Summary
In vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme, özgürce davranan hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan paha biçilmez bir araçtır. Ancak bu tekniği amigdalaya uygulamak zor olmuştur. Bu protokol, farelerde minyatürleştirilmiş bir mikroskopla amigdala hücrelerini başarıyla hedeflemek için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.
Abstract
In vivo serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesi, nöronal aktiviteyi davranışa bağlamak için temel yaklaşımlardan biridir. Bu amaçla, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), minyatürleştirilmiş bir floresan mikroskobu ve gradyan refraktif indeks (GRIN) lensi kullanarak nöronlardaki kalsiyum geçicilerini tespit eden bir in vivo görüntüleme tekniği geliştirilmiş ve birçok beyinyapısına 1, 2,3,4,5,6başarıyla uygulanmıştır. Bu görüntüleme tekniği özellikle güçlüdür, çünkü genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının birkaç haftaya kadar uzun süreli kronik eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Yararlı olmasına rağmen, bu görüntüleme tekniği, duygusal işlem ve ilişkilendirilebilir korku hafızası için gerekli bir beyin yapısı olan amigdala gibi beynin derinliklerine yer alan beyin yapılarına kolayca uygulanmamıştır7. Görüntüleme tekniğinin amigdalaya uygulanmasını zorlaştırıcı birkaç faktör vardır. Örneğin, hareket eserleri genellikle daha derin beyin bölgelerinde yapılan görüntüleme sırasında daha sık ortaya çıkar, çünkü beynin derinliklerine yerleştirilen bir kafaya monte mikroskop nispeten kararsızdır. Diğer bir sorun ise lateral ventrikülün implante grin lense yakın konumlandırılması ve solunum sırasındaki hareketinin kolayca düzeltilemeyen son derece düzensiz hareket yapıtlarına neden olmasıdır, bu da kararlı bir görüntüleme görünümü oluşturmayı zorlaştırır. Ayrıca, amigdaladaki hücreler genellikle dinlenme veya uyuşturulma durumunda sessiz olduğundan, daha sonraki görüntüleme için temelleme prosedürü sırasında amigdalada GECI'yi ifade eden hedef hücreleri bulmak ve odaklamak zordur. Bu protokol, bu kadar derin bir beyin bölgesinde başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme için kafa montajlı minyatür mikroskop ile amigdaladaki GECI'yi ifade eden hücrelerin nasıl verimli bir şekilde hedeflenerek hedeflendirılacağına dair yararlı bir kılavuz sağlar. Bu protokolün belirli bir sisteme (örneğin, Inscopix) dayandığı, ancak bununla sınırlı olmadığı belirtilmiştir.
Introduction
Kalsiyum her yerde bulunan ikinci bir habercidir, hemen hemen her hücresel işlevde çok önemli bir rol oynar8. Nöronlarda, eylem potansiyeli ateşleme ve sinaptik giriş hücre içi serbest [Ca2+]9,10'unhızlıdeğişmesineneden olur. Bu nedenle, kalsiyum geçicilerini izlemek nöronal aktiviteyi izlemek için bir fırsat sağlar. GECI'ler, tanımlanmış hücre popülasyonlarında ve hücre içi bölmelerde[Ca 2+] izlenmesine izin veren güçlü araçlardır11,12. Protein bazlı kalsiyum göstergesinin birçok farklı türü arasında, tek bir GFP molekülü13'edayanan bir Ca2+ probu olan GCaMP, en optimize edilmiş ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan GECI'dir. Birden fazla mühendislik turu sayesinde, GCaMP'nin bir dizi çeşidigeliştirilmiştir 12,14,15,16. Son geliştirilen GCaMPP'lerden birini kullanıyoruz, GCaMP7b, bu protokolde16. GCaMP sensörleri, geliştirme sırasında Ca2+ geçicilerinin görüntülenmesi, belirli bir kortikal tabakada in vivo görüntüleme18, motor görev öğreniminde devre dinamiklerinin ölçümü19ve hipokampus ve amigdala 20,21'deki ilişkisel korku hafızası ile ilgili hücre topluluğu aktivitesinin görüntülenmesi gibi bir dizi model organizmadanöraldevre fonksiyonlarının incelenmesine büyük katkıda bulunmuştur.
GECI'lerin optik görüntülemesinin çeşitli avantajları vardır22. Genetik kodlama, GECI'lerin genetik profil veya belirli anatomik bağlantı kalıpları ile tanımlanan belirli bir hücre alt kümesinde uzun süreli bir süre boyunca saptanmasını sağlar. Optik görüntüleme, canlı hayvanlarda yüzlerce ila binlerce nöronun in vivo kronik eşzamanlı izlenmesini sağlar. Kafa montajlı minyatür floresan mikroskoplar21, 23,24,25ile serbestçe davranan farelerin beynindeki GECI'lerin in vivo görüntüleme ve analizi için birkaç optik görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. GECI'lere dayanan in vivo optik görüntüleme tekniğine, GRIN lense ve kafaya monte minyatür mikroskobun nöral devre aktivitesi ve davranışı arasındaki bağlantıyı incelemek için güçlü bir araç olmasına rağmen, bu teknolojinin amigdalaya uygulanması, GÖRÜNTÜ alma kalitesini ciddi şekilde azaltan hareket yapıtlarına neden olmadan amigdaladaki GECI'leri ifade eden hücrelere GRIN lensin hedef alınmasıyla ilgili çeşitli teknik sorunlar nedeniyle zor olmuştur. Bu protokol, amigdalada başarılı in vivo optik kalsiyum görüntüleme için kritik adımlar olan baseplate eki ve GRIN lens implantasyonunun cerrahi prosedürleri için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol amigdalayı hedeflemesine rağmen, burada açıklanan çoğu prosedür genellikle diğer derin beyin bölgeleri için geçerlidir. Bu protokol belirli bir sisteme (örneğin Inscopix) dayansa da, aynı amaca diğer alternatif sistemlerle kolayca ulaşılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Kore İleri Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi.
NOT: Bu protokol altı ana adımdan oluşur: virüs enjeksiyon cerrahisi, GRIN lens implant cerrahisi, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması, taban plakası eki, davranış testi sırasında GCaMP sinyalinin optik kaydı ve veri işleme (Şekil 1A). Ameliyat dışında ticari yazılım paketi (Inscopix) kullanılmaktadır.
1. Stereotaksik cerrahi - AAV Virüs enjeksiyonu
NOT: Bu cerrahi işlemde kullanılan fare zorlanması C57BL6/J'dir. Hayvanın vücudu ameliyat sırasında steril bir örtü ile kaplanır ve protokoldeki tüm adımlar steril eldiven giyerek gerçekleştirilir. Birden fazla ameliyat genellikle aynı gün içinde yapılmaz. Bununla birlikte, aynı gün içinde birden fazla farenin aynı ameliyatı olması gerekiyorsa, fareler arasındaki cerrahi aletleri dezenfekte etmek için her fare için ayrı bir otomatik kapatılmış cerrahi araç seti ve% 70 etanol kullanın. Cerrahi işlem sırasında fareyi sıcak tutmak için, fare stereotaksik çerçeveye sabitlendikten sonra özel yapım bir cerrahi battaniye ile kaplanır.
- Gerekli tüm cerrahi aletleri% 70 etanol ile dezenfekte edin ve bir Hamilton şırıncığı ve bir cam pipet hazırlayın. Cam pipetleri damıtılmış su ile doldurun.
NOT: Protokolde kullanılan tüm cerrahi aletler otoklavlanmıştır. GRIN lens ve kafatası vidaları sterilizasyon için otoklavlanamadığı için iltihabı önlemek için dezenfektan olarak %70 etanol kullanılır. Denenmemekle birlikte, gaz veya kimyasal sterilizasyon gibi başka sterilizasyon biçimleri de kullanılabilir. - Fareyi pentobarbital (vücut ağırlığının 83 mg⭐kg-1'i) ile intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun. Fare bilinçsiz hale geldikten sonra, kafatasındaki kürkü tıraş edin.
- Kafatasının üzerindeki cildi% 70 etanol ile temizleyin ve fareyi stereotaksik çerçeveye sabitin. Cildi dikkatlice çıkarın ve kafatası yüzeyini pamuk ucu aplikatörü kullanarak% 35 hidrojen peroksit çözeltisi ile silin. Ameliyat sırasında kornea kurumasını önlemek için yağlayıcı göz merhemi uygulayın.
NOT: Genellikle sadece aseptik cilt hazırlığı için% 70 etanol kullanmada bir sorun olmamasına rağmen, iodoforlar veya klorheksidin çözeltisi ve% 70 etanol gibi 3 alternatif dezenfektan turu kullanılması önerilir. Bu protokolde, fare kafatasındaki bağ dokusunun mümkün olduğunca tamamen çıkarıldığından emin olmak için daha yüksek hidrojen peroksit konsantrasyonu kullanılır, bu da daha sonraki görüntüleme sırasında hareket yapıtını azaltmak için kritik öneme sahiptir, çünkü kafatasındaki bağ dokusu, taban plakasının kafatasına sıkı bir şekilde bağlanmasına müdahale eder. % 35 hidrojen peroksitin normalde kullanılandan çok daha yüksek olduğu belirtilmelidir (% 3). - Pimini stereotaksik prob tutucu ile sabitle. Bregma ve lambda'nın yüksekliğini pim ile hizalayın.
- Kraniyotomi için fare kafatasında belirli bir konum bulun.
NOT: Virüs enjeksiyonu için lateral amigdalanın (LA) koordinatları (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) bu protokoldeki (AP; Ön-Posterior, ML; Medial-Yanal, DV; Dorsal-Ventral, her kısaltma bregma'dan göreceli eksenel mesafeyi gösterir)26. Koordinatlar her deneysel durum için optimize edilmelidir. - Kafatası yüzeyini delin (Şekil 1B). Kafatası fraksiyonlarını fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Geri kalan tabakayı kümesleri veya 27 G iğne kullanarak çıkarın.
- Kafatasını delerken, beyin dokusu yüzeyinin zarar görmesini önlemek için son dura tabakasına dokunmamaya çalışın. Hasarlı bir beyin yüzeyi lens çevresinde iltihaplanmaya neden olur, bu da kayıt sırasında şiddetli hareket yapıtlarına ve yüksek otofluoresansa neden olur. Kraniyotomi büyüklüğü 1,6 mm'dir. Matkap hızı 18.000 rpm ve uç boyutu 0,6 mm'dir.
- GRIN lensi delinmiş alanın beyin dokusu yüzeyinden hedef amigdala bölgesine indirmek için, bregma ve maruz kalan beyin yüzeyi arasındaki DV farkını bregmaya dayalı olarak ayarlanan lens implantasyonunun DV koordinatından çıkararak "A Değeri" olarak adlandırılan mesafeyi hesaplayın (bu durumda 4,2 mm, Şekil 1C).
- Cam pipete 3 μL mineral yağ ve 0,7 μL AAV virüs çözeltisi yükleyin.
NOT: Mineral yağ, virüs çözeltisini ve suyu ayırmaya yardımcı olur. 0.7 μL, LA virüs enjeksiyonu için LA'yi tamamen kapsayabilen optimize edilmiş bir hacimdir. - Pimini stereotaksik prob tutucusundan çıkarın ve cam pipetleri sabitleyin.
- Adım 1.5'te belirtilen enjeksiyon yerinde cam pipet bulun. Kanama tamamen durduktan sonra cam pipetleri beyin dokusuna yerleştirin.
- Enjeksiyon pompası kullanarak virüsü cam pipetle teslim edin.
NOT: Yeterli sayıda GCaMP ifade hücresi elde etmek için virüsün titresi 1 x10 13 vg/mL'den yüksek olmalıdır. Enjeksiyon hızı 0.1 μL / dk'dır ve 10 dakika boyunca yayılır. Kanama varsa, beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun. - Enjeksiyonu bitirdikten sonra, cam pipet yavaşça çıkarın.
2. Stereotaksik cerrahi – GRIN lens implantasyonu
NOT: GRIN lens implant cerrahisi bu protokolün en kritik adımıdır. GRIN lens hareketinin tutarlı bir yavaş hızı başarılı GRIN lens implantasyonu için kritik olduğundan, motorlu bir ameliyat kolu yararlı olabilir. Motorlu cerrahi kol, bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilen stereotaksik bir manipülatördür. Bu protokolde motorlu kol kullanılsa da implantasyon sırasında lens sürekli ve yavaş hareket ettiği sürece başka yollar da kullanılabilir. Cihaz hakkında ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosundadır.
- İki kafatası vidası yerleştirmek için kafatasını delin. Tüm kafatası fraksiyonlarını PBS ile yıkayın.
NOT: Daha sonraki optik görüntülemedeki hareket yapıtlarını azaltmak için en az iki vida gereklidir. İki kafatası vidası ve GRIN lens implant pozisyonu bir eşkenal üçgen oluşturur (Şekil 1B). Kraniyotomi boyutu vidanın çapına sıkıca uymalıdır. Kanama varsa, kanayan yüzeyi PBS ile yıkayın. Matkap hızı 18.000 rpm ve uç boyutu 0,6 mm'dir. - İltihabı önlemek için vidaları% 70 etanol ile dezenfekte edin. Vidaları mümkün olduğunca derine yerleştirin.
NOT: Vidalar çimento gibi ek yapıştırma olmadan sıkıca sabitlenmelidir. - Stereotaksik çerçeveye motorlu bir ameliyat kolu takın. Gerekli donanımı, kontrol yazılımının yüklü olduğu dizüstü bilgisayara bağlayın (Malzeme Tablosu).
- GRIN lensi indirmeden önce, 26 G iğne ile bir iğne izi yapmaya hazırlanın.
NOT: İğne izi, enjeksiyon yolu boyunca beyin yapısının ciddi bir bozulmasına neden olmadan nispeten kalın GRIN lensin amigdala gibi derin beyin bölgelerine yerleştirilmesine yardımcı olan bir tür kılavuz parçadır. Bu kılavuz parçaya iğne izi denir, çünkü nispeten ince 26 G iğnenin alçaltma ve yükseltme prosedürü ile yapılır. - İğneyi stereotaksik çerçevede tutmak için kanül tutucuyu takın.
- 26 G iğneyi kanül tutucu ile kavrayın ve iğne yerleştirme bölgesinin koordinatlarını hesaplayın.
NOT: Bu protokolde, iğne ekleme bölgesinin koordinatları virüs enjeksiyon bölgesinden (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm) 50 μm yanaldır. - Kontrol yazılımına erişin ve iğne pozisyonunu manipüle etmek için tam hazırlık yapın.
- Denetim yazılımını çalıştırın ve oturumu denetlemeye başlamak için Yeni proje başlat düğmesini seçin.
NOT: Kontrol oturumunda, birkaç boş kutu ve menü düğmesi vardır. Boş kutular koordinatlar için giriş alanıdır. Boş kutulara koordinatları girdikten sonra motorlu stereotaksik kol Git butonuna tıklayarak hareket eder. Stereotaksik kol hareket ederken Git düğmesi DUR düğmesine dönüşür. Birkaç menü düğmesi arasında, bu protokolde yalnızca Araç düğmesi gereklidir. - Araç düğmesini tıklatın. Çerçeveyi kalibre etme menü düğmesini tıklatarak kontrol yazılımını kalibre edin. Kalibrasyon, manipülatörün gerçek konumunun Stereodrive yazılımında değer olarak ayarlanması işlemidir.
- Denetim yazılımını çalıştırın ve oturumu denetlemeye başlamak için Yeni proje başlat düğmesini seçin.
- Stereotaksik manipülatör kullanarak kafatası yüzeyindeki açıkta kalan beyin yüzeyinde iğnenin ucunu bulun.
NOT: İğnenin hızı, Araç menüsündeki Microdrive hız menüsü kullanılarak ayarlanır. Varsayılan hız 3,0 mm/s'dir. Ancak bu adımda 0,5 mm/s hız önerilir. İğnenin hareketi ok tuşları tarafından kontrol edilir. - Beyin yüzeyini ıslak tutmak için 2-3 damla PBS ekleyin. Bilgisayar ekranındaki boş kutuyu LA'nin uygun DV koordinatlarıyla doldurun. Beyin yüzeyi kuruysa, iğnenin beyin dokusuna nüfuz etmesine engel olur.
- Git düğmesine tıklayarak 26 G iğneyi 26 G'ye düşür. İğne DV koordinatları tarafından belirlenen hedef bölgeye ulaştığında otomatik olarak durur. İğnenin hızı 100 μm / dk'dır. Kanama varsa DURDUR butonuna tıklayarak iğneyi durdurun ve beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun. Kanama durduktan sonra tekrar alçalmaya başlayın.
- İğne hareket etmeyi tamamen durdurduktan sonra, bilgisayar ekranındaki boş kutuya 45,00 mm girin.
NOT: 45,00 mm, iğnenin başlangıç konumuna dönmesini sağlayan DV koordinatının bir değeridir. - Git düğmesini tıklatarak iğneyi yükseltin. İğne hareketinin hızı 100-200 μm / dk'dır.
- İğne hareket etmeyi durdurduktan sonra, beyin yüzeyindeki PBS'yi çıkarın. İğne ve kanül tutucuyu stereotaksik çerçeveden kaldırın. Deneyci gerektiğinde DUR düğmesini tıklatarak iğneyi el ile durdurabilir.
- Stereotaksik çubuğu lens tutucu ile donatın. GRIN lensi lens tutucusuna takın.
NOT: Bu protokolde LA'yi hedeflemek için optimize edilmiş GRIN lens (0,6 mm çapında, 7,3 mm uzunluğunda) kullanılır. Lens tutucu hazır değilse, GRIN lensi kavramak için bir bulldog klipsi kullanmanın alternatif bir yoludur. - Lensi % 70 etanol ile dezenfekte edin ve stereotaksik çubuğu stereotaksik çerçevelere takın.
- GRIN lensin ucunu kafatası yüzeyinde belirlenen yerde bulun (adım 2.8'de açıklanan yöntemle aynı).
NOT: GRIN lensin koordinatı (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm)(Şekil 1C). Lens, ucunda hasar görmemesi için kafatasına dokunmamalıdır. - Adım 2.16'da açıklanan lens implantasyonunun DV koordinatından "A Değeri"nin mutlak değerini çıkararak DV koordinatını hesaplayın.
- Beyin yüzeyine 2-3 damla PBS bırakın. Alçalma için 1000 μm ve bilgisayar ekranındaki boş kutuya lensi yükseltmek için 300 μm girin.
- Hedef bölgeye ulaşana kadar GRIN lensin alçaltılmasını (1000 μm aşağı) ve yükseltilmesini (300 μm yukarı) tekrarlayın. Bu yukarı ve aşağı prosedür, implantasyon yolu boyunca beyin yapılarının bozulmasına neden olabilecek lensin alçaltma prosedürü nedeniyle beyin dokusunun içinde oluşan basıncın serbest bırakılmasına yardımcı olmak için kullanılır.
NOT: GRIN lens hareketinin hızı 100 μm/dk'dır. Kanama olsa bile, GRIN lensi hareket ettirmeyi bırakmayın ve beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun. Beyin yüzeyi kuruysa, beyin dokusu GRIN lens yüzeyine yapışır ve beyin yapısının bozulmasına neden olur. - GRIN lens hedef bölgeye ulaşırsa, PBS'yi çıkarın ve reçine diş çimentosünü GRIN lensin, vidaların ve yan duvarlarının etrafına dikkatlice uygulayın (Şekil 1D).
NOT: Reçine çimentosunda kafatasının her yerine uygulanması hareket yapıtlarını azaltabilir. Aksine, reçine çimentosu yanlışlıkla kafatasına bağlı kasları kaplarsa, hareket yapıtlarını arttırır. - Reçine diş çimentosu sertleştikten sonra, GRIN lensi lens tutucudan sökün ve kafatasının her yerine akrilik çimento uygulayın (Şekil 1D).
- Kafa plakasını takmak için lens tutucuyu stereotaksik çubuktan sökün ve kafa plakasını bantlar kullanarak çubuğun ucuna takın. Kafa plakasının yatay olup olmadığını onaylayın.
NOT: Eğik bir kafa plakası eğik bir görünüme neden olur. Fare kafasını mobil ev kafes sistemine (taban plakası ek bölümünde) sabitlemek için bir kafa plakası gereklidir. Deneyci sistemi kullanmazsa, bu adımı (adım 2.22) ve aşağıdaki adım 2.23'ü atlayın. - Kafa plakası lens manşetinin üst kısmına yer bulana kadar çubuğu yavaşça dirin. Kafa plakasını 1000 μm daha düşür. Yerleştirilen GRIN lensin kafa plakasını hareket ettirerek baş plakasının iç halkasının sağ kenarında bulun.
NOT: Kafa plakası implante edilen GRIN lens yüzeyinden daha düşük konumlandırılmalıdır; aksi takdirde, mikroendoskop akril çimento nedeniyle odak düzlemini ayarlamak için implante grin lense yeterince yaklaşamaz. - Baş plakasını çimento katmanlarına tutturmak için akrilik çimento uygulayın (Şekil 1D).
- Lens yüzeyini tozdan korumak için yerleştirilen GRIN lens yüzeyine parafin filmi takın. Daha sonra parafin filminin lens yüzeyinde kalmasını sağlamak için parafin filmine çıkarılabilir epoksi bağı uygulayın.
- Farenin periton boşluğuna analjezik (PBS'de 0,5 mg/mL) ve antienflamatuar bir ilaç olan Deksametazon (PBS'de 0,02 mg/mL) çözeltisi olan Carprofen'i enjekte edin.
NOT: İlacın dozu vücut ağırlığına bağlıdır: Carprofen (5 mg⭐kg-1 vücut ağırlığı) ve Deksametazon (0.2 mg⭐kg-1 vücut ağırlığı). Hem Carprofen hem de Deksametazon ameliyattan sonra ve ameliyat sonrası 7 gün boyunca günde bir kez uygulanır. - İlacı 1 hafta boyunca uygulamak için ev kafesi suyunda bir antibiyotik olan 0.3 mg / mL amoksisilin karıştırın.
- Fareyi ev kafesine geri koyun ve iyileşme ve virüs transdüksiyon için 5-8 hafta izin verin.
NOT: Fare, anesteziden uyanana kadar elektrikli bir battaniye üzerinde önceden ısıtılmış bir kafeste kurtarılır.
3. GRIN lens implantasyonunun doğrulanması
NOT: GRIN lens implantasyonunun doğrulanması, implante edilen GRIN lensin GCaMP ekspresyasyon hücrelerine hedefte olup olmadığı hakkında bilgi sağlar. Bu bilgilere dayanarak, deneyci, hedef dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanları hariç tutarak davranış testi ve veri işleme gibi zaman alıcı süreçlerden zaman kazandırır. Doğrulama yordamı sırasında, GCaMP ifadeli hücreler kayıt görüntüleme alanına odaklanmalıdır. Bu adımda mobil bir ev kafesi kullanılır. Mobil ev kafesi, grin lens implantasyonu ve taban plakası ataşmanının doğrulanması sırasında kafa sabit farelerinin bacaklarını serbestçe hareket ettirmelerini sağlayan özel bir yuvarlak şekilli aparattır. Bu aparatta, kafa sabit farelerinin bacaklarının yer aldığı bir hava kaldırma masası, kafa sabit olmasına rağmen bacakların serbest dolaşımını sağlar. Amigdalanın lateral çekirdeğindeki hücreler genellikle dinlenme veya uyuşturulmuş durumda sessizdir, bu nedenle GCaMP floresan sinyalleri bu koşullarda nadiren tespit edilir, bu da GRIN lens implantasyonu ve taban plakası ekinin doğrulanması sırasında GCaMP'yi ifade eden hücreleri bulmayı çok zor, bazen imkansız hale getirir. Bununla birlikte, bacakların hareketi genellikle amigdala lateral çekirdeği hücrelerinde GCaMP floresan sinyalleri üretir ve böylece mikroskobun bulunmasına yardımcı olabilir. Böylece, mobil ev kafesi bu protokolde kullanılır.
- Stereotaksik manipülatörü mobil ev kafes sistemine monte edin.
- Fareyi% 1.5 izofluran gazı ile uyuşturun. Fare tamamen bilinçsiz olduktan sonra, fareyi mobil ev kafes sisteminin baş çubuğuna yerleştirin.
- Farenin altındaki karbon kafesini bulun. Karbon kafesini kapatın ve kafesin sürtünmeden serbestçe hareket etmesini sağlamak için hava akışını açın. Fare etkinleşene kadar birkaç dakika bekleyin.
NOT: Hava akışının hızı her deneysel durum için optimize edilmelidir (burada, 100 L /dk). - yerleştirilen GRIN lensin yüzeyindeki parafin filmi ve epoksi bağını çıkarın ve lens kağıdı kullanarak lens yüzeyini % 70 etanol ile silin.
- Veri toplama (DAQ) yazılımını hazırlayın (örneğin, Inscopix). Görüntüleme koşullarını ayarlayın.
NOT: DAQ yazılımı mikroskobu (LED gücü, lens odağıvb.)ve veri depolamayı kontrol etmek için kullanılır.- DAQ kutusunu açın ve mikroskop takın. Ardından, doğrudan bir kablo kullanarak veya kablosuz internet üzerinden bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
NOT: DAQ yazılımı, DAQ kutusu (örneğin, Inscopix) adı verilen ekstra donanıma yüklenir. DAQ kutusunu dizüstü bilgisayara bağlayarak, DAQ yazılımı bir dizüstü bilgisayarda erişilebilir hale gelir. - DAQ yazılımına bir internet tarayıcısı üzerinden erişin (Firefox önerilir).
- Tanımlı Oturumdagerekli tüm ayrıntıları (Tarih, fare kimliğivb.)ayarlayın. Ardından Kaydet ve Devam 'ıtıklatın. Kaydettikten sonra Çalıştır oturumunaerişin.
- Çalışma Oturumu'nda pozlama süresi, kazanç, elektronik odaklama ve pozlama-LED gücü gibi görüntüleme koşullarını ayarlayın.
NOT: Kazanç ve pozlama-LED gücü laboratuvar koşullarına bağlı olarak değiştirilebilir. Elektrik odağı için önerilen değer 500 ve maruz kalma süresi 50 ms'dir. LED gücünü ve kazancı değiştirmek için herhangi bir kısıtlama yoktur. Bununla birlikte, daha yüksek bir ışık yoğunluğu daha fazla ağartmaya neden olabilir. Kaydın pozlama süresi, video kaydının kare hızını belirler. Daha yüksek kare hızları sinyal yoğunluğunu azaltır. Görüntüleme için kullanılan GECI'ler için kare hızları optimize edilmelidir.
- DAQ kutusunu açın ve mikroskop takın. Ardından, doğrudan bir kablo kullanarak veya kablosuz internet üzerinden bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
- Mikroskobu stereotaksik bir manipülatör üzerinde tutmak için, stereotaksik çubuğu mikroskop tutuculu stereotaksik manipülatöre takın.
NOT: Tutucu, stereotaksik cihaza, hedef beyin konumuna yerleştirmek için bir mikroskop gövdesi tutmak için takılabilen küçük bir aksesuardır. - Mikroskobu mikroskop tutucu ile kavrayın. Mikroskopa bağlı LED ışığı açın ve mikroskobu dikey olarak hizalayın. yerleştirilen GRIN lensin yüzeyi ortaya çıkıp gelene kadar görüntüyü gözlemlerken mikroskobu düşürin.
- Yerleştirilen GRIN lensin merkezini görünümün merkeziyle hizalayın.
NOT: GRIN lens implantasyonunun doğrulanması bu adımda yapılabilir (sonuç bölümünde, Şekil 2B, Şekil 2 D, Şekil 2F' de belirtilmiştir). - Yerleştirilen GRIN lens yüzeyinin görüntüsünü yakalayın (Klavyede Prt Sc düğmesine tıklayın). İmplantlı GRIN lens yüzeyinin görüntüsü, daha sonraki veri işleme sırasında nöronal olmayan bileşenlerin seçimini kaldırmak için gereklidir (adım 6.8).
- Mikroskobun uygun konumunu bulun. GCaMP7b ekspresyonlu hücreleri aramak için görüntüyü gözlemlerken mikroskobun objektif merceğini yavaşça yükseltin.
NOT: Görüntü alımının veya pozlama-LED gücünün kazancını ayarlamak gerekebilir. GRIN lens implantasyonunun doğrulanması bu adımda yapılabilir (sonuç bölümünde belirtilen, Şekil 2A, Şekil 2C, Şekil 2E).
4. Taban plakası eki
NOT: Taban plakası bağlanma adımı, GRIN lens implantasyonunun doğrulanmasını izler. Taban plakası, mikroskobu farelerin kafasına monte etmek için bir platformdur. Önceki bölümde belirtildiği gibi, bu protokolde mobil bir ev kafesi kullanılır.
- GRIN lens implantasyonunu doğruladıktan sonra, mikroskop tutucusundan minyatür bir mikroskobu sökün.
- Mikroskopa taban plakası takın. Taban plakasının mikroskopa sabit bağlanması için altıgen anahtar kullanarak vidayı sıkın.
- Mikroskobu mikroskop tutucu ile kavrayın. Mikroskopa bağlı LED ışığı açın ve mikroskobu dikey olarak hizalayın. yerleştirilen GRIN lensin yüzeyi gözlemlenene kadar mikroskobu dürt. Yerleştirilen GRIN lensin merkezini görünümün merkeziyle hizalayın.
- Mikroskobun uygun konumunu bulun. GCaMP7b ekspresyonlu hücrelerin en iyi görüntülerini veren bir odak düzlemi bulana kadar mikroskobun objektif merceğini yavaşça yükseltin (Şekil 2A).
NOT: Bu adım sırasında görüntü alma veya pozlama-LED gücünün kazancını ayarlamak gerekebilir. - Taban plakasını kafa plakasına(Şekil 2G)sapta takmak için akrilik çimento uygulayın. Taban plakası ve kafa plakası arasında akrilik çimento ile yan duvarları oluşturun.
NOT: Akrilik çimento sertleştiğinde küçülür. Bu nedenle, çimento tamamen sertleşene kadar mikroskobu çıkarmayın (bu adım en az 30 dakika sürer). Mikroskop ve objektif merceği akrilik çimento ile istenmeyen çimentolaşmayı önlemek için çimentolama çok dikkatli yapılmalıdır. - Akrilik çimento tamamen sertleştikten sonra vidayı gevşetin ve mikroskop gövdesini yavaşça yükseltin.
- Yan tarafta bir boşluk varsa, implante edilen GRIN lensi tozdan korumak için ek çimentolamayı yeniden yapılandırın.
- Yerleştirilen GRIN lensi tozdan korumak için taban plakasını örtün ve taban plakasının vidasını sıkın.
- Kafa plakasını baş çubuğundan serbest bırakın. Gelecekteki optik görüntülemeye kadar fareyi ev kafesine geri döndürün.
5. Davranış testi sırasında GCaMP sinyalinin optik kaydı
NOT: Davranış sırasında GCaMP sinyal kaydı prosedürü optik görüntüleme, deneysel tasarım ve laboratuvar ortamı için kullanılan sistemlere bağlı olarak çok farklı olabilir. Bu nedenle, bu bölümde basit bir şekilde açıklanmıştır.
- Davranış testinden önce birkaç gün işleme gerçekleştirin.
- Davranış aygıtını (örneğin, korku şartlandırma odası, davranış yazılımı ve Coulbourn Enstrümanı) ve dizüstü bilgisayarı hazırlayın.
- Mikroskobu DAQ kutusuna takın ve DAQ kutusunu açın.
- DAQ kutusunu kablosuz internet bağlantısıyla dizüstü bilgisayara bağlayın.
- Dizüstü bilgisayarda DAQ yazılımını (Firefox tarayıcısı önerilir) başlatın. Dosya yöneticisi düğmesini tıklatın ve kaydedilen verileri kaydetmek için DAQ kutusunun kalan depolama kapasitesini denetleyin.
NOT: Veri boyutu 30 dakikalık kayıt için yaklaşık 80 GB'tır. - Tanımlı oturuma gerekli bilgileri (Tarih, fare kimliğivb.)girin ve Çalıştır oturumunagirin.
- Fareyi yavaşça tutun ve kafasındaki taban plakası kapağını çıkarın. Mikroskobu taban plakası platformuna yerleştirmek.
- Taban plakası vidasını sıkın ve hayvanı baş montajlı bir mikroendoskopla davranış odasına yerleştirin.
NOT: İşleme yeterli değilse, fare bu adımda kaçmaya çalışır. - NI kartı, BNC kablosu kullanarak DAQ kutusunun TRIG bağlantı noktasına bağlayın. NI kartı, davranış yazılımından (örneğin FreezeFrame) TTL sinyalleri alır ve GCaMP sinyalinin ve hayvanın davranışının eşzamanlı kayıt prosedürünü koordine eder.
- Odak düzlemini ayarlayın.
NOT: Odak düzlemi, mikroskopun objektif lensi ile beyne yerleştirilen GRIN lens arasındaki mesafeye göre belirlenir. Odak düzlemini ayarlamak için, görüntüleri gözlemlerken objektif lens konumu manipüle edilir. Hücrelerin ve kan damarlarının net morfolojisini gösteren bu iki lens arasındaki mesafe görüntüleme için odak düzlemi olarak ayarlanır. Bu protokolde, DAQ yazılımı ayarlama sırasında objektif lensin hareketini kontrol etmek için kullanılır. - Çalışma oturumunda optimize edilmiş pozlama süresini, kazancı, LED gücünü ayarlayın.
NOT: Genellikle pozlama süresi için 50 ms kullanılır. Kazanç ve LED gücü görüntü histogramlarına göre ayarlanır. Histogramlar piksellerin floresan yoğunluğunun dağılımını gösterir. Görsel incelemeye dayanarak, histogramın sağ kenarı GCaMP7b durumunda% 40 ila% 60 arasında bir değere sahip olmalıdır. Görüntüleme için kullanılan GECI'lere bağlı olarak değişir. - Kayıt seçeneğini Tetiklenen kayıtolarak değiştirin. Kaydet'i tıklatın ve davranışı başlatın.
NOT: Tetiklenen kayıt seçeneği, kayıt oturumunun ve davranış oturumunun eşleşen bir zaman çizelgesini sağlar. TTL sinyali alınırsa, TRIG bağlantı noktasının üzerindeki kırmızı ışık yanar. - Davranış testini bitirdikten sonra mikroskobu ayırın ve taban plakası kapağını takın.
- Fareyi ev kafesine geri götür. Ardından, Dosya yöneticisi'ni seçin ve DAQ kutusundan verileri dışarı aktarın.
- Davranış testinden sonra, ölüm sonrası histolojik doğrulama için fareyi feda edin.
6. Veri işleme
NOT: Veri işleme prosedürü, veri işleme yazılımına ve görüntüleme deneyi için kullanılan GECI'lere bağlı olarak çok farklıdır. Bu nedenle, bu bölümde basit bir şekilde açıklanmıştır. Bu protokol ticari veri işleme yazılımı kullanır (bkz. Malzeme Tablosu). Alternatif olarak, tartışma bölümünde belirtilen diğer açık kaynaklı yazılımlar da sorunsuz bir şekilde kullanılabilir. Bu iletişim kuralında kullanılan değişkenler Tablo 1'de listelenmiştir.
- Kayıt video veri dosyasını (1280 piksel x 800 piksel) DAQ kutusundan veri işleme için masaüstü bilgisayara aktarın. Veri işleme yazılımını başlatın.
NOT: Veri işleme yazılımı önceki adımlarda DAQ yazılımından farklıdır. Veri işleme yazılımında, 6 adım vardır: kaydedilen videodan tek hücreli kalsiyum geçici verilerini çıkarmak için gerekli olan aşağı örnekleme, kırpma, uzamsal filtre, hareket düzeltme, ΔF / F hesaplaması, olay algılama. - Videoyu altörnekle ve kırpın.
NOT: Veri işleme hızını artırmak için altörnekleme ve kırpma gereklidir. GCaMP sinyalinin gözlendiği ilgi alanı hariç alanı kırpın. - Uzamsal filtre uygulayın. Uzamsal filtre uyguladıktan sonra ortalama bir yoğunluk projeksiyon görüntüsü oluşturun.
NOT: Uzamsal filtre, kaydedilen video görüntüsündeki her pikseli ayırt eder ve yüksek kontrastlı bir görüntü sağlar. İki tip kesme filtresi vardır, düşük ve yüksek kesme filtresi. Düşük kesme filtrelerinin daha yüksek değeri görüntü kontrastını artırır, ancak aynı genel olarak gri gürültü de artar. Yüksek kesme filtresinin düşük değeri görüntünün bulanıklaşmasını sağlar. - Hareket düzeltmesi uygulayın. Ortalama yoğunluk projeksiyon görüntüsünü hareket düzeltme için referans görüntü olarak kullanın.
- Referans görüntü olarak ilk karenin görüntüsünü kullanarak hareket düzeltmeyi yeniden uygulayın.
NOT: hareket düzeltmenin iki adımı hareket yapıtını önemli ölçüde azaltır. - Parlaklıkta değişiklik gösteren pikselleri görselleştirmek için ΔF/F hesaplaması uygulayın.
NOT: Piksellerin parlaklık değişimi GCaMP'nin floresan yoğunluğu değişiminden kaynaklanır ve kalsiyum geçicilerini gösterir. - Her hücrenin kalsiyum geçici eğrisini görselleştirmek için PCA/ICA algoritmasını uygulayın.
NOT: PCA/ICA, bir veri grubunu tek bileşenli veri kümesine sıralamak için bir algoritmadır. Değişkenler her laboratuvar durumu için optimize edilmelidir. Bu iletişim kuralında, ICA zamansal ağırlığı (bu protokolde 0,4 kullanılır)27dışında tüm değişkenler varsayılandır. - Aşağıdaki Not'ta açıklanan ölçütlere göre tanımlanan bileşenler arasında nöronal olmayan bileşenlerin seçimini el ile kaldırın.
NOT: Bu amaçla iki ana kriter kullanılmaktadır. İlk olarak, bir nörondan kaynaklanan GCaMP sinyali net bir küresel şekle benziyor. Böylece, sadece net bir küresel şekle sahip sinyal nöron olarak seçilir. İkincisi, amigdala piramidal hücrenin hücre gövdesinin çapının yaklaşık 20 μm28,29,30olduğu bilinmektedir, sadece bu boyutla kabaca eşleşen sinyal bir nöron olarak seçilir. GCaMP sinyalinin boyutunu belirlemek için, tek bir pikselin gerçek boyutu lens yüzeyinin yakalanan görüntüsüne göre hesaplanır (adım 3.9) ve tek küresel şeklin maksimum genişliği hesaplanır. Örneğin, bu protokolde, implante edilen GRIN lensin çapı 600 μm'dir. Bu nedenle, lensin çapı 800 piksel ise, tek pikselin gerçek boyutu 1,5 μm'dir (20 μm yaklaşık 7 pikseldir). - Kalsiyum geçicisinin (kalsiyum olayı) önemli bir artışını tespit etmek için olay algılama işlevini uygulayın.
NOT: Bu adımda, olay en küçük bozulma süresi (φ) adı verilen değişken gereklidir. Bu protokolde, 1.18s GCaMP7b için optimize edilmiş bir değişken olarak kullanılır. Ortalama yarı çürüme süresi (t1/2=0.82s), hücrelerin spontan aktivitesi sırasında ΔF/F eğrisine göre hesaplanır. GCaMP üstel çürümeyi takip edildiğinden, δ =
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GRIN lens implantasyonunun doğrulanması
Taban plakasını çimentolama ile beyne kronik olarak takmadan önce, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması gerekir. Başarılı lens implantasyonu olan hayvanlarda, hem GCaMP ekspresyasyon hücreleri hem de kan damarları, mikroskopun objektif lensi ile implante grin lens arasındaki mesafe ile belirlenen bir odak düzlemi aralığında açıkça gözlenmiştir (Şekil 2A ve B). Buna karşılık, hedef dışı implantasyona sahip hayvanlarda, odak düzlemi aralığında (odak dışı veya görüş dışı) GCaMP ifade hücrelerinin net bir görüntüsü gözlenmedi. Odak dışı durumlarda, iyi odaklanmış kan damarları gözlemlenebilir, ancak odak düzlemi aralığındaki hücreler için sadece bulanık görüntüler görülebilir (Şekil 2C ve D). Görüş alanı dışında, çoğu durumda kan damarları gözlenmedi ve odak düzlem aralığında floresan sinyali saptanmamıştır(Şekil 2E). Ayrıca, diğer durumlardan farklı olarak, implante grin lens parlak bir kenar gösterdi (Şekil 2F). Taban plakası ataşmanı sadece hedef GRIN lens implantasyonu ile doğrulanmış hayvanlar üzerinde gerçekleştirilir.
İşitsel uyaranlara yanıt olarak LA nöronunda GCaMP sinyallerinin kaydedilme
Bu protokolde, bir fareye 4 psödorandomize ton (2.8 kHz, 200 ms süre, 25 darbe) sunuldu ve GCaMP sinyalleri baş montajlı mikroendoskoplu farelerin LA hücrelerine optik olarak kaydedildi. Görüntüleme için tek taraflı lateral amigdalada AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE enjekte edilen fareler kullanıldı. Başarılı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlarda, odak düzlemi aralığında virüs ekspresyasyon hücreleri ve kan damarları açıkça gözlenmiştir (Şekil 3A). Davranış durumunda, yaklaşık 50-150 hücre genellikle ΔF / F görüntüsünde gösterildiği gibi ton olmadan bile LA'deki görüş alanında önemli bir floresan değişikliği göstermiştir, muhtemelen kendiliğinden aktif hücreler (Şekil 3B). Ton sunumu üzerine, sadece birkaç hücre ΔF/F görüntü analizi (Şekil 3C ve Şekil 3D'deki6 hücre) tarafından belirlenen GCaMP sinyalinin tona özgü bir değişimini görüntüledi. Aynı prosedürler kontrol olarak AAV2/1-CaMKIIα-GFP enjekte edilen farelerde de yapıldı. Odak düzlemi aralığında GFP ifade hücreleri tespit edilmesine rağmen, hiçbir hücre ΔF/F görüntü analizinde(Şekil 3E ve Şekil3F) belirlendiği gibi tonlu veya tonsuz önemli bir floresan değişikliği görüntülemedi.
GCaMP ekspresyonunun histolojik doğrulaması ve GRIN lensin hedeflenmesi için, ölüm sonrası beynin koronal bölümleri floresan mikroskop altında incelenir (Şekil 4A ve Şekil 4B). DAPI boyama, sağlam hücreleri doğrulamak için kullanılır ve GRIN lens çevresindeki beyin dokusunun iltihaplanması nedeniyle doku hasarı belirtisi yoktur (Şekil 4C).
Şekil 1: LA'de in vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme için şematik iş akışı ve stereotaksik cerrahi şemaları. (A) LA'de in vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntülemenin şematik iş akışı. (B) Virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implant cerrahisi için kraniyotomi bölgelerinin iki boyutlu koordinatlarını gösteren mikroskobik bir resim. İki kafatası vidası ve mercek eşkenalı bir üçgen oluşturur. (C) Virüs enjeksiyon bölgesi ile implante edilen GRIN lens arasındaki göreli konum için bir diyagram ve "A Değeri" hesaplamak için şematik açıklama. (D) Ameliyatın son adımlarında çimento tabakasının kafatası yüzeyinden baş plakasına kadar kesiti. Reçine diş çimentosu vidaların duvarını ve implante edilmiş GRIN lensi örtmelidir. Reçine diş çimentosunda akrilik çimento uygulanır. Baş plakası çimento tabakasına tutturulur. Parafin filmi implante edilen GRIN lens yüzeyini kaplar ve tozdan korur. Çıkarılabilir epoksi bağı, parafin filminin sökülmasını önler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GRIN lens implantasyonunun doğrulanması ve taban plakası ataşmanı sonrası çimento tabakalarının yapılandırılması. (A) Başarılı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan temsili endoskopik enstantane görüntüsü. Hem GCaMP ifade hücreleri hem de kan damarları açıkça gözlenir. (B) Başarılı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan implante edilen GRIN lens yüzeyinin anlık görüntüsü. (C) Odak dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan temsili endoskopik enstantane görüntüsü. (D) Odak dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan implante edilen GRIN lens yüzeyinin anlık görüntüsü. Odak dışı durumlarda, kan damarları bazen açıkça gözlenir, ancak odak düzlemi aralığındaki hücreler için sadece bulanık görüntüler görülür. (E) Görüş dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan temsili bir endoskopik enstantane görüntüsü. Görüş dışı durumlarda, çoğu durumda kan damarları gözlenmez ve odak düzlem aralığında floresan sinyali tespit edilir. (F) İmplant edilen GRIN lens yüzeyinin, görüş dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanlardan anlık görüntüsü. Diğer durumlardan farklı olarak, bu durumda parlak kenar gözlenir. (G) Taban plakası ataşmanı için çimento tabakalarının yapılandırılması. Taban plakası ve kafa plakası akrilik çimento ile tutturulur. Taban plakası ve GRIN lens arasında akrilik çimento ile doldurulmamış bir boşluk olmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LA nöronlarında GCaMP sinyallerinin kaydediliyor. (A'dan C'ye) AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE enjekte edilen bir fareden elde edilen veriler. (A) Davranış testi sırasında temsili endoskopik anlık görüntü. GCaMP7b ekspresyaklı hücreler ve kan damarları odak düzlemi aralığında açıkça gözlendi. (B) Δ F/F sinyalini gösteren temsilibir anlık görüntü. Beyaz çizgi, davranış testi sırasında ilgi çekici bölgede önemli bir floresan değişikliği gösteren hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsü. Toplam 6 hücre GCaMP sinyalinin tona özgü bir değişimini görüntüledi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) Temsilci ΔF/F tona duyarlı hücrelerin izleri. Her renk, panelde (C) aynı renge sahip her bir hücreye karşılık gelir. (E ve F) AAV2/1-CaMKIIα-GFP enjekte edilen bir fareden elde edilenveriler. (E) Davranış testi sırasında temsili bir endoskopik anlık görüntü. Odak düzlemi aralığında GFP ekspresyaklı hücreler açıkça tespit edildi. (F) Δ F/F sinyalini gösteren temsilibir anlık görüntü. Ölçek çubuğu = 50μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: GRIN lens konumunun histolojik doğrulaması ve GCaMP7b ifadesi. (A) LA'de GCaMP7b ifadesini gösteren temsili bir koronal bölüm görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200μm. (B) Büyütülmüş görüntü. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) DAPI boyama sinyalini gösteren floresan mikroskobik görüntü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Faktörü | Değer |
| Uzamsal aşağı örnekleme faktörü | 2 |
| Zamansal aşağı örnekleme faktörü | 2 |
| Uzamsal filtre: Yüksek kesme | 0.5 |
| Uzamsal filtre: Düşük kesme | 0.005 |
| Hareket düzeltme: Yüksek kesme | 0.016 |
| Hareket düzeltme: Düşük kesme | 0.004 |
| Hareket düzeltme: Maksimum çeviri | 20 |
| ΔF/F referans çerçevesi | Ortalama çerçeve |
| PCA/ICA: blockSize | 1000 |
| PCA/ICA: yakınsamaThreshold | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: icaTemporalWeight | 0.4 |
| PCA/ICA: numIC'ler | 120 |
| PCA/ICA: numPC'ler | 150 |
| PCA/ICA: unmixType | Temporal |
| Olay Algılama: Çürüme Sabiti | 1.18 |
| Olay Algılama: Eşik | 4 |
Tablo 1: Veri işleme için değişkenlerin listesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlattığımız gibi amigdala gibi daha derin beyin bölgelerinde kafaya monte minyatür mikroskopi ile in vivo optik kalsiyum görüntülemede başarılı olmak için ustaca cerrahi teknikleri şarttır. Bu nedenle, bu protokol temel ataşman ve GRIN lens implantasyonunun optimize edilmiş cerrahi süreçleri için bir kılavuz sağlasa da, kritik adımlar için ek optimizasyon süreçleri gerekebilir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, cerrahide amigdala koordinatları, taban plakası ek adımında hava akışı hızı, kalsiyum kaydında görüntü alma ayarları (kare hızı, LED gücüvb.)ve veri işlemede değişkenlerin (ICA zamansal ağırlığı, olay en küçük çürüme süresivb.)optimize edilmesi gerekir.
Temel plaka eki adımı değiştirilebilir. Kafa plakası gereklidir, çünkü mobil ev kafesinde yapılan taban plakası ataşmanı sırasında uyanık farelerin başının sabitlemesine yardımcı olur. Ancak mobil ev kafesi laboratuvarda hazırlanmazsa izofluran gazı anestezi sistemi alternatif bir seçenektir. Bu alternatif yol için izofluran gazının konsantrasyonu kritik olabilir. %1,5 izofluran altındaki farelerin amigdalasında GCaMP sinyalinin nadiren tespit edildiğini gözlemledik. Aksine, GCaMP sinyali% 0.8 izoflurane durumu altında tespit edilir ve fareler neredeyse uyanık bir durumda kalır, ancak bu durumda önemli bir kafa hareketi olmadan. Bu anestezi durumu, kafa plakası ve mobil ev kafesi gibi ek cihazlar kullanmadan taban plakası ekinin yapılmasına izin verir.
Kafatası vidası, çimento, taban plakası ve mikroskobun dengesiz bağlanması, hareket düzeltme yazılımı algoritması kullanılarak düzeltilebilen hareket yapıtlarına neden olabilir. Lateral ventrikülün hareketinin, şu anda mevcut olan hareket düzeltme yazılımı ile kolayca düzeltilemeyen düzensiz bir hareket yapıtı türüne neden olduğu düşünülmektedir. Bu tür düzensiz hareket eserleri hipokampus ve korteks gibi yüzeysel beyin bölgelerinin çoğunda minimumdur. Ancak amigdalada optik görüntüleme sırasında sıklıkla tespit edilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bu protokol GRIN lensinin viral enjeksiyon bölgesinden lateral tarafa 50 μm uzağa yerleştirilmesini önerir (Şekil 1C), bu da lateral ventrikülden kaynaklanan potansiyel hareket yapıtlarını azaltarak görüntü alma sürecini büyük ölçüde iyileştirir. Viral enjeksiyon bölgesine göre 50 μm ayarlamamıza rağmen, lens implantasyonu için hedef koordinat da lateral ventriküle göre ayarlanabilir. Bu protokolde, görüntülemenin başarılı performansı için viral ifade sitesinin hassas bir şekilde hedeflendiğinin daha kritik olduğunu belirledik. Böylece mercek implantasyonunun hedef koordinatını belirlemek için referans olarak viral enjeksiyon koordinatı kullandık. Tekrarlanan denemeler sayesinde, GRIN lensin lateral ventrikül hareketinin neden olduğu hareket yapıtlarından kaçınırken viral ekspresyografi bölgesini verimli bir şekilde hedeflemesini sağlayan en uygun durumu oluşturduk. Sonunda, herhangi bir hareket eserini verimli ve doğru bir şekilde düzeltebilecek yöntem, optik görüntülemeye gelecekte daha derin beyin bölgelerine erişmek için büyük yardımcı olacaktır.
Kafaya monte minyatür mikroskoplu in vivo optik kalsiyum görüntüleme güçlü bir araç olmasına ve optimize edilmiş olmasına rağmen, birçok açıdan iyileştirme için hala yer vardır. Bu protokol, özgürce davranan hayvanların amigdalasında gerçek zamanlı sinirsel aktiviteyi araştırmayı amaçlayan çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Samsung Bilim ve Teknoloji Vakfı'nın (Proje Numarası SSTF-BA1801-10) hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
