Summary
이 프로토콜은 대량 분광화상 이미징과 결합된 박막(DGT)의 확산 그라데이션을 사용하여 다중 음순 무기 영양소 및 오염 물질 용성 종의 하위 mm 2D 시각화를 위한 워크플로우를 제공합니다. 솔루트 샘플링 및 고해상도 화학 분석은 지상 식물의 뿌리 부피에서 솔틸테의 정량적 매핑을 위해 자세히 설명된다.
Abstract
우리는 2차원(2D) 비질(즉, 가역흡착) 무기 영양소(예를 들어, P, Fe, Mn) 및 오염물질(예를 들어, P, Fe, Mn) 및 오염물질(예를 들어, Cd, Pb) 식물 뿌리(1μg)에 인접한 토양에서 균주종의 2차원(2D)의 시각화 및 정량화를 위한 방법을 설명한다. 이 방법은 박막(DGT) 기술의 확산 그라데이션에 의한 싱크기반 솔루트 샘플링과 레이저 절제에 의한 공간적으로 해결된 화학적 분석을 결합하여 결합된 플라즈마 질량 분석법(LA-ICP-MS)을 결합한다. DGT 기술은 균일하게 분산된 분산 된 분산 결합 단계를 가진 얇은 하이드로겔을 기반으로합니다. 사용 가능한 결합 단계의 다양성은 간단한 젤 제조 절차에 따라 다른 DGT 젤 유형의 준비를 할 수 있습니다. 뿌리 줄기권에 DGT 젤 배치의 경우 식물은 토양 재배 루트 시스템에 대한 최소 침습적 접근을 가능하게하는 평평하고 투명한 성장 용기 (rhizotrons)에서 재배됩니다. 성장 전 기간 후, DGT 젤은 뿌리 부각에서 시투 솔루트 샘플링에 대한 관심의 선택된 영역에 적용됩니다. 그 후, DGT 젤은 LA-ICP-MS 라인 스캔 이미징을 사용하여 바운드 솔루트의 후속 화학 분석을 위해 회수및 제조됩니다. 매트릭스 일치 젤 표준을 사용하여 13C 및 외부 교정을 사용하여 내부 정규화를 적용하면 2D 솔루트 플럭스의 정량화를 더욱 가능하게 합니다. 이 방법은 토양 식물 환경에서 다원 극체 유종의 정량적, 하위 mm 스케일 2D 이미지를 생성하여 뿌리 줄기권에서 솔루트 그라데이션을 측정하기 위한 다른 방법의 달성 가능한 공간 해상도를 초과하는 기능에서 독특합니다. 우리는 지상식물의 뿌리부에서 다중 양이온 및 음이온 성 졸음종을 이미징하는 방법의 적용 및 평가를 제시하고 보완적인 솔루트 이미징 기술과 이 방법을 결합할 가능성을 강조한다.
Introduction
작물 식물에 의한 영양소 획득은 작물 생산성을 결정하는 핵심 요소입니다. 작물에 의한 영양소의 효율적인 섭취를 지배하는 프로세스는 특히 토양 뿌리 인터페이스인 뿌리뿌리에서 식물 뿌리에 의한 영양 가용성과 영양 내산화를 제어하는 메커니즘을 집중적으로 연구해 왔으며, 작물 영양소 획득에 대한 역할을 인정받고 있습니다. 식물 영양소 섭취에 대 한 중요 한 프로세스 포함: 루트를 향해 영양 수송; 토양 모공수에 용해된 종과 고체 토양 표면에 결합된 종 들 사이의 동적 흡기 평형; 영양소에 대한 미생물 경쟁; 토양 유기체에 함유된 영양소의 미생물 미네랄화; 그리고 뿌리 교막으로 영양 내부화. 무기 미량 금속(oid) 오염물질의 섭취는 대체로 동일한 메커니즘에 의해 제어됩니다.
영양소와 오염 물질 가용성에 따라, 식물 수요 와 토양에서 확산, 뿌리 줄기 권에서 차동 영양소 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 비교적 높은 내재율(예: P, Fe, Mn, Zn, Cd, Pb)을 가진 강하게 흡착하는 원소의 경우, 벌크 토양에 비해 비순기(즉, 가역적으로 흡착됨) 요소 분수의 고갈이 발견되며, 고갈 영역 폭은 종종 ≤1mm, NO3등의 이동성 영양소를 위해1인치까지확장될 수 있습니다. 또한, 가용성이 식물 의 섭취량률2,3을초과할 때 Al 및 Cd와 같은 요소의 축적이 관찰되었습니다.
영양소 및 오염 물질 사이클링에서 뿌리 줄기권 공정의 중요성을 감안할 때, 높은 공간 해상도에서 식물이 이용 가능한 원소 분수를 측정하기 위한 몇 가지 기술이개발되었다 4,5. 그러나 소규모 음순 솔루트 분포를 측정하는 것은 여러 가지 이유로 어려운 것으로 입증되었습니다. 주요 어려움은 뿌리권내의 가파른 영양 그라데이션을 해결하기 위해 살아있는 식물 뿌리에 인접한 정의된 위치에서 토양 및/또는 모공수의 매우 작은(낮은 μL 범위) 양을 샘플링하는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 접근법은 모공물 샘플6의추출을 위해 마이크로 흡입 컵을 사용하는 것입니다. 이 방법으로, A. 괴틀린, A. 하임 과 E. 마츠너7 은 ~ 1cm의 공간 해상도로 퀘르쿠스 로버 L. 뿌리 부근의 토양 모공수 영양소 농도를 측정했다. 토양 또는 토양 용액의 μL 양을 분석하는 어려움은, 이러한 작은 샘플 볼륨이 주요 영양소 종을 제외한 모든 의 낮은 농도와 함께 매우 민감한 화학 적 분석 기술을 필요로한다는 것입니다.
~0.5mm까지 해상도로 영양그라데이션을 해결할 수 있는 대체 시스템은 토양 블록 표면에 뿌리 매트를 성장시키고, 토양으로부터 토양을 분리하는 얇은 친성막 층을갖는다8,9. 이 구성에서, 솔루트는 막을 통과 할 수 있으며 뿌리는 토양에서 영양분과 오염 물질을 취할 수 있으며 뿌리 는 토양으로 확산 될 수 있습니다. 조밀한 뿌리 층을 확립한 후, 토양 블록을 샘플링하여 배분의 후속 추출을 위해 토양 샘플을 구할 수 있다. 이러한 방식으로, 1차원 영양소 및 오염 물질 그라데이션은 상대적으로 넓은 면적(~100cm2)을가로질러 평균을 분석할 수 있다.
또 다른 과제는 대부분의 화학 토양 추출 기술이 식물이 영양소와 오염 물질을 차지하는 메커니즘과 비교하여 매우 다르게 작동하기 때문에 식물이 이용 가능한 소자 분획의 샘플을 얻는 것입니다. 많은 토양 추출 프로토콜에서 토양은 용해된 요소 분획과 소베드 원소 분획 사이의 (의사)평형을 확립하는 것을 목표로 추출용액과 혼합된다. 그러나 식물은 지속적으로 영양분을 내면화하고, 따라서, 종종 점진적으로 뿌리 줄기 권 토양을 고갈. 평형 추출 프로토콜은 구현하기 쉽기 때문에 토양 검사로서 널리 채택되었지만, 추출된 영양소 분획은 종종 식물성 분수 웰10,11,12,13을나타내지 않는다. 영양분을 위해 샘플링된 토양을 지속적으로 고갈시키는 싱크 방법은 유리한 방법으로 제안되었으며 뿌리 섭취량 공정10,11,14,15를모방하여 기본 영양소 섭취메커니즘과더 잘 유사할 수 있다.
상술한 방법 외에도, 수cm2의 시야에 걸쳐 ≤100 μm의 해상도로 연속 파라미터 맵을 측정할 수 있는 정품 이미징 응용 분야는 특정 원소 및 토양(bio)화학 파라미터5를위해 개발되었다. 자동 방사선 사진은 적절한 방사성 동위원소가 사용할 수 있는 경우 뿌리 부속체내의 요소 분포를 이미지화하는 데 사용할 수있다(16). 평면 광막은 pH 및 pO217,18,19와 같은 중요한 토양 화학 파라미터의 시각화를 가능하게 하고, 효소 활성 또는 총 단백질 분포는 토양 zymography20,21,22,23 및/또는 루트 블로팅방법(24)과같은 형광 지표 이미징 기술을 사용하여 매핑될 수 있다. zymography 및 사방사선 사진은 한 번에 단일 매개 변수의 측정으로 제한되지만, 평면 검정을 이용한 pH 및 pO2 이미징은 동시에 수행될 수 있다. 보다 전통적인 루트 매트 기술은 1D 정보만 제공하지만 마이크로 흡입 컵은 포인트 측정 또는 저해상도 2D 정보를 제공하지만 두 가지 접근 방식을 모두 통해 다중 요소 분석을 허용합니다. 최근에는, P.D.Ilhardt, 외. 25는 레이저 유도 고장 분광법(LIBS)을 사용하여 토양 뿌리 코어 샘플에서 ~100 μm의 해상도로 2D 총 다중 요소 분포를 매핑하여 신중한 시료 준비에 의해 자연적인 원소 분포를 보존하는 새로운 접근법을 제시하였다.
높은 공간 해상도에서 다중 영양소와 오염 물질 솔루트의 2D 샘플링을 대상으로 할 수 있는 유일한 기술은 얇은 필름(DGT) 기술의 확산 그라데이션이며, 하이드로겔층에내장된 결합 물질에 현장에서 음순 미량 금속(loid) 종을 고정시키는 싱크 기반 샘플링방법입니다. DGT는 퇴적물과 물에서 음순 솔루트를 측정하기 위한 화학적 분기 기술로 도입되었으며, 곧 토양28에서사용하기 위해 채택되었다. 하천퇴적물(29)에서처음 시연된 서브mm 스케일 다원단 단원 단조 이미징을 가능하게 하고, 식물뿌리줄기30,31,32,33에대한 적용을 위해 더욱 개발되었다.
DGT 샘플링의 경우, 약 3cm x 5cm 크기의 젤 시트가 토양 블록의 표면 층에서 자라는 단일 식물 뿌리에 적용되며, 토양으로부터 젤을 분리하는 친수성 멤브레인이 있습니다. 접촉 시간 동안, 음순 영양소 및/또는 오염물질이 젤쪽으로 확산되고 겔에 통합된 결합 물질에 의해 즉시 결합된다. 이러한 방식으로, 농도 그라데이션, 따라서 겔을 향한 연속 순 플럭스가 확립되고 샘플링 시간 동안 우세된다. 샘플링 후, 하이드로겔을 제거하고 분석할 수 있는 분석 화학 기법을 사용하여 공간적으로 해석된 분석을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위해 고도로 전문화되고 자주 사용되는 기술은 레이저 절제 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(LA-ICP-MS)입니다. 일부 초기 연구에서는 마이크로 입자 유도X선 방출(PIXE)도29를사용하였다. LA-ICP-MS 분석과 결합된 DGT 샘플링을 통해 ~100 μm의 공간 해상도로 다중 원소 화학 이미징을 허용합니다. 매우 민감한 ICP-MS 기술(예: 섹터 필드 ICP-MS)이 사용되는 경우 매우 낮은 검출 제한을 달성할 수 있습니다. 옥수수(15)에의한 Zn 및 Cd 조리에 대한 리밍의 효과에 대한 연구에서, 우리는 젤 면적당 Cd의 검출 한계와 함께 오염되지 않은 토양에서 옥수수 뿌리 줄기권에 있는 음순 CD를 매핑할 수 있었다. DGT, 평면 검소 및 zymography는 토양에서 젤 층으로 표적 원소의 확산에 의존하며, 이는 이러한 방법의 결합된 적용을 위해 동시에, 또는 연속적으로 식물 영양소 및 오염 물질 섭취와 관련된 많은 수의 파라미터를 이미지화하기 위해 악용될 수 있다. DGT 이미징의 분석 화학 적 측면에 대한 자세한 정보, DGT 및 기타 이미징 방법을 결합할 수 있는 잠재력에 대한 자세한 내용은34,35에서종합적으로 검토된다.
본 기사에서는 식물 재배, 젤 제조, 젤 응용, 젤 분석 및 이미지 생성을 포함하여 불포화 토양 환경에서 지상식물의 뿌리에 대한 DGT 기술을 사용하여 독단적 이미징 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 중요한 단계와 실험적 대안에 대한 메모를 포함하여 모든 단계는 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
1. DGT 젤 의 제조
참고: 몇몇 DGT 젤 타입은 높은 (서브 mm) 공간 해상도35에서음순 솔루트 종의 2D 화상 진찰에 유효합니다. 여기서, 솔직 한 이미징 응용 프로그램에 사용되는 3 개의 잘 특징인 고해상도 (HR)-DGT 결합 젤의 제조는 간략하게 요약된다. 미량 원소 분석을 위한 실험실 절차뿐만 아니라 제시된 모든 HR-DGT 겔의 상세한 제조 절차는 S1 및 S2 지원 정보(SI) 섹션에설명되어 있다.
- 폴리우레탄 계 혼합 음이온 및 양이온 결합 젤(HR-MBG; SI S2.1)31
- 균일하게 분산된 지르코늄(IV) 수산화 및 비노아세테이트(IDA) 위상으로 폴리우레탄 젤 서스펜션을 준비한다.
- 젤 현탁액을 유리 판에 코팅하고 용매 증발에 의한 겔 형성을 시작하여 0.1mm 얇고 눈물 방지 혼합 음이온 및 양이온 결합 젤(HR-MBG)을 얻습니다.
- 폴리아크릴라미드-지르코니아 이온 결합 젤(HR-ABG; SI S2.2)36
- 0.4 mm-얇은 아가로즈 교차 연결된 폴리아크릴아미드 젤(APA)을 제조한 후 확립된 젤 주조절차(37)(APA 제조의 상세한 프로토콜에 대한SI S2.4 참조).
- 침전 지르코늄 (IV) 수산화 단계는 0.4 mm 얇은 음이온 결합 젤 (HR-ABG)을 얻기 위해 프리 캐스트 APA 젤로 단계.
- 폴리아크릴아미드-비노아세테이트 양이온 결합 젤(HR-CBG; SI S2.3)38
- 균일하게 분산된 IDA 단계로 폴리아크릴아미드 젤 서스펜션을 준비한다.
- 두 유리 판 사이에 젤을 캐스팅하고 IDA 상이 젤의 한쪽으로 정착되는 0.4 mm 얇은 양이온 결합 젤 (HR-CBG)을 얻기 위해 중합 반응을 개시한다.
2. 식물 재배
참고: 실험 시스템은 줄기성 이미징을 위해 불포화 토양에서 식물을 재배하기 위해 rhizotrons4 (그림 1)를사용합니다. 첫째, 뿌리 줄기 토양 충진 및 급수가 설명되고, 실험식물 의 성장에 대한 세부 사항이 주어집니다. rhizotron 설계 및 토양 기판 제제에 대한 세부 사항은 sI 섹션 S3에제시된다.
그림 1: 리조트론 디자인(스케일 지정 하지 않음). (A)뿌리 줄기성자 성장 용기의 폭발적인 보기. (B)식물 성장 시 조립 된 뿌리 줄기트론. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 류생트론 토양 채우기
- 미리 축화 된 토양 (중력 수분 함량,
SI S3.2참조)로 뿌리 줄기 를 채우기 전에 접착제 테이프를 사용하여 뿌리 줄기트론 의 뒷면에급수 구멍을 닫고 전면 플레이트와 고정 레일 및 나사를 제거합니다. - 빈 뿌리 줄기트론 (전면 판, 레일 및 나사 제외), 8 5cm x 11cm 아크릴 플레이트 및 16 클램프(재료 의 표)를계량하고 무게의 합계를 기록합니다.
- 각 측면에 두 개의 클램프를 사용하여 뿌리 줄기의 바닥에 하나의 작은 아크릴 플레이트를 부착하고, 클램프의 압력은 rhizotron 프레임으로 향하도록 지시, 그래서 플레이트는 안쪽으로 구부러지지 않고 볼륨이 일정하다.
- 뿌리 줄기를 작은 플라스틱 접시쪽으로 약간 기울고 ~ 4cm(도 2A)의높이까지 미리 촉촉한 토양으로 채웁니다. 뿌리 줄기를 약간 교반하여 뿌리 줄기 론 내부의 토양을 분배하고 부드럽게 다짐 도구(도 2B)와몇 mm (특정 토양 특성에 따라)에 의해 토양을 압축합니다.
- 줄기중테론이 토양으로 채워질 때까지 2.1.3 - 2.1.4를 반복한다(도2C). 뿌리 줄기트론에 묘목의 후속 심기 위에 ~ 3cm의 간격을 둡니다.
- 토양으로 채워진 rhizotron (8 개의 작은 판과 16 클램프 포함)의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 이로부터, 2.1.2에서 얻은 빈 뿌리 줄기트론 중량을 빼고 체중 차이, 즉, 습한 토양의
질량(g)을 류조트론에서 기록한다. - Eq. 1에 따르면, 뿌리 줄기중테론에서 건조 토양의
질량을 계산한 다음, Eq. 2에 따라 건조 토양 벌크 
밀도(gcm-3)를 계산한다.
여기서,
(cm3)은뿌리 줄기의 총 내피이다.
참고: 뿌리 줄기의 일반적인 값은 1.0-1.4g cm-3사이입니다. 루트 성장이 이 값 이상으로 방해받을 수 있기 때문에 1.5gcm-3을 초과하지 마십시오. - 토양이 채워진 rhizotron을 지지상자에 놓고 뿌리 줄기론(그림2D)에서모든 클램프와 작은 판을 제거합니다. 프레임에 남아있는 토양 입자가 누출을 일으킬 수 있으므로 티슈 페이퍼를 사용하여 뿌리 줄기 프레임 (즉, 가장자리)을 조심스럽게 청소하십시오.
참고: 노출된 토양 표면은 균일해야 하며 균열이나 틈새 없이 뿌리 줄기프레임으로 수평을 유지해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 뿌리 줄기를 비우고 2.1.2 - 2.1.8을 반복합니다. - 폴리테트라플루오로틸렌(PTFE)(재료표)호일 2개를 각각 22cm x 13cm로 자른다. 또한 플라스틱 호일 조각을 46cm x 15cm로 자른다. PTFE 및 플라스틱 호일 가중치의 합계를 기록합니다. 줄기중성론의 상부에 PTFE 호일의 첫 번째 조각을 배치하여 뿌리 줄기의 상단에 있는 토양 수준에서 ~1cm 를 확장합니다.
- 점착테이프(도 2E)를사용하여 PTFE 호일을 뿌리줄기 프레임에 조심스럽게 고정합니다. 먼저 뿌리 줄기트론의 상단에 있는 한 모서리를 고정하고, 반대편 코너와 마침내 두 코너를 뿌리줄기트론 아래로 고정하는 것으로 시작합니다. 모서리를 고정할 때 장력을 적용하여 2-4로 고정하여 평평한 호일 표면을 보장합니다. 접이 나타나면 모든 접이 제거되고 PTFE 호일이 토양 표면과 평평하고 연속될 때까지 개별 모서리에서 테이프를 열고 다시 수정합니다( 한 번에 는 아님).
- 위쪽 PTFE 호일 조각을 ~1cm 겹쳐서, 위쪽 PTFE 호일 조각을 겹쳐서, 2.1.10을 반복하여 두 번째 PTFE 호일을 뿌리줄기트론에 고정시 놓는 PTFE 호일의 두 번째 조각을 뿌리줄기트론의 하부에 놓는다.
- 플라스틱 호일(46cm x 15cm)을 PTFE 호일에 놓습니다. 2.1.10에 자세히 설명된 대로 고정 절차를 사용하여 플라스틱 호일을 수정합니다.
- 앞판을 토양으로 가득 찬 호일로 덮인 뿌리줄기에 놓습니다. 한 레일을 뿌리줄기의 양쪽에 놓고 나사를 손으로 조이서 레일을 고치고, 따라서 앞판을 뿌리 줄기트론에 놓습니다. 나사는 뿌리 줄기트론의 닫힌 면, 즉 급수 구멍이 있는측면(도 1A)을향해 배치된다.
- 미리 축화 된 토양 (중력 수분 함량,
SI S3.2참조)로 뿌리 줄기 를 채우기 전에 접착제 테이프를 사용하여 뿌리 줄기트론 의 뒷면에급수 구멍을 닫고 전면 플레이트와 고정 레일 및 나사를 제거합니다.
질량(g)을 류조트론에서 기록한다.
질량을 계산한 다음, Eq. 2에 따라 건조 토양 벌크 
밀도(gcm-3)를 계산한다.
(cm3)은뿌리 줄기의 총 내피이다.
그림 2: 류조트론 조립 및 보충은 뿌리 줄기권에서 독단적 이미징을 위해 토양에서 식물을 성장시키기 위해 조립및 채웁니다. (A)뿌리 줄기로 토양을 채웁니다. (B)압축 도구를 사용하여 채워진 토양의 압축. (C)작은 아크릴 플레이트와 클램프가 있는 토양으로 채워진 rhizotron. (D)토양이 채워진 뿌리줄기와 노출된 토양 표면. (E)토양으로 채워진 rhizotron은 부분적으로 보호 PTFE 호일로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 리조트론 핸들링 및 DGT 젤 응용. (A)뿌리 줄기의 뒤쪽에 있는 급수 구멍에 10mL 파이펫 팁을 사용하여 토양급수. (B)토양으로 채워진 폐식 뿌리줄기에 모종(녹색 반점으로 표시)을 심는다. (C) 릴릭스 스미티아나 커팅으로 심은 리조트론은 전면 플레이트와 플라스틱 호일 커버를 제거했다. (D)DGT 겔 적용 전에 PTFE 호일 커버를 조심스럽게 벗겨냅니다. (E)토양 뿌리 인터페이스 ROI의 고해상도 사진. (F)DGT 젤을 장착한 전면 플레이트의 적용을 뿌리줄기에 적용한다. (G)단단한 샘플링 중에 적용된 DGT 젤을 가진 ROI의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 토양에 급수
- 뿌리 줄기론에서 실험 토양의 물 보유 용량 (WHC)을 결정합니다. 이를 위해, 열린 바닥으로 두 개의 뿌리 줄기를 제조하고 섹션 2.1에 지정된 대로 토양으로 채웁니다. 16시간 동안 물 용기에 침수하여 토양으로 채워진 이 개방된 뿌리줄기를 완전히 포화시키고 8시간 동안 뿌리줄기를 배출합니다.
- 오픈 바닥 뿌리 줄기론의 무작위 위치에서 ~ 50g의 복합 토양 샘플을 채취하고 Eq. S1에 따라 결정하기 위해 105 °C에서 샘플을 건조하십시오. 결정된 토양의 WHC에 대응하여,
따라서(gg-1)로표현된다. - 실험적인 뿌리 줄기론에서 표적을 정의한다. 성장 단계에서는, 줄기중성에서 무산소 상태를 피하면서 적절한 양의 물로 식물을 공급하기 위해 WHC(즉, WHC
계수)의 60%를 설정한다. 
Eq. 3에 따라 대상에서 뿌리 줄기론의 토양을 관개하기 위해 추가될 물의 총 질량(g)을 계산한다. 뿌리 줄기트론의 토양에 존재하는 물의 질량을 
고려합니다(g).
- 각 급수 구멍에 첨가되는 물의 질량을 얻기 위해 뿌리 줄기트론급 수(여기 14)의 수로 나눕니다. 10mL 파이펫 팁을 급수 구멍에 밀어 넣고 중력에 의해 토양으로 물이 흘러 들어오게 하여 물을 추가합니다(도3A).
- 식물 성장
- 방사형이 나타날 때까지 특정 종자 발아 요구 사항에 따라 실험 식물 (예 : 젖은 필터 용지에)의 사전 발아 씨앗 (최대 1cm 길이).
- 그림 3B에표시된 대로 뿌리 줄기에 최대 두 마리의 묘목을 심는다. 심기시, 그들의 성장을 지원하기 위해 모종에 직접 물 ~ 5 mL을 추가합니다. 투명하고 수분 유지 필름(재료표)으로 심은 후 첫 ~2일 동안 뿌리 줄기의 상단 개통을덮습니다. 알루미늄 호일에 뿌리 줄기를 감싸서 미생물 성장을 방지합니다.
참고: 모종 외에도 식물 절단은 뿌리 줄기에서 재배 할 수 있습니다. - 심어진 뿌리 줄기를 성장실로 옮기고, 환경 조건(즉, 온도, 습도, 광강도)을 특정 식물 요구 사항으로 설정합니다. 25°-35°에서 뿌리 줄기를 경사하여 중력증을 통해 전면 판과 함께 뿌리 발달을 보장합니다.
- 식물 성장 동안, 2.2.5에 상세한 바와 같이 뿌리 줄기트론급을 사용하여 2-4일마다 주기적으로 급수함으로써 뿌리 줄기의 목표 수분 함량을 주기적으로 유지한다. ~5mL의 물을 정기적으로 추가하여 토양 표면을 촉촉하게 유지하십시오.
참고: 식물이 장기간 재배되고 식물 바이오매스가 제안된 방법에 의해 뿌리줄기에 첨가된 물의 양을 실질적으로 감소시킬 것으로 예상되는 경우, 별도의 뿌리줄기에서 식물을 재배하여 식물 바이오매스의 무게를 고려하여 정해진 간격으로 식물 조직을 복제하고 수확및 계량한다. - 뿌리가 전면 판을 따라 적합한 위치에 도달하면, 뿌리 줄기의 중심에 우선적으로, 뿌리 줄기 솔루트 분포를 샘플링하기 위해 DGT 젤을 적용합니다.
따라서(gg-1)로표현된다.
계수)의 60%를 설정한다.
Eq. 3에 따라 대상에서 뿌리 줄기론의 토양을 관개하기 위해 추가될 물의 총 질량(g)을 
고려합니다(g).
3. 솔루트 분포 샘플링
- 젤 응용 프로그램
- 2.2.4.-2.2.5에 상세히 설명된 바와 같이 젤 적용 전에 60%에서 80% 24h로 줄기중테론이 증가하였다. 이것은 좋은 토양 젤 접촉을 보장하고 solute 샘플링 하는 동안 무산소 토양 조건을 피하면서 젤에 솔트 확산을 허용합니다.
- 새로운 산 세척 전면 플레이트를 가져 가서 샘플링에 사용되는 뿌리 줄기에 정렬하고 플레이트에 관심 영역 (ROI)을 표시하십시오. 플레이트를 라미나르 플로우 벤치 또는 다른 먼지 및 금속없는 환경으로 옮기면 표시되지 않은 면이 위를 향합니다.
- PTFE 코팅 면도날을 사용하여 일반적으로 약 3cm × 5cm의 ROI에 대응하는 필요한 직사각형 크기로 아크릴 지지대에서 DGT 결합 젤을 잘라냅니다. 면도날을 미끄러지기보다는 눌러 겔을 잘라 내어 투명컷을 보장합니다. 직사각형 젤 조각을 ROI의 표시된 위치에 플레이트의 표시되지 않은 측면에 놓습니다.
참고: HR-MBG를 사용하는 경우 젤이 토양 뿌리 시스템과 잘 접촉하고 있는지 확인하기 위해 젤 아래에 100 μm-얇은 스페이서 호일을 첨가할 수 있습니다. - 10 μm 얇은 폴리 카보네이트 멤브레인 (0.2 μm 모공 크기; 재료 의 표) 젤 크기를 양쪽에 ≥1cm로 확장하고 멤브레인을 젤에 놓는 크기로. 스택에서 기포를 제거하기 위해 물을 일부 적용합니다.
- 비닐 전기 테이프(재료의 표)를사용하여 네 개의 가장자리를 따라 멤브레인을 고정합니다. 이 과정에서 플라스틱 핀셋을 사용하여 젤과 멤브레인 사이에 갇힌 기포를 조심스럽게 제거합니다. 테이프는 젤이 아닌 멤브레인과만 접촉해야 합니다.
참고: 테이프가 젤과 접촉하는 경우, 기포가 젤과 멤브레인 사이에 갇혀 있거나, 최종 멤브레인 표면이 접힌 것을 보여주거나, 젤내로 솔루트의 확산 플럭스가35(반복 3.1.3 - 3.1.5)에 손상될 수 있으므로 젤/멤브레인 스택을 재조립해야 한다. - 줄기를 스탠드에 놓고 레일을 제거하고 전면 플레이트(그림 3C)에서조심스럽게 들어 올립니다. 플라스틱 호일을 제거하고, 뿌리 줄기의 가장자리에서 PTFE 호일을 잘라 내고, 토양 뿌리 시스템의 교란을 피하기 위해 PTFE 호일을 천천히 벗겨냅니다(도3D).
- 토양 구조 및 뿌리 형태에 기초한 단두질 분포의 해석 및 프리젠테이션을 용이하게 하기 위해 디지털 단일 렌즈 반사(DSLR)카메라(재료표)를사용하여 ROI의 직교 사진을 촬영한다(도 3E). 카메라 스탠드와 사용 가능한 경우 매크로 렌즈를 사용합니다. 사진의 중심이 ROI의 중심에 맞도록 카메라를 정렬하고 카메라의 초점 평면은 토양 표면과 평행합니다. 사진에 는 눈금 표시줄(예: 눈금자)을 포함합니다.
- 겔/멤브레인 스택이 장착된 플레이트를 개방 된 뿌리 줄기트론(도 3F)에부착합니다. 따라서, 기울기 트론의 가장자리에 접시의 한 가장자리를 정렬하고 부드럽게 토양을 향해 접시를 '구부리기'. 이 응용 분야 는 젤 / 멤브레인 스택과 토양 뿌리 시스템 사이의 기포를 방지하는 데 도움이됩니다. 레일과 나사를 사용하여 전면 판을 고정합니다.
참고: 이 단계는 매우 중요하며 신중하게 수행해야 합니다. 토양과 뿌리를 대체하지 않고 는 젤/멤브레인 스택과 토양 뿌리 시스템 간의 접촉을 확립한 후 플레이트를 이동할 수 없습니다. - 겔 전개의 정확한 시작 시간을 기록하고 3.1.7(도3G)에서주어진 ROI에서 전개된 젤의 사진을 찍습니다. 알루미늄 호일에 뿌리 줄기를 감싸고 솔트 샘플링 기간이 끝날 때까지 성장실로 옮김합니다(종종 24h).
- 젤 검색
- 지지 상자에 뿌리 줄기를 놓고, 조심스럽게 전면 판을 들어 올리고, 고초 입자를 씻어 물로 접시에 젤 / 멤브레인 스택을 헹구다(도 4A). 젤 배포의 정확한 종료 시간을 기록합니다. EQ. S1에 따라 RHi. 토양을 결정하기 위해 ROI로부터 토양을 시료한다.
- 전면 플레이트를 라미나르 플로우 벤치로 옮기고, 젤/멤브레인 스택이 위를 향합니다. 4개의 가장자리를 따라 먼저 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 젤을 덮는 폴리카보네이트 멤브레인(도4B)을조심스럽게 제거하여 전면 플레이트에서 젤을 회수합니다. 물을 적용하여 젤이 토양 접촉 측이 위를 향하도록 접시에 있는 얇은 물 막에 자유롭게 떠있는 데 도움이됩니다.
참고: 젤 방향을 추적하는 것이 중요합니다. 토양과 뿌리에 노출된 젤 측은 항상 (사용자를 향해) 직면해야합니다.
- 젤 건조
- 젤 블로팅 지(재료의 표)의직사각형 조각을 잘라 폴레서술페네 멤브레인 (0.45 μm 모공 크기의 약간 작은 조각을 배치; 재료 의 표) 상단에.
- 플라스틱 핀셋을 사용하여 젤 블로팅 종이 /멤브레인 스택에 접시에서 젤을 전송, 토양 접촉 측을 향하고. 젤은 젤과 멤브레인 사이의 기포없이 완화 (즉, 스트레칭되지 않음) 완전히 평평해야합니다. 젤 전달 및 포지셔닝을 용이하게 하기 위해 젤 블로팅 종이/멤브레인 스택에 물을 일부 바르게 하십시오.
- 젤 블로팅 종이/멤브레인/젤 스택을 플라스틱 호일로 완전히 덮고 젤 샘플과 그 방향을 플라스틱 호일(도4C)에라벨로 붙입니다. 젤 블로팅 종이/멤브레인/젤/플라스틱 호일 스택을 진공 젤 건조기(재료표)에놓고 스택이 완전히 건조될 때까지 건조시킵니다(일반적으로 48-72h). HR-MBG의 경우, 온도를 50-55°C로 설정하여 HR-ABG 및 HR-CBG를 실온에서 가장 건조시합니다.
- 말린 스택에서 젤 블로팅 페이퍼를 제거하고 현재 폴레더술포네 멤브레인과 분리할 수 없는 결합된 젤을 지퍼 백으로 옮긴다. 플라스틱 호일 커버는 LA-ICP-MS 분석 직전까지 젤에 유지됩니다.
- 토양에 노출되지 않는 블랭크 방법으로 원래 젤 시트에서 젤 조각을 포함한다. 3.3.2 -3.3.4에 이어 샘플 젤과 동일한 블랭크 젤 을 처리한다.
그림 4: DGT 젤 검색 및 솔트 샘플링 시 건조 준비. (A)단단한 샘플링 직후 DGT 젤과 뿌리 줄기를 가진 플레이트. (B)라미나르 플로우 벤치에서 플레이트로부터 DGT 젤의 회수. (C)젤 건조용 젤 블로팅 페이퍼/폴레셔설폰 막/DGT 젤/플라스틱 호일 커버 의 스택. 젤은 뿌리 줄기권 토양에 배치 된 후 약간 착색된다는 점에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. DGT 결합 젤의 화학 분석
참고: 본 프로토콜에서, DGT 결합 젤에 대한 단두분포의 분석은 4중 ICP-MS(그림5)에결합된 2체량 절제세포를 장착한 나노초 193 nm ArF 엑시머 LA 시스템을 사용하여 LA-ICP-MS에 의해 달성된다. 모든 계측기는 재료표에 기재되어 있습니다. 대안적으로, 나노초 213 nm 또는 266 nm 고체 상태 LA 시스템은36,39,40,41,42, 43을적용할 수 있다. 향상된 감도 또는 질량 해상도가 필요한 경우 섹터 필드 ICP-MS는 쿼드러폴 ICP-MS15,44의대안입니다. LA 시스템의 외부 교정 및 결합을 위한 DGT 겔 표준의 제조에 대한 세부 사항은 SI 섹션 S4 및 S5에제시된다.
그림 5: DGT 젤 분석을 위한 LA-ICP-MS 설정. (A)나노초 193 nm ArF 엑시머 LA 시스템과 쿼드러폴 ICP-MS. (B)말린 젤은 유리 판에 장착하고 LA 샘플 스테이지에 고정되어 절제 세포에 도입할 준비를 합니다. (C)양방향 Y-스플리터 및 토치 어댑터 피팅을 통해 ICP에 연결된 절제 세포로부터 ICP-MS 및 에어로졸 캐리어 가스(He 또는 Ar)의 분무기 가스(Ar). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- LA-ICP-MS용 샘플 준비
- 건조된 젤 샘플, 표준 및 방법 블랭크(폴레셔설포네 멤브레인 지지체와 병합됨)를 양면 접착제테이프(재료 표)의개별 조각에 전달하여 겔 측을 향하고 있다. 초과 테이프 부품을 자르면 절제 셀의 공간을 절약할 수 있습니다.
- 말린 젤을 유리 접시에 장착합니다. 각 젤 샘플, 표준 계열 또는 블랭크 방법에 개별 유리 플레이트를 사용하여 LA 샘플 스테이지(일반적인 크기 는 10cm × 10cm)에 유연하게 배열할 수 있습니다. 필요에 따라 유리 판 크기를 조정하려면 유리 커터를 사용합니다. 플라스틱(재료의 표)을사용하여 LA 샘플 단계(도 5B)에젤로 유리 판을 고정합니다. 단계 바닥을 조정하여 젤 표면을 평평하게 하고 샘플 스테이지를 절제 셀로 잠급니다.
- LA-ICP-MS 라인 스캔 분석
- SI 섹션 S5에지정된 대로 LA 시스템을 ICP-MS에 결합합니다. LA소프트웨어(재료표)에서카메라 등설정(예:'링','동축','전송')을설정하여 절제 셀에서 젤 표면을 비추고 z축 거리를 조정하여 젤 표면에 초점을 맞춥니다. 셀 전체의 임의 위치로 이동하여 모든 젤 표면이 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
- LA 소프트웨어의'레이저 설정'창에서 LA 매개 변수를 설정합니다. DGT 젤의 LA-ICP-MS 라인 스캔 분석에 사용되는 일반적인 설정은 모드 연속; 에너지 출력 20-30%; 반복 속도 10-20 Hz; 현물 직경 100-200 μm; 스캔 속도 150-250 μm s-1.
참고: 매개 변수는 사용되는 젤 유형에 최적화되어야 하며 다를 수 있습니다. 실험 및 기악 설정에 따라 신호 대 노이즈 비율, 공간 해상도 또는 획득 시간을 줄이기 위해 매개 변수를 향상시킬 수도 있습니다. 상대적으로 낮은 에너지 출력(≤40%)을 사용 및 반복 속도(≤25Hz)는 겔을 통해 백킹재료(39)로침투하지 않도록 한다. 레이저 스캔 속도가 데이터 포인트의 압축을 피하기 위해 총 ICP-MS 스캔 주기 지속 시간(4.2.6 참조)으로 나눈 스팟 직경≤ 있는지 확인하여 스캔방향(45)에서해상도가 손실되는지 확인하십시오. 예를 들어, 200 μm의 현물 직경과 총 ICP-MS 스캔 사이클 지속 시간을 0.25s로 설정할 때 스캔 속도는 ≤800 μms-1이어야한다. - 라인 도구를 선택하고 젤 표준에 걸쳐 하나의 ~ 1mm 길이의 라인 패턴을 그립니다. '검색패턴'창에서 선 패턴을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 LA 매개 변수가 4.2.3으로 설정되어 있는지 확인합니다. 채택 되었습니다. '중복스캔'도구를 사용하여 이 선을 4번 복제하고, 현물 지름보다 더 큰 인터라인 거리(선 중심 간 거리)를갖는다(그림 6). 이 방법은 젤 표준당 총 5개의 평행선을제공한다(n = 5). 각 젤 표준, 교정 블랭크 및 메서드 블랭크에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 겔 샘플로 이동하고 분석할 직사각형 영역의 위쪽 가장자리를 따라 한 줄을 그립니다. 4.2.3에 지정된 대로 전체 샘플 영역에 대해 병렬 선을 만들도록 선을 복제합니다. 300-400 μm의 인터라인 거리를 사용합니다. 각 선의 각 시작점과 끝점에 대해 포커스(z축 거리)가 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다.
참고: 분석의 공간 해상도는 인터라인 거리에 비해 스캔 방향을 따라 더 높습니다. 따라서 선의 시작 점과 끝점은 아닐리바이트 그라데이션의 방향을 가장 잘 따를 수 있습니다. 뿌리 권 구면 의 경우, 이것은 일반적으로 루트 축(도 6)에수직입니다. - ICP-MS소프트웨어(자료의 표)에서시간 해결된'데이터 전용'방법을'방법'화면에서 설정하고, 모든 분석기마다 하나 이상의 적합한 동위원소(들)를 선택하고 내부 정규화 표준31,36,40,41, 41,42로 13C를포함한다. 간섭(46)에의해 동위원소 검출이 손상되지 않았는지 확인한다.
- ICP-MS메서드('Est. Reading Time')의총 스캔 주기 지속 시간을 동위원소 당 적절한 거주 시간(일반적으로 10-50 ms 사이)으로 ≤0.5s로 설정합니다. ICP-MS'판독값'을1로 설정하고'판독/복제'값을 변경하여 샘플당 총 측정시간(예: 샘플링 시간')또는 개별 절제 라인당 설정합니다. 이는 4.2.2 - 4.2.4로 설정된 특정 LA 매개 변수 및 선 거리에 따라 다릅니다.
- 데이터 보고의 경우 강도 대 시간 데이터 수집 모드를 사용하고'파일 쓰기 옵션'을'샘플당 새'로설정하여 각 절제 라인에 대한 개별 데이터 파일(여기 .xl)을 만듭니다.
- ICP-MS ' 샘플 ' 화면에서'일괄처리'샘플서열을 설정 하 여 각 샘플 항목 4.2.3 - 4.2.4로 설정된 개별 절제 라인에 해당 합니다.
- '일괄분석'을클릭하여 ICP-MS에서 샘플 서열을 시작하며, 첫 번째 레이저 펄스에 의해 트리거될 때까지 데이터 수집을 기다립니다(트리거 구성에 대한 자세한 내용은 SI S5 참조).
- LA 소프트웨어에서 분석할 모든 라인을 선택하고 ICP-MS방법('Est. 샘플링 시간',참조 4.2.6.)이 젤 샘플, 표준 및 방법 블랭크에 대해 일반적으로 다른 개별 라인 절제의 지속 시간과 일치하는지 확인합니다. 4.2.6을 반복합니다. 필요한 경우 ICP-MS 메서드를 조정합니다.
- '레이저에너지'창에서'배출'을클릭하여 레이저 헤드를 충전한 다음'실행'을클릭하여'실행 실험'창을 엽니다. 여기서'선택한 패턴만'을선택하고,'워시아웃 지연'을20-30으로 설정하고,스캔 중 레이저 활성화상자를 체크하고' 레이저 워밍업시간'을10s로 설정합니다.
- '실행'에서실행'실행' 창 라인 스캔 분석을 시작하고 실시간으로 ICP-MS에 각 동위원소에 대한 초당 카운트 (cps)의 원시 신호 강도를 모니터링합니다. 각 라인은 레이저워밍업 시간', 10 s) 및 가스 공백으로 종료 ('워시 아웃 지연', 20-30 초)를 시작해야합니다.
- 분석 중에 레이저 유동(Jcm-2)을 모니터링하여 레이저 안정성을 평가합니다. 연도가 크게 달라지면 분석을 중단하고 레이저 소스 및 /또는 미러 시스템이 완벽하게 작동하는지 확인합니다.
- 분석 후, ICP-MS 플라즈마를 중지하고 LA 시스템의 캐리어 가스 유량속도를 0mLmin-1로설정한다. 절제 셀에서 젤을 제거하고 추가 사용을 위해 zip bags에 보관하십시오.
그림 6: DGT LA-ICP-MS 실험 설계의 회로도(확장하지 않음). 이 그림은 시동구의 시투 솔루트 샘플링과 젤 표면의 단두분포의 LA-ICP-MS 매핑을 묘사하며, 여기에는 예시적인 라인 스캔 치수 및 파라미터를 보여주는 클로즈업을 포함합니다. DGT 겔은 DGT 겔의 하단 모서리에 있는 직사각형의 위치에 의해 표시된 바와 같이, 유리 판에 뿌리 부구 토양에서 전송될 때 수평으로 뒤집힌다는 점에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 데이터 처리 및 교정
- 스프레드시트소프트웨어(재료표)에서각 축약된 줄에 대해 원시 데이터 파일(.xl)을 가져옵니다. 원시 데이터 테이블에는 CPS의 각 동위원소에 대한 ICP-MS 판독값(데이터 포인트)과 해당 시간 점을 보여 주습니다. 서로 다른 열에 서로 옆에 있는 모든 줄을 나열합니다.
- 내부표준(13C)과적절한 세척 시간의 신호 안정성을 위해 라인 스캔 데이터를 평가합니다.
- 라인 절제 전에 기록된 모든 개통 값(즉, 레이저 워밍업 시간 동안)에서 각 동위원소에 대한 평균 가스 블랭크를 계산하고 각 동위원소에 대한 해당 원시 강도로부터 평균 가스 공백을 빼서 배경 신호를 수정합니다.
- 각 동위원소(cps)의 신호 강도를 각 데이터 포인트에 대한 내부 표준(cps)의 신호 강도로 나누어 내부 정규화를 적용하여 압제 및 기악 드리프트의 양 에 대한 변동을 보정합니다.
- 시작 전과 각 축산선의 끝 이후에 데이터를 자르기 하여 백그라운드 신호를 제거합니다. 데이터 테이블을 변환하여 각 행이 축약된 선과 각 열에 해당하는 그리드 매트릭스를 정규화된 동위원소 강도 값으로 가져옵니다. 각 동위원소의 행렬을 개별 워크시트로 분리합니다.
- 교정 표준 및 교정 블랭크에 대한 동위원소당 평균 정규화 신호 강도 비율을 계산하고 겔 표준 분석 부하(μg cm-2; SI S4참조)를 x 값으로 선형 회귀 모델을 사용하여 교정 기능(y = ax + b)을계산합니다. 선형도(47)에대해 각 동위원소의 교정 함수를 평가한다.
- 샘플 데이터 매트릭스에 교정 함수를 적용합니다. 정규화된 신호 강도 비,
겔 분석제 하중(μg 
cm-2)으로변환하고, 
Eq. 4 및 Eq. 5에 따라 각 동위원소 및 데이터 포인트에 대해 시간 평균 솔루트 플럭스(pg cm-2 s-1)로변환합니다.
여기서, 보정 라인의 경사, b는 교정 라인의 요격이며, t(들)는 졸음 샘플링 시 겔 전개 시간이다. - 각 분석기의 보정된 샘플 데이터 행렬을 txt 파일로 저장합니다.
- 이미지 생성
참고: 이미지 생성의 모든 단계에서 픽셀 보간 작업을 피해야 하며, 이로 인해 생성된 이미지에서 인위적으로 매끄러운 솔루트 플럭스 그라데이션이 발생할 수 있습니다.- 보정된 샘플 데이터 매트릭스(.txt)를 이미지 분석소프트웨어(재료 표)에서텍스트 이미지로 가져옵니다.
- 총 ICP-MS 스캔 주기 지속 시간(예: 200 μms-1의 스캔 속도와 총 스캔 사이클 지속 시간 0.25s, 횡방향 해상도는 50 μm에 해당하는)으로 레이저 스캔 속도를 곱하여 x 방향(즉, 측면 해상도)으로 픽셀당 거리를 계산합니다. y 방향의 픽셀당 거리는 인터라인 거리(그림6)와동일합니다.
- 이미지의 종횡비 보정 계수를 계산합니다. 따라서 픽셀당 거리를 x 방향으로 픽셀당 거리(예: 300 μm)로 x 방향으로 나눈다(예: 50 μm). 획득한 y/x 보정 계수(이 예 6)를'배율'에적용합니다. 픽셀당 거리(μm 또는 mm)를'설정 축척'으로x 방향으로 적용합니다.
- '조회테이블',즉, 유도 색상 스케일을 적용하여 솔리테 이미지에서 화학 그라데이션을 더 잘 시각화하고 이미지 '색상 균형'을 조정하여 디스플레이 범위의 하부/상한을 제어합니다. '교정표시줄'을추가하고 솔리테어 이미지를 티프 파일로 저장합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어에서'시스템에 복사'명령을 사용하여 솔루트 이미지를 복사하여 데스크톱 게시 소프트웨어(재료 표)에 붙여넣습니다. 3.1.7에서 얻은 ROI의 사진과 함께 스케일 매치, 정렬 및 솔트 이미지를 구성합니다.
참고: 복사하기 전에 10의 X 스케일'과'설정축척'의 'Y스케일'을적용하여 요소 10을 사용하여 솔리테 이미지를 크기를 조정하여 고해상도 게시를 위한 충분한 픽셀을 보장합니다.
겔 분석제 하중(μg 
cm-2)으로변환하고, 
Eq. 4 및 Eq. 5에 따라 각 동위원소 및 데이터 포인트에 대해 시간 평균 솔루트 플럭스(pg cm-2 s-1)로변환합니다.
| DGT 젤 제작 | 식물 재배 | 시투 솔루트 샘플링 | LA-ICP-MS 솔루트 플럭스 매핑 |
| HR-MBG 1주일 |
토양 준비 1주일 |
젤 응용 프로그램 젤당 1시간 |
샘플 준비 젤당 1시간 |
| HR-ABG 3일 |
리조트론 어셈블리 복제당 2시간 |
솔루트 샘플링 기간 변수, 일반적으로 24 시간 |
LA-ICP-MS 분석 젤 당 1 일 |
| HR-CBG 3일 |
식물 성장 연구에 의존 |
젤 검색 젤당 1시간 |
데이터 처리 젤 당 4 시간 |
| 젤 건조 2-3일 |
이미지 생성 이미지당 10분 |
표 1: DGT LA-ICP-MS 기술의 일반적인 단계에 대한 대략적인 시간.
Representative Results
DGT 이미징 방법의 기능 및 데이터 세부사항을 입증하기 위해, 파고피럼 에스컬렌툼과 살릭스 스미티아나(그림 7)의뿌리에 인접한 토양에서 다중 음순 영양분 및 오염 물질 솔루트 종의 서브mm, 2D 플럭스 분포를 컴파일하였다. 프로토콜의 일반적인 절차 단계에 대한 대략적인 시간은 표 1에제시된다.
도 7의 솔루트 이미지는 HR-MBG 또는 HR-CBG 결합 젤을 사용하여 세 가지 다른 연구에서 생성되었다. 화학 적 이미지는 사용되는 LA-ICP-MS 매개 변수에 따라 x 축을 따라 82-120 μm및 y축을 따라 300-400 μm의 공간 해상도로 2D 솔루트 플럭스 분포를 보여줍니다. 이미지 보정 및 크기 조정 중에 보간이 적용되지 않으므로 단일 픽셀은 측정된 데이터 점을 나타냅니다. ROI의 사진 이미지와 솔루트 이미지의 정렬은 다른 요소의 서브 mm, 2D 솔루트 플럭스 분포가 토양 구조 및 뿌리 형태에 따라 매우 가변적임을 알 수 있습니다. 이는 토양-뿌리권-식물 계통의 원소들의 차동 적인 생체지질화학적 거동, 토양 매트릭스 및 식물 뿌리와의 상호 작용에 기인할 수 있다.
도 7A 비열성 무기 Mg, Al, P, Mn 및 Fe solute 플럭스는 NH4NO3로수정된 탄산염 없는 토양에서 자란 젊은 F. 에스컬럼 루트 를 중심으로 시각화하였다. 서브mm 솔루트 분포는 루트 섭취량으로 인해 구형 루트 섹션과 함께 감소된 알, P 및 Fe 플럭스의 영역을 보여주었으며, F. 에스컬럼 루트의 국소화된 P 동원 공정으로 인해 뿌리 정점에 Mg, Al, P, Mn 및 Fe 플럭스가 크게 증가하였다. 루트 팁은 토양 표면 뒤에 다소 위치하므로 사진 이미지에서는 거의 볼 수 없습니다. 도 7B는 젠, Cd 및 Pb로 적당히 오염된 토양에서 자란 금속 내성 S. 스미티아나 의 뿌리 주위에 Mn, Fe, Zn, Cd 및 Pb를 포함한 음순 미량 금속의 분포를 나타낸다. 솔루트 이미지는 특히 Zn, Cd 및 Pb의 뚜렷한 고갈을 즉각적인 루트 위치에서 시각화하여 S. 스미티아나 뿌리가 오염 된 토양의 음순 미량 금속에 대한 국소싱크 역할을한다는 것을 보여 주었습니다. 게다가, 국소화된 Zn, Cd 및 Pb 플럭스 증가를 관찰할 수 있고, 이는 즉각적인 토양 뿌리 인터페이스에서 이러한 미량 금속의 축적을 나타낸다.
다원소 솔루트 이미징 외에도, 제시된 방법은 평면광막(34)과같은 보완적인 확산 기반 이미징 기술과 결합될 수 있다. 이는 도 7C에서입증되며, S. 스미티아나 의 뿌리 줄기권내의 비순 미량 금속의 분포가 결합된 단일 층 평면 광막-DGT 양이온 결합겔(33)을사용하여 pH의 분포와 공동 국화되었다. 토양 기판은 (NH4)2SO4로수정되어 대량 토양에 비해 루트 축을 따라 pH가 감소하도록 이끌었다. pH 감소는 Mn, Fe, Co, Ni, Cu 및 Pb의 증가된 솔루트 플럭스와 함께 공동 국화되어 pH 유도 금속 용윤화를 시사했습니다.
더욱이, 이러한 예제 결과는 얻을 수 있는 잠재적인 화상 진찰 유물의 일부를 보여줍니다. 예를 들어, 구조적 토양 불동성, 예를 들어, 도 7A의ROI 이미지의 하부 3분의 1에서 수평선으로 관찰된, 토양 겔 접촉 불연속성을 일으켜 결합 겔내로 이 위치에서 제한된 확산을 초래할 수 있다. 반대로, 뿌리 줄기중의 과도한 토양 압축은 무산소증을 향한 토양 레독스 상태의 인위적인 변화로 인해 다공성이 저하될 수 있다. 이는 ROI 이미지의 조밀한 토양 층과 시각적으로 일치하는 솔리우트 이미지에서 높은 Mn 및 Fe 플럭스의 광범위한 영역이 시각적으로 일치하는 그림 7B에설명되어 있습니다. 이것은 높은 토양 압축으로 인한 토양 레독스 잠재력이 감소하여 백곡에 민감한 원소의 환원 용해 및 용해성 생성을 제안합니다. 따라서 충진 후 토양 표면의 신중한 뿌리 줄기 및 육안 검사가 권장됩니다.
그림 7: 다른 토양 뿌리 인터페이스에 걸쳐 음순 영양소와 오염 물질 solute 종의 하위 mm 2D 분포. (A)음이온 P및 양이온 Mg, 알, Mn 및 Fe 솔루트의 분포는 젊은 F. 에스컬럼 루트 주위로 한다. 음이온 및 양이온 솔루트의 공동 국소화 샘플링은 ~75% WHC의 토양 수도에서 24시간 동안 HR-MBG를 사용하여 달성하였다. Al, P 및 Mn 이미지는 보정된 fDGT 값(pg cm-2 s-1)으로표시되는 반면, Mg 및 Fe 이미지는 13C정규화 된 강도를 보여줍니다. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 이 그림은 심판48에서적응됩니다. (B)Zn, Cd 및 Pb로 적당히 오염된 토양에서 자란 S. 스미티아나 뿌리 주위의 Mn, Fe, Zn, Cd 및 Pb의 분포는 ~80% WHC의 토양 수도에서 20시간 동안 HR-CBG를 사용하여 샘플링하였다. 모든 이미지는 보정된 fDGT 값(pg cm -2 s-1)으로표시됩니다. 스케일 바는 0.5cm를 나타냅니다. 이 그림은 심판3에서적용됩니다. (C)Cd와 함께 스파이크된 토양에서 자란 S. 스미지아나 뿌리 주위의 pH 및 다중 양이온 솔루트의 분포는 HR-MBG 프로토콜의 수정을 사용하여 달성되었으며, 동시 솔루트 샘플링 및 평면 검소이미징(33)을가능하게 하였다. Mn, Cu, Zn 및 Cd 이미지는 보정된 fDGT 값(pg cm-2 s-1)으로표시되는 반면 Fe, Co, Ni 및 Pb 이미지는 13C정규화 강도를 표시합니다. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 이 그림은 심판33에서적응됩니다. 제시된 수치는 CC BY에따라 라이선스가 부여된 인용 기사3,33,48개에서 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 솔루트 이미징 프로토콜은 토양 식물 환경에서 2D 영양소와 오염 물질 플럭스를 시각화하고 정량화하는 다목적 방법입니다. 토양 뿌리 인터페이스에서 음순 솔루트 종의 서브mm 스케일 다원지 이미지를 생성하는 능력에서 독특하며, 뿌리 줄기권에서 유족 그라데이션을 측정하기 위한 대체 방법의 달성 가능한 공간 해상도를 초과하여 실질적으로4. DGT의 현장 샘플링 접근법을 표적으로 하는 것은 LA-ICP-MS와 같은 고감도 화학 분석 방법과 결합하여 토양 또는 이와 유사한 기판에서 자란 개별 식물 뿌리 주변의 용성 플럭스 역학에 대한 상세한 조사를 용이하게 합니다. 싱크 대 샘플링 프로세스로 인해 얻어진 이미지는 시각화된 솔루트의 가용성을 반영하므로 식물가용성(10)을추정합니다. 솔루트 플럭스의 방법 내재 측정은 식물이 이용 가능한 영양소 분획으로 해석가능성과 같은 상당한 이점을 지니고 있지만, 플럭스 측정은 모공수 농도 측정보다 이해하기가 훨씬 적습니다. 표준 DGT 샘플링 지오메트리(특히 해당 설정에 사용되는 0.8mm 두께의 확산 젤)은 실제 모공수 농도, csoln및 시간 평균 모공수 농도 추정치를 대량 DGT 측정,cGT,및 소르테 종의 재공급 역학에 관한 이러한 파라미터의 해석을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 비교는 매우 얇은 확산 층을 가진 이미징 DGT 응용 프로그램에 기초하여 수행 할 수 없습니다, 파생 된 cDGT 값은 비현실적으로 작은34. 따라서 DGT 이미징 결과는 항상 간단하고 빠르게 해석되는 것은 아니며 종종 기존의 모공수 농도 측정과 직접적으로 비교할 수 없습니다.
이 방법을 적용할 때, 주로 뿌리 줄기트론 성장 용기를 채우고 급수하는 데 관련된 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 고려해야 합니다. 뿌리 줄기로 토양을 채우는 동안, 식물 뿌리가 강하게 압축 토양을 관통 할 수 없기 때문에 토양을 너무 많이 압축하지 않도록하는 것이 매우 중요하다 뿌리 성장이 억제될 것이다. 우리는 토양이 일반적으로 덜 압축되는 뿌리가 강하게 압축 된 토양을 피하고 뿌리 줄기 성자 성장 용기의 내부 가장자리를 따라 성장하는 것을 관찰했습니다. 이 경우, DGT 젤을 편리하게 적용할 수 있는 뿌리줄기의 중심에 위치한 개별 뿌리는 전혀 개발되지 않을 수 있어 성공적인 겔 적용을 효과적으로 저해할 수 있다. 우리의 실험실에서, 경험은 1.0-1.4 gcm-3의 건조한 토양 벌크 밀도가 방해받지 않는 뿌리 발달을 허용한다는 것을 보여주었습니다. 더욱이, 과도한 토양 다짐은 또한 레독스에 민감한 원소 및 생화학적으로 연관된 종의 용해도에 관한 유물의 잠재적인 원천이다. 총 기공 부피가 감소하고 모공 직경 분포가 고압축 토양에서 낮은 직경으로 이동함에 따라 공기가 채워진 더 큰 직경의 모공 부피가 사용되어 현지에서 환원 조건으로 이어질 수 있습니다. 따라서 MnIII/IV및 Fe III-산화물이 감소하여 Mn 2+ 및 Fe2+ 플럭스가 증가할 수 있습니다. 인산염 및 미량 영양소의 경우 중요한 소취 부위인 페-옥사이드의 용해는 소베드 및/또는 공동 침전된 종을 해방시켜 생지질화학관련 종의 인위적으로 상승된 유류를 유발할 수 있다. 성장 용기에 너무 많이 물을 주면 비슷한 문제가 발생할 수 있습니다. 성장 컨테이너의 상단에 있는 작은 토양 표면적을 통한 증발은 낮으며 토양은 심기 후 최대 몇 주 동안 수포화 상태로 유지될 수 있으며, 이는 또한 레독스 유물을 유발할 수 있다.
또 다른 중요한 고려 사항은 제조 된 HR-DGT 결합 젤의 화학 적 기능입니다. 프로토콜을 따르면 결합 단계의 균일한 분포를 가진 얇은 젤이 얻어집니다. 겔에 불균성 물질 분포 영역(예를 들어, 젤내의 구멍 또는 결합 상응골)이 있는 경우 이러한 영역을 제거하거나, 너무 광범위하면 겔 제조 프로토콜을 반복해야 합니다. 올바르게 준비되면, 겔은 분석특정 젤 결합 용량에 의해 결정되는 즉시 및 정량적으로27으로확산되는 표적 솔루트 종을 결합할 수 있어야 한다. 겔 용량을 초과하는 것은 오염되지 않은 토양에서 문제가 되지 않지만 금속 오염 토양 및 식염수 토양 환경에서 고려해야 합니다. 젤 결합 단계의 포화는 정량적 솔루트 샘플링을 손상시킬 뿐만 아니라 젤의 결합 단계 사이에 소LUT의 측면 확산을 초래하여 소규모 솔루트 플럭스 피처의 무기한 국소화로 이어집니다. 따라서, 표적 토양 환경에서 매우 많은 양의 음순 영양소/오염물질이 예상되는 경우 예비 검사를 실시해야 한다. 예상 DGT 로딩을 추정하기 위해, 벌크 토양 DGT 피스톤 샘플링 다음에 겔 용출 및 습식 화학 적 분석을 적용할 수 있다15,49. 필요한 경우, DGT 배포 시간은 젤 접점 시간을 단축하고 따라서 용량 임계값 이상의 젤 포화를 피하기 위해 조정될 수 있다. 반대로, 예비 시험은 매우 낮은 솔루트 로딩이 예상되는 경우 필요한 젤 접촉 시간 및/또는 LA-ICP-MS 민감도를 식별하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 자연 토양 배경수준(15)에서미량 원소 솔루트를 매핑하는 데 중요할 수 있다. 게다가, 정확한 DGT 젤 기능은 DGT LA-ICP-MS 교정 표준의 제조에 있는 젤의 통제된 로딩을 통해 그것의 실험 적인 적용 전에 확인되어야 합니다. 상기 겔 표준은 LA-ICP-MS에 의해 결정된 시료 젤 로딩이 예상 범위 내에 있는지 평가하는 데 사용될 수 있는 매트릭스 일치 기준 젤 단량 하중을 제공한다. 가스 및 방법 빈 배경 잡음과 다른 신호를 얻을 수 없는 경우 작업자는 추적 요소 분석을 위한 실험실 절차가 구현되고 모든 프로토콜 단계가 올바르게 수행되었는지 확인해야 합니다. 때때로 DGT 젤은 레이저 빔이 아닌 유리 판을 향한 토양 노출, 로드 된 면으로 경질 샘플링 후 실수로 뒤집혀 최종 솔트 플럭스 이미지에서 낮은 신호 강도와 잘못 뒤집힌 특징을 초래합니다.
LA-ICP-MS 분석 중에 대량의 데이터가 생성되어 평가하는 데 상당한 시간이 걸립니다. 랩에서 표준 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 대상 데이터 출력 형식에 맞게 조정된 사내 데이터 평가 스크립트를 사용합니다. 반자동 정렬 및 교정 후, 이미지 플로팅은 오픈 소스, 오픈 액세스 이미지 분석 도구 (ImageJ, 피지50)를사용하여 수행됩니다. 이 방법을 사용하면 수집된 데이터가 직사각형에 해당하며 생성된 솔루트 맵에 제대로 표시해야 하는 이차 픽셀이 아니라 직사각형에 해당하기 때문에 데이터 정렬, 평가 및 프레젠테이션을 완전히 제어할 수 있습니다. 또한 데이터 처리 중에 픽셀 보간을 주의 깊게 피해야 합니다. 픽셀 보간은 화학 이미지의 매끄러운 그라데이션으로 이어지므로 순환 요소 분포 기능이 부드러워지므로 원래 데이터를 바람직하지 않게 변경합니다. 픽셀 보간은 많은 이미지 처리 소프트웨어 제품에서 작업을 다시 확장하고 다시 포맷하는 표준 절차이지만 일반적으로 선택 해제할 수 있습니다.
결론적으로, 상기 기술된 방법은 천연 토양-뿌리부-식물 시스템에서 영양소와 오염물질 역학을 이해하기 위한 중요한 발전이다. DGT 전용 응용 분야 이외에, 이 방법은 평면 검소3,33,42,43,48,51 및 zymography20,21,22,23,24와같은 다른 확산 기반 이미징 기술과 결합될 수 있으며, 추가 원소 및 토양 파라미터를 포함하는 추가적인 개발될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에 의해 공동 투자되었다 : P30085-N28 (토마스 프로하스카) 오스트리아 과학 기금 (FWF) 및 낮은 오스트리아의 연방 상태: P27571-BBL (야콥 산트너).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
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