Summary
Bu protokol, kütle spektrometresi görüntüleme ile birlikte ince filmlerdeki (DGT) difüzif gradyanlar kullanılarak birden fazla labile inorganik besin ve kirletici çözünür türünün mm altı 2D görselleştirilmesi için bir iş akışı sunar. Karasal bitkilerin rizosferinde solutların nicel haritalandırılması için çözünür örnekleme ve yüksek çözünürlüklü kimyasal analiz ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Labile dağılımının iki boyutlu (2D) görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir yöntem açıklıyoruz (yani, ters adsorbe edilmiş) inorganik besin (örneğin, P, Fe, Mn) ve kirletici (örneğin, As, Cd, Pb) milimetre altı (~100 μm) mekansal çözünürlükte bitki köklerine ('rizosfer') bitişik topraktaki türleri yatıştırır. Yöntem, ince filmlerdeki difüzyon gradyanları (DGT) tekniği ile lavabo bazlı çözünür örneklemesi, lazer ablasyon endüktif olarak bağlanmış plazma kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) ile mekansal olarak çözülmüş kimyasal analiz ile birleştirir. DGT tekniği, homojen olarak dağıtılmış analit seçici bağlama aşamalarına sahip ince hidrojellere dayanmaktadır. Mevcut bağlama aşamalarının çeşitliliği, basit jel imalat prosedürlerini takiben farklı DGT jel tiplerinin hazırlanmasını sağlar. Rizosferde DGT jel dağıtımı için bitkiler, toprakta yetiştirilen bir kök sistemine minimum invaziv erişim sağlayan düz, şeffaf büyüme kaplarında (rhizotronlar) yetiştirilir. Büyüme öncesi bir dönemden sonra, DGT jelleri rizosferde yerinde çözünen örnekleme için seçilen ilgi alanlarına uygulanır. Daha sonra, DGT jelleri la-ICP-MS hat tarama görüntüleme kullanılarak bağlı solutların sonraki kimyasal analizi için alınır ve hazırlanır. Matrisle eşleşen jel standartları kullanılarak 13C ve harici kalibrasyon kullanılarak dahili normalleştirme uygulaması, 2D çözünen akıların nicelleştirilmesini sağlar. Bu yöntem, toprak-bitki ortamlarında çok elemanlı çözünen akıların nicel, mm altı ölçek 2D görüntülerini oluşturma yeteneğinde benzersizdir ve rizosferdeki çözünür gradyanları ölçmek için diğer yöntemlerin ulaşılabilir uzamsal çözünürlüğünü büyük ölçüde aşmaktadır. Karasal bitkilerin rizosferinde birden fazla katyonik ve aniyonik çözünen türün görüntülenmesi için yöntemin uygulanmasını ve değerlendirilmesini sunuyor ve bu yöntemi tamamlayıcı çözünür görüntüleme teknikleri ile birleştirme olasılığını vurguluyoruz.
Introduction
Mahsul bitkileri tarafından besin alımı, mahsul verimliliğinin belirlenmesinde önemli bir faktördür. Besin maddelerinin ekinler tarafından verimli bir şekilde alınmasını yöneten süreçler yoğun bir şekilde incelenmiştir, özellikle toprak kökü arayüzündeki bitki kökleri tarafından besin kullanılabilirliğini ve besin içselleştirmesini kontrol eden mekanizmalar, rizosfer, mahsul besin alımındaki rolleriyle tanınmaktadır. Bitki besin alımı için önemli süreçler şunlardır: köke doğru besin taşıma; toprak porewater'da çözünen türler ile katı toprak yüzeylerine bağlı türler arasındaki dinamik sorption dengesi; besinler için mikrobiyal rekabet; toprak organik maddesinde bulunan besinlerin mikrobiyal mineralizasyonu; ve kök symplasm içine besin içselleştirme. inorganik eser metal (oid) kirleticilerin alımı büyük ölçüde aynı mekanizmalar tarafından kontrol edilir.
Besin ve kirletici mevcudiyeti, bitki talebi ve topraktaki difüzyöziteye bağlı olarak, rizosferdeki diferansiyel besin desenleri gözlenebilir. Nispeten yüksek içselleştirme oranlarına sahip güçlü bir şekilde sorbing elemanları için (örn. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), dökme toprağa kıyasla labile (yani ters adsorbe edilmiş) element fraksiyonunun tükenmesi bulunurken, tükenme bölgesi genişlikleri genellikle ≤1 mm iken, NO3-, tükenme bölgeleri gibi daha fazla mobil besin için birkaç santimetreye kadar uzayabilir1. Ayrıca, kullanılabilirlik bitki alım oranlarını aştığında Al ve Cd gibi elemanların birikmesi gözlenmiştir2,3.
Besin ve kirletici çevriminde rizosfer proseslerinin önemi göz önüne alındığında, bitkide bulunan element fraksiyonunu yüksek uzamsal çözünürlükte ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir4,5. Bununla birlikte, küçük ölçekli labile çözünür dağılımlarının ölçülmesi çeşitli nedenlerden dolayı zor olmuştur. Önemli bir zorluk, rizosferdeki dik besin gradyanlarını çözmek için canlı bitki köklerine bitişik tanımlanmış konumlarda çok küçük (düşük μL aralığı) toprak ve / veya porewater hacimlerini örneklemektir. Bu sorunu gidermek için bir yaklaşım, porewater örneklerinin ekstraksiyonu için mikro emiş kapları kullanmaktır6. Bu yöntemle A. Göttlein, A. Heim ve E. Matzner7, Quercus robur L. köklerinin çevresindeki toprak porewater besin konsantrasyonlarını ~1 cm uzamsal çözünürlükte ölçtü. μL toprak veya toprak çözeltisi hacimlerini analiz etmenin zorluğu, bu küçük numune hacimlerinin, ana besin türleri hariç hepsinin düşük konsantrasyonlarıyla birlikte, son derece hassas kimyasal analiz teknikleri gerektirmesidir.
Besin gradyanlarını ~ 0,5 mm'ye kadar bir çözünürlükte çözebilen alternatif bir sistem, toprağı köklerden ayıran ince bir hidrofilik membran tabakası ile bir toprak bloğunun yüzeyinde bir kök paspası yetiştirmektir8,9. Bu konfigürasyonda, solutlar zardan geçebilir ve kökler topraktan besinleri ve kirleticileri alabilirken, kök eksüdaları toprağa yayılabilir. Yoğun bir kök tabakasının kurulmasından sonra, toprak bloğu, element fraksiyonlarının daha sonra çıkarılması için elde edilen toprak örneklerine örneklenebilir ve dilimlenebilir. Bu şekilde, nispeten geniş bir alanda (~100 cm2)ortalama olan tek boyutlu besin ve kirletici gradyanlar analiz edilebilir.
Diğer bir zorluk da labile, bitki tarafından mevcut element fraksiyonunun örneklerini elde etmektir, çünkü çoğu kimyasal toprak çıkarma tekniği, bitkilerin besinleri ve kirleticileri aldığı mekanizmalara kıyasla çok farklı çalışır. Birçok toprak çıkarma protokolünde toprak, çözünmüş ve sorbed element fraksiyonu arasında bir (sözde)denge kurmak amacıyla bir çıkarıcı çözelti ile karıştırılır. Bununla birlikte, bitkiler besinleri sürekli olarak içselleştirir ve bu nedenle genellikle rizosfer toprağını giderek tüketer. Denge ekstraksiyon protokolleri, uygulanması kolay olduğu için toprak testleri olarak yaygın olarak benimsenmiş olsa da, çıkarılan besin fraksiyonu genellikle bitki mevcut besin fraksiyonunu iyi temsil etmez10,11,12,13. Besinler için numune alınan toprağı sürekli tüketen lavabo yöntemleri avantajlı yöntemler olarak önerilmiştir ve kök alma işlemleri 10,11 ,14,15'itaklitederekalttaki besin alma mekanizmasına daha iyi benzeyebilir.
Yukarıda açıklanan yöntemlere ek olarak, belirli elementler ve toprak (biyo)kimyasal parametreler için çeşitli cm2 görüş alanlarında 100 μm ≤ çözünürlüklerle sürekli parametre haritalarını ölçebilen orijinal görüntüleme uygulamaları geliştirilmiştir5. Otoradyografi, uygun radyoizotopların mevcut olması koşuluyla rizosferdeki eleman dağılımını görüntülemek için kullanılabilir16. Düzlemsel optodlar pH ve pO217, 18,19gibi önemli toprak kimyasal parametrelerinin görselleştirilmesini sağlar ve enzim aktivitesi veya toplam protein dağılımları toprak zymografisi20 , 21 , 22,23ve/veya kök şişirme yöntemleri24gibi floresan gösterge görüntüleme teknikleri kullanılarak haritalanabilir. Zymografi ve otoradyografi tek seferde tek bir parametrenin ölçümü ile sınırlı olmakla birlikte, düzlemsel optodlar kullanılarak pH ve pO2 görüntüleme aynı anda yapılabilir. Daha geleneksel kök paspas teknikleri yalnızca 1B bilgi sağlarken, mikro emiş kapları nokta ölçümleri veya düşük çözünürlüklü 2B bilgiler sağlar, ancak her iki yaklaşım da çok elemanlı analize izin verir. Daha yakın zamanda, P. D. Ilhardtve ark.25, doğal element dağılımının dikkatli numune hazırlığı ile korunduğu toprak kökü çekirdek örneklerinde ~100 μm çözünürlükte 2D toplam çok elemanlı dağılımları haritalamak için lazer kaynaklı arıza spektroskopisi (LIBS) kullanarak yeni bir yaklaşım sundu.
Yüksek uzamsal çözünürlükte çoklu besin ve kirletici solutların 2B örneklemesi yapabilen tek teknik, hidrojel tabakasına gömülü bağlayıcı bir malzeme üzerinde labile trace metal (loid) türlerini yerinde hareketsiz hale getiren lavabo bazlı bir örnekleme yöntemi olan ince filmler (DGT) tekniğindeki difüzif gradyanlardır26,27. DGT, çökeltilerde ve sularda labile solutes ölçümü için kimyasal bir speciation tekniği olarak tanıtıldı ve kısa süre sonra topraklarda kullanımı için kabul edildi28. Başlangıçta bir nehir tortusunda 29 'da gösterilen ve bitki rizosferleri 30, 31,32,33'teki uygulaması için daha da geliştirilmiş olan mm ölçeğinde çok elemanlı çözünür görüntülemeyisağlar.
DGT örneklemesi için, bir toprak bloğunun yüzey tabakasında yetişen tek bir bitki köküne, jeli topraktan ayıran hidrofilik bir zar ile yaklaşık 3 cm x 5 cm büyüklüğünde bir jel tabakası uygulanır. Temas süresi boyunca, labile besin maddeleri ve/veya kirleticiler jel yönünde yayılır ve jelin içine dahil edilen bağlayıcı malzeme ile hemen bağlanır. Bu şekilde, bir konsantrasyon gradyanı ve böylece jel için sürekli bir net akı kurulur ve örnekleme süresi boyunca hakimdir. Örneklemeden sonra, hidrojel mekansal olarak çözümlenmiş analize izin sağlayan analitik bir kimyasal teknik kullanılarak çıkarılabilir ve analiz edilebilir. Bu amaçla son derece uzmanlaşmış ve sıklıkla kullanılan bir teknik lazer ablasyon endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektrometresidir (LA-ICP-MS). Bazı erken çalışmalarda mikro parçacık kaynaklı X-ışını emisyonu (PIXE) da kullanılmıştır29. LA-ICP-MS analizi ile birlikte DGT örneklemesi, ~100 μm uzamsal çözünürlükte çok elemanlı kimyasal görüntüleme sağlar. Son derece hassas ICP-MS teknikleri (örneğin, sektör alanı ICP-MS) kullanılırsa, son derece düşük algılama sınırları elde edilebilir. Mısır15ile Zn ve Cd alımı üzerinde kireçlenmenin etkisi üzerine yapılan bir çalışmada, mısır rizosferinde labile Cd'yi kirlenmemiş toprakta jel alanı başına 38 pg cm-2 Cd algılama sınırı ile haritalayabildik. DGT, düzlemsel optodlar ve zimografi, hedef elementin topraktan jel tabakasına yayılmasına dayanır, bu da aynı anda veya ardışık olarak bitki besin maddesi ve kirletici alımı ile ilgili çok sayıda parametreyi görüntülemek için bu yöntemlerin kombine uygulanması için kullanılabilir. DGT görüntülemenin analitik kimyasal yönleri, DGT ve diğer görüntüleme yöntemlerinin birleştirilmesi potansiyeli ve uygulamaları hakkında ayrıntılı bilgi34,35referansında kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir.
Bu yazıda, bitki yetiştiriciliği, jel imalatı, jel uygulaması, jel analizi ve görüntü üretimi de dahil olmak üzere doymamış bir toprak ortamında karasal bitkilerin kökleri üzerinde DGT tekniğini kullanarak çözünür bir görüntüleme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Kritik adımlar ve deneysel alternatifler hakkında notlar da dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak ayrıntılı olarak hazırlanmıştır.
Protocol
1. DGT jellerinin imalatı
NOT: Yüksek (alt mm) uzamsal çözünürlükte labile çözünen türlerin 2D görüntülenmesi için çeşitli DGT jel tiplerimevcuttur 35. Burada, çözünen görüntüleme uygulamalarında kullanılan üç iyi karakterize yüksek çözünürlüklü (HR)-DGT bağlama jelinin imalatı kısaca özetlenmiştir. İz element analizi için laboratuvar prosedürlerinin yanı sıra sunulan tüm HR-DGT jellerinin ayrıntılı imalat prosedürleri S1 ve S2 Destek Bilgileri (SI) bölümlerindeaçıklanmıştır.
- Poliüretan bazlı karışık anion ve katyon bağlama jeli (HR-MBG; SI S2.1)31
- Homojen olarak dağılmış zirkonyum (IV) hidroksit ve iminodiasetat (IDA) fazlı bir poliüretan jel süspansiyon hazırlayın.
- Jel süspansiyonu ince bir film içinde cam bir plaka üzerine kaplayın ve 0,1 mm inceliğinde, yırtılmaya dayanıklı karışık anion ve katyon bağlama jeli (HR-MBG) elde etmek için çözücü buharlaşması ile jel oluşumunu başlatın.
- Poliakrilamid-zirkonya anion bağlayıcı jel (HR-ABG; SI S2.2)36
- Yerleşik jel döküm prosedürleri37'nin ardından 0,4 mm inceliğinde bir agarose çapraz bağlı poliakrilamid jel (APA) üretin (APA imalatının ayrıntılı bir protokolü içinSI S2.4'e bakın).
- Zirkonyum (IV) hidroksit fazlarını prekast APA jeline çökelterek 0,4 mm inceliğinde bir anion bağlayıcı jel (HR-ABG) elde edin.
- Poliakrilamid-iminodiasetat katyon bağlama jeli (HR-CBG; SI S2.3)38
- Homojen olarak dağılmış IDA fazlı bir poliakrilamid jel süspansiyon hazırlayın.
- Jeli iki cam plaka arasına atın ve IDA fazlarının jelin bir tarafına yerleştiği 0,4 mm inceliğinde bir katyon bağlama jeli (HR-CBG) elde etmek için polimerizasyon reaksiyonunu başlatın.
2. Bitki yetiştiriciliği
NOT: Deneysel sistem, çözünür görüntüleme için doymamış toprakta bitki yetiştirmek için rhizotrons4 (Şekil 1) kullanır. İlk olarak, rhizotron toprak dolgusu ve sulama tarif edilir, daha sonra deneysel bitki büyümesi hakkında ayrıntılar verilir. Rhizotron'a doldurmadan önce rhizotron tasarımı ve toprak substrat hazırlığı ile ilgili ayrıntılar SI bölümünde sunulmuştur S3.
Şekil 1: Rhizotron tasarımı (ölçeklemek için değil). (A) Bir rhizotron büyüme kabının patlatılmış görünümü. (B) Bitki büyümesi sırasında birleştirilmiş rhizotron. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Rhizotron toprak dolgusu
- Rhizotron'u önceden nemlendirilmiş toprakla doldurmadan önce (gravimetrik su içeriği,
, bilinir; bkz. SI S3.2), yapışkan bant kullanarak rhizotron'un arkadaki sulama deliklerini kapatın ve ön plakayı ve sabitleme raylarını ve vidalarını çıkarın. - Boş rhizotron (ön plaka, raylar ve vidalar hariç), sekiz adet 5 cm x 11 cm akrilik plaka ve 16 kelepçeyi(Malzeme Masası) tartınve ağırlıkların toplamını kaydedin.
- Rhizotron çerçevesine yönlendirilen kelepçelerin basıncı ile her iki tarafta iki kelepçe kullanarak rizotronun dibine küçük bir akrilik plaka takın, böylece plaka içe doğru bükülmez ve hacim sabittir.
- Rhizotron'u küçük plastik plakaya doğru hafifçe eğin ve ~4 cm yüksekliğe kadar önceden nemlendirilmiş toprakla doldurun(Şekil 2A). Rhizotron'un içindeki toprağı hafifçe çalkalayarak dağıtın ve toprağı bir sıkıştırma aracıyla(Şekil 2B)birkaç mm (belirli toprak özelliklerine bağlı olarak) hafifçe sıkıştırın.
- Rizotron toprakla dolana kadar 2.1.3 - 2.1.4'nü tekrarlayın (Şekil 2C). Fidelerin daha sonra rizotrona dikilmesi için üstte ~ 3 cm'lik bir boşluk bırakın.
- Toprak dolu rhizotron 'u (8 küçük plaka ve 16 kelepçe dahil) tartın ve ağırlığı kaydedin. Bundan, 2.1.2'de elde edilen boş rhizotron ağırlığını çıkarın ve ağırlık farkını, yani nemli toprağın kütlesini
(g) rizotronda kaydedin. - Rizotrondaki kuru toprak kütlesini,
(g), Eq. 1'e göre hesaplayın ve ardından rizotrondaki kuru toprak kütle yoğunluğunu 
(g cm-3)Eq. 2'ye göre hesaplayın.
Burada,(cm3)rizotronun toplam iç hacmidir.
NOT: Rhizotrondaki tipik değerler 1.0-1.4 g cm-3 arasındadır. Kök büyümesi bu değerin üzerinde engellenebileceğinden1,5 g cm -3'ü aşmayın. - Toprak dolu rhizotron'u bir destek kutusuna yerleştirin ve tüm kelepçeleri ve küçük plakaları rhizotrondan çıkarın (Şekil 2D). Çerçevede kalan toprak parçacıkları sızıntılara neden olabileceği için rhizotron çerçevesini (yani kenarları) kağıt mendil kullanarak dikkatlice temizleyin.
NOT: Maruz kalan toprak yüzeyi homojen olmalı ve herhangi bir çatlak veya boşluk olmadan rhizotron çerçevesi ile düzlenmelidir. Değilse, rhizotron boşaltın ve tekrarlayın 2.1.2 - 2.1.8. - Her biri 22 cm x 13 cm'ye iki parça politetrafloroetilen (PTFE) (Malzeme Masası)folyo kesin. Ek olarak, bir plastik folyo parçasını 46 cm x 15 cm'ye kesin. PTFE ve plastik folyo ağırlıklarının toplamını kaydedin. PTFE folyosunun ilk parçasını rizotrondaki maruz kalan toprak yüzeyinin üst yarısına yerleştirin ve rizotronun üst kısmındaki toprak seviyesinin üzerine ~1 cm uzatılın.
- Ptfe folyosünü yapışkan bant kullanarak rhizotron çerçevesine dikkatlice sabitleyin (Şekil 2E). Önce rizotronun tepesindeki bir köşeyi, ardından karşı köşesini ve son olarak da rhizotron'un iki köşesini sabitleyerek başlayın. Düz bir folyo yüzey sağlamak için köşeleri 2-4 sabitlerken gerginlik uygulayın. Kıvrımlar ortaya çıkarsa, tüm kıvrımlar çıkarılana ve PTFE folyosu toprak yüzeyiyle düz ve bitişik olana kadar bandı tek tek köşelerde (hepsi aynı anda değil) açın ve yeniden sabitleyin.
- PTFE folyosunun ikinci parçasını rhizotron'un alt ucuna yerleştirin, üst PTFE folyo parçasını ~1 cm örtüşerek, ikinci PTFE folyosunun rhizotrona sabitlemek için 2.1.10'u tekrarlayın.
- Plastik folyoyu (46 cm x 15 cm) PTFE folyolarının üzerine yerleştirin. 2.1.10'da ayrıntılı olarak belirtildiği gibi sabitleme prosedürünü kullanarak plastik folyoyu sabitlayın.
- Toprak dolgulu ve folyo kaplı rhizotron üzerine bir ön plaka yerleştirin. Rhizotron'un her iki tarafına bir ray yerleştirin ve rayları ve böylece ön plakayı rhizotron'a sabitlemek için vidaları elle sıkın. Vidalar rizotronun kapalı tarafına, yani sulama deliklerinin olduğu tarafa doğru konumlandırılmıştır (Şekil 1A).
- Rhizotron'u önceden nemlendirilmiş toprakla doldurmadan önce (gravimetrik su içeriği,
, bilinir; bkz. SI S3.2), yapışkan bant kullanarak rhizotron'un arkadaki sulama deliklerini kapatın ve ön plakayı ve sabitleme raylarını ve vidalarını çıkarın.
(g) rizotronda kaydedin.
(g), Eq. 1'e göre hesaplayın ve ardından rizotrondaki kuru toprak kütle yoğunluğunu 
(g cm-3)Eq. 2'ye göre hesaplayın.
Burada,(cm3)rizotronun toplam iç hacmidir.
Şekil 2: Rhizotron, rizosferde çözünür görüntüleme için toprakta bitki yetiştirmek için montaj ve dolgu. (A) Rhizotron içine toprak dolgusu. (B) Dolu toprağın bir sıkıştırma aracı kullanılarak sıkıştırılması. (C) Küçük akrilik plakalar ve kelepçeler ile toprak dolu rhizotron. (D) Açıkta kalan toprak yüzeyi ile toprak dolu rhizotron. (E) Toprak dolgulu rhizotron kısmen koruyucu bir PTFE folyo ile kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Rhizotron elleçleme ve DGT jel uygulaması. (A) Rhizotron'un arkadaki sulama deliklerinde 10 mL pipet uçları kullanılarak toprak sulama. (B) Toprak dolu ve kapalı rhizotron içine fidan dikimi (yeşil lekeler olarak belirtilir). (C) Rhizotron Salix smithiana kesimleri ile ekilmiş ve ön plaka ve plastik folyo kapağı çıkarılmıştır. (D) DGT jel uygulamasından önce PTFE folyo kapağını dikkatlice soyun. (E) Toprak kökü arayüzü yatırım getirisinin yüksek çözünürlüklü fotoğrafı. (F) DGT jel ile donatılmış ön plakanın rhizotron üzerine uygulanması. (G) Çözünür örnekleme sırasında uygulanan DGT jel ile yatırım getirisinin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Toprağı sulamak
- Rizotrondaki deneysel toprağın su tutma kapasitesini (WHC) belirleyin. Bu amaçla, açık tabanlı iki rhizotron üretin ve bölüm 2.1'de belirtildiği gibi toprakla doldurun. Bu açık, toprak dolu rhizotronları 16 saat boyunca bir su kabına daldırarak tamamen doyurulur ve rizotronları 8 saat boyunca boşaltın.
- Açık tabanlı rhizotronlardaki rastgele konumlardan ~50 g'lık bir kompozit toprak örneği alın ve Eq. S1'e göre belirlemek için numuneyi 105 °C'de kurutun. Belirlenen, toprağın WHC'sine karşılık gelir ve bu nedenle
(g g-1)olarak ifade edilir. - Deneysel rhizotron'daki hedefi tanımlayın. Büyüme aşamasında,
rizotrondaki anoksik koşullardan kaçınırken bitkilere yeterli miktarda su sağlamak için WHC'nin % 60'ını (yani WHC faktörünü) ayarlayın. 
Hedefteki rhizotrondaki toprağı sulamak için eklenecek toplam su kütlesini (g) hesaplayın. Rizotronda toprakta bulunan su kütlesini hesaba 
katın, (g).
- Her sulama deliğine eklenecek su kütlesini elde etmek için rhizotron sulama deliklerinin sayısına bölün (burada 14). Sulama deliklerine 10 mL pipet uçlarını iterek ve suyun yerçekimi ile toprağa akmasına izin vererek su ekleyin (Şekil 3A).
- Bitki büyümesi
- Radik ortaya çıkana kadar (örneğin, ıslak filtre kağıdında) deneysel bitkinin tohumlarını spesifik tohum çimlenme gereksinimlerine göre (1 cm uzunlukta) önceden çimlendirme.
- Şekil 3B'debelirtildiği gibi rizotona en fazla iki fide dikin. Dikim sırasında, büyümelerini desteklemek için fidelere doğrudan ~ 5 mL su ekleyin. Rhizotron'un üst açıklığı, dikimden sonraki ilk ~ iki gün boyunca şeffaf, nemi koruyan bir filmle(Malzeme Masası) örtün. Mikrofitik büyümeyi önlemek için rhizotron'ı alüminyum folyoya sarın.
NOT: Fidelerin yanı sıra, bitki kesimleri rizotronlarda da ekilebilir. - Ekilen rhizotron'ı, çevresel koşullar (yani sıcaklık, nem, ışık yoğunluğu) belirli bitki gereksinimlerine göre ayarlanmış bir büyüme odasına aktarın. Gravitropizm yoluyla ön plakanın yanında kök gelişimini sağlamak için rhizotron'u 25°-35° eğimli.
- Bitki büyümesi sırasında, rizotron sulama deliklerini 2.2.5'te ayrıntılı olarak kullanarak her 2-4 günde bir periyodik sulama yaparak rizotrondaki hedef su içeriğini gravimetrik olarak koruyun. Toprak yüzeyini ~ 5 mL su düzenli ilaveleri ile üst açıklık nemli tutun.
NOT: Bitkiler uzun süre yetiştirilirse ve bitki biyokütlesinin önerilen yöntemle rizotona eklenen su miktarını önemli ölçüde azaltması bekleniyorsa, ayrı rhizotronlarda bitki yetiştirerek bitki biyokütlesinin ağırlığını hesaba katar ve bitki dokularını tanımlanmış aralıklarla toplar ve tartar. - Kökler ön plaka boyunca uygun bir konuma ulaştığında, tercihen rizotronun merkezinde, rizosferik çözünür dağılımını örneklemek için DGT jelleri uygulayın.
(g g-1)olarak ifade edilir.
rizotrondaki anoksik koşullardan kaçınırken bitkilere yeterli miktarda su sağlamak için WHC'nin % 60'ını (yani WHC faktörünü) ayarlayın.
Hedefteki rhizotrondaki toprağı sulamak için eklenecek toplam su kütlesini (g) 
katın, (g).
3. Çözünür dağılımı örnekleme
- Jel uygulaması
- Rizotronda 2.2.4.-2.2.5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi jel uygulamasından önce % 60'tan % 80'e 24 saat artış. Bu, iyi toprak jeli teması sağlar ve çözünür örnekleme sırasında anoksik toprak koşullarından kaçınırken jel içine çözünür difüzyon sağlar.
- Yeni, asitle temizlenmiş bir ön plaka alın, örnekleme için kullanılan rhizotron üzerine hizalayın ve plakadaki ilgi alanlarını (ROI' ler) işaretleyin. Plakayı laminer akış tezgahına veya işaretlenmemiş tarafı yukarı bakacak şekilde toz ve metal içermeyen başka bir ortama aktarın.
- DGT bağlama jelini, PTFE kaplı jiletler kullanarak, genellikle 3 cm × 5 cm civarında, yatırım getirisine karşılık gelen gerekli dikdörtgen boyuta akrilik bir destek üzerinde kesin. Net bir kesim sağlamak için jiletı kaydırmak yerine bastırarak jeli kesin. Dikdörtgen jel parçasını plakanın işaretlenmemiş tarafına yatırım getirisinin işaretli konumuna yerleştirin.
NOT: HR-MBG kullanılırsa, jelin toprak kökü sistemiyle iyi temas etmesini sağlamak için jelin altına 100 μm inceliğinde bir ara folyo eklenebilir. - 10 μm inceliğinde polikarbonat membran kesin (0,2 μm gözenek boyutu; Malzeme Masası) jel boyutunu her iki tarafta ≥1 cm uzatan bir boyuta ve membranı jel üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını yığından çıkarmak için biraz su uygulayın.
- Membranı dört kenar boyunca vinil elektrik bandı(Malzeme Tablası)kullanarak sabitleyin. Bu süreçte, plastik cımbız kullanarak jel ve zar arasına sıkışmış hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın. Bant jel ile değil, sadece zar ile temas etmelidir.
NOT: Bant jelle temas ederse, hava kabarcıkları jel ve membran arasına sıkışırsa veya son membran yüzeyi kıvrımları gösterirse, solutların jelin içine difüzifakısı 35 bozulabileceğinden jel / membran yığınının yeniden birleştirilmesi gerekir (tekrar 3.1.3 - 3.1.5). - Rhizotron'u bir standa yerleştirin, rayları çıkarın ve ön plakayı dikkatlice kaldırın (Şekil 3C). Plastik folyoyu çıkarın, rizotronun kenarlarındaki PTFE folyosunu kesin ve toprak kök sisteminin bozulmasını önlemek için PTFE folyosunu yavaşça soyun (Şekil 3D).
- Toprak yapısına ve kök morfolojisine dayalı çözünür dağılımın yorumlanmasını ve sunumını kolaylaştırmak için dijital tek lensli refleks (DSLR) kamera(Malzeme Masası)kullanarak yatırım getirisinin ortogonal bir fotoğrafını çekin (Şekil 3E). Bir kamera standı ve varsa bir makro lens kullanın. Kamerayı, fotoğrafın merkezi yatırım getirisinin ortasına karşılık gelecek şekilde hizalayın ve kameranın netleme düzlemi toprak yüzeyine paralel olacak şekilde hizalayın. Fotoğrafa bir ölçek çubuğu (örneğin, cetvel) ekleyin.
- Jel/membran yığını ile donatılmış plakayı açık rhizotron'a takın (Şekil 3F). Bu nedenle, plakanın bir kenarını rhizotron kenarı ile hizalayın ve plakayı toprağa doğru hafifçe 'bükün'. Bu uygulama şekli, jel/ membran yığını ile toprak kökü sistemi arasındaki hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olur. Rayları ve vidaları kullanarak ön plakayı sabitle.
NOT: Bu adım kritiktir ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Jel/membran yığını ile toprak-kök sistemi arasında toprak ve kökleri yerinden etmeden temas kurulduktan sonra plaka hareket ettirilemez. - Jel dağıtımının tam başlangıç zamanını kaydedin ve 3.1.7 'de(Şekil 3G)verildiği gibi yatırım getirisinde dağıtılan jelin fotoğrafını çekin. Rhizotron'u alüminyum folyoya sarın ve çözünen örnekleme döneminin sonuna kadar (genellikle 24 saat) büyüme odasına aktarın.
- Jel alma
- Rhizotron'u bir destek kutusuna yerleştirin, ön plakayı dikkatlice kaldırın ve yapıştırıcı parçacıkları yıkamak için jel / membran yığınını suyla plaka üzerinde durulayın (Şekil 4A). Jel dağıtımının tam bitiş saatini kaydedin. Eq. S1'e göre rizotrondaki gerçekw toprağını belirlemek için yatırım getirisinden toprak örneği.
- Ön plakayı laminer akış tezgahına, jel/membran yığını yukarı bakacak şekilde aktarın. Önce bandı dört kenar boyunca dikkatlice çıkararak ve daha sonra jeli kaplayan polikarbonat zarı çıkararak jeli ön plakadan alın (Şekil 4B). Jelin, toprakla temas eden tarafı yukarı bakacak şekilde plaka üzerinde ince bir su filmi üzerinde serbestçe yüzmesine yardımcı olmak için su uygulayın.
NOT: Jel yönünü takip etmek önemlidir. Toprağa ve köklere maruz kalan jel tarafı her zaman (kullanıcıya doğru) yüz yüze gelmelidir.
- Jel kurutma
- Jel şişkin kağıdın dikdörtgen bir parçasını kesin (Malzeme Masası) ve biraz daha küçük bir poliethersülfon membran parçası (0,45 μm gözenek boyutu); Malzeme Masası) en üstte.
- Jeli plakadan plastik cımbız kullanarak jel şişkin kağıt / membran yığınına aktarın, toprakla temas eden taraf yukarı bakacak şekilde. Jel, jel ve membran arasında herhangi bir hava kabarcığı olmadan gevşetilmeli (yani gerilmemelidir) ve tamamen düz olmalıdır. Jel transferini ve konumlandırmasını kolaylaştırmak için jel şişirme kağıdına / membran yığınına biraz su uygulayın.
- Jel şişirme kağıdını/membran/jel yığınını tamamen bir parça plastik folyo ile örtün ve jel örneğini ve yönünü plastik folyo üzerinde etiketleyin (Şekil 4C). Jel şişkin kağıt/ membran / jel / plastik folyo yığınını bir vakum jeli kurutucusuna ( Malzeme Masası )yerleştirinve yığın tamamen kuruyana kadar kurutun (tipik olarak 48-72 saat). HR-MBG için, hr-ABG ve HR-CBG oda sıcaklığında en iyi kuru için sıcaklığı 50-55 ° C olarak ayarlayın.
- Jel şişkinlik kağıdını kurutulmuş yığından çıkarın ve şimdi poliethersülfon membranla ayrılmaz bir şekilde birleştirilen jeli bir fermuar torbasına aktarın. Plastik folyo kapak, LA-ICP-MS analizinden kısa bir süre önceye kadar jel üzerinde kalır.
- Toprağa maruz kalmayan orijinal jel levhadan bir jel parçasını boş bir yöntem olarak ekleyin. Yöntem boş jelini 3.3.2 - 3.3.4'ün ardından numune jeli ile aynı şekilde işleyin.
Şekil 4: DGT jel alımı ve çözünür örnekleme üzerine kurutma için hazırlık. (A) DGT jel ve rhizotron ile plaka doğrudan çözünen örneklemeden sonra. (B) DGT jelinin plakadan laminer akış tezgahında alınması. (C) Jel kurutma için jel şişkin kağıt / polyethersulfone membran / DGT jel / plastik folyo kapağı yığını. Jelin rizosfer toprağına konuşlandırılmasından sonra hafifçe renklendiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. DGT bağlayıcı jelin kimyasal analizi
NOT: Bu protokolde, DGT bağlama jelinde çözünen dağılımın analizi, dört ayaklı bir ICP-MS ile birleştirilmiş iki hacimli bir ablasyon hücresi ile donatılmış bir nanosaniye 193 nm ArF excimer LA sistemi kullanılarak LA-ICP-MS tarafından gerçekleştirilir (Şekil 5). Tüm enstrümanlar Malzeme Tablosundalistelenmiştir. Alternatif olarak, nanosaniye 213 nm veya 266 nm katı hal LA sistemleri36,39,40,41,42,43uygulanabilir. Gelişmiş duyarlılık veya kütle çözünürlüğü gerekiyorsa, sektör alanı ICP-MS, dörtlü ICP-MS15,44'ebir alternatiftir. LA sisteminin harici kalibrasyon ve dörtgen ICP-MS'ye kapılması için DGT jel standartlarının hazırlanmasına ilişkin ayrıntılar S4 ve S5 SI bölümlerindesunulmuştur.
Şekil 5: DGT jel analizi için LA-ICP-MS kurulumu. (A) Nanosaniye 193 nm ArF excimer LA sistemi ve dörtlü ICP-MS. (B) Cam plakalara monte edilmiş ve LA numune aşamasına sabitlenmiş kurutulmuş jeller ablasyon hücresine girişe hazırdır. (C) ICP-MS'den nebülizör gazı (Ar) ve iki yönlü Y-splitter ve torç adaptörü bağlantısı ile ICP'ye bağlı ablasyon hücresinden aerosol taşıyıcı gaz (He veya Ar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- LA-ICP-MS için numune hazırlama
- Kurutulmuş jel örneklerini, standartlarını ve yöntem boşluklarını (poliethersülfon membran desteği ile birleştirilen) çift taraflı yapışkan bant(Malzeme Masası),jel tarafı yukarı bakacak şekilde tek tek parçalara aktarın. Ablasyon hücresinde yer kazanmak için fazla bant parçalarını kırpın.
- Kurutulmuş jelleri cam plakalara monte edin. LA numune aşamasında esnek düzenlemeye izin vermek için her jel numunesi, standart seri veya yöntem boş için ayrı cam plakalar kullanın (tipik boyut 10 cm × 10 cm). Cam plaka boyutunu gerektiği gibi ayarlamak için bir cam derz kullanın. Cam plakaları LA numune aşamasındaki jellerle sabitlenin (Şekil 5B) plastik (Malzeme Masası) kullanarak. Sahne zeminini ayarlayarak jel yüzeyini düzleştirin ve numune aşamasını ablasyon hücresine kilitleyin.
- LA-ICP-MS hat tarama analizi
- LA sistemini SI bölümünde belirtildiği gibi ICP-MS ile birleşin S5. LA yazılımında (Malzeme Tablosu), ablasyon hücresindeki jel yüzeyini aydınlatmak ve z ekseni mesafesini ayarlayarak jel yüzeyine odaklanmak için kamera ışığı ayarlarını (örneğin, 'Halka', 'Coax' ve 'İletilen') ayarlayın. Tüm jel yüzeylerinin odakta olduğundan emin olmak için hücre genelinde rastgele konumlara gitme.
- LA yazılımının 'Lazer Kurulumu' penceresinde LA parametrelerini ayarlayın. DGT jellerinin LA-ICP-MS hat tarama analizinde kullanılan tipik ayarlar şunlardır: mod sürekli; enerji çıkışı %20-30; tekrarlama oranı 10-20 Hz; nokta çapı 100-200 μm; tarama hızı 150-250 μm s-1.
NOT: Parametrelerin kullanılan jel türü için optimize edilmesi gerekir ve değişebilir. Parametreler, deneysel ve enstrümantal kuruluma bağlı olarak sinyalin gürültü oranına, uzamsal çözünürlüğe yükseltilmesi veya alım sürelerinin azaltılması için de geliştirilebilir. Nispeten düşük bir enerji çıkışı kullanın (%≤40) ve jellerin destek malzemelerine nüfuz etmesini önlemek için tekrarlama oranı (≤25 Hz)39. Lazer tarama hızının, veri noktalarının sıkıştırılmasını ve böylece tarama yönü 45'te çözünürlük kaybını önlemek için nokta çapının toplam ICP-MS tarama döngüsü süresine (bkz.4.2.6)bölünmesi ≤ emin olun. Örneğin, nokta çapı 200 μm ve toplam ICP-MS tarama döngüsü süresi 0,25 s olarak ayarlandığında, tarama hızı ≤800 μm s-1olmalıdır. - Çizgi aracını seçin ve jel standardı boyunca ~1 mm uzunluğunda tek bir çizgi deseni çizin. 'Desenleri Tara' penceresindeki çizgi desenini sağ tıklatın ve LA parametrelerinin 4.2.3'te ayarladığını doğrulayın. benimsenmiştir. Bu satırı, nokta çapından daha büyük bir satır arası mesafe (çizgi merkezi arasındaki mesafe) ile dört kez çoğaltmak için 'Yinelenen Taramalar' aracını kullanın (Şekil 6). Bu yaklaşım, jel standardı başına toplam beş paralel çizgi sunar (n = 5). Her jel standardı, kalibrasyon boş ve yöntem boş için bu adımı yineleyin.
- Jel örneğine geçin ve analiz edilecek dikdörtgen alanın üst kenarı boyunca tek bir çizgi çizin. 4.2.3'te belirtildiği gibi tüm örnek alan için paralel çizgiler oluşturmak üzere satırı çoğaltın. 300-400 μm'lik bir hat arası mesafe kullanın. Odağın (z ekseni uzaklığı) her satırın her başlangıç ve bitiş noktası için doğru ayarlendiğinden emin olun.
NOT: Analizin uzamsal çözünürlüğü, tarama yönü boyunca satır arası mesafeye kıyasla daha yüksektir. Bu nedenle, çizgilerin başlangıç ve bitiş noktaları analit degradelerinin yönünü en iyi şekilde takip edebilir. Rizosfer gradyanları için, bu genellikle kök eksenine diktir (Şekil 6). - ICP-MS yazılımında (MalzemeTablosu), 'Yöntem' ekranında zaman çözümlenmiş bir 'Yalnızca Veri' yöntemi ayarlayın, her analiz için bir veya daha fazla uygun izotop seçin ve iç normalleştirme standardı 31 , 36,40,41,42olarak13C ekleyin. İzotopların algılanmasının girişimlerle bozulmadığını doğrulayın46.
- ICP-MS yönteminin toplam tarama döngüsü süresini ('Est. Okuma Süresi') izotop başına uygun bekleme süreleriyle (genellikle 10-50 ms arasında) 0,5 sn ≤ ayarlayın. ICP-MS 'Okumaları'nı 1 olarak ayarlayın ve örnek başına toplam ölçüm süresini ('Örnekleme Süresi'), yani tek tek ablasyon satırı başına ayarlamak için 'Okumalar/Çoğalt' değerini değiştirin. Bu, 4.2.2 - 4.2.4 olarak ayarlanan belirli LA parametrelerine ve satır mesafelerine bağlıdır.
- Veri raporlama için zaman veri toplama moduna karşı bir yoğunluk kullanın ve her ablasyon satırı için ayrı bir veri dosyası (burada .xl) oluşturmak üzere 'Dosya Yazma Seçeneği'ni ' Örnek BaşınaYeni' olarak ayarlayın.
- ICP-MS 'Örnek' ekranında, her örnek girişi 4.2.3 - 4.2.4 olarak ayarlanmış tek bir ablasyon satırına karşılık gelen bir 'Batch' örnek dizisi ayarlayın.
- İlk lazer darbesi tarafından tetiklenene kadar veri alımıyla bekleyecek olan ICP-MS'deki örnek sırayı başlatmak için'Toplu İşlemi Çözümle'yi tıklatın (tetikleyici yapılandırmasıyla ilgili ayrıntılar için SI S5'e bakın).
- LA yazılımında, analiz edilecek tüm satırları seçin ve ICP-MS yönteminin ('Est. Örnekleme Süresi', bkz. 4.2.6.) jel örnekleri, standartlar ve yöntem boşlukları için genellikle farklı olan tek tek satır ablasyonlarının süresiyle eşleştiğini doğrulayın. 4.2.6'ı tekrarlayın. gerekirse ICP-MS yöntemini ayarlamak için.
- Lazer kafasını şarj etmek için 'Lazer Enerjisi' penceresinde 'Emisyon'a tıklayın ve ardından 'DenemeyiÇalıştır' penceresini açmak için ' Çalıştır ' ı tıklatın. Burada, 'Yalnızca Seçili Desenler'i seçin, 'Yıkama Gecikmesi'ni 20-30 s olarak ayarlayın, 'Taramalar Sırasında Lazeri Etkinleştir' kutusunu işaretleyin ve ' LazerIsınma Süresi'ni 10 s olarak ayarlayın.
- Çizgi tarama analizini başlatmak ve ICP-MS'deki her izotop için saniyedeki sayılarda (cps) ham sinyal yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak izlemek için 'Denemeçalıştır ' penceresinde 'Çalıştır'ı tıklatın. Her satır başlamalı ('Lazer Isınma Süresi', 10 s) ve gaz boşluğu ile bitmelidir ('Yıkama Gecikmesi', 20-30 s).
- Lazer stabilitesini değerlendirmek için analiz sırasında lazer akıcılığını (J cm-2)izleyin. Akıcılık büyük ölçüde değişirse, analizi iptal edin ve lazer kaynağının ve/veya ayna sisteminin tamamen işlevsel olduğunu doğrulayın.
- Analizden sonra, ICP-MS plazmasını durdurun ve LA sistemindeki taşıyıcı gaz akış hızını 0 mL min-1olarak ayarlayın. Jelleri ablasyon hücresinden çıkarın ve daha fazla kullanım için fermuar torbalarında saklayın.
Şekil 6: DGT LA-ICP-MS deneysel tasarımının şeması (ölçeklemek için değil). Resimde, rizosferdeki DGT tabanlı yerinde yatıştırıcı örnekleme ve örnek hat tarama boyutlarını ve parametrelerini gösteren yakın çekim de dahil olmak üzere jel yüzeyindeki çözünür dağılımının LA-ICP-MS haritalaması gösterilmektedir. DGT jelinin, dikdörtgenin DGT jelinin alt köşesindeki konumuyla belirtildiği gibi, rizosfer toprağından cam plakaya aktarıldığında yatay olarak çevrildiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Veri işleme ve kalibrasyon
- Elektronik tablo yazılımındaki(Malzeme Tablosu)her ablated satır için ham veri dosyasını (.xl) içe aktarın. Ham veri tablosu, cps'deki her izotop için ICP-MS okumalarını (veri noktaları) ve s'deki karşılık gelen zaman noktalarını gösterir. Yan yana tüm satırları farklı sütunlarda listeleyin.
- İç standardın(13C) sinyal kararlılığı ve yeterli yıkama süreleri için hat tarama verilerini değerlendirin.
- Satır ablasyonlarından önce kaydedilen tüm gaz boş değerlerinden (yani lazer ısınma süresi boyunca) her izotop için ortalama bir gaz boşluğu hesaplayın ve arka plan sinyalini düzeltmek için her izotop için karşılık gelen ham yoğunluklardan ortalama gazı boş bırakın.
- Her izotopun (cps) sinyal yoğunluğunu, ablated ve enstrümantal sürüklenme miktarındaki değişimleri düzeltmek için her veri noktası için iç standardın (cps) sinyal yoğunluğuna bölerek dahili normalleştirme uygulayın.
- Arka plan sinyalini kaldırmak için her ablated satırın başlangıcından önce ve bitiminden sonra verileri kırpın. Her satırın ablated bir satıra ve her sütunun normalleştirilmiş bir izotop yoğunluk değerine karşılık geldiği bir kılavuz matrisi elde etmek için veri tablosunu çevirin. Her izotop için matrisleri tek tek çalışma sayfalarına ayırın.
- Kalibrasyon standartları ve kalibrasyon boşluğu için izotop başına ortalama normalleştirilmiş sinyal yoğunluğu oranını hesaplayın ve kalibrasyon işlevini ( y = ax + b) jel standardı analit yüklemeleri(μg cm-2; bkz. SI S4)ile doğrusal bir regresyon modeli kullanarak x değerleri olarak hesaplayın. Doğrusallık için her izotopun kalibrasyon fonksiyonunu değerlendirin47.
- Kalibrasyon işlevini örnek veri matrisine uygulayın. Normalleştirilmiş sinyal yoğunluğu oranlarını,
jel analiz yüklemelerine 
(μg cm-2)ve daha sonra 
Eq. 4 ve Eq. 5'e göre her izotop ve veri noktası için zaman ortalamalı çözünür akılara (pg cm-2 s-1)dönüştürün:
Burada, a kalibrasyon hattının eğimidir, b kalibrasyon hattının kesişim noktasıdır ve t (ler) çözünür örnekleme sırasında jel dağıtım süresidir. - Her analit için kalibre edilmiş örnek veri matrisini txt dosyası olarak kaydedin.
- Görüntü oluşturma
NOT: Görüntü oluşturmanın tüm adımları sırasında herhangi bir piksel enterpolasyon işleminden kaçındığından emin olun, çünkü bu, elde edilen görüntülerde yapay olarak yumuşatılmış çözünür akı degradelerine yol açabilir.- Kalibre edilmiş örnek veri matrisini (.txt) görüntü analiz yazılımında(Malzeme Tablosu)metin görüntüsü olarak içe aktarın.
- Lazer tarama hızını toplam ICP-MS tarama döngüsü süresiyle çarparak piksel başına x yönünde (yani yanal çözünürlük) mesafeyi hesaplayın (örneğin, 200 μms -1 tarama hızı ve toplam tarama döngüsü süresi 0,25 s varsayılarak, yanal çözünürlük 50 μm'ye eşittir). y yönünde piksel başına mesafe, satır arası mesafeye eşittir (Şekil 6).
- Görüntünün en boy oranı düzeltme faktörünü hesaplayın. Bu nedenle, piksel başına mesafeyi y yönünde (örneğin, 300 μm) x yönünde piksel başına mesafeye bölün (örneğin, 50 μm). Elde edilen y/x düzeltme faktörünü (bu örnekte 6) 'Ölçek' altında uygulayın. Piksel başına mesafeyi (μm veya mm cinsinden) x yönünde 'Ölçeği ayarla' altında ölçekleme olarak uygulayın.
- Çözünen görüntüdeki kimyasal degradelerin daha iyi görselleştirilmesi için 'Tabloya Bak' yani sahte renk ölçeği uygulayın ve görüntü aralığının alt/üst sınırlarını kontrol etmek için görüntü 'renk dengesini' ayarlayın. Bir 'Kalibrasyon çubuğu' ekleyin ve çözünen görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin.
- Görüntü analiz yazılımındaki 'Sisteme Kopyala' komutunu kullanarak çözünen görüntüyü kopyalayın ve masaüstü yayıncılık yazılımınayapıştırın( Malzeme Tablosu ). 3.1.7'de elde edilen yatırım getirisinin fotoğrafıyla çözünen görüntüyü ölçekleyin, hizalayın ve oluşturun.
NOT: Kopyalamadan önce, yüksek çözünürlüklü yayıncılık için yeterli piksel sağlamak için 'Ölçeği Ayarla' altında 10'luk bir 'X Ölçeği' ve 10 'luk bir 'Y Ölçeği' uygulayarak çözünen görüntüyü yeniden boyutlandırın.
jel analiz yüklemelerine 
(μg cm-2)ve daha sonra 
Eq. 4 ve Eq. 5'e göre her izotop ve veri noktası için zaman ortalamalı çözünür akılara (pg cm-2 s-1)dönüştürün:
| DGT jel imalatı | Bitki yetiştiriciliği | Yerinde yatıştırıcı örnekleme | LA-ICP-MS çözünen akı eşlemesi |
| İk-MBG 1 hafta |
Toprak hazırlığı 1 hafta |
Jel uygulaması Jel başına 1 saat |
Numune hazırlama Jel başına 1 saat |
| İk-ABG 3 gün |
Rhizotron montajı Çoğaltma başına 2 saat |
Çözünür örnekleme dönemi değişken, genellikle 24 saat |
LA-ICP-MS analizi Jel başına 1 gün |
| İk-CBG 3 gün |
Bitki büyümesi çalışmaya bağımlı |
Jel alma Jel başına 1 saat |
Veri işleme Jel başına 4 saat |
| Jel kurutma 2-3 gün |
Görüntü oluşturma Görüntü başına 10 dakika |
Tablo 1: DGT LA-ICP-MS tekniğinin genel adımları için yaklaşık süreler.
Representative Results
DGT görüntüleme yönteminin yeteneğini ve veri detaylarını göstermek için, Fagopyrum esculentum ve Salix smithiana köklerine bitişik topraktaki birden fazla labile besin ve kirletici çözünür türünün alt mm, 2B akı dağılımını derledik (Şekil 7). Protokolün genel prosedür adımları için yaklaşık süreler Tablo 1'de sunulmuştur.
Şekil 7'deki çözünür görüntüler, HR-MBG veya HR-CBG bağlama jelleri kullanılarak üç farklı çalışmada oluşturulmuştur. Kimyasal görüntüler, kullanılan LA-ICP-MS parametrelerine bağlı olarak x ekseni boyunca 82-120 μm ve y ekseni boyunca 300-400 μm uzamsal çözünürlükte 2B çözünür akı dağılımını göstermektedir. Görüntü kalibrasyonu ve yeniden boyutlandırma sırasında enterpolasyon uygulanmadığı için, tek pikseller ölçülen veri noktalarını temsil eder. Çözünen görüntülerin yatırım getirisinin fotoğrafik bir görüntüsüyle hizalanması, farklı elementlerin alt mm, 2B çözünür akı dağılımının toprak yapısına ve kök morfolojisine göre oldukça değişken olduğunu ortaya koymaktadır. Bu, toprak-rizosfer-bitki sistemindeki elementlerin diferansiyel biyojeokimyasal davranışlarına ve toprak matrisi ve bitki kökleri ile etkileşimlerine bağlanabilir.
Şekil 7A labile inorganik Mg, Al, P, Mn ve Fe çözünen akılar, NH4NO3ile döllenmiş karbonat içermeyen toprakta yetişen genç bir F. esculentum kökü etrafında görselleştirildi. Alt mm çözünür dağılımı, kök alımı nedeniyle eski kök bölümlerinin yanı sıra azalmış Al, P ve Fe akı bölgelerini ve F. esculentum kökünün lokalize P mobilizasyon süreçleri nedeniyle kök tepe noktasında yüksek oranda artmış Mg, Al, P, Mn ve Fe akılarını göstermiştir. Kök ucunun toprak yüzeyinin biraz arkasında bulunduğunu ve bu nedenle fotoğrafik görüntüde neredeyse hiç görünmediğini unutmayın. Şekil 7B, Mn, Fe, Zn, Cd ve Pb dahil olmak üzere labile eser metallerin Zn, Cd ve Pb ile orta derecede kirlenmiş bir toprakta yetişen metale dayanıklı S. smithiana kökü etrafında dağılımını göstermektedir. Çözünen görüntüler, özellikle Zn, Cd ve Pb'nin ani kök konumunda belirgin tükenmesini görselleştirerek, S. smithiana köklerinin kirlenmiş topraktaki labile iz metalleri için lokalize bir lavabo görevi aldığını gösterdi. Ayrıca, bu eser metallerin hemen toprak kökü arayüzünde birikmeye işaret eden lokalize Zn, Cd ve Pb akı artışları gözlenebilir.
Çok elementli çözünür görüntülemeye ek olarak, sunulan yöntem düzlemsel optodlar34gibi tamamlayıcı difüzyon tabanlı görüntüleme teknikleri ile de birleştirilebilir. Bu, S. smithiana'nın rizosferinde labile eser metallerin dağılımının kombine, tek katmanlı düzlemsel optod-DGT katyon bağlama jeli33kullanılarak pH dağıtımı ile birlikte lokalize edildiği Şekil 7C'degösterilmiştir. Toprak substratı (NH4)2SO4ile döllendi, bu da kök eksenleri boyunca toplu toprağa kıyasla ~1 birim pH azalmasına yol açtı. pH düşüşleri Mn, Fe, Co, Ni, Cu ve Pb'nin artan çözünür akıları ile birlikte lokalize edildi ve bu da pH kaynaklı metal çözünürlüğü düşündürdü.
Ayrıca, bu örnek sonuçlar elde edilebilecek potansiyel görüntüleme eserlerinden bazılarını göstermektedir. Örneğin, şekil 7A'nınyatırım getirisi görüntüsünün alt üçte biri yatay bir çizgi olarak gözlenen yapısal toprak inhomogeneities, bu konumda bağlayıcı jel içine sınırlı difüzyon ile sonuçlanan toprak-jel temas süreksizliklerine neden olabilir. Tersine, rhizotrondaki aşırı toprak sıkışması, toprak redoksu durumunun yapay bir şekilde anoksiye doğru kaymasına neden olan zayıf gözenekliliğe yol açabilir. Bu Şekil 7B'de gösterilmiştir, burada çözünen görüntülerdeki yüksek yüksek Mn ve Fe akı alanlarının roi görüntüsündeki yoğun bir toprak tabakasıyla görsel olarak eşleştiği yer. Bu, yüksek toprak sıkıştırması nedeniyle toprak redoksu potansiyelinin azaldığını ve bu da son derece redoksa duyarlı elemanların indirgeyici çözünmesine ve çözünmesine neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle dikkatli rhizotron dolgusu ve toprak yüzeyinin dolgudan hemen sonra görsel muayenesi önerilir.
Şekil 7: Labile besin ve kirletici çözünen türlerin farklı toprak kökü arayüzlerinde alt mm 2D dağılımı. (A) Anionik P ve katyonik Mg, Al, Mn ve Fe solutes'in genç bir F. esculentum kökü etrafında dağılımı. Aniyonik ve katyonik solutların birlikte lokalize örneklemesi, ~%75 WHC'lik bir toprak suyu doygunluğunda 24 saat boyunca HR-MBG kullanılarak elde edildi. Al, P ve Mn görüntüleri kalibre edilmiş fDGT değerleri (pg cm -2 s-1)olarak görüntülenirken, Mg ve Fe görüntüleri 13C normalleştirilmiş yoğunluk gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm'dir. Bu rakamref. 48'den uyarlanmıştır. (B) Mn, Fe, Zn, Cd ve Pb'nin Zn, Cd ve Pb. Cationic iz metal solutları ile orta derecede kirlenmiş toprakta yetişen bir S. smithiana kökü etrafında dağılımı, ~% 80 WHC toprak suyu doygunluğunda 20 saat boyunca HR-CBG kullanılarak örneklenmiştir. Tüm görüntüler kalibre edilmiş fDGT değerleri (pg cm -2 s-1)olarak görüntülenir. Ölçek çubuğu 0,5 cm'dir. Bu şekilref. 3'ten uyarlanmıştır. (C) PH ve çoklu katyonik solutların Cd ile çivilenmiş toprakta yetişen S. smithiana kökleri etrafında dağılımı, hr-MBG protokolünün bir modifikasyonu kullanılarak elde edildi, eşzamanlı çözünür örnekleme ve düzlemsel optode görüntüleme33. Mn, Cu, Zn ve Cd görüntüleri kalibre edilmiş fDGT değerleri (pg cm-2 s-1)olarak görüntülenirken, Fe, Co, Ni ve Pb görüntüleri 13C normalleştirilmiş yoğunluk gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm'dir. Bu rakamref. 33'ten uyarlanmıştır. Sunulan rakamlar CC BY kapsamında lisanslanan 3,33,48 sayılı makalelerden çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Burada sunulan çözünür görüntüleme protokolü, toprak bitkisi ortamlarında 2D besin ve kirletici akıları görselleştirmek ve ölçmek için çok yönlü bir yöntemdir. Toprak kökü arayüzünde labile çözünen türlerin mm altı ölçekli çok elemanlı görüntülerini oluşturma yeteneğinde benzersizdir, rizosferdeki çözünür gradyanları ölçmek için alternatif yöntemlerin ulaşılabilir uzamsal çözünürlüğünü aşmaktadır4. DGT'nin hedeflenen yerinde örnekleme yaklaşımı, LA-ICP-MS gibi son derece hassas bir kimyasal analiz yöntemi ile birlikte, toprakta veya benzeri substratlarda yetişen bireysel bitki kökleri etrafındaki çözünür akı dinamiklerinin ayrıntılı olarak araştırılmasını kolaylaştırır. Lavabo bazlı örnekleme işlemi nedeniyle, elde edilen görüntüler görselleştirilmiş solutların yeteneğini yansıtır ve bu nedenle bitki kullanılabilirliklerinin bir tahminidir10. Çözünen akıların yöntemsel olarak ölçülmesi, bitki mevcut besin fraksiyonları olarak yorumlanabilirlik gibi önemli avantajlar taşısa da, akı ölçümleri porewater konsantrasyon ölçümlerinden çok daha az düz bir şekilde anlaşılır. Dökme toprak uygulamalarındaki standart DGT örnekleme geometrisi (özellikle bu kurulumda kullanılan 0,8 mm kalınlığındaki difüzyon jelleri), gerçek porewater konsantrasyonu, csolnve zaman ortalamalı porewater konsantrasyon tahmininin toplu bir DGT ölçümü, cDGTve bu parametrelerin çözünen bir türün ikmal dinamikleri ile ilgili olarak yorumlanmasına olanak tanır. Ancak, türetilmiş cDGT değerleri gerçekçi olmayan şekilde küçük olduğu için, çok ince difüzyon katmanlarına sahip görüntülemeDGT uygulamasına dayanarak bu tür bir karşılaştırma yapılamaz34. Bu nedenle DGT görüntüleme sonuçları her zaman basit ve hızlı yorumlanamaz ve genellikle daha geleneksel porewater konsantrasyon ölçümleriyle doğrudan karşılaştırılamaz.
Yöntemi uygularken, esas olarak rizotron büyüme kaplarının doldurulması ve sulanabilirliği ile ilgili birkaç kritik adımın dikkatlice düşünülması gerekir. Toprağın rizotrona doldurulması sırasında, bitki kökleri güçlü bir şekilde sıkıştırılmış toprağa nüfuz edemeyeceğinden ve kök büyümesi engelleneceğinden, toprağın çok fazla sıkıştırılmasından kaçınmak çok önemlidir. Güçlü bir şekilde sıkıştırılmış topraktan kaçınan ve toprağın genellikle daha az sıkıştırıldığı rizotron büyüme kabının iç kenarları boyunca büyüyen kökler gözlemledik. Bu durumda, DGT jellerinin rahatça uygulanabileceği rizotronların merkezinde bulunan bireysel kökler hiç gelişmeyebilir ve başarılı jel uygulamasını etkili bir şekilde engelleyebilir. Laboratuvarımızda deneyim, 1.0-1.4 g cm-3 kuru toprak kütle yoğunluklarının engelsiz kök gelişimine izin verdiğini göstermiştir. Ayrıca, aşırı toprak sıkıştırma, redoksa duyarlı elementlerin ve biyojeokimyasal olarak ilişkili türlerin çözünürlüğü ile ilgili potansiyel bir eser kaynağıdır. Toplam gözenek hacmi azaldığı ve gözenek çapı dağılımı yüksek sıkıştırılmış toprakta daha düşük çaplara doğru kaydırıldığı için, daha az hava dolu daha büyük çaplı gözenek hacmi mevcuttur ve bu da yerel olarak indirgeyici koşullara yol açabilir. Sonuç olarak, MnIII/IV- ve FeIII-oksitler azaltılabilir ve bu da Mn2+ ve Fe2+ akılarının artmasına neden olabilir. Fosfat ve mikro besinler için önemli sorption bölgeleri olan Fe-oksitlerin çözünmesi, sönmüş ve/veya birlikte çökelenmiş türleri özgürleştirebilir ve böylece biyojeokimyasal olarak ilişkili türlerin yapay olarak yüksek akılarına neden olabilir. Büyüme kapları çok fazla sulanırsa benzer bir sorun ortaya çıkabilir. Büyüme kabının üst kısmındaki küçük toprak yüzey alanı aracılığıyla buharlaşma düşüktür ve toprak ekimden sonra birkaç haftaya kadar su doygun kalabilir ve bu da redoks eserlerine neden olabilir.
Bir diğer önemli husus, fabrikasyon HR-DGT bağlama jelinin kimyasal işlevselliğidir. Protokole uyularak, bağlama fazlarının homojen dağılımına sahip ince jeller elde edilir. Jellerin inhomogeneöz malzeme dağılımı alanları varsa (örneğin, jeldeki delikler veya bağlama fazlarının agregaları) bu alanların çıkarılması veya çok kapsamlıysa jel imalat protokolünün tekrarlanması gerekir. Doğru hazırlanırsa, jel, jelin içine yayılan hedef çözünen türleri hemen ve nicel olarakbağlayabilmelidir 27Analit spesifik jel bağlama kapasitesi ile belirlenir. Jel kapasitesinin aşılması kirlenmemiş topraklarda daha az sorunlu olmakla birlikte, metalle kirlenmiş topraklarda ve tuzlu toprak ortamlarında göz önünde bulundurulmalıdır. Jel bağlama fazlarının doygunluğu sadece nicel çözünür örneklemeyi bozmakla kalmaz, aynı zamanda jeldeki bağlama aşamaları arasında solutların yanal difüzyonuna neden olur ve küçük ölçekli çözünür akı özelliklerinin belirsiz lokalizasyonuna yol açacaktır. Bu nedenle hedef toprak ortamında çok yüksek miktarlarda labile besin/kirletici türleri bekleniyorsa ön testler yapılmalıdır. Beklenen DGT yüklemelerini tahmin etmek için, dökme toprak DGT piston örneklemesi ve ardından jel elution ve ıslak-kimyasal analiz uygulanabilir15,49. Gerekirse, jel temas süresini azaltmak ve böylece kapasite eşiklerinin üzerindeki jel doygunluğunu önlemek için DGT dağıtım süreleri ayarlanabilir. Tersine, ön testler, doğal toprak arka plan seviyelerinde iz element solutes haritalamak için önemli olabilecek çok düşük çözünür yüklemeler bekleniyorsa gerekli jel temas sürelerini ve / veya LA-ICP-MS hassasiyetlerini belirlemek için de yararlı olabilir15. Ayrıca, DGT LA-ICP-MS kalibrasyon standartlarının hazırlanmasında jellerin kontrollü yüklenmesi yoluyla deneysel uygulamasından önce doğru DGT jel işleyişi doğrulanmalıdır. Jel standardı, LA-ICP-MS tarafından belirlenen numune jel yüklemesinin beklenen aralıkta olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilecek matrisle eşleşen bir referans jel analit yüklemesi sağlar. Gaz ve yöntem boş arka plan gürültüsünden farklı bir sinyal alınamazsa, operatör eser element analizi için laboratuvar prosedürlerinin uygulandığından ve tüm protokol adımlarının doğru şekilde uygulandığından emin olmalıdır. Bazen, DGT jeli, toprağa maruz kalan, yüklenen tarafı lazer ışını yerine cam plakaya bakacak şekilde çözünür örneklemeden sonra yanlışlıkla çevrilir, bu da düşük sinyal yoğunluklarına ve son çözünen akı görüntülerinde hatalı bir şekilde çevrilmiş özelliklere neden olur.
LA-ICP-MS analizi sırasında, değerlendirmek için önemli ölçüde zaman alan büyük miktarda veri oluşturulur. Laboratuvarımızda, standart elektronik tablo yazılımı kullanarak hedef veri çıktı formatımıza göre uyarlanmış şirket içi veri değerlendirme komut dosyaları kullanıyoruz. Yarı otomatik sıralama ve kalibrasyondan sonra, görüntü çizimi açık kaynak kodlu, açık erişimli görüntü analiz araçları kullanılarak gerçekleştirilir (ImageJ, Fiji50). Bu yaklaşım, toplanan verilerin oluşturulan çözünür haritalarda düzgün görüntülenmesi gereken ikinci dereceden piksellere değil dikdörtgen piksellere karşılık gelmesi nedeniyle gerekli olan veri sıralama, değerlendirme ve sunum üzerinde tam denetim sağlar. Ayrıca, veri işleme sırasında, herhangi bir piksel enterpolasyonundan dikkatlice kaçınılmalıdır. Piksel enterpolasyonu, kimyasal görüntülerde yumuşatılmış degradelere yol açar, bu da yumuşatılmış, genellikle dairesel eleman dağıtım özellikleriyle sonuçlanır ve bu nedenle orijinal verilerin istenmeyen bir şekilde değiştirilmesidir. Piksel enterpolasyonu, birçok görüntü işleme yazılımı ürününde yeniden ölçeklendirme ve yeniden biçimlendirme işlemlerinde standart bir prosedürdür, ancak genellikle seçimi kaldırılabilir.
Sonuç olarak, açıklanan yöntem doğal toprak-rizosfer-bitki sistemlerinde besin ve kirletici dinamikleri anlamak için önemli bir ilerlemedir. Sadece DGT uygulamalarına ek olarak, yöntem düzlemsel optodlar 3 , 33 , 42,43,48,51ve zymography 20,21 ,22 ,23,24gibi diğer difüzyon tabanlı görüntüleme teknikleri ile birleştirilebilir ve ek elemanlar ve toprak parametreleri dahil olmak üzere daha fazla geliştirilebilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu (FWF) tarafından ortaklaşa finanse edildi: P30085-N28 (Thomas Prohaska) ve Avusturya Bilim Fonu (FWF) ve Aşağı Avusturya Federal Devleti: P27571-BBL (Jakob Santner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
- Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
- Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
- Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
- Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
- Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
- Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
- Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
- Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
- Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
- Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
- Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
- Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
- Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
- Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
- Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
- Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
- Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
- Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
- Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
- Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
- Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
- Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
- Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
- Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
- Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
- Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
- Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
- Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
- Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
- Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
- May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
- Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
- Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
- Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).
