Summary
In vivo mikroskopisk calciumbilleddannelse er et uvurderligt værktøj, der muliggør realtidsovervågning af neuronale aktiviteter i frit barbering af dyr. Det har dog været vanskeligt at anvende denne teknik på amygdala. Denne protokol har til formål at give en nyttig retningslinje for vellykket målretning amygdala celler med en miniaturiseret mikroskop i mus.
Abstract
In vivo real-time overvågning af neuronale aktiviteter i frit bevægelige dyr er en af de vigtigste tilgange til at forbinde neuronal aktivitet til adfærd. Til dette formål er en in vivo billeddannelsesteknik, der registrerer calciumtransienter i neuroner ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer (GECIs), et miniaturiseret fluorescensmikroskop og en gradient brydningsindeks (GRIN) linse udviklet og anvendt med succes på mange hjernestrukturer1,2 ,3,4,5,6. Denne billeddannelsesteknik er særlig kraftfuld, fordi den muliggør kronisk samtidig billeddannelse af genetisk definerede cellepopulationer i en længere periode op til flere uger. Selvom det er nyttigt, er denne billeddannelsesteknik ikke let blevet anvendt på hjernestrukturer, der lokaliserer dybt inde i hjernen, såsom amygdala, en vigtig hjernestruktur til følelsesmæssig behandling og associativ frygthukommelse7. Der er flere faktorer, der gør det vanskeligt at anvende billeddannelsesteknikken på amygdala. For eksempel forekommer bevægelsesartefakter normalt oftere under billeddannelsen udført i de dybere hjerneområder, fordi et hovedmonteringsmikroskop implanteret dybt i hjernen er relativt ustabilt. Et andet problem er, at lateral ventrikel er placeret tæt på den implanterede GRIN linse og dens bevægelse under respiration kan forårsage meget uregelmæssig bevægelse artefakter, der ikke let kan korrigeres, hvilket gør det vanskeligt at danne en stabil billeddannelse opfattelse. Da cellerne i amygdala normalt er stille i hvile- eller bedøvet tilstand, er det desuden svært at finde og fokusere målcellerne, der udtrykker GECI i amygdala under baseplating-proceduren til senere billeddannelse. Denne protokol giver en nyttig retningslinje for, hvordan man effektivt målrette celler udtrykke GECI i amygdala med hoved-mount miniaturiseret mikroskop for vellykket in vivo calcium imaging i sådan en dybere hjerne region. Det skal bemærkes, at denne protokol er baseret på et bestemt system (f.eks.
Introduction
Calcium er en allestedsnærværende anden messenger, der spiller en afgørende rolle i næsten alle cellulære funktioner8. I neuroner, handling potentielle fyring og synaptisk input forårsage hurtig ændring af intracellulære fri [Ca2 +]9,10. Derfor giver sporing af calciumtransienter en mulighed for at overvåge neuronal aktivitet. GECIs er kraftfulde værktøjer, der gør det muligt at overvåge [Ca2+] i definerede cellepopulationer og intracellulære rum11,12. Blandt mange forskellige typer proteinbaseret calciumindikator er GCaMP, en Ca2 + sonde baseret på et enkelt GFP-molekyle13, den mest optimerede og dermed udbredte GECI. Gennem flere runder af teknik, en række varianter af GCaMP er blevet udviklet12,14,15,16. Vi bruger en af de nyligt udviklede GCaMPs, GCaMP7b, i denne protokol16. GCaMP sensorer har i høj grad bidraget til studiet af neurale kredsløb funktioner i en række model organismer såsom billeddannelse af Ca2 + transienter under udvikling17, in vivo billeddannelse i et bestemt kortikalt lag18, måling af kredsløb dynamik i motor opgave læring19 og billeddannelse af celle ensemble aktivitet i forbindelse med associative frygt hukommelse i hippocampus og amygdala20,21.
Optisk billedbehandling af GECIs har flere fordele22. Genetisk kodning gør det muligt at udtrykke GECIs stabilt i en længere periode i en bestemt delmængde af celler, der er defineret ved genetisk profil eller specifikke mønstre for anatomisk forbindelse. Optisk billeddannelse muliggør in vivo kronisk samtidig overvågning af hundreder til tusinder af neuroner hos levende dyr. Der er udviklet et par optiske billeddannelsessystemer til in vivo-billeddannelse og analyse af GECIs i hjernen hos frit barberende mus med miniaturiserede fluorescensmikroskoper21,23,24,25. På trods af in vivo optisk billeddannelse teknik baseret på GECIs, GRIN linse, og et hoved-mount miniature mikroskop er et kraftfuldt værktøj til at studere forbindelsen mellem neurale kredsløb aktivitet og adfærd, anvende denne teknologi til amygdala har været vanskeligt på grund af flere tekniske problemer i forbindelse med målretning grin linsen til celler udtrykke GECIs i amygdala uden at forårsage bevægelse artefakter, der alvorligt reducere kvaliteten af billedopsamling og finde celler udtrykke GECIs. Denne protokol har til formål at give en nyttig retningslinje for kirurgiske procedurer for bundplade vedhæftet fil og GRIN linse implantation, der er kritiske skridt for en vellykket in vivo optisk calcium billeddannelse i amygdala. Selvom denne protokol er rettet mod amygdala, er de fleste procedurer, der er beskrevet her, almindeligt anvendelige for andre dybere hjerneregioner. Selv om denne protokol er baseret på et bestemt system (f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Animal Ethics Committee på Korea Advanced Institute of Science and Technology. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjen fra Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -brug.
BEMÆRK: Denne protokol består af seks vigtige trin: virusinjektionskirurgi, GRIN-linseimplantatkirurgi, validering af GRIN-linseimplantation, bundpladetilbehør, optisk optagelse af GCaMP-signal under en adfærdstest og databehandling (Figur 1A). Bortset fra kirurgi anvendes den kommercielle softwarepakke (Inscopix).
1. Stereotaxic kirurgi – AAV Virus injektion
BEMÆRK: Den musestamme, der anvendes i denne kirurgiske procedure, er C57BL6/J. Dyrets krop er dækket af en steril drapering under operationen, og alle trin i protokollen udføres med sterile handsker. Flere operationer udføres normalt ikke samme dag. Men hvis flere mus skal have den samme operation samme dag, skal du bruge et separat sæt autoklaveret kirurgisk værktøj til hver mus og 70% ethanol til at desinficere de kirurgiske instrumenter mellem mus. For at holde musen varm under den kirurgiske procedure er musen dækket af et skræddersyet kirurgisk tæppe efter fastgjort til den stereotaxiske ramme.
- Desinficere alle nødvendige kirurgiske værktøjer med 70% ethanol, og forberede en Hamilton sprøjte og et glas pipette. Fyld glaspipetten med destilleret vand.
BEMÆRK: Alle kirurgiske værktøjer, der anvendes i protokollen er autoklaveret. Da GRIN-linsen og kranieskruerne ikke kan autoklaveres til sterilisering, anvendes 70 % ethanol som desinfektionsmiddel for at forhindre betændelse. Selv om andre former for sterilisering ikke er afprøvet, kan de anvendes, f.eks. - Bedøve musen med pentobarbital (83 mg∙ kg-1 af kropsvægt) ved intraperitoneal injektion. Når musen bliver bevidstløs, barber pelsen på kraniet.
- Rengør huden over kraniet med 70% ethanol og fastgør musen til den stereotaxiske ramme. Fjern forsigtigt huden og tør kraniets overflade af med en 35% brintoverilteopløsning ved hjælp af en bomuldsspidsapplikator. Påfør smøremiddel øjensalt for at forhindre hornhindetørring under operationen.
BEMÆRK: Selvom der normalt ikke er noget problem med kun at bruge 70% ethanol til aseptisk hudpræparat, anbefales det at bruge 3 vekslende runder desinfektionsmiddel, f.eks. iodophors eller chlorhexidinopløsning og 70% ethanol. Højere koncentration af brintoverilte anvendes i denne protokol for at sikre, at bindevæv på museskallen fjernes så fuldstændigt som muligt, hvilket er afgørende for at reducere bevægelsesartefakt under senere billeddannelse, fordi bindevævet på kraniet forstyrrer en fast fast fastgørelse af bundpladen til kraniet. Det skal bemærkes, at 35% brintoverilte er meget højere end det, der normalt anvendes (3 %). - Fastgør stiften med en stereotaxisk sondeholder. Juster højden af bregma og lambda med stiften.
- Find den specifikke placering på musekraniet til kraniotomi.
BEMÆRK: Koordinaterne for lateral amygdala (LA) til virusinjektion er (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) fra bregma i denne protokol (AP; Anterior-Posterior, ML; Medial-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, hver forkortelse angiver relativ aksial afstand fra bregma)26. Koordinaterne skal optimeres til hver eksperimentel tilstand. - Bor kraniets overflade(Figur 1B). Vask kraniefraktioner med fosfat buffered saltvand (PBS). Fjern det resterende lag ved hjælp af pincet eller en 27 G nål.
- Når du borer kraniet, skal du prøve ikke at røre ved det sidste duralag for at undgå skader på hjernevævets overflade. En beskadiget hjerneoverflade forårsager betændelse omkring linsen, som fremkalder alvorlige bevægelse artefakter og høj autofluorescens under optagelsen. Størrelsen af craniotomy er 1,6 mm. Borehastigheden er 18.000 omdrejninger i minuttet, og bitstørrelsen er 0,6 mm.
- For at sænke GRIN-linsen fra hjernevævsoverfladen på det borede sted til mål amygdala-stedet skal du beregne den afstand, der er navngivet som "Værdi A", ved at trække DV-forskellen mellem bregma og den eksponerede hjerneoverflade fra DV-koordinaten af linseimplantationen, som er indstillet baseret på bregma (4,2 mm i dette tilfælde figur 1C).
- 3 μL mineralsk olie og 0,7 μL af AAV-virusopløsningen i glaspipetten.
BEMÆRK: Mineralsk olie hjælper med at adskille virusopløsning og vand. 0,7 μL er et optimeret volumen til LA-virusinjektionen, som fuldt ud kan dække LA. - Fjern stiften fra den stereotaxiske sondeholder, og fastgør glaspipetten til den.
- Find glaspipetten på injektionsstedet, der er nævnt i trin 1.5. Sæt glaspipetten ind i hjernevævet, når blødningen er helt stoppet.
- Levere virus gennem et glas pipette ved hjælp af en injektion pumpe.
BEMÆRK: Virusets titer skal være højere end 1 x 1013 vg/mL for at opnå et tilstrækkeligt antal GCaMP-udtryksceller. Injektionshastigheden er 0,1 μL/min. og diffus i 10 min. Hvis der er blødning, vask hjernens overflade med PBS. Hold hjerneoverfladen våd i dette trin. - Når injektionen er afsluttet, skal du langsomt fjerne glaspipetten.
2. Stereotaxic kirurgi – GRIN linse implantation
BEMÆRK: GRIN linse implantat kirurgi er det mest kritiske skridt i denne protokol. Da en konsekvent langsom hastighed grin linse bevægelse er afgørende for en vellykket GRIN linse implantation, en motoriseret kirurgi arm kan være nyttig. Den motoriserede kirurgi arm er en stereotaxic manipulator, der styres af computersoftware. Selvom den motoriserede arm bruges i denne protokol, kan andre måder også bruges, så længe linsen bevæger sig konsekvent og langsomt under implantation. Detaljerede oplysninger om enheden findes i tabellen over materialer.
- Bor kraniet for at implantere to kranieskruer. Vask alle kraniefraktioner med PBS.
BEMÆRK: For at reducere bevægelsesartefakterne i senere optisk billedbehandling kræves der mindst to skruer. De to kranieskruer og GRIN-linsens implantatposition danner en ligesidet trekant (Figur 1B). Craniotomyens størrelse skal tæt passe med skruens diameter. Hvis der er blødning, vask den blødende overflade med PBS. Borehastigheden er 18.000 omdrejninger i minuttet, og bitstørrelsen er 0,6 mm. - Desinficer skruerne med 70% ethanol for at forhindre betændelse. Implantat skruerne så dybt som muligt.
BEMÆRK: Skruerne skal fastgøres tæt uden yderligere vedhæftning, f.eks. cement. - Installer en motoriseret kirurgi arm på den stereotaxic ramme. Tilslut den nødvendige hardware til den bærbare computer, hvor styring af software er installeret (Tabel over materialer).
- Før du sænker GRIN-linsen, skal du forberede dig på at lave et nålespor med en 26 G nål.
BEMÆRK: Nålesporet er en slags guidespor, der hjælper med at implantere den relativt tykke GRIN-linse i dybe hjerneområder som amygdala uden at forårsage en alvorlig forvrængning af hjernestrukturen langs injektionsstien. Denne guide spor kaldes en nål spor, fordi det er lavet af en sænkning og opløftende procedure af relativt tynde 26 G nål. - Fastgør kanyleholderen for at holde nålen på den stereotaxiske ramme.
- Tag fat i 26 G-nålen med kanyleholderen, og beregn koordinaterne for nåleindføringsstedet.
BEMÆRK: I denne protokol er koordinaterne for nåleindsætningsstedet 50 μm lateral fra virusinjektionsstedet (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm). - Få adgang til den styrende software og komplet forberedelse til at manipulere nålen position.
- Kør styringssoftwaren, og vælg knappen Start nyt projekt for at starte styringen af sessionen.
BEMÆRK: I den styrende session er der flere tomme bokse og menuknapper. De tomme bokse er inputplads til koordinater. Når du har indtastet koordinater i de tomme bokse, bevæger den motoriserede stereotaxiske arm sig ved at klikke på knappen Gå til. Knappen Gå til ændres til en STOP-knap, når den stereotaxiske arm bevæger sig. Blandt flere menuknapper kræves kun knappen Værktøj i denne protokol. - Klik på knappen Værktøj. Kalibrer styringssoftwaren ved at klikke på knappen Kalibrer rammemenuen. Kalibrering er den proces, hvor den faktiske position manipulator er indstillet som værdier på Stereodrive software.
- Kør styringssoftwaren, og vælg knappen Start nyt projekt for at starte styringen af sessionen.
- Find nålespidsen på den blottede hjerneoverflade på kraniets overflade ved hjælp af stereotaxisk manipulator.
BEMÆRK: Nålens hastighed indstilles ved hjælp af menuen Microdrive-hastighed i værktøjsmenuen. Standardhastigheden er 3,0 mm/s. En hastighed på 0,5 mm/s anbefales dog i dette trin. Nålens bevægelse styres af piletasterne. - Tilsæt 2-3 dråber PBS for at holde hjerneoverfladen våd. Udfyld det tomme felt på computerskærmen med de relevante DV-koordinater for LA. Hvis hjerneoverfladen er tør, hindrer det nålens indtrængen i hjernevævet.
- Sænk 26 G-nålen ved at klikke på knappen Gå til. Den stopper automatisk, når nålen når det målsted, der er indstillet af DV-koordinater. Nålens hastighed er 100 μm/min. Hvis der er blødning, skal du stoppe nålen ved at klikke på STOP-knappen og vaske hjerneoverfladen med PBS. Hold hjerneoverfladen våd i dette trin. Når blødningen er stoppet, skal du begynde at sænke igen.
- Når nålen helt holder op med at bevæge sig, skal du indtaste 45,00 mm i den tomme boks på computerskærmen.
BEMÆRK: 45,00 mm er en dv-koordinatværdi, der får nålen til at vende tilbage til udgangspositionen. - Løft nålen ved at klikke på knappen Gå til. Nålebevægelsens hastighed er 100-200 μm/min.
- Når nålen holder op med at bevæge sig, skal du fjerne PBS på hjerneoverfladen. Afinstaller kanylen og kanyleholderen fra den stereotaxiske ramme. Eksperimentatoren kan manuelt stoppe nålen ved at klikke på STOP-knappen, når det er nødvendigt.
- Udstyr den stereotaxiske stang med linseholderen. Installer GRIN-linsen på linseholderen.
BEMÆRK: GRIN-linsen, der er optimeret til målretning af LA (0,6 mm i diameter, 7,3 mm i længden), bruges i denne protokol. Hvis linsen indehaveren ikke er forberedt, en alternativ måde er at bruge en bulldog klip til at greb GRIN linsen. - Desinficer linsen med 70% ethanol og fastgør den stereotaxiske stang til de stereotaxiske rammer.
- Find spidsen af GRIN-linsen på det udpegede sted på kraniets overflade (samme metode beskrevet i trin 2.8).
BEMÆRK: Koordinaten for GRIN-linsen er (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (Figur 1C). Linsen bør ikke røre kraniet for at undgå skader på spidsen. - Dv-koordinaten beregnes ved at trække den absolutte værdi af "Værdi A" fra DV-koordinaten for den linseimplantation, der er beskrevet i trin 2.16.
- Drop 2-3 dråber PBS på hjernens overflade. Indtast 1000 μm for sænkning og 300 μm for at hæve linsen i den tomme boks på computerskærmen.
- Sænkning (1000 μm nedad) og 300 μm opadgående af GRIN-linsen, indtil den når målstedet. Denne op og ned procedure bruges til at hjælpe med at frigive det tryk, der genereres inde i hjernevævet på grund af sænkning procedure linse, der ellers kan forårsage forvrængning af hjernens strukturer langs implantation sti.
BEMÆRK: Hastigheden af GRIN linsen bevægelse er 100 μm/min. Selv hvis der er blødning, må du ikke stoppe med at flytte GRIN-linsen og vaske hjerneoverfladen med PBS. Hold hjerneoverfladen våd i dette trin. Hvis hjernens overflade er tør, hjernevæv klæber til GRIN linsen overflade, og det forårsager forvrængning af hjernens struktur. - Hvis GRIN-linsen når målstedet, skal du fjerne PBS og forsigtigt anvende harpiksandcementen omkring GRIN-linsen, skruerne og deres sidevæg (Figur 1D).
BEMÆRK: Anvendelse af harpikscement over hele kraniet kan reducere bevægelsesartefakter. Tværtimod, hvis harpikscementen ved et uheld dækker musklerne fastgjort til kraniet, øger det bevægelsesartefakter. - Efter harpiks dental cement hærder, adskille GRIN linsen fra linsen indehaveren og anvende akryl cement over hele kraniet (Figur 1D).
- For at fastgøre hovedpladen skal du adskille linseholderen fra den stereotaxiske stang og fastgøre hovedpladen på spidsen af stangen ved hjælp af bånd. Bekræft, om hovedpladen er vandret.
BEMÆRK: En vippet hovedplade giver en vippet visning. Der kræves en hovedplade til fastgørelse af musehovedet i det mobile hjemmebursystem (i fastgørelsesafsnittet). Hvis eksperimentatoren ikke bruger systemet, skal du springe dette trin over (trin 2.22) og følgende trin 2.23. - Sænk langsomt stangen, indtil hovedpladen lokaliseres øverst på linsemanchetten. Sænk hovedpladen 1000 μm mere. Flyt hovedpladen for den implanterede GRIN-linse for at finde den højre kant af hovedpladens indvendige ring.
BEMÆRK: Hovedpladen skal placeres lavere end den implanterede GRIN-linseoverflade. Ellers kan mikroskopet ikke nærme sig tæt nok på den implanterede GRIN-linse til justering af brændplanet på grund af akrylscementen. - Påfør akrylcement for at fastgøre hovedpladen til cementlagene (Figur 1D).
- Fastgør paraffinfilm på den implanterede GRIN-linseoverflade for at beskytte linseoverfladen mod støv. Påfør derefter aftagelig epoxybinding på paraffinfilmen for at holde paraffinfilmen tilbage på linseoverfladen.
- Indsprøjt Carprofen, et smertestillende middel (0,5 mg/mL i PBS), og Dexamethasone, et antiinflammatorisk lægemiddel (0,02 mg/mL i PBS) opløsning, i musens peritoneale hulrum.
BEMÆRK: Dosis af lægemidlet afhænger af kropsvægten: Carprofen (5 mg∙ kg-1 kropsvægt) og Dexamethasone (0,2 mg∙ kg-1 kropsvægt). Både Carprofen og Dexamethasone administreres efter operationen og en gang om dagen i 7 dage efter operationen. - Bland 0,3 mg / mL amoxicillin, et antibiotikum, i hjemmet bur vand til at administrere stoffet i 1 uge.
- Returner musen til hjemmeburet og lad 5-8 uger til genopretning og virustransduktion.
BEMÆRK: Musen genvindes i et forvarmet bur på et elektrisk tæppe, indtil musen vågner fra bedøvelsen.
3. Validering af GRIN-linseimplantationen
BEMÆRK: Validering af GRIN-linseimplantationen giver oplysninger om, hvorvidt den implanterede GRIN-linse er på mål for GCaMP, der udtrykker celler. Baseret på disse oplysninger sparer eksperimentatoren deres tid fra tidskrævende processer som adfærdstest og databehandling ved at udelukke dyr med off-targeted GRIN-linseimplantation. Under valideringsproceduren skal celler med GCaMP-udtryk fokuseres i registreringsfeltet. Et mobile home bur bruges i dette trin. Et mobile home bur er et specialiseret rundformet apparat, der gør det muligt for hovedfaste mus frit at bevæge deres ben under valideringen af GRIN-linseimplantationen og bundpladetilbehøret. Et luftløftningsbord i dette apparat, hvor benene på hovedfaste mus er placeret, muliggør en sådan fri bevægelighed for ben, selvom hovedet er fastgjort. Cellerne i den laterale kerne af amygdala er normalt stille i en hvilende eller bedøvet tilstand, så GCaMP fluorescens signaler er sjældent opdaget under disse forhold, hvilket gør det meget vanskeligt, til tider umuligt, at finde celler, der udtrykker GCaMP under valideringen af GRIN linse implantation og bundplade vedhæftet fil. Men bevægelsen af ben producerer ofte GCaMP fluorescenssignaler i cellerne af lateral kerne af amygdala og derved kan bidrage til at lokalisere mikroskopet. Således bruges mobile home buret i denne protokol.
- Saml den stereotaxiske manipulator til mobile home bursystemet.
- Bedøve musen med 1,5% isoflurane gas. Når musen er helt bevidstløs, skal du placere musen på hovedbjælken i mobile home bursystemet.
- Find kulstofburet under musen. Luk kulstofburet og tænd luftstrømmen for at få buret til at bevæge sig frit uden friktion. Vent et par minutter, indtil musen bliver aktiv.
BEMÆRK: Luftstrømmens hastighed skal optimeres for hver eksperimentel tilstand (her 100 L/min). - Fjern paraffinfilm og epoxybinding på overfladen af den implanterede GRIN-linse, og tør linseoverfladen af med 70 % ethanol ved hjælp af linsepapir.
- Forbered daq-softwaren (data acquisition) (f.eks. Angiv billedbetingelserne.
BEMÆRK: DAQ-softwaren bruges til styring af mikroskopet (LED-effekt, linsefokusosv. .) og datalagring.- Tænd DAQ-boksen, og tilslut et mikroskop til den. Tilslut den derefter til en bærbar computer enten direkte ved hjælp af et kabel eller via trådløst internet.
BEMÆRK: DAQ-softwaren installeres i den ekstra hardware kaldet DAQ box (f.eks. Inscopix). Ved at forbinde DAQ-boksen til den bærbare computer bliver DAQ-software tilgængelig i en bærbar computer. - Få adgang til DAQ-softwaren via en internetbrowser (Firefox anbefales).
- Angiv alle de nødvendige detaljer (Dato, muse-idosv.)i den definerede session. Klik derefter på Gem og fortsæt. Når du har gemt , skal du åbne kør sessionen.
- I kør sessionenskal du angive billedbetingelserne, f.eks.
BEMÆRK: Forstærknings- og eksponerings-LED-effekt kan skiftes afhængigt af laboratorieforholdene. Den anbefalede værdi for elektrisk fokus er 500, og eksponeringstiden er 50 ms. Der er ingen begrænsning for at ændre LED-effekt og gevinst. Men en højere intensitet af lys kan forårsage mere blegning. Eksponeringstiden for optagelse bestemmer en billedhastighed for videooptagelse. Højere billedhastigheder reducerer signalintensiteten. Billedhastigheder skal optimeres til de GECIs, der bruges til afbildningen.
- Tænd DAQ-boksen, og tilslut et mikroskop til den. Tilslut den derefter til en bærbar computer enten direkte ved hjælp af et kabel eller via trådløst internet.
- Hvis du vil holde mikroskopet på en stereotaxisk manipulator, skal du fastgøre den stereotaxiske stang med mikroskopgriber til stereotaxisk manipulator.
BEMÆRK: Griberen er et lille tilbehør, der kan fastgøres til det stereotaxiske apparat for at holde et mikroskopkrop for at placere det på målhjernens placering. - Tag fat i mikroskopet med mikroskopet gripper. Tænd led-lampen, der er tilsluttet mikroskopet, og juster mikroskopet lodret. Sænk mikroskopet, mens du observerer billedet, indtil overfladen af implanteret GRIN-linse dukker op.
- Juster midten af den implanterede GRIN-linse med midten af visningen.
BEMÆRK: Validering af GRIN-linseimplantationen kan udføres i dette trin (nævnt i resultatafsnittet, figur 2B, figur 2D, figur 2F). - Tag billede af den implanterede GRIN-linseoverflade (klik på Prt Sc-knappen på tastaturet). Billedet af den implanterede GRIN-linseoverflade er påkrævet for at fravælge ikke-neuronale komponenter under senere databehandling (trin 6.8).
- Find den rette placering af mikroskopet. Langsomt hæve den objektive linse af mikroskop, mens observere billedet for at søge efter celler med GCaMP7b udtryk.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere forstærkningen af billedopsamlingen eller eksponerings-LED-strømmen. Validering af GRIN-linseimplantationen kan udføres i dette trin (nævnt i resultatafsnittet, figur 2A, figur 2C, figur 2E).
4. Fastgørelsesplade
BEMÆRK: Trinnet til fastgørelse af bundpladen følger valideringen af GRIN-linseimplantation. Bundpladen er en platform til montering af mikroskopet til musens hoved. Som nævnt i det foregående afsnit anvendes et mobile home bur i denne protokol.
- Efter validering grin linse implantation, adskille en miniature mikroskop fra mikroskop gripper.
- Fastgør bundpladen til mikroskopet. Skruen strammes ved hjælp af hex-tasten for stabil fastgørelse af bundpladen til mikroskopet.
- Tag fat i mikroskopet med mikroskopet gripper. Tænd led-lampen, der er tilsluttet mikroskopet, og juster mikroskopet lodret. Sænk mikroskopet, indtil overfladen af implanteret GRIN-linse er observeret. Juster midten af den implanterede GRIN-linse med midten af visningen.
- Find den rette placering af mikroskopet. Løft langsomt mikroskopets objektive linse, indtil du finder et brændplan, der giver de bedste billeder af celler med GCaMP7b-udtryk (Figur 2A).
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere forstærkningen af billedopsamling eller eksponerings-LED-effekt i dette trin. - Påfør akrylcement for at fastgøre bundpladen til hovedpladen (Figur 2G). Opbyg sidevæggene med akrylcement mellem bundpladen og hovedpladen.
BEMÆRK: Akrylcement krymper, når det hærder. Af denne grund må du ikke fjerne mikroskopet, før cementen helt hærder (dette trin tager mindst 30 minutter). Cementering bør gøres meget omhyggeligt for at undgå uønsket cementering af mikroskopet og dets objektive linse med akrylcement. - Efter akryl cement helt hærder, løsne skruen og hæve mikroskop kroppen langsomt.
- Hvis der er et hul på sidevæggen, skal du gentage yderligere cementering for at beskytte den implanterede GRIN-linse mod støv.
- Dæk bundpladen for at beskytte den implanterede GRIN-linse mod støv og stram skruen på bundpladen.
- Slip hovedpladen ud af hovedstangen. Vend musen tilbage til hjemmeburet indtil fremtidig optisk billedbehandling.
5. Optisk optagelse af GCaMP-signal under en adfærdstest
BEMÆRK: Proceduren for GCaMP-signalregistrering under adfærd kan være meget forskellig afhængigt af de systemer, der bruges til optisk billeddannelse, eksperimentelt design og laboratoriemiljø. Derfor er det beskrevet på en enkel måde i dette afsnit.
- Udfør flere dages håndtering før adfærdstesten.
- Forbered adfærdsapparatet (f.eks. frygtkonditioneringskammer, adfærdssoftware og Coulbourn-instrumentet) og bærbar computer.
- Tilslut mikroskopet til DAQ-boksen, og tænd DAQ-boksen.
- Tilslut DAQ-boksen til bærbar computer via trådløs internetforbindelse.
- Start DAQ-softwaren (Firefox-browser anbefales) på den bærbare computer. Klik på knappen Filhåndtering, og kontroller den resterende lagerkapacitet i DAQ-boksen for at gemme registrerede data.
BEMÆRK: Datastørrelsen er ca. 80 GB for 30 minutters optagelse. - Angiv de nødvendige oplysninger (Dato, muse-idosv. .) i den definerede session, og gå ind i sessionen Kør.
- Tag forsigtigt fat i musen og fjern bundpladedækslet på hovedet. Placering af mikroskopet på bundpladeplatformen.
- Stram bundpladeskruen og læg dyret med et hovedmonteringsmikroskop ind i adfærdskammeret.
BEMÆRK: Musen forsøger at flygte i dette trin, hvis håndteringen ikke er nok. - Tilslut NI-brættet til DAQ-porten ved hjælp af et BNC-kabel. NI board modtager TTL-signaler fra adfærdssoftware (f.eks. FreezeFrame) og koordinerer samtidig optagelsesprocedure for GCaMP-signal og dyrets adfærd.
- Juster brændplanet.
BEMÆRK: Brændplanet bestemmes af afstanden mellem mikroskopets objektive linse og GRIN-linsen implanteret i hjernen. For at justere brændplanet manipuleres den objektive linseposition under observation af billeder. Afstanden mellem de to linser, der viser klar morfologi af celler og blodkar er indstillet som brændplan for billeddannelse. I denne protokol bruges DAQ-softwaren til at styre bevægelsen af den objektive linse under justering. - Indstil den optimerede eksponeringstid, forstærkning, LED-effekt i Kør session.
BEMÆRK: Generelt bruges 50 ms til eksponeringstid. Forstærknings- og LED-effekt indstilles baseret på billed histogrammer. Histogrammer angiver fordelingen af pixels fluorescensintensitet. Baseret på visuel inspektion skal histogrammets højre kant have en værdi på mellem 40% og 60% for GCaMP7b. Den ændres afhængigt af de GECIs, der bruges til billedbehandling. - Skift optagelsesindstilling til Udløst optagelse. Klik på Optag, og start funktionsmåden.
BEMÆRK: Den udløste optagelsesindstilling giver en matchet tidslinje for optagelsessessionen og adfærdssessionen. Hvis TTL-signalet modtages, tændes et rødt lys over TRIG-porten. - Når opførselstesten er afsluttet, skal du tage mikroskopet af og fastgøre bundpladedækslet.
- Sæt musen tilbage i hjemmeburet. Vælg derefter Filhåndtering, og eksporter data fra daq-boksen.
- Efter adfærdstesten skal du ofre musen for histem histologisk verifikation efter døden.
6. Databehandling
BEMÆRK: Databehandlingsproceduren er meget forskellig afhængigt af databehandlingssoftwaren og de GECIs, der bruges til billedeksperimentet. Derfor er det beskrevet på en enkel måde i dette afsnit. Denne protokol bruger kommerciel databehandlingssoftware (se Materialeoversigt). Alternativt kan anden open source-software, der er nævnt i diskussionsafsnittet, også bruges uden problemer. De variabler, der bruges i denne protokol, er angivet i tabel 1.
- Importer videodatafilen til optagelse (1280 pixel x 800 pixel) fra DAQ-boksen til stationær computer til databehandling. Start databehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Databehandlingssoftware er forskellig fra DAQ-software i tidligere trin. I databehandlingssoftware er der 6 trin: ned-prøveudtagning, beskæring, rumligt filter, bevægelseskorrektion, ΔF / F beregning, hændelsesregistrering, der er nødvendige for at udtrække enkeltcelle calcium forbigående data fra optaget video. - Nedsample og beskære videoen.
BEMÆRK: Nedsampling og beskæring er nødvendige for at øge databehandlingshastigheden. Beskær området undtagen interesseområde, hvor GCaMP-signalet observeres. - Anvend rumligt filter. Når du har anvendt rumligt filter, skal du oprette et projektionsbillede for middelintensitet.
BEMÆRK: Rumligt filter skelner mellem hver pixel i optaget videobillede og giver et billede med stor kontrast. Der findes to typer afskæringsfilter, lavt og højt afskæringsfilter. Den højere værdi af lav cut-off filtre øger kontrasten i billedet, men på samme samlede grå støj også stiger. Den lavere værdi af høj cut-off filter gør billedet bliver sløret. - Anvend bevægelseskorrektion. Brug det gennemsnitlige intensitetsprojektionsbillede som referencebillede til bevægelseskorrektion.
- Anvend bevægelseskorrektion igen ved hjælp af billedet af den første ramme som referencebillede.
BEMÆRK: To trin i bevægelseskorrektion reducerer bevægelsesartefakt betydeligt. - Anvend ΔF/F-beregning for at visualisere pixel, der viser en ændring i lysstyrken.
BEMÆRK: Lysstyrkeændringen af pixels skyldes fluorescensintensitetsændringen af GCaMP, og det indikerer calciumtransienter. - Påfør PCA/ICA-algoritmen for at visualisere calciumtransientkurven for hver celle.
BEMÆRK: PCA/ICA er en algoritme til sortering af en gruppe data i et sæt enkeltkomponentdata. Variablerne skal optimeres for hver laboratorietilstand. I denne protokol er alle variabler standard undtagen ICA-tidsmæssig vægt (0,4 bruges i denne protokol)27. - Fravælg manuelt ikke-neuronale komponenter blandt identificerede komponenter baseret på de kriterier, der er beskrevet i følgende note.
BEMÆRK: Der anvendes to hovedkriterier til dette formål. For det første, GCaMP signal stammer fra en neuron ligner en klar sfærisk form. Således er det kun signalet med en klar sfærisk form, der vælges som en neuron. For det andet, i betragtning af diameteren af cellekroppen af amygdala pyramidecelle er kendt for at være ca 20 μm28,29,30, kun signalet groft matcher med denne størrelse er valgt som en neuron. For at bestemme størrelsen på GCaMP-signalet beregnes den faktiske størrelse på en enkelt pixel ud fra det hentede billede af linseoverfladen (trin 3.9), og den maksimale bredde af en enkelt sfærisk figur beregnes. I denne protokol er diameteren af den implanterede GRIN-linse f.eks. 600 μm. Derfor, hvis diameteren af linsen er 800 pixels, den faktiske størrelse af den enkelte pixel er 1,5 μm (20 μm er omkring 7 pixels). - Påfør hændelsesdetekteringsfunktionen for at opdage en betydelig stigning i calciumtransienten (calciumhændelse).
BEMÆRK: I dette trin kræves variablen kaldet hændelses mindste henfaldstid (τ). I denne protokol bruges 1.18s som en optimeret variabel til GCaMP7b. Den gennemsnitlige halv henfaldstid (t1/2=0,82s) beregnes på basis af ΔF/F-kurven under cellernes spontane aktivitet. Da GCaMP følger eksponentiel henfald, τ =
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering af GRIN-linseimplantation
Før bundpladen sættes kronisk fast på hjernen ved cementering, skal GRIN-linseimplantationen valideres. Hos dyr med vellykket linseimplantation blev både GCaMP, der udtrykker celler og blodkar, tydeligt observeret inden for et brændplanområde bestemt af afstanden mellem objektiv linse af mikroskop og implanteret GRIN-objektiv (Figur 2A og B). I modsætning hertil blev der hos dyr med implantation uden for målet ikke observeret et klart billede af GCaMP, der udtrykker celler inden for brændplanområdet (enten ude af fokus eller ude af syne). I tilfælde af ude af fokus kunne velfokuserede blodkar observeres, men kun slørede billeder til celler inden for brændplanområdet (figur 2C og D). I tilfælde af ude af syne blev blodkarrene ikke observeret i de fleste tilfælde, og der blev ikke fundet noget fluorescenssignal inden for brændplanområdet (Figur 2E). Desuden viste den implanterede GRIN-linse i modsætning til andre tilfælde en lys kant (Figur 2F). Bundpladen vedhæftet fil udføres kun på validerede dyr med på målet GRIN linse implantation.
Optagelse af GCaMP-signaler i LA-neuron som reaktion på auditive stimuli
I denne protokol blev 4 forekomster af pseudorandomiseret tone (2,8 kHz, 200 ms varighed, 25 impulser) præsenteret for en mus, og GCaMP-signaler blev optisk registreret i LA-cellerne hos mus med hovedmonteringsmikroskop. Mus injiceret med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE i den ensidige laterale amygdala blev brugt til billeddannelsen. Hos dyr med vellykket GRIN-linseimplantation blev virus, der udtrykker celler og blodkar, tydeligt observeret inden for brændplanområdet (Figur 3A). I adfærdstilstanden viste ca. 50-150 celler normalt en signifikant fluorescensændring i synsfeltet i LA, selv uden tone som vist i ΔF/F-billedet, sandsynligvis spontant aktive celler (Figur 3B). Ved tonepræsentation viste kun nogle få celler en tonespecifik ændring af GCaMP-signalet som bestemt af ΔF/F-billedanalyse (6 celler i figur 3C og figur 3D). De samme procedurer blev udført på mus injiceret med AAV2/1-CaMKIIα-GFP som en kontrol. Selv om GFP-udtryksceller blev påvist inden for brændplanområdet, viste ingen celler en signifikant fluorescensændring med eller uden tone som bestemt af ΔF/F-billedanalyse (Figur 3E og Figur 3F).
Til histologisk verifikation af GCaMP-ekspression og målretning af GRIN-linse undersøges koronale dele af postmortemhjernen under fluorescensmikroskopet (Figur 4A og Figur 4B). DAPI farvning bruges til at bekræfte intakte celler og ingen tegn på vævsskader på grund af betændelse i hjernevævet omkring GRIN linsen (Figur 4C).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang og diagrammer til stereotaxisk kirurgi for in vivo mikroskopisk calciumbilleddannelse i LA. (A) En skematisk arbejdsgang for in vivo mikroskopisk calciumbilleddannelse i LA. (B) Et mikroskopisk billede, der viser todimensionelle koordinater for kraniotomisteder for virusinjektionen og GRIN-linseimplantatoperationen. To kranieskruer og linsen danner en ligesidet trekant. (C) Et diagram over den relative position mellem virusinjektionsstedet og den implanterede GRIN-linse og en skematisk forklaring på beregningen af "Værdi A". (D) Tværsnit af cementlaget fra kraniets overflade til hovedpladen i de sidste trin af operationen. Harpiks dental cement bør dække væggen af skruerne og implanteret GRIN linse. Akrylcement påføres harpiksens dentalcement. Hovedpladen er fastgjort på cementlaget. Paraffinfilm dækker den implanterede GRIN-linseoverflade og beskytter den mod støv. Aftagelig epoxybinding forhindrer afmontering af paraffinfilm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Validering af GRIN-linseimplantationen og konfiguration af cementlag efter fastgørelse af bundpladen. (A) Et repræsentativt endoskopisk snapshotbillede fra dyr med vellykket GRIN-linseimplantation. Både GCaMP, der udtrykker celler og blodkar, observeres tydeligt. (B) Snapshot billede af den implanterede GRIN linse overflade fra dyr med vellykket GRIN linse implantation. (C) Et repræsentativt endoskopisk snapshotbillede fra dyr med grinlinseimplantation uden for fokus. (D) Snapshot billede af den implanterede GRIN linse overflade fra dyr med out-of-fokus GRIN linse implantation. I tilfælde af out-of-fokus, blodkar er undertiden tydeligt observeret, men kun slørede billeder til celler inden for brændplanet rækkevidde. (E) Et repræsentativt endoskopisk snapshotbillede fra dyr med udsyn grinlinseimplantation. I tilfælde af ude af syne observeres blodkarrene ikke i de fleste tilfælde, og der registreres ikke noget fluorescenssignal inden for brændplanområdet. (F) Et øjebliksbillede af den implanterede GRIN linse overflade fra dyr med out-of-view GRIN linse implantation. I modsætning til andre tilfælde observeres den lyse kant i dette tilfælde. (G) Konfiguration af cementlag til fastgørelse af bundplade. Bundplade og hovedplade fastgøres af akrylcement. Der skal være et rum, der ikke er fyldt med akrylcement mellem bundpladen og GRIN-linsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Optagelse af GCaMP-signaler i LA-neuronerne. (A til C) Data indhentet fra en mus injiceret med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE. (A) Et repræsentativt endoskopisk snapshotbillede under en adfærdstest. GCaMP7b udtrykke celler og blodkar blev tydeligt observeret inden for brændplanområdet. (B) Et repræsentativt snapshotbillede, der viser ΔF/F-signalet. Hvid linje angiver celler, der viste en betydelig fluorescensændring i interesseområdet under adfærdstesten. Skalalinje = 50 μm. (C) Billede af den maksimale intensitetsprojektion. I alt 6 celler viste en tonespecifik ændring af GCaMP-signalet. Skalalinje = 50 μm. (D) Repræsentative ΔF/F-spor af toneresponsive celler. Hver farve svarer til hver enkelt celle med samme farve i panelet (C). (E og F) Data fra en mus injiceret med AAV2/1-CaMKIIα-GFP. (E) Et repræsentativt endoskopisk snapshotbillede under en adfærdstest. GFP- udtryk for celler blev tydeligt påvist inden for brændplanområdet. (F) Et repræsentativt snapshotbillede, der viser ΔF/F-signalet. Skalalinje = 50μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Histologisk verifikation af GRIN-linsens position og GCaMP7b-udtryk. (A) Et repræsentativt koronasektionsbillede, der viser GCaMP7b-udtryk i LA. Skalalinje = 200μm. (B) Forstørret billede. Skalabjælke = 50 μm. (C) Fluorescensmikroskopisk billede, der viser DAPI-farvningssignal. Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Faktor | Værdi |
| Geografisk ned samplingfaktor | 2 |
| Tidsmæssig ned prøvetagning faktor | 2 |
| Rumligt filter: Høj cut-off | 0.5 |
| Rumligt filter: Lav cut-off | 0.005 |
| Bevægelseskorrektion: Høj cut-off | 0.016 |
| Bevægelseskorrektion: Lav afskæring | 0.004 |
| Bevægelseskorrektion: Makstranslation | 20 |
| Referencerammen ΔF/F | Gennemsnitlig ramme |
| PCA/ICA: blockSize | 1000 |
| PCA/ICA: konvergensDereshold | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: icaTemporalWeight | 0.4 |
| PCA/ICA: antal pc'er | 120 |
| PCA/ICA: antal pc'er | 150 |
| PCA/ICA: unmixType | Tidsmæssige |
| Hændelsesregistrering: Henfaldskonstant | 1.18 |
| Hændelsesregistrering: Tærskel | 4 |
Tabel 1: Liste over variabler til databehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dygtige kirurgi teknikker er afgørende for at opnå en vellykket in vivo optisk calcium billeddannelse med hoved-mount miniature mikroskopi i dybere hjerne regioner såsom amygdala som vi beskrev her. Derfor, selv om denne protokol giver en retningslinje for optimerede kirurgiske processer af bundplade vedhæftet fil og GRIN linse implantation, yderligere optimering processer kan være nødvendige for kritiske trin. Som nævnt i protokolafsnittet skal amygdalakoordinater i kirurgi, luftstrømshastighed i fastgørelsestrin til bundplade, billedopsamlingsindstillinger (billedhastighed, LED-effektosv.)i calciumregistrering og variabler (ICA-tidsvægt, begivenheds mindste henfaldstidosv. .) i databehandling optimeres.
Trinnet til fastgørelse af bundpladen kan ændres. Hovedpladen er nødvendig, fordi den hjælper med at fastgøre hovedet af vågne mus under bundpladetilbehøret, der udføres i mobile home bur. Men hvis mobile home buret ikke er forberedt i laboratoriet, isoflurane gas anæstesi system er en alternativ mulighed. På denne alternative måde kan koncentrationen af isoflurangas være kritisk. Vi observerede, at GCaMP-signal sjældent påvises i amygdala hos mus under 1,5% isofluran. Tværtimod opdages GCaMP-signalet under en 0,8% isofluran tilstand, og mus forbliver i en næsten vågen tilstand, men uden væsentlig hovedbevægelse i denne tilstand. Denne bedøvelsestilstand giver således mulighed for at udføre bundpladetilbehøret uden at bruge yderligere enheder som hovedplade og mobile home bur.
Ustabil fastgørelse af kraniet skrue, cement, bundplade, og mikroskop kan forårsage bevægelse artefakter, der kan korrigeres ved hjælp af bevægelse korrektion software algoritme. Bevægelsen af lateral ventrikel menes at forårsage en uregelmæssig type bevægelse artefakter, der ikke let kan korrigeres med aktuelt tilgængelige bevægelse korrektion software. Sådanne uregelmæssige bevægelsesartefakter er minimale i de fleste overfladiske hjerneregioner som hippocampus og cortex. Det registreres dog ofte under optisk billeddannelse i amygdala. For at løse dette problem foreslår denne protokol at implantere GRIN-linsen 50 μm væk fra viral injektionssted til sidesiden (Figur 1C), hvilket i høj grad forbedrer billedopsamlingsprocessen ved at reducere de potentielle bevægelsesartefakter, der stammer fra lateral ventrikel. Selvom vi sætter 50 μm i forhold til det virale injektionssted, kan målkoordinaten for linseimplantation også indstilles i forhold til lateral ventrikel. I denne protokol begrundede vi, at det er mere kritisk præcist at målrette det virale udtrykssted for vellykket udførelse af billeddannelse. Således brugte vi en viral injektionskoordinat som en reference til at indstille målkoordinaten for linseimplantation. Gennem gentagne forsøg, etablerede vi en optimal tilstand, der tillod GRIN linse til effektivt at målrette viral udtrykke site og samtidig undgå bevægelse artefakter forårsaget af lateral ventrikel bevægelse. Til sidst, den metode, der effektivt og præcist kan korrigere enhver bevægelse artefakter ville være til stor hjælp for at få adgang til optisk billeddannelse til dybere hjerne regioner i fremtiden.
Selv om in vivo optisk calcium billeddannelse med hoved-mount miniature mikroskop er et kraftfuldt værktøj og er blevet optimeret, er der stadig plads til forbedringer i mange aspekter. Denne protokol vil lette undersøgelser, der har til formål at undersøge neural aktivitet i realtid i amygdala af frit barbering af dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
