Summary
Этот протокол представляет собой рабочий процесс для суб-мм 2D визуализации нескольких половых неорганических питательных веществ и загрязняющих солют видов с использованием диффузных градиентов в тонких пленках (DGT) в сочетании с масс-спектрометрии изображений. Солутный отбор проб и химический анализ высокого разрешения подробно описаны для количественного картирования растворов в корневищах наземных растений.
Abstract
Мы описываем метод двухмерной (2D) визуализации и количественной оценки распределения половых (т.е. обратимо адсорбных) неорганических питательных веществ (например, P, Fe, Mn) и загрязняющих (например, As, Cd, Pb) растворимых видов в почве, прилегающей к корням растений (ризосфера) в субмиллиметре. Метод сочетает в себе растворимую выборку на основе раковины диффузными градиентами в тонких пленках (DGT) с пространственно разрешенным химическим анализом путем лазерной абляции, индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрией (LA-ICP-MS). Техника DGT основана на тонких гидрогелях с однородно распределенными аналитно-селективными фазами связывания. Разнообразие доступных фаз связывания позволяет готовить различные типы геля DGT после простых процедур изготовления геля. Для развертывания геля DGT в ризосфере растения выращиваются в плоских прозрачных контейнерах роста (ризотронах), которые обеспечивают минимальный инвазивный доступ к почвенной корневой системе. После периода предварительного роста гели DGT применяются к отдельным регионам, представляющим интерес для отбора проб на месте в корневищах. После этого гели DGT извлекаются и готовятся к последующему химическому анализу связанных растворов с помощью изображений линии LA-ICP-MS. Применение внутренней нормализации с использованием 13C и внешней калибровки с использованием матричных стандартов геля также позволяет количественно определить 2D растворимые потоки. Этот метод уникален своей способностью генерировать количественные, суб-мм масштабные 2D-изображения многоэкторных растворимых потоков в почвенной среде, значительно превышающих достижимое пространственное разрешение других методов измерения растворимых градиентов в корневой среде. Мы представляем применение и оценку метода визуализации нескольких катионных и анионных растворимых видов в корневищах наземных растений и подчеркиваем возможность объединения этого метода с дополнительными методами солютной визуализации.
Introduction
Приобретение питательных веществ растениеводствами является ключевым фактором в определении урожайности. Процессы, регулирующие эффективное поглощение питательных веществ сельскохозяйственными культурами, были тщательно изучены, особенно механизмы контроля за доступностью питательных веществ и интернализации питательных веществ корнями растений в почве-корневом интерфейсе, ризосфере, признаются за их роль в приобретении питательных веществ для сельскохозяйственных культур. Важные процессы поглощения питательных веществ в растениях включают: транспортировку питательных веществ к корню; динамическая уравновешенность между видами, растворенными в почве, и видами, связанными с твердыми почвенными поверхностями; микробная конкуренция за питательные вещества; микробная минерализация питательных веществ, содержащихся в органическом веществе почвы; и интернализация питательных веществ в корневую симплазму. Поглощение неорганических следов металлических (oid) загрязняющих веществ в значительной степени контролируется теми же механизмами.
В зависимости от наличия питательных веществ и загрязняющих веществ, спроса на растения и диффузии в почве можно наблюдать дифференциальные питательные вещества в ризосфере. Для сильно сорбяющих элементов со сравнительно высокими показателями интернализации (например, P, Fe, Mn, n, As, Cd, Pb), происходит истощение половых губ (т.е. обратимо адсорбированная) фракция элемента по сравнению с навалом почвы, при этом ширина зоны истощения часто составляет ≤1 мм, в то время как для более мобильных питательных веществ, таких как NO3-,зоны истощения могут простираться до нескольких сантиметров. Кроме того, накопление таких элементов, как Al и Cd наблюдается, когда доступность превышает уровень поглощения растений2,3.
Учитывая важность процессов ризосферы в питательных и загрязняющих велосипеде, несколько методов для измерения растительно-доступной фракции элемента при высоком пространственномразрешении были разработаны 4,5. Тем не менее, измерение мелкомасштабных половых растворимых дистрибутивов оказалось сложным по нескольким причинам. Основная трудность заключается в том, чтобы отведать очень небольшие (низкий диапазон йЛ) объемы почвы и/или поры в определенных положениях, прилегающих к живым корням растений, для решения крутых градиентов питательных веществ в корневищах. Один из подходов к решению этой проблемы заключается в использовании микро-всасывания чашки для извлечения образцовпоры 6. С помощью этого метода А. Гёттлин, А. Хейм иЭ. Мацнер 7 измеряли концентрацию питательных веществ в почве в непосредственной близости от корней Кверк-робура L. при пространственном разрешении 1 см. Трудность анализа объемов почвы или почвы заключается в том, что эти небольшие объемы выборки в сочетании с низкими концентрациями всех, кроме основных видов питательных веществ, требуют весьма чувствительных методов химического анализа.
Альтернативная система, способная разрешать градиенты питательных веществ с разрешением до 0,5 мм, заключается в том, чтобы вырастить корневой коврик на поверхности блока почвы, с тонким гидрофильных мембранный слой, отделяющий почву откорней 8,9. В этой конфигурации растворы могут проходить через мембрану и корни могут принимать питательные вещества и загрязняющие вещества из почвы, в то время как корневые экссудаты могут распространяться в почву. После создания плотного корневого слоя почвенный блок можно отведать и нарезать полученными образцами почвы для последующей извлечения фракций стихии. Таким образом, можно анализировать одномерные питательные вещества и загрязняющие градиенты, усредняя их на относительнобольшой площади (100 см 2).
Еще одна задача состоит в том, чтобы получить образцы лабильной, растительной фракции элемента, так как большинство методов извлечения химических почв работают очень по-разному по сравнению с механизмами, с помощью которых растения принимают питательные вещества и загрязняющие вещества. Во многих протоколах извлечения почвы почва смешивается с экстрактантным раствором с целью установления (псевдо)равновесия между растворенным и сорбированная фракция элемента. Однако растения постоянно интернализируют питательные вещества и, следовательно, часто постепенно истощают корневища почвы. Хотя протоколы равновесной добычи были широко приняты в качестве почвенных тестов, поскольку они просты в реализации, извлеченная питательная фракция часто не представляет собой доступную для растений питательнуюфракцию хорошо 10,11,12,13. Методы раковины, которые постоянно истощают отобранную почву для питательныхвеществ,были предложены в качестве выгодных методов и могут лучше напоминать основной механизм поглощения питательных веществ,имитируя процессы поглощения корней 10,11,14,15.
В дополнение к описанным выше методам, были разработаны подлинные приложения для визуализации, способные измерять непрерывные карты параметров с разрешениями ≤100 мкм пополям зрения нескольких см 2 для конкретных элементов и химических параметров почвы(био) 5. Авторадиография может быть использована для изображения распределения элементов в корневищах при условии, что подходящие радиоизотопыдоступны 16. Планарные оптоды позволяют визуализировать важные химические параметрыпочвы, такиекак рН и pO 217,18, 19,и активность ферментовили общее распределение белка могут быть отображены с помощью флуоресцентных методов визуализациииндикатора, таких как почвенная зимография 20,21,22,23 и/или корневыеметоды blotting 24. В то время как цымография и ауторадиография ограничиваются измерением одного параметра одновременно, pH и pO2 изображения с использованием планарных оптодов могут быть сделаны одновременно. Более традиционные методы корневого коврика предоставляют только 1D-информацию, в то время как чашки микро-всасывания обеспечивают точечные измерения или 2D-информацию с низким разрешением, однако оба подхода позволяют проводить многоэтакторный анализ. Совсем недавно, P. D. Ilhardt, и др.25 представил новый подход с использованием лазерной индуцированной спектроскопии разбивки (LIBS) для карты 2D общего многоу элемента распределения с разрешением 100 мкм в почве корневой основе образцов, где распределение природных элементов было сохранено тщательной подготовки образца.
Единственный метод, способный целевой 2D выборки нескольких питательных веществ и загрязняющих растворов при высоком пространственном разрешении диффузивных градиентов в тонких пленках (DGT) техники, раковина основе метода отбора проб, который обездвиживает половых следов металла (лоид) видов на месте на связывающий материал, встроенныйв гидрогель слой 26,27. DGT был введен в качестве метода химического видообразования для измерения половых растворов в отложениях и водах, и вскоре был принят для его использования в почвах28. Он позволяет суб-мм масштаба много элемента растворимой визуализации, которая была первоначальнопродемонстрирована в речном отложениях 29, и была разработана далее для его применения вкорневищах растений 30,31,32,33.
Для отбора проб DGT гель размером примерно 3 см х 5 см наносится на один корень растения, который растет в поверхностном слое почвы блока, с гидрофильной мембраной, отделяющей гель от почвы. Во время контакта питательные вещества и/или загрязняющие вещества рассеиваются по отношению к гелю и немедленно связываются связывающим материалом, включенным в гель. Таким образом, градиент концентрации, и, таким образом, непрерывный чистый поток к гелю устанавливается и преобладает во время отбора проб. После отбора проб гидрогель можно удалить и проанализировать с помощью аналитического химического метода, позволяющего пространственно разрешить анализ. Высокоспециализированной и часто используемой техникой для этой цели является лазерная абляция, индуктивно соединенная плазменная масс-спектрометрия (LA-ICP-MS). В некоторых ранних исследованиях, микрочастицы индуцированной рентгеновского излучения (PIXE) также был использован29. Выборка DGT в сочетании с анализом LA-ICP-MS позволяет осуществлять многофакторную химическую визуализацию при пространственном разрешении в размере 100 мкм. Если используются высокочувствительные методы МСП-МС (например, секторальные ПМС-МС), то могут быть достигнуты исключительно низкие пределы обнаружения. В исследовании о влиянии лимирования на Зн и Cd поглощениякукурузы 15, мы смогли сопоставить labile Cd в корневища кукурузы в незагрязненных почвы с ограничением обнаружения 38 пг см-2 cd на гель области. DGT, планарные оптоды и цымография опираются на диффузию целевого элемента из почвы в слой геля, который может быть использован для комбинированного применения этих методов для одновременного или последовательного изображения большого количества параметров, имеющих отношение к питательным веществам растений и поглощению загрязняющих веществ. Подробная информация об аналитических химических аспектах DGT изображений, о потенциале объединения DGT и других методов визуализации, а также о его применении всесторонне рассматривается в рефери34,35.
В этой статье мы описываем, как провести сорутный эксперимент изображения с использованием метода DGT на корнях наземных растений в ненасыщенной почве окружающей среды, в том числе выращивание растений, производство геля, гель применения, гель анализа и генерации изображений. Все шаги подробно проработаны, включая заметки о критических шагах и экспериментальные альтернативы.
Protocol
1. Изготовление гелей DGT
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько типов геля DGT доступны для 2D-изображения половых растворимых видов с высоким (суб-мм) пространственным разрешением35. Здесь кратко резюмируется изготовление трех хорошо охарактеризованных гелей высокого разрешения (HR)-DGT, используемых в растворимых приложениях для визуализации. Лабораторные процедуры анализа микроэлементов, а также подробные процедуры изготовления всех представленных гелей HR-DGT описаны в разделах Поддержка информации (SI) S1 и S2.
- Гель для связывания полиуретана на основе смешанного аниона и катиона (HR-MBG; SI S2.1)31
- Приготовьте суспензию полиуретанового геля с однородно рассеянными фазами гидроксида циркония (IV) и иминодиадетата (МАР).
- Пальто гель подвески в тонкой пленке на стеклянную пластину и инициировать образование геля растворителем испарения, чтобы получить 0,1 мм толщиной, слезоточивый смешанный анион и катиона связывающий гель (HR-MBG).
- Полиакриламид-зиркония анион связывающий гель (HR-ABG; SI S2.2)36
- Изготовить 0,4 мм толщиной агарозы кросс-связанных полиакриламид гель (АПА) после установленныхпроцедур литья геля 37 (см. SI S2.4 для подробного протокола изготовления АПА).
- Осадок циркония (IV) гидроксид фазы в precast APA гель для получения 0,4 мм-тонкий анионный связывающий гель (HR-ABG).
- Полиакриламид-иминодиакат катионная связывающая гель (HR-CBG; SI S2.3)38
- Приготовьте подвеску полиакриламинида с однородно рассеянными фазами МАР.
- Брось гель между двумя стеклянными пластинами и инициировать реакцию полимеризации, чтобы получить 0,4 мм толщиной катиоции связывания гель (HR-CBG), где фазы МАР поселились в одну сторону геля.
2. Выращивание растений
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная система использует ризотроны4 (рисунок 1 )для выращиваниярастений в ненасыщенной почве для растворяемой визуализации. Сначала описаны заполнение корневища почвы и полив, затем даются сведения об экспериментальном росте растений. Подробная информация о дизайне ризотрона и подготовке почвенных субстратов перед заполнением в ризотрон представлены в разделе SI S3.
Рисунок 1: Rhizotron дизайн (не для масштабирования). (A)Взорванный вид контейнера роста ризотрона. (B) Собранный ризотрон во время роста растений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Заполнение почвы Ризотрона
- Перед заполнением ризотрона предварительно увлажненной почвой (гравиметрическое содержание воды,
известно; см. SI S3.2), закройте полив отверстия в задней части ризотрона с помощью клейкой ленты и удалите переднюю пластину и ее фиксации рельсы и винты. - Взвесь пустой ризотрон (за исключением передней пластины, рельсов и винтов), восемь 5 см х 11 см акриловые пластины и 16зажимов (таблица материалов)и зафиксировать сумму веса.
- Прикрепите одну небольшую акриловую пластину в нижней части ризотрона, используя два зажима с каждой стороны, с давлением зажимов, направленных на раму ризотрона, так что пластина не сгибается внутрь и объем является постоянным.
- Слегка наклоняют ризотрон к небольшой пластиковой пластине и заполняют предварительно увлажненной почвой высотой до 4 см(рисунок 2А). Распределите почву внутри ризотрона, немного агитизовав ризотрон и аккуратно сжать почву на несколько мм (в зависимости от конкретных характеристик почвы) инструментом уплотнения(рисунок 2B).
- Повторите 2.1.3 - 2.1.4 до тех пор, пока ризотрон не будет заполнен почвой(рисунок 2C). Оставьте зазор в 3 см в верхней части для последующей посадки саженцев в ризотрон.
- Взвесь заполненный почвой ризотрон (включая 8 небольших пластин и 16 зажимов) и замещать вес. Из этого вычесть пустой вес ризотрона, полученный в 2.1.2, и зафиксировать разницу в весе, т.е. массу влажной
почвы, (г), в ризотроне. - Рассчитайте массу сухой почвы в
ризотроне, (г), согласно Eq. 1, а затем вычислите плотность сухого 
грунта (гсм -3),в ризотроне в соответствии с Eq. 2.
Здесь
(см.3)находится общий внутренний объем ризотрона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные значения в ризотроне между 1,0-1,4 г см-3. Не превышать 1,5 г см-3, так как рост корня может быть затруднен выше этого значения. - Поместите заполненный почвой ризотрон на опорную коробку и удалите все зажимы и небольшие пластины из ризотрона(рисунок 2D). Тщательно очистите корневища кадр (т.е. края) с помощью бумаги, так как оставшиеся частицы почвы на раме могут вызвать утечки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность открытой почвы должна быть однородной и выравниваться с рамой ризотрона без каких-либо трещин или зазоров. Если нет, опорожните ризотрон и повторите 2.1.2 - 2.1.8. - Вырезать два куска политетрафторэтилена (PTFE)(Таблица материалов)фольги до 22 см х 13 см каждый. Кроме того, вырезать кусок пластиковой фольги до 46 см х 15 см. Запись суммы PTFE и пластиковой фольги весов. Поместите первый кусок фольги PTFE на верхнюю половину открытой поверхности почвы в ризотрон, простирающийся на 1 см над уровнем почвы в верхней части ризотрона.
- Аккуратно зафиксировать фольгу PTFE на раме ризотрона с помощью клейкой ленты(рисунок 2E). Начните с фиксации один угол в верхней части rhizotron во-первых, а затем его противоположный угол и, наконец, два угла дальше вниз по ризотрону. Нанесите натяжение при фиксации углов 2-4, чтобы обеспечить плоскую поверхность фольги. Если складки возникают, откройте и перефиксните ленту на отдельных углах (не все сразу) до тех пор, пока все складки не будут удалены, а фольга PTFE будет плоской и прилегающей к поверхности почвы.
- Поместите второй кусок фольги PTFE на нижнем конце ризотрона, перекрывая верхнюю часть фольги PTFE на 1 см. Повторите 2.1.10 для фиксации второй фольги PTFE на ризотрон.
- Поместите пластиковую фольгу (46 см х 15 см) на фольгу PTFE. Зафиксните пластиковую фольгу с помощью процедуры фиксации, подробно описанной в 2.1.10.
- Поместите переднюю пластину на заполненный почвой и покрытый фольгой ризотрон. Поместите один рельс вокруг каждой стороны ризотрона и затяните винты вручную, чтобы исправить рельсы и, таким образом, переднюю пластину к ризотрону. Винты расположены в сторону закрытой стороны ризотрона, т.е. сбоку с поливными отверстиями(рисунок 1A).
- Перед заполнением ризотрона предварительно увлажненной почвой (гравиметрическое содержание воды,
известно; см. SI S3.2), закройте полив отверстия в задней части ризотрона с помощью клейкой ленты и удалите переднюю пластину и ее фиксации рельсы и винты.
почвы, (г), в ризотроне.
ризотроне, (г), согласно Eq. 1, а затем вычислите плотность сухого 
грунта (гсм -3),в ризотроне в соответствии с Eq. 2.
(см.3)находится общий внутренний объем ризотрона.
Рисунок 2: Ризотрон сборки и заполнения для выращивания растений в почве для растворимой визуализации в корневой сфере. (A)Заполнение почвы в ризотрон. (B)Уплотнение заполненной почвы с помощью инструмента уплотнения. (C)Заполненный почвой ризотрон с небольшими акриловыми пластинами и зажимами. (D)Заполненный почвой ризотрон с открытой поверхностью почвы. (E)Заполненный почвой ризотрон частично покрыт защитной фольгой PTFE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обработка Rhizotron и применение геля DGT. (A)Полив почвы с использованием 10 мл пипетки советы в полив отверстия в задней части ризотрона. (B)Посадка саженцев (показанных как зеленые пятна) в заполненный почвой и закрытый ризотрон. (C) Rhizotron посадили с Salix smithiana черености и удалены передней пластины и пластиковой фольги крышкой. (D) Тщательно пилинг от крышки фольги PTFE перед применением геля DGT. (E)Высокое разрешение фото почвы корневой интерфейс рентабельности инвестиций. (F) Применение передней пластины, оснащенной гель DGT на ризотрон. (G)Фото рентабельности инвестиций с гель DGT применяется во время solute выборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Полив почвы
- Определите емкость удерживаемой воды (WHC) экспериментальной почвы в ризотроне. С этой целью изготовите два ризотрона с открытым дном и заполните их почвой, указанной в разделе 2.1. Полностью насытить эти открытые, заполненные почвой ризотроны путем погружения в контейнер для воды в течение 16 ч и процедить ризотроны в течение 8 ч.
- Возьмите композитный образец почвы в размере 50 г из случайных мест в корневищах с открытым дном и высушите образец при 105 градусов по Цельсию, чтобы определить в соответствии с Eq. S1. Определяется соответствует WHC почвы и, следовательно, выражается как
(г г-1). - Определите цель в экспериментальном ризотроне. Во время фазы роста, установить 60% WHC (т.е. фактор WHC,
) для снабжения растений с достаточным количеством воды, избегая при этом аноксических условий в rhizotron. - Рассчитайте общую массу воды, которая будет
добавлена, (г), для орошения почвы в ризотроне в цель в соответствии с Eq. 3. Приходится на массу воды, присутствуют в почве в ризотроне, 
(г).
- Разделите на количество корневища полива отверстия (здесь 14), чтобы получить массу воды, которая будет добавлена в каждом водопое. Добавить воду, нажав 10 мл пипетки советы в полив отверстия и позволяя воде течь в почву под действием силытяжести (рисунок 3A).
- Рост растений
- Предварительно прорастаемые семена экспериментального растения (например, на влажной фильтровальной бумаге) в соответствии с конкретными требованиями к прорастанию семян до появления радикула (до 1 см в длину).
- Высадить до двух саженцев в ризотрон, как указано на рисунке 3B. При посадке добавьте 5 мл воды непосредственно к саженцам, чтобы поддержать их рост. Обложка верхнее отверстие ризотрона в течение первых двух дней после посадки с прозрачной, влагоузаздной пленки(Таблица материалов). Оберните ризотрон в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить рост микрофизики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо саженцев, череные растения также могут быть выращены в ризотронах. - Перенесите посаженный ризотрон в комнату роста, с условиями окружающей среды (т.е. температурой, влажностью, интенсивностью света) в соответствии с конкретными требованиями растений. Наклонить ризотрон на 25 -35 ", чтобы обеспечить развитие корней наряду с передней пластиной через гравитропизм.
- Во время роста растений гравиметрически поддерживать целевое содержание воды в ризотроне путем периодического полива каждые 2-4 дня с использованием ризотронных поливных отверстий, как описано в 2.2.5. Держите поверхность почвы на верхнем открытии влажной регулярными добавлениями воды в 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если растения выращиваются в течение длительных периодов времени и биомасса растений, как ожидается, существенно уменьшить количество воды, добавленной в ризотрон предлагаемым методом, приходится вес биомассы растений путем выращивания растений в отдельных реизотронных репликаций и сбора и взвешивания тканей растений через определенные промежутки времени. - Как только корни достигают подходящего места вдоль передней пластины, преимущественно в центре ризотрона, нанесите DGT гели для отбора проб корневища растворитель распределения.
(г г-1).
) для снабжения растений с достаточным количеством воды, избегая при этом аноксических условий в rhizotron.
добавлена, (г), для орошения почвы в ризотроне в цель 
(г).
3. Выборка растворимого распределения
- Гелеобразуя приложение
- Увеличение корневища с 60% до 80% 24 ч до применения геля, как подробно описано в 2.2.4.-2.2.5. Это обеспечивает хороший контакт почвы-геля и позволяет растворить диффузии в гель, избегая при этом аноксических условий почвы во время раствора выборки.
- Возьмите новую, очищенную от кислоты переднюю пластину, выровняй ее на ризотроне, используемом для отбора проб, и отметите области интереса (ROIs) на тарелке. Перенесите пластину в скамейку для ламинарного потока или любую другую свободную от пыли и металла среду, немаркированную сторону лицом вверх.
- Вырезать DGT связывания гель на акриловой поддержки необходимого прямоугольного размера, соответствующего рентабельности инвестиций, как правило, около 3 см × 5 см, используя PTFE покрытием лезвия бритвы. Вырезать гель, нажав, а не скольжения лезвие бритвы, чтобы обеспечить четкий разрез. Поместите прямоугольный гель кусок на немаркированной стороне пластины на отмеченном месте рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется HR-MBG, под гелем может быть добавлена фольга площадью 100 мкм, чтобы убедиться, что гель находится в хорошем контакте с корневой системой почвы. - Вырежьте поликарбонатную мембрану размером 10 мкм (размер поры 0,2 мкм; Таблица материалов) до размера, который расширяет размер геля на ≥1 см с каждой стороны и поместить мембрану на гель. Нанесите немного воды, чтобы удалить пузырьки воздуха из стека.
- Зафиксйте мембрану по всем четырем краям с помощью виниловой электрическойленты (Таблица материалов). При этом тщательно удаляйте пузырьки воздуха, застрявшие между гелем и мембраной с помощью пластиковых пинцетов. Лента должна соегодировать только с мембраной, а не с гелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если лента соединяясь с гелем, пузырьки воздуха оказываются в ловушке между гелем и мембраной, или окончательная поверхность мембраны показывает складки, гель / мембрана стек должен быть собран как диффузный поток растворов в гель может бытьнарушена 35 (повторить 3.1.3 - 3.1.5). - Поместите ризотрон на подстой, снимите рельсы и осторожно снимите переднюю пластину(рисунок 3C). Снимите пластиковую фольгу, отрежьте фольгу PTFE по краям ризотрона и медленно снимите фольгу PTFE, чтобы избежать нарушения корневой системы(рисунок 3D).
- Возьмите ортогональной фотографии рентабельности инвестиций с помощью цифровой однообъективный рефлекс (DSLR) камеры (Таблица материалов), чтобы облегчить интерпретацию и представление растворимого распределения на основе структуры почвы и корневой морфологии (Рисунок 3E). Используйте стенд камеры и, при наличии, макрообъектив. Выровнять камеру так, чтобы центр фотографии соответствовал центру рентабельности инвестиций, а плоскость фокусировки камеры была параллельно поверхности почвы. Включите на фото планку масштаба (например, линейку).
- Прикрепите пластину, оснащенную гелем/мембранным стеком, к открытому ризотрону(рисунок 3F). Поэтому выровнять один край пластины с краем ризотрона и аккуратно «согнуть» пластину к почве. Этот способ применения помогает избежать пузырьков воздуха между гель / мембрана стек и почвы корневой системы. Зафиксите переднюю пластину с помощью рельсов и винтов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение и должен быть выполнен тщательно. Пластина не может быть перемещена после установления контакта между гель / мембрана стек и почвы корневой системы без вытеснения почвы и корней. - Завехать точное время начала развертывания геля и сфотографировать развернутый гель на рентабельность инвестиций, как у данность в 3.1.7 (Рисунок 3G). Оберните ризотрон в алюминиевую фольгу и перенесите в комнату роста до конца периода отбора проб (часто 24 ч).
- Увеличение
- Поиск геля
- Поместите ризотрон на опорную коробку, осторожно смахните переднюю пластину и промойте гель/мембранный стек на тарелку водой, чтобы смыть прилипающие частицы(рисунок 4A). Завезение точное время окончания развертывания геля. Образец почвы из roi для определения фактического W почвы в rhizotron в соответствии с Eq. S1.
- Передача передней пластины в ламинарный поток скамейке, гель / мембрана стек лицом вверх. Извлеките гель из передней пластины, тщательно удалив сначала ленту по всем четырем краям, а затем поликарбонатную мембрану, покрывающуюгель (рисунок 4B). Нанесите воду, чтобы помочь гелю свободно плавать на тонкой пленке воды на тарелке с почво-контактной стороной лицом вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно следить за ориентацией на гель. Сторона геля подвергается воздействию почвы и корни должны всегда лицом вверх (по отношению к пользователю).
- Сушка геля
- Вырезать прямоугольный кусок геля blotting бумаги (Таблица материалов) и место немного меньший кусок полиэтерсульфона мембраны (0,45 мкм поры размер; Таблица материалов) на вершине.
- Передача гель из пластины на гель blotting бумаги / мембраны стек с помощью пластиковых пинцетов, почвы контактной стороне лицом вверх. Гель должен быть расслабленным (т.е. не растянутым) и полностью плоским, без пузырьков воздуха между гелем и мембраной. Нанесите немного воды на гель blotting бумаги / мембраны стек для облегчения передачи геля и позиционирования.
- Обложка гель blotting бумаги / мембраны / гель стек полностью с куском пластиковой фольги и этикетки образца геля и его ориентации на пластиковой фольге (Рисунок 4C). Поместите гель blotting бумаги / мембраны / гель / пластиковый стек фольги в вакуумной сушилке геля (Таблица материалов) и сухой, пока стек полностью высохли (как правило, 48-72 ч). Для HR-MBG установите температуру до 50-55 градусов по Цельсию, для HR-ABG и HR-CBG лучше всего высохнуть при комнатной температуре.
- Удалите гель blotting бумаги из высушенного стека и передачи гель, который в настоящее время неразрывно слились с полиэтерсульфона мембраны, в почтовый мешок. Пластиковая крышка фольги остается на гель незадолго до LA-ICP-MS анализа.
- Включите гель кусок из оригинального листа геля в качестве метода пустой, который не подвергается воздействию почвы. Обработать метод пустой гель идентичны образца гель следующие 3.3.2 - 3.3.4.
Рисунок 4: DGT гель поиска и подготовки к сушке на растворимый выборки. (A) Плита с гелем DGT и ризотроном сразу после соляной выборки. (B)Извлечение геля DGT из пластины в скамейке ламинарного потока. (C)Стек гель blotting бумаги / полиэтиленовой мембраны / DGT гель / пластиковая фольга крышка для сушки геля. Обратите внимание, что гель слегка окрашен после его развертывания на корневой почве. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
4. Химический анализ геля связывания DGT
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, анализ растворимого распределения на DGT связывающий гель осуществляется LA-ICP-MS с помощью наносекундной 193 нм ArF excimer LA система оснащена двухтомной абляционной ячейки в сочетании с четырехугольной ICP-MS (Рисунок 5). Все инструменты перечислены в таблице материалов. Кроме того, наносекундные 213 нм или 266 нм твердотопливные системы LAмогут быть применены 36,39,40,41,42,43. Если требуется повышенная чувствительность или массовое разрешение, секторная область МСП-МС является альтернативой четырехугольной ICP-MS15,44. Подробная информация о подготовке стандартов DGT гель для внешней калибровки и соединения системы LA с четырехугольной ICP-MS представлены в разделах SI S4 и S5.
Рисунок 5: УСТАНОВКА LA-ICP-MS для анализа геля DGT. (A) Наносекунда 193 нм ArF excimer LA системы и четырехугольный ICP-MS. (B)Сушеные гели, установленные на стеклянных пластинах и закрепленные на этапе образца LA, готовые к введению в абляционную клетку. (C) Небулайзер газа (Ar) от ICP-MS и аэрозоля перевозчика газа (Он или Ар) от абляционной ячейки, подключенной к МСП через двухмерный Y-сплиттер и факел адаптер установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Пример подготовки к LA-ICP-MS
- Перенесите высушенные образцы геля, стандарты и заготовки метода (которые сливаются с поддержкой мембраны полиэтилена) на отдельные кусочки двусторонних клеевых лент(Таблица материалов),гель стороны лицом вверх. Урожай избыточных частей ленты, чтобы сэкономить место в клетке абляции.
- Намонтировать сушеные гели на стеклянные пластины. Используйте отдельные стеклянные пластины для каждого образца геля, стандартные серии, или метод пустой, чтобы обеспечить гибкое расположение на этапе образца LA (типичный размер 10 см × 10 см). Используйте стеклорез для регулировки размера стеклянной пластины по мере необходимости. Исправить стеклянные пластины с гелями на этапе образца LA(рисунок 5B) с использованием пластилина(Таблица материалов). Уровень поверхности геля путем регулировать пол этапа и зафиксировать этап образца в клетку абляции.
- Анализ линейных сканирований LA-ICP-MS
- Привяжу систему LA к ICP-MS, как указано в разделе S5 SI. В программном обеспечении LA(Таблица материалов), установите настройки света камеры (т.е. 'Кольцо', 'Coax' и 'Передано') для освещения поверхности геля в клетке абляции и сосредоточиться на поверхности геля, регулируя расстояние z-оси. Перемещение в случайных местах по всей ячейке, чтобы убедиться, что все поверхности геля находятся в фокусе.
- Установите параметры LA в окне'Laser Setup' программногообеспечения Лос-Анджелеса. Типичные настройки, используемые в LA-ICP-MS линейный анализ DGT гелей являются: режим непрерывный; выход энергии 20-30%; скорость повторения 10-20 Гц; диаметр пятна 100-200 мкм; скорость сканирования 150-250 мкм с-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры должны быть оптимизированы для типа используемого геля и могут варьироваться. Параметры также могут быть увеличены для увеличения соотношения сигнала к шуму, пространственного разрешения или сокращения времени приобретения в зависимости от экспериментальной и инструментальной установки. Использование относительно низкой мощности (≤40%) и скорость повторения (≤25 Гц), чтобы избежать проникновения через гели в бэк-материалы39. Убедитесь, что скорость лазерного сканирования ≤ диаметр пятна делится на общую продолжительность цикла сканирования ICP-MS (см. 4.2.6), чтобы избежать сжатия точек данных и, таким образом, потери разрешения в направлениисканирования 45. Например, при установлении диаметра пятна 200 мкм и общей продолжительности цикла сканирования ICP-MS 0,25 с, скорость сканирования должна быть ≤800 мкм с-1. - Выберите линейный инструмент и нарисуйте один, длиной 1 мм линейный узор по стандарту геля. Нажмите на шаблон строки в окне'Scan Patterns'и убедитесь, что параметры LA установлены в 4.2.3. были приняты. Используйте инструмент 'Duplicate Scans' для дублирования этой строки четыре раза, с межлинейное расстояние (расстояние между центром линии) больше, чем диаметр пятна(рисунок 6). Этот подход предлагает в общей сложности пять параллельных линий на гель стандарта(n No 5). Повторите этот шаг для каждого стандарта геля, калибровки пустой и метод пустой.
- Переместись к образцу геля и нарисуйте одну линию вдоль верхнего края прямоугольной области, которая будет проанализирована. Дублируйте линию для создания параллельных линий для всей области выборки, указанной в 4.2.3. Используйте межлинейное расстояние 300-400 мкм. Убедитесь, что фокус (расстояние z-оси) установлен правильно для каждой точки старта и конца каждой строки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение анализа выше по направлению сканирования по сравнению с межлинейной дистанцией. Таким образом, стартовые и конечные точки линий могут лучше всего следовать направлению градиентов аналита. Для градиентов ризосферы, это, как правило, перпендикулярно оси корня(рисунок 6). - В программном обеспечении ICP-MS(Таблица материалов),настроить время решены 'Данныетолько ' метод в 'Метод' экран, выберите один или несколько подходящих изотопов (ы) для каждого аналита и включают 13C в качестве внутреннего стандарта нормализации31,36,40,41,42. Убедитесь, что обнаружение изотопов не нарушается помехами46.
- Установите общую продолжительность цикла сканирования метода ICP-MS ('Est. Reading Time') до ≤0,5 с с соответствующим временем пребывания на изотоп (обычно от 10-50 мс). Установите значение ICP-MS 'Readings' to 1 и измените значение'Чтения/Replicate',чтобы установить общее время измерения на выборку ('Est. Sampling Time'),т.е. на одну строку абляции. Это зависит от конкретных параметров LA и линейных расстояний, установленных в 4.2.2 - 4.2.4.
- Для отчетности данных используйте режим сбора данных по интенсивности и времени и установите опцию«Файл написать»на«Новый пример»для создания индивидуального файла данных (here.xl) для каждой линии абляции.
- Настройка последовательность образцов 'Batch'на экране образца ICP-MS, при этом каждая запись образца соответствует индивидуальной линии абляции, настроенной в 4.2.3 - 4.2.4.
- Нажмите 'Analyze Batch', чтобы инициировать последовательность образцов на ICP-MS, которая будет ждать с получением данных, пока она не будет вызвана первым лазерным импульсом (см. SI S5 для получения подробной информации о конфигурации триггера).
- В программном обеспечении LA выберите все строки, которые будут проанализированы, и убедитесь, что метод ICP-MS ('Est. Sampling Time', см. 4.2.6.) соответствует продолжительности отдельных абляций линии, которая обычно отличается для образцов геля, стандартов и заготовок метода. Повторите 4.2.6. при необходимости отрегулировать метод ICP-MS.
- Нажмите' Emission' в окне'Laser Energy'для подзарядки лазерной головки, а затем щелкните 'Run', чтобы открытьокно 'Run Experiment'. Здесь выберите«Выбранные шаблоны только»,установите'Задержка вымывания'до 20-30 с, пометьте 'Enable Laser вовремя сканирования' box, и установите ' LaserWarmup Time' до 10 с.
- Нажмите' Run' в окне ' Runexperiment', чтобы начать анализ линии сканирования и контролировать интенсивность необработанных сигналов в счетах в секунду (cps) для каждого изотопа на ICP-MS в режиме реального времени. Каждая линия должна начаться ('Лазерное время разминки', 10 s) и конец ('Задержка вымывания', 20-30 s) с газовым пробелом.
- Мониторинг лазерного гриппа (J см-2) во время анализа для оценки лазерной устойчивости. Если флюенс в значительной степени варьируется, прервать анализ, и убедитесь, что лазерный источник и / или его зеркальная система полностью функциональны.
- После анализа остановите плазму ICP-MS и установите скорость потока газа перевозчика по системе LA до 0 мл мин-1. Удалите гели из абляционной клетки и храните в почтовых мешках для дальнейшего использования.
Рисунок 6: Схема экспериментального дизайна DGT LA-ICP-MS (не для масштабирования). На иллюстрации изображена проба DGT in situ solute в корневищах и картирование LA-ICP-MS растворительного распределения на поверхности геля, включая крупным планом, показывающий образцовые размеры и параметры сканирования линии. Обратите внимание, что гель DGT горизонтально переворачивается при переводе из корневой почвы на стеклянную пластину, о чем свидетельствует положение прямоугольника в нижнем углу геля DGT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Обработка и калибровка данных
- Импорт необработанных файлов данных (.xl) для каждой абляционной строки в программном обеспечении электроннойтаблицы (Таблица материалов). В таблице необработанных данных показаны показания ICP-MS (точки данных) для каждого изотопа в CPS и соответствующие точки времени в s. Перечислите все строки рядом друг с другом в разных столбцах.
- Оцените данные сканирования линий для стабильности сигнала внутреннего стандарта(13C) и адекватного времени вымывания.
- Рассчитайте средний газовый пробел для каждого изотопа из всех газовых пустых значений, зарегистрированных до абляций линии (т.е. во время лазерной разминки) и вычесть средний газовый пробел из соответствующей необработанной интенсивности для каждого изотопа, чтобы исправить для фонового сигнала.
- Примените внутреннюю нормализацию, разделив интенсивность сигнала каждого изотопа (cps) на интенсивность сигнала внутреннего стандарта (cps) для каждой точки данных, чтобы исправить для колебаний количества материала абляционных и инструментальных дрейфа.
- Данные об урожае до начала и после окончания каждой абляционной линии для удаления фонового сигнала. Переведиционировать таблицу данных для получения матрицы сетки, где каждая строка соответствует абляционной линии, а каждая колонка — нормализованное значение интенсивности изотопов. Разделим матрицы для каждого изотопа на отдельные листы.
- Рассчитайте среднее нормализованный коэффициент интенсивности сигнала на изотоп для стандартов калибровкии калибровки пустым и вычислите функцию калибровки (y q ax и b)с помощью линейной регрессионной модели со стандартными аналитами геля (мкгсм -2; см. SI S4) в качестве x-значений. Оцените функцию калибровки каждого изотопа длялинейности 47.
- Применить функцию калибровки к матрице выборочных данных. Преобразовать нормализованные коэффициенты интенсивности сигнала,
, чтобы гель аналитовые 
нагрузки, (мкгсм -2), а затем в усреднечные по времени растворимые потоки, 
(пг см -2 с-1), для каждого изотопа и datapoint в соответствии с Eq. 4 и Eq. 5:
Здесь, является наклон калибровочной линии, b является перехватом калибровочной линии, и t (ы) время развертывания геля во время solute выборки. - Сохраните откалиброванную матрицу данных образца для каждого анализа в качестве txt-файла.
- Поколение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы избежать любой операции интерполяции пикселей на всех этапах генерации изображений, так как это может привести к искусственному сглаживанию градиентов растворимого потока в полученных изображениях.- Импорт откалиброванной матрицы данных выборки (.txt) в качестве текстового изображения в программном обеспечении анализаизображений (Таблица материалов).
- Рассчитайте расстояние на пиксель в направлении x (т.е. боковое разрешение) путем умножения скорости лазерного сканирования с общей продолжительностью цикла сканирования ICP-MS (например, предполагая скорость сканирования 200 мкмс -1 и общую продолжительность цикла сканирования 0,25 с, боковое разрешение приравнивается к 50 мкм). Расстояние на пиксель в направлении y приравнивается к межлинейному расстоянию(рисунок 6).
- Рассчитайте коэффициент коррекции соотношения сторон изображения. Таким образом, разделите расстояние на пиксель в направлении по-ги (например, 300 мкм) на расстояние на пиксель в направлении x (например, 50 мкм). Применить полученный коэффициент коррекции y/x (в данном примере 6) в соответствии с'Шкалой'. Примените расстояние на пиксель (в мкм или мм) в x-направлении в качестве масштабирования пошкале 'Set'.
- Применитетаблицу 'Look Up Table',т.е. псевдоцветную шкалу для лучшей визуализации химических градиентов в solute изображении и отрегулируйте «цветовой баланс» изображения, чтобы контролировать нижние/верхние пределы диапазона дисплея. Добавьте 'Калибровку бар' и сохранить растворимое изображение, как tiff-файл.
- Копировать solute изображение с помощью команды'Copy to System' впрограммном обеспечении анализа изображений и вставлять в настольное издательское программное обеспечение(Таблица материалов). Масштаб-матч, выровнять и составить solute изображение с фотографией рентабельности инвестиций, полученных в 3.1.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед копированием, хотите размер solute изображения, например, фактор 10 с помощью применения 'X шкала' 10 и 'Y шкала' 10 под 'Установить шкалу' для обеспечения достаточного количества пикселей для публикации с высоким разрешением.
, чтобы гель аналитовые 
нагрузки, (мкгсм -2), а затем в усреднечные по времени растворимые потоки, 
(пг см -2 с-1), для каждого изотопа и datapoint в соответствии с Eq. 4 и Eq. 5:
| Изготовление геля DGT | Культивирование растений | На месте растворимая выборка | LA-ICP-MS растворить поток отображение |
| HR-MBG 1 неделя |
Подготовка почвы 1 неделя |
Гелеобразуя приложение 1 час за гель |
Подготовка образца 1 час за гель |
| HR-ABG 3 дня |
Сборка Ризотрона 2 часа на репликацию |
Период отбора проб Solute переменная, обычно 24 часа |
Анализ LA-ICP-MS 1 день на гель |
| HR-CBG 3 дня |
Рост растений зависит от учебы |
Поиск геля 1 час за гель |
обработка данных 4 часа на гель |
| Сушка геля 2-3 дня |
Поколение изображений 10 мин на изображение |
Таблица 1: Приблизительное время для общих этапов техники DGT LA-ICP-MS.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать возможности и детали данных метода визуализации DGT, мы составили суб-мм, 2D распределение потока нескольких половых питательных веществ и загрязняющих растворимых видов в почве, прилегающей к корням Fagopyrum esculentum и Salix smithiana (рисунок 7). Ориентировочное время для общих процедурных этапов протокола представлено в таблице 1.
Solute изображения на рисунке 7 были созданы в трех различных исследованиях с использованием либо HR-MBG или HR-CBG связывающих гелей. Химические изображения показывают распределение 2D растворимого потока при пространственном разрешении 82-120 мкм вдоль х-оси и 300-400 мкм вдоль оси, в зависимости от используемых параметров LA-ICP-MS. Поскольку интерполяция не применялась во время калибровки и размера изображения, отдельные пиксели представляют собой измеренные точки данных. Выравнивание соляных изображений с фотографическим изображением рентабельности инвестиций показывает, что суб-мм, 2D растворимый поток распределения различных элементов является весьма переменной в зависимости от структуры почвы и корневой морфологии. Это можно объяснить дифференциальным биогеохимическим поведением элементов в почве-ризосферно-растительной системе, а также их взаимодействием с почвенной матрицей и корнями растений.
На рисунке 7A половых неорганических Mg, Al, P, Mn и Fe solute потоки были визуализированы вокруг молодого корня F. esculentum, выращенного в карбонат-свободной почве, оплодотворенной NH4NO3. Суб-мм раствор распределения показали зоны снижение Al, P и Fe потоки наряду со старыми корневых секций из-за поглощения корней, и значительно увеличилось Mg, Al, P, Mn и Fe потоки на вершине корня из-за локализованных процессов мобилизации P F. esculentum корень. Обратите внимание, что кончик корня расположен несколько позади поверхности почвы и поэтому едва виден на фотографическом изображении. Рисунок 7B показывает распределение половых следов металлов, в том числе Mn, Fe, Зн, Cd и Pb вокруг корня металлоустойчивых S. smithiana, выращенных в почве, умеренно загрязненной Зн, Cd и Pb. Растворимые изображения визуализировали различные истощения особенно Зн, Cd и Pb в непосредственной корневой позиции, показывая, что корни S. smithiana выступать в качестве локализованной раковиной для половых следов металлов в загрязненной почве. Кроме того, можно наблюдать локализованное увеличение потока n, Cd и Pb, что указывает на накопление этих микроэлементов в непосредственной близости от корневого интерфейса почвы.
В дополнение к много элементарной соютой визуализации, представленный метод также может быть объединен с дополнительными методами диффузии на основе изображений, таких как планарныеоптоды 34. Это попродемонстрировано на рисунке 7C, где распределение половых следов металлов в ризосфере S. smithiana было совместно локализовано с распределением рН с использованием комбинированного, однослойного планарного оптодно-DGT катиции связывающегогеля 33. Почвенный субстрат был оплодотворен (NH4)2SO4,что привело к снижению рН вдоль корневых осей на 1 единицу по сравнению с навалом почвы. Снижение рН было со-локализовано с увеличением растворимых потоков Mn, Fe, Co, Ni, Cu и Pb, что свидетельствует о плН-индуцированной растворизации металла.
Кроме того, эти примеры показывают некоторые из потенциальных артефактов изображения, которые могут быть получены. Например, структурные неоднородности почвы, например, наблюдаемые в качестве горизонтальной линии в нижней трети изображения roi рисунка 7A, могут вызватьразрыв контакта почвы и геля, приводящий к ограниченному распространению в этом месте в связывающий гель. И наоборот, чрезмерное уплотнение почвы в ризотроне может привести к плохой пористости, что приведет к искусственному сдвигу статуса редокса почвы в сторону аноксии. Это иллюстрируется на рисунке 7B, где обширные области высоко поднятых Mn и Fe потоки в растворимые изображения визуально совпадают с плотным слоем почвы в roi изображения. Это говорит о снижении потенциала переделокса почвы из-за высокого уплотнения почвы, что приводит к редуктивного растворения и растворения высокочувствительных к редоксу элементов. Поэтому рекомендуется тщательная ризотронная начинка и визуальный осмотр поверхности почвы сразу после заполнения.
Рисунок 7: Суб-мм 2D распределение половых питательных веществ и загрязняющих солют видов через различные почвы корневых интерфейсов. (A) Распределение анионических P и катиоических Mg, Al, Mn, и Fe solutes вокруг молодого корня F. esculentum. Ко локализованный отбор проб анионных и катионных растворов был достигнут с использованием HR-MBG в течение 24 ч при насыщении почвы водой 75% WHC. Изображения Al, P и Mn отображаются как откалиброванные значения fDGT (pg cm-2 s-1), в то время как изображения Mg и Fe показывают 13C-нормализованных интенсивности. Шкала бар представляет 1 см. Эта цифра адаптирована из ref.48. (B) Распределение Mn, Fe, N, Cd и Pb вокруг корня S. smithiana, выращенного в почве, умеренно загрязненной n, Cd и Pb. Cationic trace metal solutes были отобраны с использованием HR-CBG для 20 ч при насыщении почвенной воды в размере 80% WHC. Все изображения отображаются в качестве откалиброванныхзначений f DGT (pg cm-2 s-1). Масштабная планка составляет 0,5 см. Эта цифра адаптирована из ref.3. (C) Распределение рН и несколько катионных растворов вокруг S. smithiana корни, выращенные в почве шипами с Cd. Ко-локализации рН и растворительной динамики была достигнута с помощью модификации протокола HR-MBG, что позволяет одновременно растворить выборки и планарного оптодыизображения 33. Изображения Mn, Cu, zn и Cd отображаются в качестве откалиброванных значений fDGT (pg cm-2 s-1), в то время как изображения Fe, Co, Ni и Pb показывают 13C-нормализованных интенсивности. Шкала бар представляет 1 см. Эта цифра адаптирована из ref.33. Представленные цифры воспроизводятся из приведенныхстатей 3,33,48 лицензированных в соответствии с CC BY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Протокол соютой визуализации, представленный здесь, является универсальным методом визуализации и количественной оценки 2D питательных веществ и загрязняющих веществ в почве-растительной среде. Он уникален своей способностью генерировать суб-мм масштаба многофюкторных изображений половых растворимых видов на почве-корневом интерфейсе, превышая достижимое пространственное разрешение альтернативных методов измерения растворимых градиентов в корневойсфере существенно 4. Целевой подход DGT к отбору проб на месте в сочетании с высокочувствительным методом химического анализа, таким как LA-ICP-MS, облегчает детальное исследование динамики растворимого потока вокруг отдельных корней растений, выращенных в почве или аналогичных субстратах. Из-за процесса отбора проб на основе раковины полученные изображения отражают lability визуализированных растворов, и, следовательно, являются оценкой их растительнойдоступности 10. Хотя присущее методу измерение растворимых потоков имеет значительные преимущества, такие как интерпретируемость как доступные для растений питательные фракции, измерения потока гораздо менее прямолинейны для понимания, чем измерения концентрации морской воды. Стандартная геометрия выборки DGT в массовых применениях почвы (в частности, 0,8 мм толщиной диффузионных гелей, используемых в этой установке) позволяет сравнивать фактическую концентрацию поры, csoln, и в среднем по времени оценки концентрации морской воды навалом DGT измерения, cDGT, и для интерпретации этих параметров в отношении снабжения динамики растворимого вида. Тем не менее, такое сравнение не может быть сделано на основе изображения DGT приложения с очень тонкими слоями диффузии, так как производные значения cDGT нереально малы34. Таким образом, результаты визуализации DGT не всегда просты и быстры в интерпретации и часто не напрямую сопоставимы с более обычными измерениями концентрации морской воды.
При применении метода необходимо тщательно продумать несколько важных шагов, в основном связанных с заполнением и поливом контейнеров роста ризотрона. При заполнении почвы в ризотрон, очень важно, чтобы избежать уплотнения почвы слишком много, так как корни растений не могут проникнуть сильно уплотненной почве и рост корней будет ингибироваться. Мы наблюдали корни избегая сильно уплотненной почвы и растет вдоль внутренних краев контейнера роста ризотрона, где почва, как правило, менее уплотняется. В этом случае отдельные корни, расположенные в центре ризотронов, где гель DGT можно применять удобно, могут вообще не развиваться, эффективно подавляя успешное применение геля. В нашей лаборатории опыт показал, что плотность сухого грунта 1,0-1,4г см -3 позволяют беспрепятственно развитие корней. Кроме того, чрезмерное уплотнение почвы также является потенциальным источником артефактов, касающихся чувствительность чувствительных к редоксу элементов и биогеохимически связанных видов. По мере сокращения общего объема пор и сдвига диаметра пор в сторону более низких диаметров в высоко уплотненной почве имеется меньше заполненных воздухом пор большего диаметра, что может привести к редуктивным условиям на местном уровне. Следовательно, MnIII/IV- и FeIII- оксиды могут быть уменьшены, что приводит к увеличению Mn2 "и Fe2" потоки. Растворение оксидов фе, которые являются важными местами сорбции, например, для фосфатов и микроэлементов, может освободить сорбированную и/или совместно осаждаемую такие виды и тем самым вызвать искусственно повышенные потоки биогеохимически связанных видов. Аналогичная проблема может возникнуть, если контейнеры роста поливать слишком много. Испарение через небольшую площадь поверхности почвы в верхней части контейнера роста является низким и почва может оставаться насыщенной водой в течение нескольких недель после посадки, которые также могут вызвать redox артефактов.
Другим важным соображением является химическая функциональность изготовленного геля связывания HR-DGT. Следуя протоколу, получаются тонкие гели с однородным распределением связывающих фаз. Если гели имеют области неоднородного распределения материала (например, отверстия в геле или агрегатах связывающих фаз), эти области необходимо удалить или, если они слишком обширны, протокол изготовления геля должен быть повторен. Если подготовлено правильно, гель должен быть в состоянии связать целевой раствор видов, которые рассеиваютсяв гель немедленно и количественно 27, который определяется анализ-специфической геля связывания потенциала. Хотя превышение емкости геля является менее проблематичным в незагрязненных почвах, его следует учитывать в загрязненных металлом почвах и солевой почве. Насыщение фаз связывания геля не только ухудшит количественную отбор проб, но и приведет к боковому рассеиванию растворов между связывающими фазами в геле, что приведет к бессрочной локализации мелкомасштабных растворимых флюсов. Таким образом, если в целевой почве ожидается очень большое количество половых питательных веществ/загрязняющих видов, следует про проводить предварительные испытания. Для оценки ожидаемых DGT нагрузок, объем почвы DGT поршневой выборки следуют гель elution и мокро-химическийанализ может быть применен 15,49. При необходимости время развертывания DGT может быть скорректировано, чтобы сократить время контакта с гелем и тем самым избежать насыщения гелем пороговых значений емкости. И наоборот, предварительные тесты также могут быть полезны для выявления требуемого времени контакта геля и/или чувствительности LA-ICP-MS, если ожидается очень низкая сольная нагрузка, которая может иметь важное значение для картирования солютов микроэлементов на естественных фоновыхуровнях почвы 15. Кроме того, правильное функционирование геля DGT должно быть проверено перед его экспериментальным применением с помощью контролируемой загрузки гелей при подготовке стандартов калибровки DGT LA-ICP-MS. Стандарт геля обеспечивает матричную нагрузку эталонного геля, которая может быть использована для оценки нагрузки образцов геля, определяемой LA-ICP-MS, в пределах ожидаемого диапазона. Если не удается получить сигнал, который отличается от газа и метод пустой фоновый шум, оператор должен убедиться, что лабораторные процедуры для анализа микроэлементов были реализованы и все этапы протокола были выполнены правильно. Иногда гель DGT случайно переворачивается после соляной выборки с открытой почвой, загруженной стороной, обращенной к стеклянной пластине, а не к лазерному лучу, что приводит к низкой интенсивности сигнала и ошибочно перевернутым функциям в окончательных изображениях потока раствора.
В ходе анализа LA-ICP-MS генерируется большое количество данных, что требует значительного времени для оценки. В нашей лаборатории мы используем скрипты оценки данных, адаптированные для нашего формата вывода целевых данных, используя стандартное программное обеспечение для электронных таблиц. После полуавтоматической сортировки и калибровки, построение изображений проводится с использованием инструментов анализа изображений с открытым исходным кодом (ImageJ, Fiji50). Такой подход позволяет полностью контролировать сортировку, оценку и представление данных, что необходимо, поскольку собранные данные соответствуют прямоугольным, а не квадратным пикселям, которые должны быть должным образом отображены на генерируемых соляных картах. Кроме того, при обработке данных следует тщательно избегать любой пиксельной интерполяции. Пиксельная интерполяция приводит к сглаживанию градиентов на химических изображениях, что приводит к смягчению часто круговых функций распределения элементов и, следовательно, является нежелательным изменением исходных данных. Пиксельная интерполяция является стандартной процедурой при повторном масштабировании и переформатировании операций во многих программных продуктах обработки изображений, но обычно может быть удалена.
В заключение, описанный метод является значительным достижением для понимания питательных веществ и динамики загрязняющих веществ в естественных почво-ризосферно-растительных системах. В дополнение к DGT-только приложения, метод может быть объединен с другими, диффузии наоснове методов визуализации, как планарныеоптоды3, 33,42,43,48,51 и zymography20,21,22,23,24, и могут быть разработаны для включения дополнительных элементов и параметров почвы.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было совместно профинансировано Австрийским научным фондом (FWF): P30085-N28 (Томас Прохаска) и Австрийским научным фондом (FWF) и Федеральной государством Нижняя Австрия: P27571-BBL (Якоб Сантнер).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
- Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
- Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
- Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
- Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
- Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
- Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
- Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
- Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
- Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
- Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
- Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
- Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
- Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
- Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
- Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
- Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
- Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
- Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
- Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
- Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
- Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
- Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
- Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
- Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
- Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
- Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
- Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
- Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
- Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
- Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
- May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
- Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
- Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
- Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).
