Summary
CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
컬렉스 모기는 웨스트 나일 바이러스와 개 심장벌레와 코끼리와 같은 filarial 선충에 기인한 질병을 포함하여 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 질병의 중요한 벡터입니다. 최근에는 제네라 아노필스와 에데스에속하는 모기를 포함하여 여러 곤충 종의 갓 배치된 배아에 가이드 RNA(gRNA)로 복합된 Cas9 단백질을 주입하여 현장 지향 돌연변이를 유도하는 데 사용되어 왔다. 컬렉스 모기를 조작하고 주입하는 것은 이 모기가 다른 모기 종처럼 뗏목에서 알을 똑바로 세우기 때문에 약간 더 어렵습니다. 여기에서 우리는 gRNA를 디자인하는 방법, Cas9 단백질로 그(것)들을 복잡하게 하고, Culex pipiens의 여성 모기를 계란을 낳기 위하여 유도하고, Cas9/gRNA를 가진 미세 주입을 위한 새로 놓인 태아를 준비하고 주입하는 방법을 기술합니다. 우리는 또한 원하는 돌연변이를 위해 주입된 모기를 후방및 스크린하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과는 이 기술이 Culex 모기의 게놈에 있는 사이트 지시돌연변이를 유도하기 위하여 이용될 수 있고, 약간의 수정으로, 그밖 모기 종에 있는 널 돌연변이를 생성하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.
Introduction
컬렉스 모기는 전 세계의 온대 및 열대 지역에 분포되어 있으며 웨스트 나일 바이러스1,세인트 루이스 뇌염2뿐만 아니라 개 심장벌레3 및 elephantiasis4를일으키는 필리알 선충을 포함한 여러 치명적인 바이러스를 전송합니다. Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens 및 Cx. pipiens 성추행을포함하는 Culex pipiens 복합체의 구성원은 생물학의 많은 양상에서 눈에 띄는 변화를 보여줍니다. 예를 들어, Cx. quinquefasciatus 및 Cx. pipiens 성추행은 겨울휴면5,6, Cx. pipiens 피피엔스는 짧은 일7,8에대한 응답으로 강력한 계절 반응을 표시하고 diapause를 입력 할 수 없습니다. 또한 Cx. pipiens 성추행은 더 인류애호가경향이 있는 반면 Cx. pipiens와 Cx. quinquefasciatus는 더 많은 동물 애호가6. 그러나 미국과 전 세계 많은 다른 장소에 걸쳐, Cx의 하이브리드로 질병 전염에 강한 영향을 미치는 이 종간 교배. pipiens pipiens 와 Cx. pipiens 성추행은 기회 피더이며 조류와 인간 을 모두 물린것입니다 9,따라서 웨스트 나일 바이러스에 대한 다리 벡터역할을. Culex 모기의 생물학의 이것과 그밖 매혹적인 양상을 공부하는 것은, 부분적으로, Culex 모기는 정지및 건조 저항하는 계란10을 생성하는 Aedes 모기 보다는 실험실에서 서있기 약간 더 어렵기 때문에 및 기능적인 분자 공구가 Culex 종을 위해 잘 개발되지 않기 때문에 방해되었습니다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은남부 집 모기, 컬렉스 퀸케파시아투스14,15,16을포함하여 몇 가지 중요한 모기 종11,12,13의생물학을 평가하는 데 사용되는 강력한 기술이다. 제니퍼 두나와 엠마뉴엘 샤펜티에가 개발한 이 기술은 세균 유래, CRISPR 관련 엔도니클로스(Cas 단백질; Van der Oost 외17)에의한 바이러스에 대한 자연적인 세균 방어를 이용합니다. 동물 배아에 주입할 때, Cas9 단백질은 적당한 가이드 RNA와 조합하여 게놈 내의 이중 좌초 된 휴식을 생성할 수 있습니다. 이것은 가장 빈번하게 게놈의 특정 지구에 엔도누엔리스 활성을 지시하는 가이드 RNA로 복합되는 Cas9 단백질을 사용하여 행해집니다. Cas9 단백질이 사이트별 이중 좌초 휴식을 만든 후, 세포 기계는 두 가지 메커니즘 중 하나를 사용하여 휴식을 복구하려고합니다. 첫 번째는 오류가 발생하기 쉽고 종종 비기능성 단백질을 초래할 수 있는 게놈의 아웃프레임 삽입 및 삭제를 생성하는 비동상종 결합(NHEJ)을 통해 두 끝을 결집시켜 녹아웃 돌연변이를 생성합니다. 또는 셀룰러 기계는 유사한 시퀀스를 찾아 파손을 올바르게 복구하여 동종 학 지향 수리(HDR)를 사용할 수 있습니다. 유사한 서열은 유기체 내의 제2 염색체에 의해 제공될 수 있다(리뷰18참조). 그러나, 수리된 서열이 원래 서열과 정확히 일치하면 Cas9 단백질은 DNA를 다시 절단할 수 있을 것이다. 대안적으로, 연구원은 또한 대체 수리 순서를 가진 표적 서열의 절단 사이트의 양쪽에 동종 서열을 포함하는 기증자 플라스미드를 포함할 수 있습니다 - 종종 형광 마커 단백질, 원래 유전자의 변형 된 버전, 또는 기타 수정 - 게놈에 복사 및 삽입 할 수 있습니다, 또는 "노크-인."
타이밍은 배아를 주입 할 때 중요하며, 특히 CRISPR / Cas9 게놈 편집을 사용하여 곤충의 돌연변이를 만들 때 특히 그렇습니다. 이는 Cas9 단백질과 gRNA가 배아가 동기화 상태에 있을 때만, 세포막이 형성되기 전에, 그리고 다중 핵이 배아 내에서 접근할 수 있을 때만 돌연변이를 생성하는 가장 큰 능력을 갖기 때문이다. 모기의 경우, 핵은 온도19에따라 oviposition 후 주변 ~ 2-4 시간 동안 도달하므로 성공적인 미세 주입이 이 시간 전에 발생해야합니다. 추가적으로, Cas9 단백질은 주입에서 유래된 개별이 세포의 모자이크를 포함할 것이라는 점을, 몇몇은 원하는 돌연변이를 가진, 그리고 그 외는 접근할 수 있는 어떤 핵 DNA든지 자를 것입니다. 이러한 돌연변이가 성공적으로 상속되기 위해서는 Cas9 단백질이 미래의 계란과 정자를 초래할 생식선에 있는 DNA를 잘라야합니다. 생식선에서 돌연변이가 생성되도록 하기 위해 곤충 생식선의 선조인 배아 내극 세포의 위치에 가까운 모든 물질을 주입하는 것이 가장 좋습니다. 극 세포는 Culex 배아20의후방 끝 근처에 위치한다. 배아를 주입하는 것 외에도 원하는 돌연변이를 감지하기 위해 자손을 횡단하고 선별하기 위한 신중한 계획을 개발하는 것이 필수적입니다.
이 프로토콜은 gRNA를 생성하고 주입 믹스를 준비하기 위해 Cas9 단백질로 복합하는 방법뿐만 아니라, 쿨렉스 피피엔스의 여성 모기가 계란을 낳는 방법과 CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집을 위해 그 계란을 준비하고 주입하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 원하는 돌연변이가 얻어졌다는 것을 확인하기 위하여 주입된 태아 및 그들의 자손을 후면, 교차 및 스크린하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 컬렉스 피피엔스의벅아이 균주에서 관심 있는 유전자, 사이클에대한 null 돌연변이를 생성했습니다. 이 균주는 원래 콜럼버스, 오하이오에서 필드 수집 모기에서 2013 년에 설립되었으며 Meuti 실험실에 의해 유지됩니다. 이 프로토콜은 쿨렉스 모기뿐만 아니라 다른 모기 종에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 요구하는 추가 연구에 사용될 수 있으며, 더 일반적으로 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 모든 곤충 종에 사용하는 것과 관련이 있습니다.
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Protocol
대부분의 연구 기관에서, 승인된 생물안전 프로토콜은 유전자 변형 된 유기체가 실험실 시설에서 탈출하거나 제거되지 않도록 트랜스 제닉 곤충이 생성되거나 유지되기 전에 제자리에 있어야합니다. 추가 정부 규정도 적용될 수 있습니다. 이러한 특성의 프로젝트를 시작하기 전에 모든 기관 정책과 절차를 확인하여 필요한 문서와 승인이 결정됩니다.
1. gRNA 설계 및 사출 믹스 준비
- 몇몇 gRNA가 그 외 보다는 더 잘 작동하기 때문에 각 표적 유전자를 위한 2-5 gRNA를 디자인합니다. 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 gRNA는 잘게 자르기와 같은 수동으로 설계되거나 무료 프로그램이 사용될 수 있다.
- 각 gRNA 주위에 100-200 bp 조각을 증폭할 수 있는 디자인 및 주문 프라이머. 이상적으로, 절단 사이트는 PCR 제품의 중간 3분의 1에서 절반에 위치해야 합니다. 컷의 각 사이트에 얼마나 많은 bp가 생성됩니다 유의하십시오.
- gRNA를 가져옵니다.
- 통합 DNA 기술, 피셔 과학, Genescript 등과 같은 상업 회사에서 gRNA를 구입하십시오. 이것은 가장 쉬운 옵션입니다.
- 또는 PCR 증폭을 사용하여 실험실에서 gRNA를 만들어 후속 합성을 위한 템플릿을 생성합니다. 포트 외21 및 Kistler 외22에의해 설명 된 프로토콜을 참조하십시오.
- 배아에 주입되는 플라스미드를 통해 gRNA를 제공합니다. 이 경우 gRNA는 U6 프로모터에 의해 구동되어야합니다 (자세한 내용은 23,24 참조).
- Cas9 단백질을 얻습니다.
- 피셔 사이언과학을 포함한 여러 회사에서 상업적으로 Cas9을 주문하십시오. 이것은 가장 쉬운 옵션입니다.
- 바스 외25 및 Kistler 외22에따라 실험실에서 Cas9 단백질을 만들고 정화한다.
- Cas9 mRNA를 배아에 주입하면 나중에 활성 Cas9 단백질로 변환됩니다. Cas9 mRNA는 시험관 내전사(22)를 사용하여 실험실에서 합성되거나 시그마와 같은 공급업체로부터 구입할 수 있다.
참고: 번역된 Cas9 단백질은 C-terminus에 핵 국소화 신호(NLS)를 포함해야 하므로 NLS도 주입된 Cas9 mRNA에 존재해야 합니다. - 플라스미드 계 발현을 통해 생체내에서 Cas9 단백질을 표현한다. 이 경우, 표적 종에서 잘 특징지어져 온 배아 프로모터에 의해 구동되는 플라스미드에 Cas9의 발현을 갖는 것이 가장 좋습니다.
참고: 현재까지 배아 프로모터는 컬렉스 모기의 특징이 잘 되지 않았기 때문에 정제된 단백질 또는 Cas9 mRNA를 주입하는 것이 좋습니다.
- 키슬러 외22에서적응한 Cas9 단백질을 가진 gRNA를 복합한다.
- gRNA를 함께 Cas9 단백질을 주입하는 경우(권장), Cas9 단백질의 최종 농도가 300 ng/μL이고 단일 gRNA의 최종 농도가 80 μg/μL입니다.
- 얼음에 20 분 동안 배양.
- 시험관 내 분석으로 gRNA를 테스트합니다(예: 가이드-it sgRNA 스크리닝 키트).
- PCR을 사용하여 각 gRNA에 대한 절단 부위 주위의 조각을 증폭시합니다.
- PCR 제품을 젤로 실행하여 올바른 크기인지 확인합니다. 그런 다음 PCR 제품을 정화하고 정확한 유전자 영역을 대상으로 하도록 순서를 지정합니다.
- 남은 정제 PCR 제품의 200 ng를 Cas9 반응 버퍼 1μL, BSA 1μL, 복합 Cas9:gRNA의 1.5 μL을 혼합하고 총 반응 부피를 15 μL. 인큐베이터로 37°C에서 5분 동안 가져옵니다.
- 젤에 제품을 다시 실행합니다. Cas9 단백질이 PCR 제품을 성공적으로 절단하면 기본 밴드가 더 희미하고 추가적인 더 작은 밴드가 있어야 합니다. 원래 PCR 제품의 크기 감소에 유의하고, 원하는 경우, 절단 효율을 근사화하기 위해 대역 강도의 감소를 계산합니다.
- 최종 사출 믹스 준비
- 표적 PCR 생성물을 성공적으로 절단한 각 gRNA에 대해, 최종 부피가 Cas9 단백질의 300 ng/μL및 각 gRNA의 80 ng/μL상태로 유지될 수 있도록 각 Cas9 및 gRNA의 양을 0.5mL 튜브로 혼합합니다.
- 복잡한 Cas9 및 gRNA를 주사에 필요할 때까지 -80°C에 저장합니다.
2. 바늘을 당기고 베를 링
참고 : 성공적인 주사와 배아의 생존은 날카로운 바늘을 필요로한다(그림 1).
- 1mm 외부 직경의 보로실리케이트 또는 석영 유리 미세 카세혈관을 사용하십시오. 당기기 전에 화학 연기 후드에 미세 모세 혈관을 실리콘화.
- 간단히 말해서, 3mL의 시그마호테를 유리 비커에 넣고 진공을 유리 미세 카세혈관을 포함하는 두 번째 비커에 적어도 4시간 동안 구비커를 넣고, 실리콘화 용액이 미세모세혈관의 모든 표면에 기화하고 정착할 수 있도록 한다.
- 그 후, 진공 챔버가 스톱콕 밸브를 점진적으로 열고 공기가 챔버로 돌아갈 수 있도록 하여 주변 압력과 균등화되도록 천천히 허용합니다. 바늘은 다음 당겨 질 준비가되어 있습니다.
- 사용 전에 바늘 풀러의 사용 설명서를 항상 읽으십시오.
참고: 아래 지침은 P-2000 레이저 바늘 풀러를 사용하여 유리 바늘을 당기는 방법을 자세히 설명합니다. 동일한 브랜드의 모든 바늘 풀러도 다른 단위에 걸쳐 정확히 동일한 바늘을 당겨 보정되지 않는 것이 중요합니다. 좋은 바늘을 얻기의 열쇠는 매개 변수의 주어진 세트에서 시작한 다음 위의 이러한 값 아래 매개 변수를 사용하여 바늘을 당기는 것입니다. 바늘이 배아를 얼마나 잘 관통하는지, 그리고 주사 혼합이 바늘에서 얼마나 잘 흐르는지 평가하여 이러한 각 매개 변수에서 바늘을 테스트합니다. 바늘이 열리거나 구부리기 쉽고, 배아를 부드럽게 관통하고 사출 혼합을 쉽게 전달하는 바늘이 얻을 때까지 매개 변수를 정제합니다.
- P-2000 레이저 바늘 풀러를 사용하여 바늘을 당기다
- 레이저 바늘 풀러를 켜고 레이저가 첫 번째 당기기 전에 15 분 동안 따뜻하게 할 수 있습니다.
- 유리 마이크로 모세관 튜브의 유형에 대한 기계를 프로그램 (바늘 풀러는 모든 풀러에 걸쳐 동일한 바늘을 생산하기 위해 보정되지 않기 때문에 어떤 바늘 풀러 매개 변수는 출발점기억):
석영: 열 = 730; 필 = 4; 벨 = 40; 델 = 122; 풀 = 156 - 바늘 풀러를 프로그래밍 한 후, 마이크로 모세관을로드하고 제자리에 고정, 단지 마이크로 모세관 튜브의 끝을 터치하고 레이저에 의해 가열 될 영역을주의.
- 마이크로 모세관을 클램핑 한 후 엄지와 집게 손가락을 손가락 막대에 놓고 스프링 을 눌러 풀 바를 한 번에 하나씩 놓습니다.
- 엄지와 집게 손가락을 짜서 바를 완전히 함께 당깁니다.
- 마이크로 모세관 관의 다른 면을 그 클램프에 배치하여 튜브의 작은 부분이 양쪽에서 확장됩니다. 클램프를 조여 두 클램프가 손가락이 꽉 막고 "풀 바"를 제자리에 단단히 고정시합니다.
- 풀러의 보호 덮개를 닫습니다.
- 풀 버튼을 누르면 레이저가 유리를 가열하기 시작하며, 덮개 아래에 있는 빨간색 "레이저 켜기" 라이트로 표시됩니다. 풀 막대가 완전히 분리되고 금속 소리가 함께 당겨지면 당겨가 완료됩니다.
- 덮개를 들어 올리기 전에 "레이저 켜기" 빛이 켜지지 않았는지 확인합니다.
- 엄지와 집게 손가락으로 클램프를 넘어 확장 마이크로 모세관 튜브의 작은 끝을 잡고 클램프를 느슨하게. 그런 다음 클램프에서 마이크로 모세관 튜브를 들어 올립니다.
- 집게를 사용하여 마이크로 모세관 튜브를 양면 테이프가 늘어선 사각형 페트리 접시에 조심스럽게 놓습니다. 바늘을 홀딩 박스에 넣을 때 바늘의 뒤쪽 끝이 먼저 닿고 바늘이 부드럽게 제자리에 내리고 날카로운 팁이 손상되지 않도록하십시오.
- PC-10/PC-100 바늘 풀러를 사용하여 바늘을 당기다
- 4개의 가중치를 사용하여 PC-10 풀러를 설정하고 단단계 풀기용 50.4°C의 온도를 설정합니다.
- 보로실리케이트 유리 마이크로카세필을 상단 클램프에 넣습니다. 그런 다음 가중 된 바닥 클램프를 위치로 올리고 미세 모세관의 바닥 부분을 고정시켜 모세관이 두 개의 좋은 바늘을 당길 위치에 있는지 확인합니다. 이것은 다소 긴 풀 주기, 하지만 그것은 beveling에 대 한 좋은 바늘을 생산.
- 바늘을 베벨링.
참고 : 젖은 베벨링의이 방법은 바늘의 상대 개방 크기에 대한 실시간 피드백을 제공합니다.- 연마판과 바늘 베벨러의 고정 고리를 조립합니다. 연마판의 회색 면이 상부및 하부 유지 링 사이에서 위쪽으로 향하도록 합니다. 고정 링의 나사를 조이고 나사에서 나사로 번갈아 가며 각 나사를 고르게 조여두십시오. 연마 플레이트 및 유지 링은 그라인딩 어셈블리라고 합니다.
- 13 방울(~ 520 μL)의 받침대 오일을 광학 평평한 표면에 놓고 분쇄 어셈블리를 플레이트 위에 놓습니다. 해부 현미경 아래에 어셈블리를 놓고 베벨러를 켭니다. 이 젖은 베벨링 방법과 함께 사용할 때 연마 판이 더 긴 기간 동안 회전 유지로, Sutter의 권장 사항에 비해 약간의 여분의 오일이 사용됩니다.
- 1% 포토 플로 용액을 연삭 표면에 추가하고 심지를 위치로 이동하여 Photo-Flo 솔루션에 침지되도록 합니다.
- 메인 소스에서 공기를 켭니다. 그런 다음 당겨보리케이트 바늘을 홀더에 넣고 고정 링을 조입니다. 레귤레이터에서 공기를 켜고 압력이 26 PSI에 도달 할 때까지 증가합니다.
- 옆에서 보고, 거의 Photo-Flo 액체 표면에 닿을 때까지 거친 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 낮춥다.
- 현미경을 조정하여 시야에서 바늘을 찾습니다. 가장 낮은 배율에서 시작하여 배율을 증가시면 됩니다. 포토 플로 액체의 표면에 닿을 때까지 거친 조정 노브를 사용하여 바늘의 위치를 신중하게 조정합니다.
- 거친 조정 노브를 사용하고 현미경 아래에서 계속 보고, 연마 표면에 가깝지만 만지지 않을 때까지 바늘을 낮춥니다.
- 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 주의 깊게 천천히 낮추고 바늘과 베블러의 연마 표면에 잎이 있는 그림자에 주의를 기울입니다. 바늘과 그림자가 연마 표면을 만질 것 같은 것처럼 보일 때, 바늘을 더욱 느리고 신중하게 계속 낮춥니다.
- 바늘을 연마 표면으로 낮추고 들어 올려 "bevel"을 시키는 것 사이에서 번갈아 가며. 바늘을 들어 올리기 전에 미세 조정 노브의 마이크로미터에 있는 설정을 신속하게 주의하여 바늘을 동일한 위치로 낮추거나 필요한 경우 약간 낮은 위치로 낮출 수 있습니다. 포토 플로 액체 층 아래에 바늘을 유지하는 것을 기억하십시오. 바늘이 연마 표면 위로 올라오면 재빨리 멈추고 베블러의 회전을 다시 시작하여 거품을 확인하십시오. 바늘이 적절하게 변해지면 기포가 바늘에서 포토 플로로 흘러 들어와야 합니다. 플레이트가 중지되지 않으면 바늘 개구부가 너무 커질 때까지 거품이 보이지 않을 수 있습니다.
- 바늘이 연마 표면 위에 올려지고 베블러가 멈출 때 거품이 나타나지 않으면, 베벨링 절차를 반복하고, 미세 조정 손잡이에 있는 마이크로미터에 약간 낮은 위치로 바늘을 낮추고, 바늘을 들어 올리고, 베블러 플레이트를 멈추고 기포를 확인한다. 작지만 꾸준한 거품 스트림이 나타날 때까지 반복합니다.
- 기포가 나타나면, 연마판을 멈추고 공기 압력을 낮추어 상대개방 크기를 확인하여, 기포 형성이 멈추는 PSI를 지적하는 것은 베브레드 바늘의 개구부 크기의 상대적인 표시이기 때문이다. 공기가 바늘 끝에서 탈출을 멈추는 압력이 낮을수록 바늘이 개구부가 커집니다. 바늘은 18-20 PSI에서 바늘에서 거품이 탈출하는 것을 멈추는 점에 veveled 바늘이 상대적으로 작은 개구부를 가지고 있고 미세 주입에 사용될 때 태아에 최소한의 손상을 야기해야 한다는 것을 나타냅니다.
- 바늘 개구부를 확인한 후, 액체가 바늘로 유입되는 것을 방지하기 위해 기압을 26 PSI로 늘립니다. 그런 다음 거친 조정 노브를 사용하여 포토 플로 층에서 바늘을 위아래로 올립니다. 공기가 바늘에서 흐르는 한 Photo-Flo는 바늘에 들어가지 않으므로 바늘 내부가 오염으로부터 보호된다는 점에 유의해야합니다.
- 바늘이 Photo-Flo에서 꺼지면 공기를 끄고 바늘 홀더에서 바늘을 제거하십시오.
- 집게를 사용하여 새로 베들린 바늘을 양면 테이프또는 모델링 점토가 있는 페트리 접시에 넣고 제자리에 유지합니다. 10-20 개의 베브 바늘이 생성 될 때까지 과정을 반복하십시오.
3. 모기의 부모 세대를 혈액 공급
- 25-27°C에서 25-27°C에서 모호한 긴 하루 조건(>13h의 빛/일)에 따라 모기의 후방 애벌레가 모기가 겨울이 지나간 휴면또는 투아경에 들어가지 않도록 합니다.
- 성인이 성수기 출현 후 7~10일 후에는 난방 장치를 전원 공급 장치에 연결하여 헤모텍 멤브레인 급유 시스템을 준비합니다. 각 유닛의 온도를 37°C(인체 내부 체온) 또는 41°C(닭 내부 체온)로 조정하여 장치의 상단에 조정 나사를 사용한다. 전기 온도계를 사용하여 올바른 온도에 도달했는지 확인합니다.
- 먹이를 주기 위해 혈액 식사 저수지를 준비하십시오.
- 각 혈액 공급 실린더에 대한 파라필름 의 사각형을 잘라, 맨발에 파라필름을 문질러. 이것은 모기에게 매력적인 향기를 제공합니다.
- 파라필름을 가능한 한 얇게 펴고 식사 저장소 주위에 가장자리를 단단히 감쌉니다. 원하는 경우 고무 O 링으로 제자리에 고정하십시오.
- 약 200 μL의 0.1 M ATP 용액을 신선하거나 해동된 통, 구연산 나트륨 처리 닭혈의 15mL에 추가합니다. ATP는 혈액 공급을 자극하는 데 도움이되며, 구연산나트륨은 혈액이 응고하는 것을 방지합니다.
- 파라필름 측이 아래로 향하도록 저수지를 잡고, 조심스럽게 저수지를 채우기 위해 일회용 파이펫을 사용합니다. 각 저수지는 ~ 3mL의 혈액을 보유하고 있습니다. 충전 포트에 플라스틱 플러그를 밀봉합니다.
- 식사 저장소를 가열 장치로 나사로 넣고 파라필름 측이 아래로 향하고 모기가 메쉬를 통해 공급될 수 있도록 모기 케이지 위에 놓습니다.
- 검은 쓰레기 봉투로 케이지를 덮고 CO2 농도가 증가하여 혈액 공급을 자극할 때 각 케이지에 적극적으로 불어 넣습니다.
- 피의 공급을 최대화하기 위해 2-8 시간 동안 케이지에 피더를 보관하십시오. 주기적으로 확인하고 혈액 식사를 한 여성의 비율을 주의하십시오 (빨간색과 비하 복부에 의해 분명).
4. 성인 모기에 계란 누워 유도
- 혈액 공급 후 4~5일 후에 모기 배란을 위해 50mL 원원관을 준비합니다.
- 원문 관 의 바닥 근처에 ~ 20mm 구멍을 만듭니다.
- 두 사각형 (35mm2)치과 댐 고무의 구멍을 커버, 수평 슬릿과 다른 수직 슬릿하나. 테이프를 사용하여 치과 댐의 사각형을 원물 튜브에 부착하십시오.
- 4.25cm의 필터 용지를 35mm x 10mm 페트리 접시에 놓고 750 μL의 증류수로 필터 용지를 적시습니다.
- 원추형 튜브를 필터 용지에 반전시키고 몇 번 앞뒤로 비틀어 안전한지 확인합니다.
- 입 흡인기를 사용하여 케이지에서 X10 암컷의 피피엔스를 조심스럽게 제거하고 준비된 원문 튜브로 옮기십시오.
- 원추형 관 위에 불투명 한 실린더를 놓고 모기에게 어둠을 제공하여 계란 을 낳는 것을 자극하고 20-25 분 기다립니다.
5. 갓 낳은 컬렉스 달걀을 마이크로 조작
- 미세 주입을 위해 모기 배아를 부착하기 위한 슬라이드를 준비합니다.
- 커버 글래스의 너비에 양면 테이프 조각을 부착합니다.
- 투명 의료 드레싱의 얇은 스트립 (예를 들어, Tegaderm, 2-3 mm 폭) 양면 테이프에 부착하여 커버 유리의 짧은 끝에 평행하게 실행하고 커버 유리의 끝에서 약 5mm 를 배치합니다.
- 날카로운 면도날로 과도한 양면 테이프를 제거하고 커버 글래스의 각 끝에서 2-3mm의 의료 드레싱과 양면 테이프를 제거합니다. 이를 통해 계란이 커버 글래스에 장착된 후 오일 층이 슬라이드에 남아 있을 수 있습니다.
- 왁스 연필을 사용하여 양면 테이프와 의료 드레싱 스트립 주위에 "D" 모양을 그립니다. 이것은 주입 후에 계란 의 주위에 물을 붙잡기 위하여 장벽으로 작동할 것입니다.
- 슬라이드가 준비되고 20-25 분 경과 한 후 불투명한 튜브를 제거하고 모기가 알을 낳았는지 여부를 결정합니다.
- 그렇지 않은 경우 5-10 분 동안 덮습니다.
- 모기가 알을 낳은 경우, 신중하지만 신속하게 원식 튜브를 들어 올리고 뚜껑으로 덮습니다. 모기를 별도의 케이지에 놓고 스프레드시트에 계란을 수집한 시간을 기록합니다. 그런 다음 달걀 뗏목을 포함하는 필터 용지에 DI 물의 50-100 μL을 추가합니다.
- 해부 현미경에서 계란을 정렬합니다.
- 24mm x 40mm 커버 글래스 아래에 필터 용지(10mm x 30mm 직사각형이 빠른 유량으로 잘라내기)를 24mm x 40mm 커버 글래스 아래에 배치하여 커버 글래스가 필터 용지의 왼쪽 의 50-60%를 커버합니다.
- DI 물의 50 μL로 필터 용지를 적시다. 물은 덮개 유리 아래에 천천히 퍼져 미세 조작 중에 필터 용지와 계란을 젖은 상태로 유지하는 저수지를 만듭니다. 반월 상 연골은 정확한 양의 물이 적용될 때 커버 유리와 필터 용지 사이에 형성됩니다.
- 알래프트에서 미세한 페인트 브러시를 사용하여 분리하고, 배아의 좁고 후방 끝이 커버 글래스(왼쪽)를 만지고 앞쪽 끝이 오른쪽에 닿도록 배치합니다.
- 계란을 20분 간 정렬하여 유백색에서 매우 밝은 회색으로 색상이 바뀌는 것을 주의 깊게 관찰합니다. 커버 글래스 아래의 물 필름을 정기적으로 검사하여 적절한 양의 물이 있는지 확인합니다. 계란이 건조되는 것처럼 보이면 필터 용지에 소량의 DI 물 (20-30 μL)을 추가하십시오.
- 20분 후 남은 계란을 모두 버리십시오.
- 계란을 미세 주입 슬라이드로 옮기습니다.
- 작은(10mm x 30mm) 의 거친 필터 용지를 사용하여 포화 필터 용지의 측면에서 물을 심고 집게로 위킹 필터 용지를 제거합니다. 계란이 있는 필터 용지가 가능한 한 건조하도록 2-3회 반복하십시오.
- 필터 용지의 신선하고 건조한 사각형을 놓고 한 쌍의 집게로 제자리에 놓습니다. 조심스럽게 왼쪽에 커버 유리를 당겨, 멀리 정렬 된 계란에서.
- 정렬된 계란을 포함하는 작은 필터 종이를 방해하지 않고 무대에서 여분의 물을 건조. 젖은 필터 용지를 여러 번 더 건조시키고 엄지 손가락 및 / 또는 집게가있는 필터 용지의 작은 사각형을 눌러 주사 슬라이드로 옮기기 전에 계란이 가능한 한 건조하도록하십시오.
- 집게를 사용하여 마운팅 슬라이드에서 의료 드레싱 스트립에서 백백된 용지를 제거합니다.
- 엄지와 가운데 손가락으로 마운팅 슬라이드를 잡고 노출된 의료 드레싱은 아래를 향하고, 정렬된 계란의 라인에 45° 각도로 낮춥습니다. 계란의 넓고 앞쪽 끝이 의료 드레싱의 끝에서 약간 매달려 있는 것처럼 슬라이드를 배치하여 컬렉스 애벌레가 장착된 계란에서 성공적으로 부화하는 능력을 향상시킵니다.
- 커버 글래스의 밑면에 검지 손가락을 누르면 엄지손가락과 가운데 손가락 사이에 덮개 유리를 계속 유지하면서 모든 정렬 된 계란이 의료 드레싱에 단단히 부착되도록합니다.
- 계란이 위로 향하고 있도록 즉시 커버 유리를 반전하고, 알에 오일 할로카본 오일 (2-3 방울; ~20 μL)의 얇은 층을 적용합니다. 이것은 미세 주입 도중 계란건조에서 계란을 방지합니다. 의료 드레싱에 부착되지 않았거나 오일로 덮여 있지 않은 계란을 제거하십시오.
- 유리 커버에 장착 된 계란을 사각형 페트리 접시 내부로 향하게 하고 마이크로 주입을위한 대형 젖은 필터 용지사각형을 놓습니다.
6. 컬렉스 배아 주입
- 주사 혼합물로 주사 바늘을 다시 채우는
- 선택한 주사 바늘의 백 엔드에 쉽게 맞는 바늘 필러 또는 젤 로딩 팁을 선택하고 바늘 필러의 끝과 주입 바늘 사이의 약간의 공간이 있습니다.
- 바늘 필러를 사용하여 바늘을 다시 채우기 위해 주사 바늘에 단일 및 소량의 주입 믹스 (~0.5-1 μL)를 조심스럽게 배치하십시오. 주사 바늘이 테이퍼되기 시작하는 곳 근처에 주사 믹스의 방울을 놓습니다.
- 주입 바늘을 마이크로 인젝터에 부착합니다.
- 배아를 포함하는 슬라이드를 현미경의 단계에 놓습니다.
- 바늘 열기
참고: beveled 바늘을 사용하는 경우, 이것은 필요하지 않습니다.- ~30 PSI의 시작 사출 압력을 사용하고 적절한 양의 사출 믹스를 제공하기 위해 필요에 따라 조정하십시오.
- 해부 현미경하에서, 태아 위에 바늘을 배치하고, 조심스럽게 미세 조작기를 사용하여 바늘을 배아에 낮춥다. 바늘이 태아를 거의 만지지 않는 후에, 빨리 바늘의 긴 축에 수직으로 배아를 이동합니다.
- 바늘이 성공적으로 열렸는지 확인하려면 주입 트리거를 누르고 바늘에서 거품 / 주입 혼합이 빠져 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 바늘이 열릴 때까지 바늘에 대해 배아를 이동시키고 트리거를 누르면 주사 믹스가 빠져나간다.
- 배아 주입
- 현미경의 시야 중앙에 첫 번째 배아를 배치하고 초점에 있는지 확인합니다.
- 첫 번째 계란 위에 바늘을 놓고 현미경 내의 시야 의 중심 내에서도 놓습니다.
- 현미경의 배율을 점진적으로 증가시키고, 바늘을 조심스럽게 낮추고 첫 번째 배아 바로 위에 유지하며 중심적이고 집중합니다. 현미경이 가장 높은 배율에 도달하고 태아와 바늘이 모두 초점을 맞출 때까지 진행하십시오.
- 조심스럽게 왼쪽에 약간 단계에 배아를 이동하고 바늘과 배아가 보기의 동일한 평면에 지금 있도록 약간 바늘을 낮춥니다.
- 현미경 단계를 사용하여 배아를 움직여 조심스럽게 조심스럽게 바늘 끝까지 배아를 가볍게 만지십시오. 배아의 좁고 후방 끝은 약간 편향되어야 합니다. 너무 높거나 너무 낮은 경우 바늘의 높이를 조정합니다.
- 현미경 단계를 사용하여, 태아의 후방 끝을 바늘로 이동하고 모기 계란의 초리온을 관통하는 바늘을 관찰한다. 바늘은 컬렉스 배아 내극 세포의 대략적인 위치에 있는 막에 다만 침투해야 합니다. 일단 이것이 생기면, 태아로 주사 혼합을 쏠 주사 트리거를 1-3 번 당깁니다. 소량의 주사 믹스를 전달하여 배아 플라스롬의 작은 클리어링을 감지할 수 있을 만큼 충분히 전달합니다.
- 스테이지를 사용하여 배아를 오른쪽으로 움직여 바늘 끝을 멀리 하고 벗어나보도록 합니다. 주사가 잘 되면 배아에서 거의 또는 전혀 액체가 누출되지 않아야합니다.
- 라인의 다음 배아가 바늘 앞에 위치되도록 스테이지를 아래로 이동합니다. 그런 다음 다시 스테이지를 왼쪽으로 이동하여 배아를 주사 바늘에 배치하고 주입 트리거를 당깁니다.
- 주사 혼합물이 나오지 않는 경우 및 /또는 바늘이 제거 된 후 배아에서 많은 양의 유체가 탈출하면 주사 바늘을 교체하고 다시 시작합니다.
- 주입되지 않거나 손상된 알을 파괴하십시오.
- 주사 후 배아를 돌보는 방법
- 슬라이드에 있는 모든 배아를 주입한 후에, 물줄기 병으로 역 삼투압수를 적용하여 할로탄소 오일을 씻어내고, 물의 흐름이 주입된 배아 위의 유리 덮개 슬립의 상단에 향하고 물이 덮개 슬립 아래로 흘러 배아 위로 흘러 오일을 헹구도록 합니다. 이 손상 또는 의료 드레싱에서 그들을 분리 할 수 있기 때문에 배아에 직접 물 스트림을 지시하지 않도록해야합니다. 이 공정은 할로탄소 오일의 대부분을 제거하지만 전부는 아닙니다.
- 150 μL의 DI 물로 슬라이드를 덮습니다.
- 각지 페트리 접시 안쪽에 주입된 배아를 젖은 필터 용지에 놓습니다.
- 25-27°C로 설정된 환경 챔버에 주입된 배아를 함유한 페트리 접시를 긴 하루 동안 70-80% RH(>13h light/day)로 설정합니다.
7. 주입된 배아(F0)를성인기에 사육하고 십자가를 설정합니다.
- 매일 주입 된 배아의 슬라이드를 검사하여 1st instar 애벌레가 주입 후 1.5 일 후에 나타나야한다고 기대합니다.
- 1st 인스타 애벌레의 수를 계산하고, 디워터 450mL, 지상 생선 사료 50 mg의 신발 상자 크기의 Tupperware 용기에 100-200 애벌레를 놓습니다. 이 때, 주입된 모기와 교차하는 데 사용될 야생형 또는 주입되지 않은 애벌레를 함유한 1-5배 더 많은 용기를 만듭니다.
- 애벌레를 매일 먹이고, 애벌레 생활의 6일째에 300-500 mg에 도달할 때까지 매일 받는 음식의 양을 약간 증가시면 됩니다.
- pupae가 나타나면, 1개의 푸파를 DI 물로 가득 찬 2mL 마이크로 센심분리기 튜브에 1개의 푸파를 넣습니다. 모든 강아지에 대 한 반복, 배아로 주입 된 강아지 뿐만 아니라 주입 되지 않은, 야생 형 pupae. 뚜껑을 조심스럽게 눌러 모기가 탈출하는 것을 방지하지만 여전히 소량의 가스 교환을 허용합니다.
- 성인 모기가 마이크로 원심 분리관 내부에 나타나면 주입 된 여성 모기를 처녀 야생 형 남성 모기가 들어있는 케이지에 방출하여 주입 된 모든 여성에게 적어도 1 야생 형 남성의 비율을 달성하십시오. 마찬가지로, 처녀 야생 형 암컷을 포함하는 케이지에 남성 모기를 주입하여 모든 주입 된 남성에 대해 약 5-10 처녀 야생 형 암컷의 비율을 달성합니다. 각 남성 모기가 여러 번 짝짓기 할 수 있기 때문에 주사된 남성에 대한 야생 형 여성의 비율이 더 높습니다. 따라서, 주입된 수컷과 짝짓기하는 야생형 암컷의 수가 더 많면 생성될 수 있는 F1 자손의 수가 증가한다.
8. F1 모기를 획득하고 사육하고 돌연변이를 검사합니다.
- 성인 출현 후 7~10일, 위에서 설명한 대로 각 케이지의 여성에게 혈액 식사를 제공합니다(3단계).
- 피를 먹이고 나흘 후, 각 케이지에 물을 넣습니다. 각 달걀 뗏목은 단일 여성 모기의 자손이므로 oviposition 직후 자체 플라스틱 신발 상자 크기의 양육 용기에 배치해야합니다. 각 용기에 고유한 식별자로 라벨을 부착하고, 또한 유충이 관심 유전자에 대한 F1 세대에 속한다는 것을 나타내며, 남성 또는 여성 부모가 주입되었는지 여부, 팬이 설정된 날짜, 사육 조건 및 실험자의 이니셜을 나타낸다.
- 매일 애벌레의 팬을 모니터링합니다. 프라이팬에 애벌레가 부화하자마자 50 mg의 지상 생선 음식을 제공합니다. 위에서 설명한 대로 매일 6일 동안 음식을 늘립니다(7.3단계).
- 개별 푸파를 DI 물의 1-1.5mL 사이에 함유된 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 각 튜브에 라벨을 부착하고 뚜껑을 균열시합니다.
- 성인 모기가 나타나면 2mL 마이크로센심분리기 튜브를 조심스럽게 열고 검지 손가락으로 덮고 다른 손으로는 마이크로 센심분리기 튜브 위에 3개의 드램 유리 유리 유리를 놓습니다. 모기의 자연적인 본능은 유리 바이알에 날아 가야한다. 일단 이런 일이 발생하면 유리 유리병의 개구부 위에 손가락을 밀어 넣고 빠르게 반전하여 10 % 자당 용액으로 약간 젖은 작은 면공을 유리병 의 상단에 놓습니다. 이것은 모기가 탈출하는 것을 방지하고 필요한 음식과 물 원을 제공합니다.
- 푸팔 엑외비아를 포함하는 튜브와 성인 모기가 함유된 유리 유리 병은 모두 라벨을 부착하여 유래한 애벌레 팬, 모기의 성별 및 해당 개인을 위한 고유 식별자를 나타냅니다. 예: "II"가 남성 부모가 주입된 것을 나타내는 II.C.M32, "C"는 개인이 유래한 팬/달걀 뗏목을 나타내고, "M32"는 그 애벌레 사육 용기에서 나오는 32번째 남성이었다.
- 개별 유리 바이알 내에 성인 모기를 다시 환경 챔버에 넣고 매일 면에 10 % 자당 용액의 소량 (~20 μL)을 추가하십시오. 모기가 자당 용액에 갇히고 죽을 것이기 때문에 면에 과잉 공급하거나 포화시키지 않도록하십시오.
- 원하는 돌연변이를 위한 모기 검열
- 제조업체의 지시에 따라 Phire Direct PCR 키트를 사용하여 애벌레의 각 달걀 뗏목 /팬에서 5-10 pupal 엑설비아에서 유전체 DNA를 추출할 뿐만 아니라 대조군역할을 할 1-2 야생 형 개인.
참고: 각 뗏목의 자손이 완전한 형제자매일 가능성이 있기 때문에 각 팬에서 5-10 개의 애벌레를 선별하면 돌연변이가 자손에게 전달되었는지 여부를 결정합니다. 한 팬에서 선별 된 애벌레중 어느 것도 원하는 돌연변이가없는 경우 추가 성인을 선별하지 마십시오. 애벌레 중 일부가 돌연변이가있는 경우, 그 팬의 모든 개인은 가려야합니다. - 이전에 설계된 PCR 프라이머(1.2단계)를 사용하여, 야생형과 F1 자손 모두에서 Phire PCR 키트를 사용하여 돌연변이의 예측 된 위치 주위의 조각을 증폭시키고 3-4 % 아가로즈 젤에서 PCR 조각을 실행하여 눈에 보이는 삽입 또는 삭제 (indels)가 있는지 확인합니다.
참고: 원하는 돌연변이가 있는 모든 개인은 이종수구이며 2개의 대역, 1개의 야생형 및 원하는 위치에서 약간 더 짧거나 더 길게 표시되어야 합니다. 이를 구별하려면 야생 유형 개인의 밴드의 위치와 두께를 F1 자손의 밴드에 있는 밴드와 비교합니다. 이상적으로 2 개의 개별 밴드가 표시되지만 인델이 매우 작으면 밴드가 더 넓거나 흐릿해 보일 수 있습니다. - 의심되는 인델 (권장)을 포함하는 밴드를 절제하거나 젤에 로드되지 않은 나머지 PCR 제품을 정화하여 PCR 제품을 정화하십시오. 원하는 돌연변이가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 시퀀싱을 위해 정제 된 PCR을 제출하십시오.
- 제조업체의 지시에 따라 Phire Direct PCR 키트를 사용하여 애벌레의 각 달걀 뗏목 /팬에서 5-10 pupal 엑설비아에서 유전체 DNA를 추출할 뿐만 아니라 대조군역할을 할 1-2 야생 형 개인.
9. F2 와 F3 모기를 획득하고 사육하고 돌연변이를 검사합니다.
- 원하는 돌연변이가 개별 유리 바이알에서 푸팔 엑설비아를 검사하고 이성의 야생 형, 주입되지 않은 모기를 포함하는 케이지로 발견 된 모든 F1 성인 모기를 방출하십시오. 이 2 대에 대 한 백크로그널 주사와 근친 교배의 모든 해로운 효과 제거 해야 합니다.
- 혈액은 돌연변이 F1 모기의 케이지와 이전에 설명된 대로 그들의 야생 형 대응을 공급합니다. 4~5일 후, 그 결과 F2 달걀 뗏목을 수집합니다.
- 위에서 설명한 대로 F2 애벌레를 라벨과 리어로 표시하여 각 달걀 뗏목을 별도의 라벨이 붙은 용기에 넣습니다. 강아지가 되면 개별 푸파를 개별 2mL 미세 원심 분리 튜브로 다시 분리하고, 각 성인을 자당에 흠뻑 젖은 면으로 덮인 별도의 유리 바이알로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 각F2 개인의 pupal 엑설비아를 앞에서 설명한 바와 같이 원하는 돌연변이를 선별한다(단계 8.5-8.8).
참고: 여기에 원하는 돌연변이를 가진 모든 개별은 이종수구가 될 것이고, 따라서 PCR 제품은 3-4% 아가로즈 젤에서 실행될 때 이상적으로 2개의 별개의 밴드를 생성해야 합니다. - 돌연변이 F2 애벌레가 확인되면, 짝짓기 위해 같은 케이지에 돌연변이가있는 모든 남성과 여성을 배치합니다. 성인 출현 후 7-10 일, 그리고 4-5 일 후, F3 달걀 뗏목을 수집 합니다.
- 각 F3 달걀 뗏목을 별도의 애벌레 사육 용기에 넣고 위에서 설명한 대로 라벨과 사료를 넣습니다.
- F3 푸파를 개별 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 분리합니다. 성인이 나타나면 10 % 자당에 젖은 면으로 덮인 개별 유리 바이알로 옮겨 넣습니다. 앞서 설명한 대로 푸팔 엑설비아를 화면으로 검사합니다. 이번에는 각 팬의 자손의 약 25%가 null 돌연변이에 대해 동종자여야 합니다. 이 개별을 단일 케이지에 넣고, 모기의 새로 생성된 돌연변이 라인을 만들고 유지하기 위하여 그(것)들을 이용하십시오.
참고: 동종수 모기의 수가 적으면, 이테로지구우스F3 남성과 암컷은 F4 세대에 추가 적인 동질-null 모기를 생성하기 위하여 서로 교차될 수 있습니다.
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Representative Results
설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 Cx. pipiens의배아를 주입할 수 있었고, 주입된 태아 중 생존율이 높은 것을 관찰하였다(~55%, 도 1). 이전 시험은 달걀 여포의 전방이 의학 드레싱 스트립에 부착되었기 때문에 생존의 비율이 낮았으며, 모기 유충이 초리온에서 탈출하고 성공적으로 물로 수영하는 것을 막았습니다. 전방 끝이 의료 드레싱의 스트립을 넘어 크게 증가 애벌레 생존을 보장하고, 성인기및 재생(그림 2B)에개발 할 수있는 고품질자에서 초래한다.
후속 실험 및 스크리닝은 circadian 클럭 유전자주기(cyc;)에대한 null 돌연변이를 나타낸다. KM355981)은 주입된 배아의 세균선으로만들었다(도 3). 우리의 프라이머가 절단 부위 근처의 낭성 유전자의 큰 영역을 증폭시켰다는 점을 감안할 때, 이종화구, F1 모기에서 두 개의 분리된 밴드를 관찰하기가 어려웠습니다. 이는 절단 부위 주변에 ~100-200 bp인 조각을 증폭시키는 프라이머를 설계하는 유틸리티와 의심되는 모든 돌연변이 모기를 시퀀싱하는 것의 중요성을 보여줍니다. 시퀀싱은 선별된 모기의 약 10%가 우리가 설계한 첫 번째 가이드 RNA의 Cas9 절단 부위 근처에서 작은 삽입 또는 삭제를 보였다는 것을 밝혔습니다(그림3),이것은 매우 효과적인 gRNA이고 미세 주입 도중 극 세포를 성공적으로 표적으로 했다는 것을 시사합니다. F1 개인 성공적으로 교제 하 고 실행 가능한 자손을 생산 (F2 세대), 일부는 또한 돌연변이를 포함.
그림 1: 베벨보리케이트 바늘의 예. 이 바늘은 실리콘 보로실리케이트 마이크로카세필레 튜브에서 제조되었고, PC-10 수직 바늘 풀러를 사용하여 끌어당긴 다음 BV-10 Beveller에 베브레드를 사용했습니다. 바늘은 ~ 63배 배율 하에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: F0 세대의 생존은 그들의 발전을 통해. (A)주입된 배아를 포함하는 3개의 슬라이드에서 부화한1st 인스타 애벌레의 이미지. (B)각 생활 단계에서 개인의 수의 그래픽 표현. 주입된 801개의 배아 중 44111마리의 성애가 부화되었고, 이들 149명 중 149명이 새끼를 낳았고, 그 결과 총 121명의 성인(남성 73명, 암컷 43명)이 새끼를 낳았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 원하는 돌연변이의 전염을 보여주는 대표적인 결과. 상위 2개의 서열은 컬렉스 퀸케파스카이투스에서 사이클 유전자의 서열을 나타낸다(Cx.quinq; XP_001865023.1) 및 Cx. pipiens (WT의 야생 유형 여성) F; KM355981). 아래 시퀀스는 세 남성 F1 자손의 시퀀스를 나타냅니다 (I.DM1; II.JM4; II.K10M). 녹색 상자는 Cas9 단백질 (CGG)에 의해 인식된 PAM 서열을 나타내고 녹색 화살표는 Cas9 단백질이 게놈 DNA를 갈라진 위치를 나타냅니다. 이러한 결과는 2 또는 4 뉴클레오티드의 짧은 삭제가 F1 남성에서 상속되었다는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 Culex 모기의 게놈으로 특정 돌연변이를 소개하는 방법을 제시하고 또한 그밖 모기의 게놈을 편집하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주입 물질을 준비하는 방법뿐만 아니라 모기가 계란을 낳도록 유도하는 방법과 그 계란을 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 비디오 개요를 제공한다는 점에서 중요합니다. 우리는 또한 개별 뗏목에 계란을 낳고 따라서 원하는 돌연변이를 위해 각 여성에서 자손의 작은 비율을 가리기 위하여 여성 Cx. pipiens의 생물학을 이용하는 방법의 요약합니다. 여기에 제시된 방법은 Cx. pipiens에 최적화되었지만, 다른 모기 또는 곤충의 게놈을 편집하기 위하여, 작은 조정으로, 적응될 수 있습니다. 추가적으로, 여기에서 기술된 미세 조작 및 미세 주입 프로토콜은 탈렌스 또는 아연 핑거 뉴클레아제와 같은 트랜스포슨, dsRNA 또는 그밖 엔도니슬리스를 포함하여 곤충 배아에 몇몇 다른 물질을 주입하는 것이 가능합니다. 더욱이, 베벨링 프로토콜은 가변 개방 크기로 미세 주입 바늘을 생성하므로 다양한 주입 물질을 주입하는 데 사용할 수있는 바늘을 생성합니다. 바늘의 개방된 크기는 바늘이 베약된 후 공기의 압력을 서서히 감소시키고 새로 열린 바늘끝에서 공기의 거품이 흐르는 압력을 지적함으로써 추론될 수 있다. 기포를 생성하는 데 필요한 공기 압력이 적다는 것은 바늘이 개구부 크기가 더 크다는 것을 나타내며, 반대로 공기 압력이 높을수록 바늘이 개구부 크기가 더 작다는 것을 나타냅니다. 개구부 크기가 큰 바늘은 더 큰 입자와 더 점성 물질을 주입하는 것이 좋지만 배아에 더 큰 손상을 입히고 따라서 생존을 줄일 수 있습니다.
미세 주입 실험은 여러 면에서 시계에 대한 경쟁입니다. 첫째, 초리온이 경화되고 blastoderm 형성이 발생하기 전에, oviposition의 처음 2 시간 안에 개별 적인 태아를 주입해야 합니다. 따라서 모기가 oviposition 챔버에 처음 배치되었을 때, 주사를 위해 계란을 조작하는 데 걸리는 시간 (20-30 분 이상 권장), 모든 배아를 주입하는 데 걸리는 시간을 주의해야합니다. Cx. pipiens는 그들의 주변에 아주 과민하고 모기는 일반적으로 개별 유리 유리 유리 병에서 3-5 일 동안 만 살아남기 때문에 돌연변이를 위한 성인 모기를 검열할 때 시간도 제한됩니다. 따라서 가능한 한 빨리 모기 푸팔 엑설비아를 검사하는 것이 필수적입니다. 대안적으로, 하나는 또한 단일 모기다리14에서게놈 DNA를 추출할 수 있었다 14. 그러나 모기는 먼저 얼음에 마취되어야 합니다. 우리는 차가운 치료와 사지의 손실이 모기 생존과 실행 가능한 계란을 짝짓고 낳는 능력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 지쳐 있었기 때문에, 우리는 대신 돌연변이에 대한 버려진 pupal exuvia를 선별하기로 결정했습니다. exuvia 내의 gDNA 수준은 모기 다리 안쪽에 있는 보다는 확률이 낮습니다, 이것은 pupal 단계에서 모기를 분리하는 추가 노력과 시간을 추가합니다, 그러나 또한 모든 성인이 그들의 적당한 새장에 풀어 놓일 때 짝을 지키지 않도록 합니다, 절대적으로 중요합니다. 우리는 결과가 가치가 있다고 생각하지만, 다리를 제거하는 것이 실험적 요구에 대한 더 나은 행동 과정이 될 수 있는지 다른 사람들에게 고려하도록 격려합니다.
돌연변이에 대한 검열을 신속히 하는 가장 좋은 방법은 절단 부위의 양쪽에 상동성 서열에 의해 측면형 단백질과 같은 유전 마커를 포함하는 플라스미드를 주입하는 것입니다. 상동성 지향 수리 (HDR)를 사용하여 노크 돌연변이의 비율은 일반적으로 비 동형 최종 결합 (NHEJ), 녹아웃 돌연변이 (HDR = 0.71 %보다 낮다; NHEJ=24.87%; 22).따라서 마커의 삽입은 훨씬 낮은 주파수로 발생할 가능성이 높지만, 형광 현미경으로 모기 유충을 신속하게 검사할 수 있게 함으로써 제공되는 시간 절감은 프로젝트에 따라 위험할 만한 가치가 있을 수 있다. 또한, HDR 및 노크인 돌연변이의 비율은 또한 잘 특징적인 배아 양성기구에 의해 구동되는 Cas9 단백질의 유전 서열을 포함하는 플라스미드를 주입할 때 향상되고, U6프로모터(24,26)에의해 구동되는 gRNA. 이것은 태아 발달초기에, 핵이 급속하게 분할될 때 (세포 주기의 S 단계), 오류 경향이 있지만 편법 NHEJ 기계장치가 이중 좌초 된 휴식을 복구하는 바람직한 방법인 것으로 보인다기 때문에 (검토18). 그러나, 배아발생이 진행됨에 따라 세포 기계는 이중 좌초 된 휴식 (늦은 S 단계 및 G2 상)을 복구하기 위해 보다 정확한 HDR 메커니즘을 사용하기 위해 준비된다. 배아 발달 초기에 Cas9 서열을 포함하는 플라스미드를 주입하면 Cas9 단백질이 대부분의 표적 세포에 도달할 수 있으며, 배아가 여전히 동기화 상태이고 세포막이 형성되기 전에 약간의 지연이 발생하지만 Cas9 단백질을 전사하고 번역하는 데 필요한 약간의 지연은 개발 중인 배아가 유전자를 정확하게 사용하여 유전자를 정확하게 복구할 가능성이 더 높은 시기에 활성화될 가능성을 높이는 것으로 보인다. 예를 들어, Lin et al.27은 gRNA로 복합된 Cas9 단백질이 세포 주기의 M 단계에서 체포된 인간 세포주에서 주입되었을 때 HDR의 비율이 ~33%로 향상되었다는 것을 발견했습니다. 플라스미드에 Cas9및 gRNAs를 전달하는 추가 이득은 주사 도중 바늘을 막을 확률이 적기 때문에 더 적은 점성이 있다는 것입니다 (R. Harrell, 개인적인 관측). 그러나, embyronic 프로모터가 Culex 모기에서 특징과 검증될 때까지, 여기에서 기술한 바와 같이 Cas9 단백질 또는 mRNA를 주입하는 것이 좋습니다.
또한 모기를 사육하고 선별하는 데 전념해야 하는 시간을 감안할 때 이 작업에 전념하는 전임 기술자, 학생 또는 연구원을 한 명 이상 두는 것이 좋습니다. 또한 주어진 실험에 필요한 null 돌연변이가 얼마나 많은지, 그리고 null 라인 내에서 유전적 다양성의 중요성을 전략적으로 고려하는 것이 좋습니다. 우리는 돌연변이가 있던 F1과 F2 세대에 있는 모기를 확인할 수 있었습니다, F2 모기의 소수만이 성인기에 살아남았고 이종수 돌연변이 모기는 실행 가능한 자손을 생성하지 못했습니다. 우리는 이것이 돌연변이와 관련이 훨씬 적다고 생각하고, 우리가 그(것)들을 검열하는 동안 남성과 여성 모기 둘 다 유리 관에 국한된 시간의 긴 기간의 결과일 확률이 높습니다. 고립의이 장기간 된 기간은 가장 가능성이 성공적으로 짝짓기 하는 그들의 능력을 방해 하 고, 여성의 경우, 혈액 식사를 얻고 실행 가능한 계란을 낳는. 단일 세대를 위해 교차하거나 최적화된 스크리닝 기술을 갖추면 향후 이 문제가 발생하지 않도록 해야 합니다. 따라서,이 프로토콜을 따라 우리는 연구원이 성공적으로 Culex 모기의 널 라인을 생성 할 수있을 것이라고 확신하고, 사소한 조정, 추가 곤충.
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Disclosures
RH는 곤충 유전자 변형 서비스를 제공하는 곤충 변환 시설에서 작동합니다.
Acknowledgments
우리는 데이비드 O'Brochta 박사와 곤충 유전 기술 조정 연구 네트워크의 모든 구성원들이 유전 기술의 구현에 대해 우리와 다른 사람들에게 제공하는 도움과 훈련을 주셔서 감사합니다. 우리는 특히 컬렉스 배아를 주입하고 부화할 수 있도록 미세 조작 프로토콜을 최적화한 찬나 알루비헤어에게 감사드립니다. 또한 Meuti 연구소에서 일하는 학부 생인 데반테 시몬스와 조셉 우르소(Joseph Urso)와 트랜스제닉 모기를 돌보고 선별하는 데 도움을 준 데반테 시몬스와 조셉 우르소, ITF의 조라 엘름카미(Zora Elmkami)가 모기를 사육하고 주사를 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 MEM에 제공 OSU에 감염증 연구소에서 학제 간 씨앗 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
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- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
