequenza simile può essere fornita dal secondo cromosoma all'interno dell'organismo (vedi revisione18). Tuttavia, se la sequenza riparata corrisponde esattamente alla sequenza originale, la proteina Cas9 sarà in grado di tagliare nuovamente il DNA. In alternativa, i ricercatori possono anche includere un plasmide donatore che contiene sequenze omologhe su entrambi i lati del sito di taglio della sequenza target con una sequenza di riparazione alternativa - spesso una proteina marcatore fluorescente, una versione modificata del gene originale o altre modifiche - che possono essere copiate e inserite nel genoma o "knocked-in".
Il tempismo è fondamentale quando si iniettano embrioni, e questo è particolarmente vero quando si utilizza l'editing del genoma CRISPR / Cas9 per creare mutazioni negli insetti. Questo perché la proteina Cas9 e i gRNA hanno la maggiore capacità di generare mutazioni solo quando l'embrione è nel suo stato sinciziale, prima che si siano formate membrane cellulari e quando più nuclei siano accessibili all'interno dell'embrione. Per le zanzare, i nuclei raggiungono la periferia ~ 2-4 ore dopo l'ovodeposizione, a seconda della temperatura19, e quindi la microiniezione di successo deve avvenire prima di questo momento. Inoltre, la proteina Cas9 taglierà qualsiasi DNA nucleare a cui può accedere, in modo tale che l'individuo risultante dall'iniezione conterrà un mosaico di cellule, alcune con la mutazione desiderata e altre no. Affinché queste mutazioni siano ereditate con successo, la proteina Cas9 deve tagliare il DNA che risiede nella linea germinale che darà origine alle future uova e spermatozoi. Per garantire che le mutazioni siano generate nella linea germinale è meglio iniettare tutti i materiali vicino alla posizione delle cellule polari all'interno dell'embrione, che sono i progenitori della linea germinale dell'insetto. Le cellule polari si trovano vicino all'estremità posteriore degli embrioni di Culex 20. Oltre a iniettare embrioni, è imperativo sviluppare un piano attento per l'incrocio e lo screening della prole al fine di rilevare la mutazione desiderata.
Questo protocollo descrive come generare gRNA e complessarli con la proteina Cas9 per preparare miscele di iniezione, nonché come indurre le zanzare femmine di Culex pipiens a depostare le uova e come preparare e iniettare quelle uova per l'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9. Inoltre, descriviamo come allevare, incrociare e schermare gli embrioni iniettati e la loro progenie per confermare che la mutazione desiderata è stata ottenuta. Usando questo protocollo, abbiamo generato mutazioni nulle per un gene di interesse, ciclo,nel ceppo Buckeye di Culex pipiens. Questo ceppo è stato originariamente istituito nel 2013 da zanzare raccolte sul campo a Columbus, Ohio ed è mantenuto dal laboratorio Meuti. Questo protocollo può essere utilizzato per ulteriori studi che richiedono l'editing del genoma CRISPR / Cas9 nelle zanzare Culex, così come in altre specie di zanzare e, più in generale, è rilevante per l'impiego dell'editing del genoma CRISPR / Cas9 a qualsiasi specie di insetti.
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Protocol
Nella maggior parte degli istituti di ricerca, un protocollo di biosicurezza approvato deve essere in atto prima che gli insetti transgenici siano generati o mantenuti per garantire che gli organismi geneticamente modificati non sfuggano o vengano rimossi dalla struttura di laboratorio. Potrebbero essere applicati anche ulteriori regolamenti governativi. Prima di iniziare un progetto di questa natura, controllare tutte le politiche e le procedure istituzionali per determinare quali documenti e approvazioni sono necessari.
1. Progettazione di gRNA e preparazione di miscele di iniezione
- Progettare 2-5 gRNA per ciascun gene bersaglio poiché alcuni gRNA funzionano meglio di altri. I gRNA che prendono di mira un gene di interesse possono essere progettati manualmente o possono essere utilizzati programmi gratuiti, come Chop-Chop.
- Progetta e ordina primer che amplifichino frammenti di 100-200 bp attorno a ciascun gRNA. Idealmente, il sito di taglio dovrebbe essere posizionato approssimativamente nella terza metà del prodotto PCR. Si noti quanti bp su ogni sito del taglio verranno prodotti.
- Ottenere gRNA.
- Acquista gRNA da società commerciali come Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript e altri. Questa è l'opzione più semplice.
- In alternativa, creare gRNA in laboratorio utilizzando l'amplificazione PCR per generare i modelli per la successiva sintesi isotermica. Vedi il protocollo descritto da Port et al.21 e Kistler et al.22.
- Fornire gRNA tramite plasmide che viene iniettato negli embrioni. In questo caso, il gRNA dovrebbe essere guidato dal promotore U6 (vedi 23,24 per i dettagli).
- Ottenere la proteina Cas9.
- Ordina Cas9 commercialmente da diverse aziende tra cui Fisher Scientific. Questa è l'opzione più semplice.
- Produrre la proteina Cas9 e purificare in laboratorio secondo Basu et al.25 e Kistler et al.22.
- Iniettare l'mRNA Cas9 negli embrioni, dove verrà successivamente tradotto in proteina Cas9 attiva. L'mRNA Cas9 può essere sintetizzato in laboratorio utilizzando la trascrizione in vitro22 o acquistato da fornitori come Sigma.
NOTA: La proteina Cas9 tradotta deve contenere un segnale di localizzazione nucleare (NLS) sul C-terminus, e quindi l'NLS deve essere presente anche nell'mRNA Cas9 iniettato. - Esprimere la proteina Cas9 in vivo attraverso l'espressione a base di plasmidi. In questo caso, è meglio avere l'espressione di Cas9 sul plasmide guidato da un promotore embrionale che è stato ben caratterizzato nelle specie bersaglio.
NOTA: Ad oggi, i promotori embrionali non sono stati ben caratterizzati nelle zanzare Culex, e quindi si raccomanda di iniettare proteine purificate o mRNA Cas9.
- Complesso i gRNA con la proteina Cas9, adattata da Kistler et al.22.
- Se si inietta la proteina Cas9 con il gRNA insieme (raccomandato), assicurarsi che le concentrazioni finali della proteina Cas9 siano 300 ng/μL e che la concentrazione finale di un singolo gRNA sia di 80 μg/μL. Mescolare la proteina e un singolo gRNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
- Incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
- Test dei gRNA con un test in vitro (ad esempio, Guide-it sgRNA Screening Kit).
- Amplificare i frammenti intorno al sito di taglio per ogni gRNA utilizzando la PCR.
- Eseguire i prodotti PCR su un gel per assicurarsi che siano della dimensione corretta. Quindi, purificare i prodotti PCR e sequenziarli per garantire che colpiscano la regione genica corretta.
- Mescolare 200 ng del prodotto PCR purificato residuo con 1 μL di tampone di reazione Cas9, 1 μL di BSA, 1,5 μL di Cas9:gRNA complessato e portare il volume totale della reazione a 15 μL. Incubare per 5 minuti a 37°C.
- Eseguire nuovamente il prodotto su un gel. Se la proteina Cas9 taglia con successo il prodotto PCR, la banda primaria dovrebbe apparire più debole e dovrebbero essere presenti ulteriori bande più piccole. Notare la riduzione delle dimensioni del prodotto PCR originale e, se lo si desidera, calcolare la riduzione dell'intensità della banda per approssimare l'efficienza di taglio.
- Preparazione della miscela di iniezione finale
- Per ogni gRNA che ha tagliato con successo il suo prodotto PCR mirato, mescolare i volumi di ciascun Cas9 e gRNA in un tubo da 0,5 mL in modo tale che il volume finale rimanga 300 ng / μL di proteina Cas9 e 80 ng / μL di ciascun gRNA.
- Conservare i Cas9 e i gRNA complessati a -80 °C fino a quando non sono necessari per l'iniezione.
2. Tirare e smussare gli aghi
NOTA: il successo delle iniezioni e la sopravvivenza degli embrioni richiedono aghi affilati (Figura 1).
- Utilizzare microcapillari di borosilicato di diametro esterno di 1 mm o vetro al quarzo. Siliconare i microcapillari in una cappa chimica prima di essere tirati.
- In breve, posizionare 3 ml di Sigmacote in un becher di vetro e aspirare in un secondo becher contenente i microcapillari di vetro per almeno 4 ore, consentendo alla soluzione siliconante di vaporizzare e depositarsi su tutte le superfici dei microcapillari.
- Successivamente, consentire lentamente alla camera a vuoto di equalizzare alla pressione ambiente aprendo gradualmente la valvola del rubinetto e consentendo all'aria di tornare nella camera. Gli aghi sono quindi pronti per essere tirati.
- Leggere sempre il manuale di istruzioni degli estrattori di aghi prima dell'uso.
NOTA: le istruzioni riportate di seguito descrivono in dettaglio come utilizzare un estrattore di aghi laser P-2000 per tirare gli aghi di vetro. È importante notare che tutti gli estrattori di aghi, anche della stessa marca, non sono calibrati per tirare esattamente lo stesso ago su unità diverse. La chiave per ottenere buoni aghi è iniziare con un determinato insieme di parametri, quindi tirare gli aghi usando parametri che sono al di sopra e al di sotto di questi valori. Testare gli aghi a ciascuno di questi parametri valutando quanto bene l'ago perfora gli embrioni e quanto bene la miscela di iniezione scorre dall'ago. Affinare i parametri fino ad ottenere un ago facile da aprire o smussare, che fori gli embrioni senza intoppi e che eroghi facilmente la miscela di iniezione.
- Tirare gli aghi utilizzando l'estrattore di aghi laser P-2000
- Accendere l'estrattore dell'ago laser e lasciare che il laser si riscaldi per 15 minuti prima della prima trazione.
- Programmare la macchina per il tipo di tubo microcapillare in vetro (Ricorda che qualsiasi parametro dell'estrattore dell'ago è un punto di partenza poiché gli estrattori dell'ago non sono calibrati per produrre lo stesso ago su tutti gli estrattori):
Quarzo: Calore = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156 - Dopo aver programmato l'estrattore dell'ago, caricare un microcapillare e bloccarlo in posizione, avendo cura di toccare solo l'estremità del tubo microcapillare e non l'area che verrà riscaldata dal laser.
- Dopo aver bloccato il microcapillare, posizionare il pollice e l'indice sulle barre delle dita e quindi rilasciare le barre di trazione premendo i rilasci a molla uno alla volta.
- Spremere il pollice e l'indice per tirare le barre completamente insieme.
- Posizionare l'altro lato del tubo microcapillare nel suo morsetto in modo tale che una piccola porzione del tubo si estenda da entrambi i lati. Stringere i morsetti assicurandosi che entrambi i morsetti siano a tenuta di dita e che tengano saldamente in posizione le "barre di trazione".
- Chiudere il sudario protettivo sull'estrattore.
- Premi il pulsante Pull e il laser inizierà a riscaldare il vetro, indicato dalla luce rossa "laser on" situata sotto il sudario. La trazione è completata quando le barre di trazione sono completamente separate, accompagnate da un tonfo metallico.
- Assicurarsi che la luce "laser on" non sia illuminata prima di sollevare il sudario.
- Tenere la piccola estremità del tubo microcapillare che si estende oltre il morsetto con pollice e indice e allentare il morsetto. Quindi sollevare il tubo microcapillare dal morsetto.
- Utilizzare una pinna per posizionare con cura il tubo microcapillare in una capsula di Petri quadrata rivestita con nastro biadesivo. Assicurarsi quando si posiziona l'ago nella scatola di tenuta che l'estremità posteriore dell'ago tocchi per prima e l'ago venga delicatamente abbassato in posizione in modo che la punta affilata non sia danneggiata.
- Tirare gli aghi usando un estrattore di aghi PC-10 / PC-100
- Impostare l'estrattore PC-10 utilizzando 4 pesi e impostare la temperatura per 50,4 °C per una trazione a passo singolo.
- Posizionare un microcapillare di vetro borosilicato nel morsetto superiore. Quindi sollevare il morsetto inferiore pesato in posizione e bloccare la parte inferiore del microcapillare, assicurandosi che il capillare sia in posizione per tirare due buoni aghi. Questo è un ciclo di trazione piuttosto lungo, ma produce buoni aghi per la smussatura.
- Aghi smussanti.
NOTA: questo metodo di smussatura a umido fornisce un feedback in tempo reale sulla dimensione relativa dell'apertura dell'ago.- Assemblare la piastra abrasiva e l'anello di ritenzione della smussatrice ad ago. Assicurarsi che il lato grigio della piastra abrasiva sia orientato verso l'alto tra l'anello di ritenuta superiore e inferiore. Stringere le viti sull'anello di fissaggio, alternando da vite a vite per garantire che ogni vite sia serrata in modo uniforme. La piastra abrasiva e gli anelli di ritenzione saranno d'ora in poi denominati assemblaggio di rettifica.
- Posizionare 13 gocce (~ 520 μL) di olio per piedistalli sulla superficie piana ottica, quindi posizionare il gruppo di rettifica sopra la piastra. Posizionare l'assemblaggio sotto un microscopio di dissezione, quindi accendere la smussatrice. Viene utilizzato un po 'di olio in più rispetto alla raccomandazione di Sutter, in quanto ciò mantiene la piastra abrasiva che gira per un periodo più lungo se utilizzata in combinazione con questo metodo di smussatura a umido.
- Aggiungere la soluzione Photo-Flo all'1% sulla superficie di rettifica e spostare lo stoppino in posizione in modo che sia immerso nella soluzione Photo-Flo.
- Accendi l'aria alla fonte principale. Quindi posizionare un ago di borosilicato tirato nel supporto e stringere l'anello di ritenzione. Accendere l'aria al regolatore e aumentare fino a quando la pressione non ha raggiunto i 26 PSI.
- Guardando di lato, abbassare l'ago usando la manopola di regolazione grossolana fino a quando non tocca quasi la superficie del liquido Photo-Flo.
- Regolare il microscopio per individuare l'ago nel campo visivo. Inizia con l'ingrandimento più basso e aumenta l'ingrandimento. Regolare con attenzione la posizione dell'ago utilizzando la manopola di regolazione grossolana fino a quando non tocca la superficie del liquido Photo-Flo.
- Utilizzando la manopola di regolazione grossolana e continuando a guardare al microscopio, abbassare l'ago fino a quando non è vicino alla superficie abrasiva ma non toccandolo.
- Utilizzando la manopola di regolazione fine, abbassare con attenzione e lentamente l'ago, prestando molta attenzione all'ago e all'ombra che lascia sulla superficie abrasiva della smussatrice. Quando l'ago e la sua ombra sembrano sul punto di toccare la superficie abrasiva, continuare ad abbassare l'ago ancora più lentamente e con attenzione.
- Alternare tra lasciare l'ago "smussato" abbassandolo sulla superficie abrasiva e quindi sollevarlo. Prima di sollevare l'ago, annotare rapidamente l'impostazione sul micrometro sulla manopola di regolazione fine in modo che l'ago possa essere abbassato nella stessa posizione o, se necessario, in una posizione leggermente inferiore. Ricordarsi di tenere l'ago sotto lo strato liquido Photo-Flo. Una volta che l'ago è stato sollevato sopra la superficie abrasiva, arrestare rapidamente e riavviare la rotazione della smussatrice per verificare la disponibilità di bolle. Se l'ago è stato adeguatamente smussato, le bolle d'aria devono fuoriere dall'ago e nel Photo-Flo. Se la piastra non viene fermata, le bolle probabilmente non diventeranno visibili fino a quando l'apertura dell'ago non sarà troppo grande.
- Se non compaiono bolle quando l'ago viene sollevato sopra la superficie abrasiva e la smussatrice si è fermata, ripetere la procedura di smussatura, abbassando l'ago in una posizione leggermente inferiore sul micrometro situato sulla manopola di regolazione fine, sollevando l'ago, fermando la piastra di smussatura e controllando la presenza di bolle d'aria. Ripeti fino a quando non appare un piccolo ma costante flusso di bolle.
- Una volta che le bolle d'aria sono presenti, controllare la dimensione relativa dell'apertura fermando la piastra abrasiva e abbassando la pressione dell'aria, notando il PSI a cui si ferma la formazione di bolle, poiché questa è un'indicazione relativa della dimensione dell'apertura degli aghi smussati. Minore è la pressione alla quale l'aria smette di fuoriuscire dalla punta dell'ago, maggiore è l'apertura dell'ago. Gli aghi smussati fino al punto in cui le bolle smettono di fuoriuscire dall'ago a 18-20 PSI indicano che l'ago ha un'apertura relativamente piccola e dovrebbe causare danni minimi a un embrione se usato per microiniezioni.
- Dopo aver controllato l'apertura dell'ago, aumentare la pressione dell'aria a 26 PSI per evitare che il liquido penetri nell'ago. Quindi sollevare l'ago su e fuori dallo strato Photo-Flo utilizzando la manopola di regolazione grossolana. È importante notare che finché l'aria fuoriesci dall'ago il Photo-Flo non entra nell'ago e quindi l'interno dell'ago è protetto dalla contaminazione.
- Una volta che l'ago è fuori dal Photo-Flo, spegnere l'aria e rimuovere l'ago dal supporto dell'ago.
- Usando la pinna, posiziona l'ago appena smussato in una capsula di Petri con nastro biadesivo o argilla modellante per tenerlo in posizione. Ripetere il processo fino a quando non sono stati prodotti 10-20 aghi smussati.
3. Alimentazione del sangue della generazione parentale di zanzare
- Larve posteriori di zanzare Cx. pipiens in condizioni di lunga giornata inequivocabili (>13 ore di luce / giorno) a 25-27 ° C per garantire che le zanzare non entrino nella loro dormienza o diapausa svernante.
- Da sette a dieci giorni dopo il picco di emergenza degli adulti, preparare il sistema di alimentazione Hemotek Membrane collegando le unità di riscaldamento all'alimentazione. Regolare la temperatura di ciascuna unità a 37 °C (temperatura corporea interna umana) o 41 °C (temperatura corporea interna del pollo) utilizzando la vite di regolazione sulla parte superiore dell'unità. Assicurarsi che sia stata raggiunta la temperatura corretta utilizzando un termometro elettrico.
- Preparare il serbatoio di farina di sangue per l'alimentazione.
- Tagliare un quadrato di parafilm per ogni cilindro di alimentazione del sangue e strofinare il parafilm contro i piedi nudi. Questo fornisce profumi che sono attraenti per le zanzare.
- Allungare il parafilm il più sottilmente possibile e avvolgere strettamente i bordi attorno al serbatoio del pasto. Se lo si desidera, fissare in posizione con un O-ring in gomma.
- Aggiungere circa 200 μL di soluzione di ATP 0,1 M a 15 mL di sangue di pollo intero fresco o scongelato, trattato con citrato di sodio. L'ATP aiuta a stimolare l'alimentazione del sangue e il citrato di sodio impedisce al sangue di coagulare.
- Tenere il serbatoio in modo che il lato del parafilm sia rivolto verso il basso e utilizzare con attenzione una pipetta usa e getta per riempire il serbatoio. Ogni serbatoio contiene ~ 3 ml di sangue. Sigillare le porte di riempimento con tappi di plastica.
- Avvitare i serbatoi dei pasti nelle unità di riscaldamento e posizionarli sopra la gabbia delle zanzare in modo che il lato del parafilm sia rivolto verso il basso e le zanzare possano nutrirsi attraverso la rete.
- Coprire le gabbie con sacchetti neri della spazzatura per simulare il crepuscolo e soffiare vigorosamente in ogni gabbia poiché l'aumento della concentrazione di CO2 stimola l'alimentazione del sangue.
- Tenere l'alimentatore sulla gabbia per 2-8 ore per massimizzare l'alimentazione del sangue. Controllare periodicamente e notare la percentuale di femmine che hanno preso un pasto di sangue (evidente dai loro addominali rossi e distesi).
4. Indurre la deposizione delle uova nelle zanzare adulte
- Quattro o cinque giorni dopo l'alimentazione del sangue, preparare un tubo conico da 50 ml per l'ovodeposizione delle zanzare.
- Create un foro di circa 20 mm vicino alla parte inferiore del tubo conico.
- Coprire il foro con due quadrati (35 mm2)di gomma da diga dentale, uno con una fessura orizzontale e un altro con una fessura verticale. Utilizzare il nastro adesivo per fissare i quadrati della diga dentale al tubo conico.
- Posizionare un pezzo di carta da filtro di 4,25 cm su una capsula di Petri da 35 mm x 10 mm e bagnare la carta da filtro con 750 μL di acqua distillata.
- Invertire il tubo conico sulla carta da filtro e ruotare avanti e indietro un paio di volte per assicurarsi che sia sicuro.
- Utilizzare un aspiratore a bocca per rimuovere con cura ~ 10 femmine di Cx. pipiens dalla loro gabbia e trasferirle nel tubo conico preparato.
- Posizionare un cilindro opaco sopra il tubo conico per fornire oscurità alle zanzare in quanto ciò stimola la deposizione delle uova e attendere 20-25 minuti.
5. Micro-manipolazione delle uova Culex appena deposte
- Preparare la diapositiva per attaccare gli embrioni di zanzara per la microiniezione.
- Attaccare un pezzo di nastro biadesivo alla larghezza di un vetro di copertura.
- Attaccare una sottile striscia di medicazione medica trasparente (ad esempio, Tegaderm, larga 2-3 mm) al nastro biadesivo in modo che corra parallela all'estremità corta del vetro di copertura e sia posizionata a circa 5 mm dall'estremità del vetro di copertura.
- Rimuovere il nastro biadesivo in eccesso con una lama di rasoio affilata e rimuovere 2-3 mm di medicazione medica e nastro biadesivo da ciascuna estremità del vetro di copertura. Ciò consente a uno strato di olio di rimanere sul vetrino dopo che le uova sono state montate sul vetro di copertura.
- Usando una matita di cera, disegna una forma a "D" attorno al nastro biadesivo e alla striscia di medicazione medica. Questo fungerà da barriera per trattenere l'acqua intorno alle uova dopo l'iniezione.
- Dopo che la diapositiva è stata preparata e sono trascorsi 20-25 minuti, rimuovere il tubo opaco e determinare se le zanzare hanno deposto o meno le uova.
- In caso contrario, coprirli per altri 5-10 minuti.
- Se le zanzare hanno deposto le uova, sollevare con attenzione ma rapidamente il tubo conico e coprire con un cappuccio. Metti le zanzare in una gabbia separata e registra il tempo in cui le uova sono state raccolte su un foglio di calcolo. Quindi aggiungere 50-100 μL di acqua DI alla carta da filtro contenente le zattere di uova.
- Sotto un microscopio sezionante allineare le uova.
- Posizionare un pezzo di carta da filtro (rettangoli da 10 mm x 30 mm tagliati da carta da filtro grossolana con portata rapida) sotto un vetro di copertura di 24 mm x 40 mm in modo tale che il vetro di copertura copra il 50-60% del lato sinistro della carta da filtro.
- Bagnare la carta da filtro con 50 μL di acqua DI. L'acqua si diffonderà lentamente sotto il vetro di copertura, creando un serbatoio per mantenere la carta da filtro e le uova bagnate durante la micromanipolazione. Un menisco si formerà tra il vetro di copertura e la carta da filtro quando viene applicata la giusta quantità di acqua.
- Separare le uova dalle loro zattere di uova usando un pennello fine e posizionarle in modo che l'estremità stretta e posteriore dell'embrione tocchi il vetro di copertura (a sinistra) e l'estremità anteriore più ampia sia a destra.
- Allineare le uova per 20 minuti, osservando attentamente il cambiamento del loro colore da un bianco latte a un grigio molto chiaro. Ispezionare regolarmente il film d'acqua sotto il vetro di copertura per assicurarsi che vi sia una quantità adeguata di acqua. Se le uova sembrano asciugarsi, aggiungere una piccola quantità di acqua DI (20-30 μL) alla carta da filtro.
- Dopo 20 minuti, scartare tutte le uova rimanenti.
- Trasferire le uova sul vetrino di microiniezione.
- Utilizzare un piccolo pezzo (10 mm x 30 mm) di carta da filtro grossolana per espellere l'acqua dal lato della carta da filtro satura e rimuovere la carta da filtro traspirante con una pinna. Ripeti 2-3 volte per assicurarti che la carta da filtro con le uova sia il più asciutta possibile.
- Adacci un rettangolo fresco e asciutto di carta da filtro e tienilo in posizione con un paio di pinci. Tirare via con attenzione il vetro di copertura a sinistra, lontano dalle uova allineate.
- Asciugare l'acqua in eccesso sul palco senza disturbare la piccola carta da filtro che contiene le uova allineate. Continuare ad asciugare la carta da filtro bagnata con le uova più volte, premendo sui piccoli rettangoli di carta da filtro con pollici e/o pinna, per assicurarsi che le uova siano il più asciutte possibile prima di trasferirle sul vetrino di iniezione.
- Usando la pinna, rimuovere il supporto di carta dalla striscia di medicazione medica dalla diapositiva di montaggio.
- Tenere il vetrino di montaggio con un pollice e un dito medio e la medicazione medica esposta rivolta verso il basso e abbassare con un angolo di 45 ° sulla linea di uova allineate. Posizionare la diapositiva in modo tale che l'estremità anteriore più ampia delle uova (a sinistra) sia leggermente appesa all'estremità della medicazione medica, in quanto ciò migliora la capacità delle larve di Culex di schiudersi con successo dalle uova montate.
- Premere l'indice sul lato inferiore del vetro di copertura, continuando a tenere il vetro di copertura tra il pollice e il dito medio, per assicurarsi che tutte le uova allineate siano saldamente attaccate alla medicazione medica.
- Invertire immediatamente il vetro di copertura in modo che le uova siano rivolte verso l'alto e applicare un sottile strato di olio di olio Halocarbon (2-3 gocce; ~ 20 μL) alle uova. Ciò impedisce alle uova di essiccare durante la microiniezione. Rimuovere eventuali uova che non sono attaccate alla medicazione medica o non sono coperte dall'olio.
- Posizionare il coperchio di vetro con le uova montate rivolte verso l'alto all'interno di una capsula di Petri quadrata con un grande quadrato di carta da filtro bagnata per il trasporto per la microiniezione.
6. Iniezione di embrioni di Culex
- Riempimento posteriore degli aghi per iniezione con la miscela di iniezione
- Scegli un riempitivo per ago o una punta di caricamento del gel che si adatti facilmente all'estremità posteriore dell'ago per iniezione selezionato e abbia un po 'di spazio tra l'estremità del riempitivo dell'ago e l'ago per iniezione.
- Posizionare con attenzione una singola e piccola goccia di miscela per iniezione (~ 0,5-1 μL) nell'ago per iniezione, utilizzando il riempitivo dell'ago per riempire l'ago. Posizionare la goccia della miscela di iniezione vicino al punto in cui l'ago per iniezione inizia a diminuire.
- Collegare l'ago per iniezione al microiniettore.
- Posizionare il vetrino contenente gli embrioni sullo stadio del microscopio.
- Apertura dell'ago
NOTA: Se si utilizzano aghi smussati, questo non è necessario.- Utilizzare una pressione di iniezione iniziale di ~ 30 PSI e regolare se necessario per fornire un volume appropriato di miscela di iniezione.
- Al microscopio a dissezione, posizionare l'ago sopra l'embrione e utilizzare attentamente il micromanipolatore per abbassare l'ago sull'embrione. Una volta che l'ago tocca a malapena l'embrione, sposta rapidamente l'embrione perpendicolarmente all'asse lungo dell'ago.
- Per determinare se l'ago è stato aperto correttamente, premere il grilletto dell'iniezione e vedere se dall'ago fuoriescono bolle/miscela per iniezione. In caso contrario, ripetere lo spostamento dell'embrione contro l'ago fino a quando l'ago è aperto e la miscela di iniezione fuoriesce quando viene premuto il grilletto.
- Iniezione degli embrioni
- Posiziona il primo embrione in linea al centro della vista al microscopio e assicurati che sia a fuoco.
- Posizionare l'ago sopra il primo uovo, anche all'interno del centro del campo visivo all'interno del microscopio.
- Aumentare progressivamente l'ingrandimento sul microscopio, abbassando con cura l'ago per mantenerlo appena sopra il primo embrione, centrato e a fuoco. Procedere fino a quando il microscopio ha raggiunto il suo massimo ingrandimento e sia l'embrione che l'ago sono a fuoco.
- Spostare con attenzione l'embrione sul palco leggermente a sinistra e abbassare leggermente l'ago in modo che l'ago e l'embrione siano ora sullo stesso piano di vista.
- Usando lo stadio del microscopio per spostare l'embrione, tocca attentamente e delicatamente l'embrione sulla punta dell'ago. L'estremità stretta e posteriore dell'embrione dovrebbe deviare leggermente. Regolare l'altezza dell'ago se è troppo alto o troppo basso.
- Usando lo stadio del microscopio, sposta l'estremità posteriore dell'embrione sull'ago e osserva l'ago penetrare nel coro dell'uovo di zanzara. L'ago dovrebbe solo penetrare nella membrana nella posizione approssimativa delle cellule polari all'interno degli embrioni Culex. Una volta che ciò si verifica, premere il grilletto dell'iniezione 1-3 volte per sparare la miscela di iniezione nell'embrione. Fornire una piccola quantità di mix di iniezione, quanto basta per rilevare una piccola compensazione nell'embrioplasma.
- Usando lo stadio, sposta l'embrione a destra, lontano e fuori dalla punta dell'ago. Se l'iniezione è andata bene, poco o nessun liquido dovrebbe fuoriuscire dall'embrione.
- Spostare lo stadio verso il basso in modo che l'embrione successivo nella linea sia posizionato davanti all'ago. Quindi di nuovo, spostare il palco a sinistra, posizionando l'embrione sull'ago dell'iniezione e premere il grilletto dell'iniezione.
- Se la miscela per iniezione non sembra uscire e/o se una grande quantità di liquido fuoriesce dall'embrione dopo la rimozione dell'ago, sostituire l'ago per iniezione e ricominciare.
- Distruggi eventuali uova non iniettate o danneggiate.
- Cura degli embrioni post-iniezione
- Dopo che tutti gli embrioni sul vetrino sono stati iniettati, lavare via l'olio di halocarbon applicando acqua ad osmosi inversa con una bottiglia di schizzo, in modo tale che il flusso d'acqua sia diretto sulla parte superiore del coperchio di vetro sopra gli embrioni iniettati e consentendo all'acqua di fluire lungo il coperchio e sopra gli embrioni per sciacquare via l'olio. Assicurati di non dirigere il flusso d'acqua direttamente sugli embrioni in quanto ciò potrebbe danneggiarli o staccarli dalla medicazione medica. Questo processo rimuove la maggior parte, ma non tutto, dell'olio Halocarbon.
- Coprire la diapositiva con 150 μL di acqua DI.
- Posizionare il vetrino con gli embrioni iniettati su carta da filtro bagnata all'interno di una capsula di Petri quadrata.
- Posizionare la capsula di Petri contenente gli embrioni iniettati in una camera ambientale impostata a 25-27 °C, 70-80% RH con un fotoperiodo a lunga giornata (>13 ore luce/giorno).
7. Allevamento di embrioni iniettati (F0) fino all'età adulta e creazione di croci
- Esaminare i vetrini degli embrioni iniettati ogni giorno, aspettandosi che1a larva di instar dovrebbe emergere 1,5 giorni dopo l'iniezione.
- Conta il numero di1a larva instar e metti 100-200 larve in un contenitore Tupperware delle dimensioni di una scatola da scarpe con 450 ml di acqua DI e 50 mg di cibo per pesci macinato. In questo momento, crea 1-5 volte più contenitori contenenti larve selvatiche o non iniettate che verranno utilizzate per incrociare con le zanzare iniettate.
- Nutrire le larve ogni giorno, aumentando leggermente la quantità di cibo che ricevono ogni giorno fino a raggiungere 300-500 mg il6 ° giorno di vita larvale.
- Una volta che le pupe appaiono, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare una pupa in un tubo microcentrifuga da 2 ml riempito al 50-75% di acqua DI. Ripetere per tutte le pupe, sia le pupe che sono state iniettate come embrioni, sia le pupe selvatiche non iniettate. Premere con attenzione i coperchi in modo che siano leggermente socchiusi, impedendo alle zanzare di fuoriuscire ma consentendo comunque una piccola quantità di scambio di gas.
- Una volta che le zanzare adulte emergono all'interno dei loro tubi di microcentrifuga, rilasciano zanzare femmine iniettate in una gabbia contenente zanzare maschio selvatiche vergini, ottenendo un rapporto di almeno 1 maschio selvatico per ogni femmina iniettata. Allo stesso modo, rilascia zanzare maschio iniettate in una gabbia contenente femmine vergini di tipo selvatico, raggiungendo un rapporto di circa 5-10 femmine vergini di tipo selvatico per ogni maschio iniettato. Si raccomanda un rapporto più elevato tra femmine selvatiche e maschi iniettati poiché ogni zanzara maschio può accoppiarsi più volte. Pertanto, avere un numero maggiore di femmine selvatiche che si accoppiano con maschi iniettati aumenta il numero di progenie F1 che può essere prodotta.
8. Ottenere e allevare zanzare F1 e controllarle per le mutazioni
- Da sette a dieci giorni dopo l'emergenza degli adulti, offrire un pasto di sangue alle femmine in ogni gabbia come descritto sopra (passaggio 3).
- Quattro giorni dopo l'alimentazione del sangue, posizionare l'acqua di ovodeposizione in ogni gabbia. Ogni zattera di uova rappresenta la progenie di una singola zanzara femmina, e quindi dovrebbe essere collocata nel proprio contenitore di plastica delle dimensioni di una scatola da scarpe poco dopo l'ovodeposizione. Etichettare ogni contenitore con un identificatore univoco e indicare anche che le larve appartengono alla generazione F1 per il gene di interesse, indipendentemente dal fatto che sia stato iniettato il genitore maschio o femmina, la data in cui è stata stabilita la padella, le condizioni di allevamento e le iniziali dello sperimentatore.
- Monitora quotidianamente le padelle delle larve. Non appena le larve si schiudono nelle padelle, fornire 50 mg di cibo per pesci macinato. Aumentare il cibo ogni giorno per 6 giorni come descritto sopra (passo 7.3).
- Trasferire le singole pupe in tubi microcentrifuga da 2 mL contenenti tra 1-1,5 mL di acqua DI, etichettare ciascun tubo e rompere i coperchi.
- Una volta che le zanzare adulte emergono, aprire con attenzione il tubo di microcentrifuga da 2 ml, coprendo con un dito indice, e usando l'altra mano, posizionare una fiala di vetro da 3 dram sopra la parte superiore del tubo di microcentrifuga. L'istinto naturale della zanzara dovrebbe essere quello di volare su e nella fiala di vetro. Una volta che ciò accade, far scorrere un dito sull'apertura del flaconcino di vetro e invertirlo rapidamente, posizionando un piccolo batuffolo di cotone che è stato leggermente bagnato con una soluzione di saccarosio al 10% nella parte superiore del flaconcino. Ciò impedisce alla zanzara di fuggire e fornisce una fonte di cibo e acqua necessaria.
- Etichettare sia il tubo contenente l'esudavia pupale che la fiala di vetro contenente la zanzara adulta per indicare la padella larvale da cui ha avuto origine, il sesso della zanzara e l'identificatore univoco per quell'individuo. Es: II.C.M32, dove "II" rappresenta che il genitore maschio è stato iniettato, "C" rappresenta la zattera pan/uovo da cui l'individuo ha avuto origine, e "M32" indica che è stato il 32° maschio ad emergere da quel contenitore di allevamento larvale.
- Posizionare le zanzare adulte all'interno delle loro singole fiale di vetro nella camera ambientale e aggiungere una piccola quantità (~ 20 μL) di soluzione di saccarosio al 10% al loro cotone ogni giorno. Assicurati di non sovralimentare o saturare il cotone poiché le zanzare rimarranno bloccate nella soluzione di saccarosio e moriranno.
- Screening delle zanzare per la mutazione desiderata
- Estrarre il DNA genomico da 5-10 esuvia pupali da ogni zattera di uova / padella di larve utilizzando il Phire Direct PCR Kit secondo le istruzioni del produttore, così come 1-2 individui selvatici che serviranno da controllo.
NOTA: Poiché la prole di ogni zattera è probabilmente un fratello completo, lo screening di 5-10 larve da ogni padella determinerà se la mutazione è stata trasmessa alla prole. Se nessuna delle larve schermate da una padella ha la mutazione desiderata, non eseguire lo screening di altri adulti. Se alcune delle larve hanno la mutazione, allora ogni individuo da quella padella dovrebbe essere sottoposto a screening. - Utilizzando i primer PCR precedentemente progettati (fase 1.2), amplificare il frammento intorno alla posizione prevista della mutazione utilizzando il kit Phire PCR sia nella progenie wild-type che F1 ed eseguire frammenti di PCR su un gel di agarose al 3-4% per determinare se ci sono inserzioni o delezioni visibili (indels).
NOTA: Tutti gli individui che hanno la mutazione desiderata saranno eterozigoti e dovrebbero mostrare 2 bande, un tipo selvatico e una leggermente più corta o più lunga nella posizione desiderata. Per distinguerli, confronta la posizione e lo spessore delle bande degli individui selvatici con quelli nelle bande della progenie F1. Idealmente saranno visibili 2 bande discrete, ma se l'indel è molto piccolo, la banda potrebbe sembrare più ampia e / o più sfocata. - Purificare il prodotto PCR eliminando la fascia contenente i sospetti indels (consigliato) o purificando il prodotto PCR rimanente che non è stato caricato nel gel. Sottoporre la PCR purificata per il sequenziamento per determinare se la mutazione desiderata è presente.
- Estrarre il DNA genomico da 5-10 esuvia pupali da ogni zattera di uova / padella di larve utilizzando il Phire Direct PCR Kit secondo le istruzioni del produttore, così come 1-2 individui selvatici che serviranno da controllo.
9. Ottenere e allevare zanzare F2 e F3 e controllarle per le mutazioni
- Rilasciare tutte le zanzare adulte F1 per le quali è stata trovata la mutazione desiderata schermando la sua esuvia pupale dalle loro singole fiale di vetro e in una gabbia contenente zanzare selvatiche non iniettate del sesso opposto. Il backcrossing per questa seconda generazione dovrebbe rimuovere tutti gli effetti deleteri dell'iniezione e della consanguineità.
- Il sangue alimenta le gabbie delle zanzare mutanti F1 e le loro controparti wild-type come precedentemente descritto. Quattro o cinque giorni dopo, raccogli le zattere di uova F2 risultanti.
- Etichettare e allevare le larve F2 come descritto sopra, posizionando ogni zattera di uova in un contenitore separato ed etichettato. Dopo la pupa, separare nuovamente le singole pupe in singoli tubi microcentrifuga da 2 ml e trasferire ogni adulto in fiale di vetro separate ricoperte di cotone imbevuto di saccarosio all'emergenza. Quindi esaminare l'esuvia pupale di ciascun individuo F2 la mutazione desiderata come precedentemente descritto (passaggi 8.5-8.8).
NOTA: Qui tutti gli individui che hanno la mutazione desiderata saranno eterozigoti, e quindi il prodotto PCR dovrebbe idealmente produrre 2 bande distinte quando viene eseguito su un gel di agarosio al 3-4%. - Una volta identificate le larve mutanti F2, posizionare tutti i maschi e le femmine che hanno la mutazione nella stessa gabbia per accoppiarsi. Il mangime per il sangue 7-10 giorni dopo l'emergenza degli adulti e 4-5 giorni dopo, raccogliere le zattere di uova F3.
- Posizionare ogni zattera di uova F3 in un contenitore di allevamento larvale separato, etichettare e nutrire come descritto sopra.
- Separare le pupe F3 in singoli tubi microcentrifuga da 2 ml. Una volta che gli adulti emergono, trasferiscili in singole fiale di vetro ricoperte di cotone imbevuto di saccarosio al 10%. Scherma l'exuvia pupale come descritto in precedenza. Questa volta, circa il 25% della prole in ogni padella dovrebbe essere omozigote per la mutazione nulla. Metti questi individui in un'unica gabbia e usali per creare e mantenere la linea mutante di zanzare appena generata.
NOTA: Se è presente un basso numero di zanzare omozigoti, maschi e femmine eterozigoti F3 possono essere incrociati tra loro per generare ulteriori zanzare omozigoti-nulle nella generazione F4.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo descritto, siamo stati in grado di iniettare con successo embrioni di Cx. pipiense abbiamo osservato un alto tasso di sopravvivenza tra gli embrioni iniettati (~ 55%, Figura 1). Gli studi precedenti avevano una percentuale inferiore di sopravvivenza, probabilmente perché l'anteriore del follicolo dell'uovo era attaccato alla striscia medicazione, impedendo alle larve di zanzara di sfuggire al coro e nuotare con successo nell'acqua. Garantire che l'estremità anteriore si estenda oltre la striscia di medicazione medica ha notevolmente aumentato la sopravvivenza larvale e si traduce in una prole di alta qualità che è in grado di svilupparsi fino all'età adulta e riprodursi (Figura 2B).
Esperimenti e screening successivi indicano che la mutazione nulla per il ciclo del gene dell'orologio circadiano (cyc; KM355981) è entrato nella linea germinale degli embrioni iniettati (Figura 3). Dato che i nostri primer hanno amplificato una vasta regione del gene cyc vicino ai siti di taglio, è stato difficile osservare due bande separate nelle zanzare eterozigoti F1. Ciò dimostra l'utilità di progettare primer che amplificheranno frammenti che sono ~ 100-200 bp intorno al sito di taglio, e anche l'importanza di sequenziare tutte le zanzare mutanti sospette. Il sequenziamento ha rivelato che circa il 10% delle zanzare sottoposte a screening ha mostrato una piccola inserzione o delezione vicino al sito di taglio Cas9 del primo RNA guida che avevamo progettato(Figura 3),suggerendo che si trattava di un gRNA altamente efficace e che abbiamo mirato con successo alle cellule polari durante le microiniezioni. Gli individui F1 si sono accoppiati con successo e hanno prodotto prole vitale (generazione F2), alcuni dei quali contenevano anche la mutazione.
Figura 1: Esempio di ago borosilicato smussato. Questo ago è stato fabbricato da un tubo microcapillare di borosilicato siliconato, tirato usando un estrattore di ago verticale PC-10 e quindi smussato su un BV-10 Beveller. L'ago viene visualizzato con un ingrandimento ~ 63x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sopravvivenza della generazione F0 durante il loro sviluppo. (A) Immagine di1a larva instar che si è schiusa da 3 vetrini contenenti embrioni iniettati. (B) Rappresentazione grafica del numero di individui in ogni fase della vita. Degli 801 embrioni che sono stati iniettati, 4411a larva di instar si sono schiuse e di questi 149 individui hanno raggiunto la pupa, risultando in un totale di 121 adulti (73 maschi e 43 femmine). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi che mostrano la trasmissione della mutazione desiderata. Le prime due sequenze rappresentano la sequenza del gene del ciclo in Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) e in femmine selvatiche di Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Le sequenze sottostanti rappresentano sequenze in tre figli maschi F1 (I.DM1; II.JM4; II.K10M). La scatola verde rappresenta la sequenza PAM riconosciuta dalla proteina Cas9 (CGG) mentre la freccia verde rappresenta dove la proteina Cas9 ha scisso il DNA genomico. Questi risultati mostrano che brevi delezioni di 2 o 4 nucleotidi sono state ereditate nei maschi F1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo presenta metodi per introdurre mutazioni specifiche nel genoma delle zanzare Culex e può essere utilizzato anche per modificare il genoma di altre zanzare. Il protocollo è significativo in quanto fornisce dettagli specifici non solo su come preparare i materiali di iniezione, ma anche una panoramica video dettagliata su come indurre le zanzare a dedurre le uova, nonché su come preparare e iniettare quelle uova. Riassumiamo anche come sfruttare la biologia della femmina Cx. pipiens per deportare le uova in singole zattere e quindi schermare una percentuale minore di prole da ogni femmina per le mutazioni desiderate. I metodi qui presentati sono stati ottimizzati per Cx. pipiens ma possono essere adattati, con piccoli aggiustamenti, per modificare i genomi di altre zanzare o insetti. Inoltre, i protocolli di micromanipolazione e microiniezione qui descritti sono suscettibili di iniettare diversi materiali in embrioni di insetti, tra cui trasposoni, dsRNA o altre endonucleasi come TALEN o nucleasi Zinc-Finger. Inoltre, il protocollo di smussatura genera aghi di microiniezione con dimensioni di apertura variabili creando così aghi che possono essere utilizzati per iniettare un'ampia varietà di materiali di iniezione. La dimensione aperta dell'ago può essere dedotta diminuendo lentamente la pressione dell'aria dopo che l'ago è stato smussato e notando la pressione alla quale le bolle d'aria smettono di fluire dalla punta dell'ago appena aperto. La minore pressione dell'aria necessaria per produrre bolle indica che l'ago ha una dimensione di apertura maggiore e, al contrario, pressioni dell'aria più elevate indicano che l'ago ha una dimensione di apertura più piccola. Gli aghi con dimensioni di apertura più grandi sono migliori per iniettare particelle più grandi e materiali più viscosi, ma probabilmente causeranno maggiori danni all'embrione e quindi ridurranno la sopravvivenza.
Gli esperimenti di microiniezione sono per molti versi una corsa contro il tempo. In primo luogo, si devono iniettare singoli embrioni entro le prime 2 ore di ovodeposizione, prima che il corion si indurisca e si verifichi la formazione di blastoderma. Pertanto, è imperativo notare quando le zanzare sono state posizionate per la prima volta nella camera di ovodeposizione, quanto tempo ci vuole per manipolare le uova per l'iniezione (raccomandiamo non più di 20-30 minuti) e quanto tempo ci vuole per iniettare tutti gli embrioni. Il tempo è anche limitato quando lo screening delle zanzare adulte per mutazioni come Cx. pipiens sono abbastanza sensibili all'ambiente circostante e le zanzare generalmente sopravvivono solo per 3-5 giorni in singole fiale di vetro. Pertanto, è imperativo schermare l'exuvia pupale di zanzara il più rapidamente possibile. In alternativa, si potrebbe anche estrarre il DNA genomico da una singola gamba di zanzara14. Per fare ciò, tuttavia, le zanzare dovrebbero prima essere anestetizzate sul ghiaccio. Poiché eravamo stanchi di come il trattamento a freddo e la perdita degli arti potessero influire sulla sopravvivenza delle zanzare e sulla loro capacità di accoppiarsi e deportare uova vitali, abbiamo deciso invece di esaminare l'esudavia pupale scartata per le mutazioni. Il livello di gDNA all'interno dell'esuvia è probabilmente inferiore a quello all'interno di una gamba di zanzara, e questo aggiunge ulteriore sforzo e tempo per separare le zanzare nella fase pupale, ma assicura anche che tutti gli adulti non sianomati quando vengono rilasciati nelle loro gabbie appropriate, il che è assolutamente vitale. Riteniamo che i risultati ne valgano la pena, ma incoraggiamo gli altri a considerare se rimuovere una gamba potrebbe essere una linea d'azione migliore per le loro esigenze sperimentali.
Il modo migliore per accelerare lo screening per le mutazioni è quello di iniettare un plasmide contenente un marcatore genetico, come una proteina fluorescente, affiancato da sequenze omologhe su entrambi i lati del sito di taglio. I tassi di mutazioni knock-in che utilizzano l'omologia directed-repair (HDR) sono generalmente inferiori rispetto alle mutazioni knock-out non omologhe (NHEJ), knock-out (HDR = 0,71%; NHEJ=24,87%; 22). Pertanto, l'inserimento del marcatore avverrà probabilmente con una frequenza molto più bassa, ma il risparmio di tempo offerto dalla possibilità di schermare rapidamente le larve di zanzara al microscopio fluorescente può valere il rischio, a seconda del progetto. Inoltre, i tassi di mutazioni HDR e knock-in sono aumentati quando si inietta anche un plasmide contenente la sequenza genetica della proteina Cas9, guidata da un promotore embrionale ben caratterizzato, e il gRNA guidato dal promotore U624,26. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che all'inizio dello sviluppo embrionale, quando i nuclei si dividono rapidamente (fase S del ciclo cellulare), il meccanismo NHEJ soggetto a errori ma opportuno sembra essere il metodo preferito per riparare le rotture a doppio filamento (recensito18). Tuttavia, con il progredire dell'embriogenesi, il meccanismo cellulare è pronto a utilizzare il meccanismo HDR più accurato per riparare le rotture a doppio filamento (fase S tardiva e fase G2). L'iniezione di un plasmide che contiene la sequenza Cas9 all'inizio dello sviluppo embrionale consente alla proteina Cas9 di raggiungere la maggior parte delle cellule bersaglio mentre l'embrione è ancora nel suo stato sinciziale e prima che le membrane cellulari si siano formate, ma il leggero ritardo richiesto per trascrivere e tradurre la proteina Cas9 sembra aumentare la probabilità che l'endonucleasi sia attiva in un momento in cui l'embrione in via di sviluppo ha maggiori probabilità di utilizzare l'HDR per riparare con precisione le rotture a doppio filamento nel DNA genomico. Ad esempio, Lin et al.27 hanno scoperto che i tassi di HDR sono stati migliorati a ~ 33% quando la proteina Cas9 complessata con gRNA è stata iniettata in linee cellulari umane arrestate nella fase M del ciclo cellulare. Un ulteriore vantaggio della consegna di Cas9 e gRNA sui plasmidi è che sono meno viscosi e quindi meno propensi a ostruire l'ago durante le iniezioni (R. Harrell, osservazione personale). Tuttavia, fino a quando i promotori embyronici non sono caratterizzati e convalidati nelle zanzare Culex, si consiglia di iniettare la proteina Cas9 o l'mRNA come descritto qui.
Inoltre, data la quantità di tempo che si deve dedicare all'allevamento e allo screening delle zanzare, si consiglia di avere almeno un tecnico, studente o ricercatore a tempo pieno dedicato a questo compito. Raccomandiamo anche di considerare strategicamente quanti mutanti nulli sono di cui si ha bisogno per un determinato esperimento e l'importanza della diversità genetica all'interno della linea nulla. Mentre siamo stati in grado di identificare le zanzare nelle generazioni F1 e F2 che avevano la mutazione, solo una manciata delle zanzare F2 è sopravvissuta fino all'età adulta, le zanzare mutanti eterozigoti non sono riuscite a produrre prole vitale. Pensiamo che questo abbia molto meno a che fare con la mutazione, e più probabilmente è il risultato del lungo periodo di tempo in cui sia le zanzare maschili che quelle femmine sono state confinate in tubi di vetro mentre le stavamo esaminando. Questo prolungato periodo di isolamento molto probabilmente interferiva con la loro capacità di accoppiarsi con successo e, nel caso delle femmine, ottenere un pasto di sangue e deportare uova vitali. L'outcrossing per una singola generazione e/o l'utilizzo di tecniche di screening ottimizzate dovrebbero impedire che questo problema si verifichi in futuro. Pertanto, seguendo questo protocollo siamo fiduciosi che i ricercatori saranno in grado di generare con successo linee nulle di zanzare Culex e, con piccoli aggiustamenti, insetti aggiuntivi.
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Disclosures
RH lavora per l'Insect Transformation Facility, che fornisce servizi di modificazione genetica degli insetti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. David O'Brochta e tutti i membri della Rete di ricerca di coordinamento delle tecnologie genetiche degli insetti per l'aiuto e la formazione che forniscono a noi e ad altri sull'implementazione delle tecnologie genetiche. Ringraziamo in particolare Channa Aluvihare per aver ottimizzato il protocollo di micromanipolazione per consentire l'iniezione e la schiusa degli embrioni Culex. Ringraziamo anche Devante Simmons e Joseph Urso, studenti universitari che lavorano nel laboratorio Meuti, per la loro assistenza nella cura e nello screening delle zanzare transgeniche, e Zora Elmkami dell'ITF per l'assistenza all'allevamento e la preparazione delle zanzare per l'iniezione. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione interdisciplinare Seeds dell'Istituto di malattie infettive dell'OSU fornita a MEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
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