Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

न्यूरॉन्स के लिए विविध सिनैप्टिक आदानों का एकीकरण सबसे अच्छा एक तैयारी है कि प्राकृतिक समय और सर्किट प्लास्टिसिटी के लिए सभी पूर्व सिनैप्टिक नाभिक को बरकरार रखता है में मापा जाता है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस आम तौर पर कई कनेक्शन तोड़ । हमने विट्रो प्रयोग क्षमता को बनाए रखते हुए वीवो सर्किट गतिविधि में नकल करने के लिए एक संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विकसित किया।

Abstract

इन विट्रो स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक सटीक इलेक्ट्रिकल और लौकिक संकल्प के साथ एकल-कोशिका गतिविधि को मापती है। मस्तिष्क स्लाइस पैच-क्लैंपिंग या इमेजिंग के लिए न्यूरॉन्स को ठीक से कल्पना करने और एक्सेस करने के लिए अपेक्षाकृत पतला होना चाहिए, और मस्तिष्क सर्किटरी की विट्रो परीक्षा केवल तीव्र स्लाइस में शारीरिक रूप से मौजूद होने तक ही सीमित है। प्रेसिनैप्टिक नाभिक के एक बड़े हिस्से को संरक्षित करते हुए इन विट्रो स्लाइस प्रयोग के लाभों को बनाए रखने के लिए, हमने एक उपन्यास स्लाइस तैयारी विकसित की। यह "वेज स्लाइस" पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि ब्रेनस्टेम में मध्यम ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स के लिए विविध मोनारल, ध्वनि-चालित इनपुट की विशेषता हो। इन न्यूरॉन्स को कॉन्ट्रालेट्रल कान और इसी कॉकलियर न्यूक्लियस (सीएन) में उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय न्यूरॉन्स से उनकी प्राथमिक अफ़ोड़क उत्तेजक और निरोधात्मक जानकारी प्राप्त होती है। एक विषम मस्तिष्क टुकड़ा डिजाइन किया गया था जो एक गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे पर रोस्ट्रो-कौडल डोमेन में सबसे मोटा है और फिर विपरीत गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे की ओर पतला होता है। इस टुकड़े में मोटी तरफ, श्रवण तंत्रिका पक्ष मस्तिष्क को श्रवण उत्तेजनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, आंतरिक सीएन सर्किटरी, और दोनों डिंपिटिक उत्तेजक और ट्राइसिनैप्टिक निरोधात्मक अफरेंशक रास्ते जो कॉन्ट्रालेटरल एमओसी न्यूरॉन्स पर एकाग्र होते हैं। रिकॉर्डिंग स्लाइस के पतले पक्ष पर MOC न्यूरॉन्स से की जाती है, जहां उन्हें विशिष्ट पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए डीआईसी ऑप्टिक्स का उपयोग करके कल्पना की जाती है। श्रवण तंत्रिका की प्रत्यक्ष उत्तेजना के रूप में यह श्रवण ब्रेनस्टेम में प्रवेश करती है, आंतरिक सीएन सर्किट गतिविधि और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के लिए अनुमति देने के लिए MOC न्यूरॉन्स के ऊपर synapses पर होने के लिए किया जाता है । इस तकनीक के साथ, कोई भी स्लाइस के भीतर जितना संभव हो उतना बारीकी से वीवो सर्किट सक्रियण में नकल कर सकता है। यह वेज स्लाइस तैयारी अन्य मस्तिष्क सर्किट पर लागू होती है जहां सर्किट विश्लेषण इन विट्रो स्लाइस फिजियोलॉजी के तकनीकी फायदों के संयोजन में अपस्ट्रीम कनेक्टिविटी और लंबी दूरी के आदानों के संरक्षण से लाभान्वित होंगे।

Introduction

तंत्रिका सर्किट की गतिविधि का अवलोकन आदर्श रूप से देशी संवेदी आदानों और प्रतिक्रिया के साथ किया जाता है, और वीवो में मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच बरकरार कनेक्टिविटी। हालांकि, तंत्रिका सर्किट समारोह के एकल कोशिका संकल्प देने वाले प्रयोगों का प्रदर्शन अभी भी बरकरार मस्तिष्क में तकनीकी चुनौतियों से सीमित है। जबकि वीवो एक्सट्रासेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या मल्टीफोटोन इमेजिंग विधियों का उपयोग अक्षुण्ण तंत्रिका तंत्र में गतिविधि की जांच के लिए किया जा सकता है, यह व्याख्या करते हुए कि विभिन्न इनपुट सबथ्रेसहोल्ड सिनैप्टिक इनपुट को एकीकृत या मापने के तरीके मुश्किल बने हुए हैं। वीवो पूरे सेल रिकॉर्डिंग में इन सीमाओं को दूर लेकिन प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, यहां तक कि मस्तिष्क क्षेत्रों में जो आसानी से पहुँचा रहे हैं । एकल-कोशिका संकल्प प्रयोगों की तकनीकी चुनौतियां मस्तिष्क में गहरी स्थित कुछ न्यूरॉन आबादी में या स्थानिक रूप से फैलाना आबादी में परिलक्षित होती हैं जिन्हें वीवो में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, ऑप्टरोड रिकॉर्डिंग के साथ जोड़े गए चैनलरहोडोप्सिन की आनुवंशिक अभिव्यक्ति) या रिकॉर्डिंग साइट लेबलिंग के बाद पोस्ट-हॉक हिस्टोकेमिकल पहचान (जैसे न्यूरोट्रांसमिशन-विशिष्ट मार्कर के साथ)। ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह के पास फैला हुआ स्थित होने के नाते, औसत दर्जे के ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स उपरोक्त सीमाओं1से पीड़ित हैं, जिससे उन्हें वीवो प्रयोग में उपयोग करना बेहद मुश्किल हो जाता है।

मस्तिष्क के स्लाइस (~ 100-500 माइक्रोन मोटाई) का उपयोग लंबे समय से मस्तिष्क सर्किटरी का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जिसमें श्रवण ब्रेनस्टेम सर्किटरी शामिल है, क्योंकि एक हीस्लाइस2,3,4,5,6,7,8, 9के भीतर निहित कनेक्टेड न्यूरॉन्स के भौतिक अलगाव के कारण। बहुत मोटे स्लाइस (>1 मिमी) का उपयोग करके प्रयोगों को अन्य प्रयोगशालाओं में नियोजित किया गया है ताकि यह समझा जा सके कि मध्यवर्ती बेहतर जैतून10, 11सहित बेहतर अल्पारी परिसर (एसओसी) के क्षेत्रों में द्विपक्षीय आदान कैसे एकीकृत होतेहैं। इन स्लाइस को इस तरह तैयार किया गया था कि श्रवण तंत्रिका (एएन) के अक्षों टुकड़े के भीतर बरकरार रहे और सीएन में सिनैप्टिक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज शुरू करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित थे, पहले आदेश श्रवण न्यूरॉन्स की गतिविधि की नकल उतारते हुए क्योंकि वे ध्वनि का जवाब देंगे। इन मोटी स्लाइस का एक प्रमुख नुकसान पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग ("पैचिंग") के लिए न्यूरॉन्स की दृश्यता है। पैचिंगतेजी से मुश्किल हो जाती है क्योंकि इस क्षेत्र में कई अक्षों को12, 13, 14,15की उम्र के साथ myelinated होजाताहै, जिससे ऊतक ऑप्टिकल रूप से घने हो जाते हैं और एक विशिष्ट, पतले मस्तिष्क के टुकड़े में भी न्यूरॉन्स को अस्पष्ट कर देते हैं। हमारा लक्ष्य विट्रो तैयारी में बनाना है जो वीवो रिकॉर्डिंग में सर्किट कनेक्टिविटी के समान है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस में नेत्रहीन निर्देशित पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की उच्च-थ्रूपुट और उच्च-रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग क्षमताओं के साथ।

हमारी प्रयोगशाला MOC न्यूरॉन्स सहित श्रवण efferent प्रणाली के न्यूरॉन्स के शरीर विज्ञान की जांच । ये कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) 16 , 17 ,18,19,20की गतिविधि को मॉडुलन करके कॉकलियाकोप्रतिक्रिया प्रदानकरतेहैं । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यह मॉडुलन 21 , 22 ,23,24 ,25,26 और ध्वनिक आघात27, 28,20,30,32 ,32,33 मेंनियंत्रण प्राप्त करने में भूमिकानिभाताहै । चूहों में, एमओसी न्यूरॉन्स श्रवण ब्रेनस्टेम1में ट्रैपेजॉइड शरीर (वीटीबी) के वेंट्रल नाभिक में स्थित होते हैं। हमारे समूह ने एपीफ्लोरोसेंट रोशनी के तहत ब्रेनस्टेम स्लाइस में MOC न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए tdTomato रिपोर्टर माउस लाइन के साथ पार की गई ChAT-IRES-Cre माउस लाइन का उपयोग किया है। हमने दिखाया कि एमओसी न्यूरॉन्स को ट्रैपेज़ाइड शरीर (एमएनएलबी) के इप्सिलेटरल मध्यीय नाभिक से अफरीन निरोधात्मक इनपुट प्राप्त होता है, जो बदले में, गोलाकार जंगली कोशिकाओं (जीबीसी) सेअक्षतल कॉकलियर नाभिक (सीएन)34, 35,36,37,38में एक्सॉन द्वारा उत्साहित है। इसके अतिरिक्त, एमओसी न्यूरॉन्स की संभावना को टी-स्टेलेटकोशिकाओं से कॉन्ट्रालेटल सीएन39,40,41में उनके उत्तेजक इनपुट प्राप्त होते हैं। एक साथ लिया, इन अध्ययनों से पता चलता है MOC न्यूरॉन्स दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक एक ही (contralateral) कान से प्राप्त आदानों प्राप्त करते हैं । हालांकि, प्रेसिनैप्टिक न्यूरॉन्स, और उनके एक्सॉन MOC न्यूरॉन्स पर अभिसरण, एक ठेठ कोरोनल स्लाइस तैयारी में पूरी तरह से बरकरार होने के लिए एक दूसरे के लिए काफी करीब नहीं हैं। यह जांचने के लिए कि एमओसी न्यूरॉन्स के लिए सिनैप्टिक इनपुट का एकीकरण उनके एक्शन संभावित फायरिंग पैटर्न को कैसे प्रभावित करता है, नए वर्णित अवरोध पर ध्यान केंद्रित करने के साथ, हमने एक तैयारी विकसित की जिसमें हम सबसे शारीरिक यथार्थवादी तरीके से एक कान से MOC न्यूरॉन्स के लिए विविध afferents को उत्तेजित कर सकते हैं, लेकिन इन विट्रो ब्रेन स्लाइस प्रयोगों के तकनीकी लाभों के साथ।

वेज स्लाइस एक संशोधित मोटी टुकड़ा तैयारी है जो एमओसी न्यूरॉन्स में सर्किट एकीकरण की जांच के लिए डिज़ाइन की गई है (चित्रा 1 एमें स्कीमेट किया गया)। स्लाइस के मोटे पक्ष पर, कील में श्रवण तंत्रिका के कटे हुए एक्सॉन (इसके बाद "श्रवण तंत्रिका जड़" कहा जाता है) होता है क्योंकि वे सीएन में परिधि और सिनेप्स से ब्रेनस्टेम में प्रवेश करते हैं। श्रवण तंत्रिका जड़ को पूरी तरह से अक्षुण्ण सीएन 42 , 43 ,44,45 , 46की कोशिकाओं की न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज औरसिनैप्टिकसक्रियता पैदा करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित किया जासकताहै। इस उत्तेजना प्रारूप सर्किट विश्लेषण के लिए कई लाभ है। सबसे पहले, एमओसी न्यूरॉन्स को अफ़ुरेंट इनपुट प्रदान करने वाले टी-स्टेलेट और जीबीसी एक्सॉन को सीधे उत्तेजित करने के बजाय, हम सीएन में प्रचुर मात्रा में आंतरिक सर्किट की सक्रियता की अनुमति देने के लिए एक को उत्तेजित करते हैं। ये सर्किट सीएन न्यूरॉन्स के आउटपुट को पूरे मस्तिष्क में अपने लक्ष्यों में मिलाते हैं, जिनमें एमओसी न्यूरॉन्स46,47 ,48,49,50, 51शामिल हैं। दूसरा, MOC न्यूरॉन्स के सीएन अपस्ट्रीम के माध्यम से एएन से एफेरेंट सर्किट की पॉलीसाइनैप्टिक सक्रियण अधिक प्राकृतिक सक्रियण समय के लिए और प्लास्टिसिटी के लिए इन सिनेप्स पर होने की अनुमति देता है क्योंकि वे श्रवण उत्तेजना के दौरान वीवो में होते हैं। तीसरा, हम एक गतिविधि की नकल करने के लिए हमारे उत्तेजना पैटर्न भिन्न हो सकते हैं। अंत में, MOC न्यूरॉन्स के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक मोनारल दोनों अनुमानों कील टुकड़ा में बरकरार हैं, और उनके एकीकरण पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की परिशुद्धता के साथ एक MOC न्यूरॉन पर मापा जा सकता है । एक पूरे के रूप में, यह सक्रियण योजना एक विशिष्ट मस्तिष्क स्लाइस तैयारी की तुलना में एमओसी न्यूरॉन्स को अधिक बरकरार सर्किट प्रदान करती है। इस ब्रेनस्टेम वेज स्लाइस का उपयोग अन्य श्रवण क्षेत्रों की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है जो पार्श्व सुपीरियर जैतून, बेहतर ओलिवरी न्यूक्लियस और मध्यवर्ती बेहतर जैतून 10,11,52, 53 , 54,55, 56,56सहित इप्सिल्टरल एमएनएलबी से निरोधात्मक इनपुट प्राप्त करते हैं। हमारी विशिष्ट तैयारी से परे, लंबी दूरी के आदानों की कनेक्टिविटी बनाए रखने और विभिन्न प्रकार के एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग तकनीकों के लिए न्यूरॉन्स के दृश्य में सुधार के लाभों के साथ अन्य प्रणालियों का मूल्यांकन करने के लिए इस स्लाइसिंग विधि का उपयोग या संशोधित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक कंपन चरण या मंच के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसे लगभग 15 डिग्री झुकाया जा सकता है। यहां हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-टुकड़ा चुंबकीय चरण का उपयोग करते हैं जहां "चरण" एक धातु डिस्क है जिसमें एक घुमावदार नीचे एक अवतल चुंबकीय "चरण आधार" में रखा गया है। इसके बाद स्लाइस एंगल को एडजस्ट करने के लिए स्टेज को शिफ्ट किया जा सकता है । चरण आधार पर गाढ़ा हलकों का उपयोग कोण को पुन: पेश करने के लिए किया जाता है। स्टेज और स्टेज बेस को स्लाइसिंग चैंबर में रखा जाता है, जहां मैग्नेटिक स्टेज बेस को भी घुमाया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार संस्थान और स्ट्रोक/राष्ट्रीय बधिरता और अन्य संचार विकारों पशु देखभाल और उपयोग समिति पर संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. प्रायोगिक तैयारी

नोट: टुकड़ा करने की क्रिया समाधान, टुकड़ा करने की क्रिया तापमान, टुकड़ा इनक्यूबेशन तापमान और उपकरण (आदि) सहित टुकड़ा तैयारी के बारे में विवरण इस प्रयोग में किए गए ब्रेनस्टेम तैयारी के लिए विशिष्ट हैं। स्लाइस इनक्यूबेशन विवरण प्रयोगशाला अनुभव के अनुसार बदला जा सकता है।

  1. पैच क्लैंपिंग के लिए आंतरिक समाधान तैयार करें।
    1. वोल्टेज क्लैंप समाधान तैयार करें जिसमें (एमएमए में) 76 सीएस-मीथेनसुलफोनेट, 56 सीएससीएल, 1 एमजीसीएल2,1 सीएसीएल2,10 एचईपी, 10 ईजीटीए, 03 एनए-जीटीपी, 2 एमजी-एटीपी, 5एनए 2-फॉस्फोक्रेटिन, 5 क्यूएक्स-314, और 0.01 एलेक्सा फ्लोरर-488 हाइड्राजाइड। सीएसओएच के साथ पीएच को 7.2 पर समायोजित करें।
    2. (एमएमएम में) 125 के-ग्लूकोनेट, 5 केसीएल, 1 एमजीसीएल2,0.1 सीएसीएल2,10 एचईपीई, 1 ईजीटीए, 0.3 एनए-जीटीपी, 2 एमजी-एटीपी, 1 ना2-फॉस्फोक्रीटिन, और 0.01 एलेक्स फ्लूर-488 zide युक्त वर्तमान क्लैंप समाधान तैयार करें। पीएच को कोह के साथ 7.2 पर समायोजित करें।
  2. 100 एमएल गर्म (उबलते के पास) पानी में 4 ग्राम आगर डालकर 4% एगर का 100 एमएल तैयार करें। तापमान बनाए रखने के लिए गर्म हलचल प्लेट पर रखें और पूरी तरह से भंग होने तक हलचल करें। लगभग 1 सेमी गहराई में 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों में डालें और ठंडा होने दें। जरूरत होने तक फ्रिज में रखें।
  3. 1 एल कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (एसीएसएफ) तैयार करें जिसमें एमएमएम शामिल है: 124 एनएसीएल, 1.2 सीएसीएल2,1.3 एमजीएसओ4,5 केएलएसएल, 26 नाएचसीओ3,1.25 केएच2पीओ4,और 10 डेक्सट्रोस। कम से कम 10 मिनट के लिए कार्बोजन (5% सीओ2 / 95% O2)के साथ बुलबुला, फिर जरूरत पड़ने पर 1 एम नाओएच के साथ अंतिम पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। पूरे प्रयोग में कार्बोजेन के साथ लगातार बुदबुदाते हुए ऑक्सीजन और समाधान के पीएच बनाए रखें।
  4. एसीएसएफ में 1 एमएम क्यून्यूरेनिक एसिड डालकर 200 एमएल स्लाइसिंग सॉल्यूशन तैयार करें। 10 मिनट के लिए एक सोनिकिंग पानी स्नान में सोनिकेट समाधान जब तक किन्यूरेनिक एसिड भंग न हो जाए। कार्बोजन के साथ लगातार बुलबुला और बर्फ पर जगह।
    सावधानी: क्यून्यूरेनिक एसिड से निपटने के दौरान उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
  5. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए वाइब्रेकोम में एक उपयुक्त ब्लेड माउंट करें। बर्फ के साथ आसपास के द्वारा ठंडा कंपन टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष।

2. उत्तेजना के लिए बरकरार श्रवण तंत्रिका जड़ के साथ मस्तिष्क को हटाने

नोट: इन प्रयोगों के लिए चूहों को TdTomato रिपोर्टर चूहों (Ai14) के साथ C57BL/6J पृष्ठभूमि पर ChAT-IRES-Cre ट्रांसजेनिक चूहों को पार करके प्राप्त किया गया था । हिस्पियोलॉजी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले चूहे सुनवाई के बाद की शुरुआत (P14-P23) थे, जो चूहों में P12 के आसपास है । ट्रैपेजॉइड शरीर (वीटीबी) के वेंट्रल नाभिक में टीडीटोमाटो को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को पहले इस माउस लाइन57में एमओसी न्यूरॉन्स के रूप में चिह्नित किया गया है।

  1. इच्छामृत्यु (उदाहरण के लिए, सीओ2 श्वासावरोध) और अनुमोदित संस्थागत प्रक्रियाओं का उपयोग करके जानवर को काटना।
  2. रेजर ब्लेड का इस्तेमाल करते हुए खोपड़ी के मिडलाइन पर त्वचा को नाक से गर्दन के पीछे तक काट लें। खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को वापस छीलें।
  3. छोटी कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी के आधार (रीढ़ की हड्डी के पास कौडल छोर) से शुरू होने वाली मिडलाइन के माध्यम से खोपड़ी में एक चीरा बनाएं और नाक की ओर जारी रखें।
  4. लैम्ब्डा सीवन में, मिडलाइन से खोपड़ी में कटौती करें, दोनों तरफ कान की ओर पार्श्व। मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी को वापस छील लें।
  5. रोस्ट्रल एंड से शुरू होकर, धीरे-धीरे मस्तिष्क को खोपड़ी से दूर एक छोटी प्रयोगशाला स्पैटुला या कुंद संदंश के साथ उठाएं। ऑप्टिक तंत्रिका को काटें और वेंट्रल सतह को उजागर करते हुए मस्तिष्क को पीछे की ओर धीरे से काम करना जारी रखें।
  6. ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह के पास बारीक संदंश के साथ उन्हें चुटकी देकर ट्राइजेमिनल नसों को काट लें।
    नोट: यह ध्यान से करें क्योंकि वेस्टीबुलोकोचलर तंत्रिका इसके ठीक नीचे स्थित है और अंतिम उत्तेजना के लिए बरकरार रहने की आवश्यकता है।
  7. तैयारी को ठंडे टुकड़ा करने की क्रिया के घोल से भरे ग्लास पेट्री डिश में रखें। डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। धीरे-धीरे कार्बोजन के साथ बुलबुला।
  8. चेहरे की तंत्रिका को ब्रेनस्टेम के करीब ट्रिम करें और वेस्टीबुलोकोचलियर तंत्रिका का पर्दाफाश करें।
  9. ठीक संदंश का उपयोग करके, सुझावों को फोरमिना में धकेलें जहां वेस्टिबुलोकोचलर तंत्रिका खोपड़ी से बाहर निकलती है जहां तक संभव हो और तंत्रिका को तोड़ने के लिए चुटकी लें, जिससे तंत्रिका जड़ दिमाग से जुड़ी हो। इसे दूसरी तरफ दोहराएं।
  10. एक बार जब दोनों तंत्रिका जड़ें मुक्त हो जाएं, तो ट्रैपेजॉइड शरीर के पास ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह से मेनिंग्स और वेक्यूलेचर को हटा दें।
  11. शेष कपाल नसों और संयोजी ऊतक को यदि संभव हो तो शेष रीढ़ की हड्डी को संरक्षित करने के लिए ध्यान रखकर खोपड़ी से मस्तिष्क को पूरी तरह से मुक्त करें।

3. ब्लॉक और मंच पर मस्तिष्क माउंट (चुंबकीय डिस्क)

  1. ऑप्टिक चियाम के स्तर पर मस्तिष्क को अवरुद्ध करके चरण को ठीक करने के लिए मस्तिष्क की सतह तैयार करें।
    1. वेंट्रल सतह के साथ, रीढ़ की हड्डी को धीरे-धीरे स्थिर करने के लिए एक कुंद उपकरण का उपयोग करके मस्तिष्क को स्थिर करें ताकि मस्तिष्क निम्नलिखित चरण के दौरान झुका न हो।
    2. ऑप्टिक चियाम के स्तर पर, खुले संदंश का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क के माध्यम से डालने के द्वारा मस्तिष्क को अवरुद्ध करने के लिए विमान बनाने के लिए पकवान के नीचे करने के लिए नीचे । ऊर्ध्वाधर से लगभग 20 डिग्री के कोण पर संदंश डालें ताकि युक्तियां मस्तिष्क कौडल की पृष्ठीय सतह को ऑप्टिक चियाम से बाहर निकालें।
    3. रेजर ब्लेड का उपयोग कर संदंश के साथ काटें।
  2. मस्तिष्क को मंच की सतह पर गोंद करें।
    1. मस्तिष्क का समर्थन करने के लिए 4% एगर का एक छोटा ब्लॉक (~ 1 सेमी3)तैयार करें।
    2. मंच पर गोंद की एक छोटी सी बूंद रखें और इसे आयत में फैलाएं ताकि मस्तिष्क और आगर ब्लॉक दोनों को नीचे चिपकाया जा सके।
    3. संदंश का उपयोग करना, ध्यान से मस्तिष्क उठा और धीरे से एक कागज तौलिया के किनारे का उपयोग कर अतिरिक्त तरल थपका । अवरुद्ध सतह को गोंद पर रखें, वेंट्रल सतह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान ब्लेड की ओर होगी।
    4. आगर ब्लॉक धीरे मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह के खिलाफ पुश करने के लिए यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान समर्थन और उचित मस्तिष्क स्थिति (यानी, कोण) सुनिश्चित करने के लिए ।

4. स्लाइस मस्तिष्क कील टुकड़ा बनाने के लिए

नोट: वाइब्रेकोम का उपयोग करके एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयार करें जिसमें मोटी तरफ कॉकलियर तंत्रिका जड़ और मध्यीय ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स और पतली तरफ ट्रैपेज़ाइड शरीर (MNTB) के मध्यीय नाभिक हैं।

  1. चुंबकीय डिस्क को संलग्न मस्तिष्क के साथ चरण आधार पर रखें और इसे ब्लेड की ओर उन्मुख मस्तिष्क की वेंट्रल सतह के साथ स्लाइसिंग कक्ष में रखें।
  2. कार्बोजन के साथ बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया समाधान और बुलबुले के साथ चैंबर भरें।
  3. ब्लेड को समाधान में कम करें और स्लाइस सममित हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में स्लाइस काउडल काटें। यदि स्लाइस विषम दिखाई देते हैं, तो समरूपता प्राप्त करने के लिए मंच को थोड़ा झुकाएं।
    नोट: 0.05-0.10 मिमी के बीच ब्लेड की गति स्वस्थ स्लाइस काटने के लिए प्रभावी थे और पशु आयु और मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  4. एक बार स्लाइस सममित हो जाने के बाद, स्टेज ~ 15 ° (स्टेज बेस पर लगभग 3 गाढ़ा छल्ले के अनुरूप) को एक तरफ शिफ्ट करें।
    नोट: मंच को श्रवण तंत्रिका जड़ से दूर शिफ्ट करें जिसे आप स्लाइस में संरक्षित करना चाहते हैं।
  5. जब तक श्रवण तंत्रिका जड़ एक तरफ सतह के करीब न हो, तब तक ध्यान से टुकड़ा करना जारी रखें, और चेहरे की तंत्रिका दूसरी तरफ की सतह पर देखी जा सकती है।
  6. मंच को वापस 15 डिग्री मूल स्थिति में स्थानांतरित करें।
  7. ब्लेड को ऊतक से दूर ले जाएं और स्टेज बेस 90 ° स्पिन करें ताकि पतली तरफ के पार्श्व किनारे ब्लेड का सामना कर रहे हों। ब्लेड को कई सौ माइक्रोन कम करें और फिर धीरे-धीरे ब्लेड को ऊतक के किनारे के करीब लाएं। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि ब्लेड पार्श्व किनारे को न छुए। टुकड़ा की पतली धार की वांछित मोटाई के लिए ब्लेड कम, यहां एक अतिरिक्त दो सौ माइक्रोन।
    नोट: परिणामी टुकड़ा आदर्श रूप से ~ 300 मिमी मोटा है जो ट्रैपेज़ाइड शरीर (वीटीबी) के वेंट्रल नाभिक के स्तर पर है जहां पैच क्लैंपिंग होगी।
  8. ब्लेड को ऊतक से दूर ले जाएं और स्टेज बेस को वापस स्पिन करें ताकि वेंट्रल सतह इसका सामना कर रही हो।
  9. कट बनाओ जो कील स्लाइस की रोस्ट्रल सतह को नामित करता है। स्लाइस को इंटरफेस पेपर (1 सेमी2)कौडल सतह के नीचे एक टुकड़े में स्थानांतरित करें। वसूली के लिए इनक्यूबेशन कक्ष या अन्य उपयुक्त इनक्यूबेशन उपकरण (35 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के लिए टुकड़ा ले जाएँ।
    नोट: चेहरे की तंत्रिका रोस्ट्रल सतह पर स्लाइस के दोनों गोलार्द्धों पर दिखाई नी चाहिए (चित्रा 1Bदेखें)।

5. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट-अप और रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष में कील टुकड़ा रखें और एक वीणा या स्थिर प्रणाली के साथ सुरक्षित टुकड़ा। ऊतक को लगातार 7-10 एमएल/मिनट की दर से गर्म (35 डिग्री सेल्सियस) ACSF के साथ कार्बोजन के साथ बुलबुला किया जाता है।
  2. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए 561 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ एपिफ्लोरेसेंस का उपयोग करके वीएनटीबी में आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए एमओसी न्यूरॉन्स की पहचान करें। यदि कोई संभावित पैच करने योग्य कोशिकाएं नहीं हैं तो स्लाइस फ्लिप करें।
  3. डीआईसी ऑप्टिक्स का उपयोग करके, स्लाइस के मोटे पक्ष पर श्रवण तंत्रिका जड़ पर ध्यान केंद्रित करें और द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड को श्रवण तंत्रिका जड़ में ले जाने के लिए एक माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करें और धीरे-धीरे ऊतक की सतह में।
    नोट: सक्शन इलेक्ट्रोड अन्य प्रयोगशालाओं में श्रवण तंत्रिका उत्तेजना प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है। यदि अन्य विशिष्ट तैयारी पर लागू होता है तो थेटा ग्लास इलेक्ट्रोड, या ऑप्टिकल उत्तेजना विधियों को नियोजित किया जा सकता है।
  4. पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए लक्षित करने के लिए एक MOC न्यूरॉन चुनने के लिए वीटीबी को वापस देखने के क्षेत्र ले जाएँ।
  5. प्रस्तावित प्रयोग के लिए उचित आंतरिक समाधान के साथ एक रिकॉर्डिंग पिपेट भरें।
  6. पैच और पूरे सेल विन्यास में MOC न्यूरॉन से रिकॉर्ड। यदि आवश्यक हो तो झिल्ली क्षमता और श्रृंखला प्रतिरोध की भरपाई करें।
  7. MOC न्यूरॉन में लगातार पोस्टसिनैप्टिक घटनाओं को प्राप्त करने के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ के विद्युत उत्तेजना आयाम को समायोजित करें।
    नोट: उत्तेजना इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करना आवश्यक हो सकता है।
  8. MOC (वोल्टेज क्लैंप) या कार्रवाई संभावित पैटर्न (वर्तमान क्लैंप) में पैदा की गई सिनैप्टिक धाराओं का निरीक्षण करने के लिए उचित उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाएं।
    नोट: वेज स्लाइस तैयारी का उपयोग किसी भी विशिष्ट पैच-क्लैंप टूल जैसे ढीले पैच रिकॉर्डिंग, फार्माकोलॉजी, ऑप्टोजेनेटिक्स, कैल्शियम इमेजिंग, न्यूरोट्रांसमीटर अनकिंग आदि के साथ किया जा सकता है।

6. ब्रेनस्टेम न्यूक्लियी की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि

नोट: यह क्रेसिल वायलेट धुंधला के साथ किया जाता है, फिक्स्ड में, फिर से खंडित कील टुकड़ा । यह विधि नाभिक के दृश्य के लिए अनुमति देती है जो स्लाइस में निहित हैं।

  1. एक कील टुकड़ा तैयार करने के बाद, फिक्सेटिव (पीबीएस में 4% पीएफए) में रातोंरात टुकड़ा जलमग्न । पीबीएस (शेकर पर कमरे का तापमान) में 10 मिनट के लिए स्लाइस 3x कुल्ला, फिर क्रायोप्रोटेक्ट के लिए रात भर पीबीएस में 30% सुक्रोज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. एक ठंड माइक्रोटोम (40-70 मिमी) पर स्लाइस को फिर से सेक्शन करें और पीबीएस में 24 अच्छी प्लेट में सीरियल सेक्शन एकत्र करें।
  3. जिलेटिन लेपित स्लाइड पर माउंट वर्गों और पूरी तरह से सूख जाने दें। स्लाइड गाड़ी में स्लाइड्स.
  4. क्रेसिल वायलेट समाधान तैयार करें
    1. 500 एमएल डीएच2ओ में 5 ग्राम क्रेसिल वायलेट एसीटेट मिलाकर 1% क्रेसिल वायलेट एसीटेट तैयार करें
    2. पहले 90 एमएल सॉल्यूशन ए (540 एमएल हिमनदों एसिटिक एसिड + 89.46 एमएल डीएच 2 ओ) और 10 एमएल सॉल्यूशन बी (10 एमएलडीएच2ओ में 136 मिलीग्राम सोडियम एसीटेट) तैयार करके एसीटेट बफर तैयार करें। एसिटेट बफर को उत्पील्ड करने वाले समाधान ए और समाधान बी को मिलाएं।
    3. एसीटेट बफर में 0.5% क्रेसिल वायलेट के लिए एसीटेट बफर 1:1 के साथ 1% क्रेसिल वायलेट एसीटेट मिलाएं। उपयोग से पहले फ़िल्टर करें।
    4. 100% इथेनॉल को कमजोर करके 95% और 70% इथेनॉल तैयार करें डीएच2ओ की उचित मात्रा के साथ
  5. क्रेसिल वायलेट धुंधला प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं। समाधान ट्रे के माध्यम से स्लाइड गाड़ी ले जाएँ, ट्रे के बीच एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त समाधान दाग: जाइलीन - 5 मिनट; 95% इथेनॉल - 3 मिनट; 70% इथेनॉल - 3 मिनट; dH2O - 3 मिनट; 0.5% क्रेसिल वायलेट समाधान - 8-14 मिनट की निगरानी अक्सर जब तक परमाणु धुंधला गहरा बैंगनी हो जाता है; dH2O - 3 मिनट; 70% इथेनॉल - 3 मिनट; 95% इथेनॉल - 1-2 मिनट; 100% इथेनॉल - दो बार स्लाइड डुबकी; जाइलीन - 5 मिनट; जाइलीन: 25 मिनट जब तक बढ़ते प्रदर्शन किया जाता है।
    सावधानी: केवल एक धुएं हुड के नीचे जाइलीन का उपयोग करें।
  6. एक बार में जाइलीन से स्लाइड निकालें और बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड पर तुरंत कवर स्लिप रखें। बढ़ते माध्यम को सूखने की अनुमति दें (रात भर)।
  7. छवि अनुभाग।

7. लाइव, अनसर्गित ऊतक में एक्सॉन के एंटीरोग्रेड ट्रेसिंग के लिए बायोसाइटिन लेबलिंग

  1. ऊपर के रूप में एक कील टुकड़ा तैयार (चरण 2-4) ।
  2. स्लाइस को इंटरफेस पेपर (~ 1 सेमी2)में स्थानांतरित करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, स्लाइस के मोटे पक्ष पर सीएन का पता लगाएं।
  3. ध्यान से एक ऊतक कागज के एक कोने घुमा द्वारा टुकड़ा आसपास के क्षेत्र से अतिरिक्त ACSF हटाने के लिए ऊतक से दूर ACSF आकर्षित । यह बायोसाइटिन को स्लाइस के आसपास के क्षेत्रों में फैलने से रोकता है जो सीएन के बाहर कोशिकाओं में तेज हो सकता है।
  4. ठीक संदंश के साथ, बायोसाइटिन के एक छोटे क्रिस्टल का चयन करें और इसे सीएन की सतह पर रखें। धीरे से ऊतक में क्रिस्टल प्रेस न्यूरॉन्स के साथ संपर्क को बढ़ावा देने और बाद में सोमा में तेज । इस मामले में टी-स्टेलेट और जीबीसी न्यूरॉन्स वाले सीएन क्षेत्रों में रुचि के वांछित क्षेत्र को कवर करने के लिए इस कदम को दोहराएं।
  5. स्लाइस को एक इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। स्लाइस को बायोसाइटिन के तेज और परिवहन के लिए अनुमति देने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के बाद, किसी भी बायोसाइटिन कणों को हटाने के लिए ACSF में टुकड़ा कुल्ला।
  6. रात भर फिक्सेटिव (पीबीएस में 4% पीएफए) में स्लाइस रखें। पीबीएस में 10 मिनट के लिए 3x कुल्ला।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पीबीएस में 30% सुक्रोज में क्रायोप्रोटेक्ट स्लाइस या जब तक स्लाइस डूब जाता है।
  8. 70-100 मिमी पर एक ठंड माइक्रोटॉम पर ट्रांसवर्स वर्गों का उत्पादन करने के लिए ऊतक को फिर से काटना।
  9. एक फ्लोरोसेंटली संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन के साथ मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियों का उपयोग करके ऊतक की प्रक्रिया करें।
    नोट: सर्किट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए महत्वपूर्ण प्रेसिनैप्टिक सेल निकायों, एक्सोन, रिसेप्टर्स या अन्य सिनैप्टिक अणुओं को लेबल करने के लिए उपयोगी होने पर अनुभागों पर अतिरिक्त इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री किया जा सकता है (यानी, प्राथमिक एंटीबॉडी चरणों को बायोसाइटिन माध्यमिक दृश्य को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं करना चाहिए)।
  10. छवि ऊतक।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वेज स्लाइस की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा
श्रवण ब्रेनस्टेम न्यूरॉन समारोह की हमारी जांच के लिए, कील टुकड़ा तैयारी रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित MOC न्यूरॉन्स के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ और CN contralateral को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था (उदाहरण चित्रा 1Bमें दिखाया गया टुकड़ा) । तैयारी की प्रारंभिक हिस्टोलॉजिकल परीक्षा इस बात की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्लाइस में सर्किट सक्रियण के लिए आवश्यक नाभिक होता है और अक्षीय अनुमान बरकरार होते हैं। सीएन के भीतर दो सेल प्रकार MOC न्यूरॉन्स को ध्वनि जानकारी प्रदान करते हैं। टी-स्टेलेट कोशिकाओं को एमओसी न्यूरॉन्स39, 40,41,58को उत्तेजक इनपुट प्रदान करने के लिए परिकल्पना की जाती है। गोलाकार जंगली कोशिकाएं (जीबीसी) कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध में एमएनएनटीबी न्यूरॉन्स को उत्तेजित करती हैं (आयोजित सिनेप्स के विशेष कैलिक्स के माध्यम से)34,36,37,38,59,60 जो, बदले में, एमओसी न्यूरॉन्स57 (योजनाबद्ध चित्रा 1A)को निरोधात्मक इनपुट प्रदान करती हैं। दोनों टी-स्टेलेट कोशिकाओं और GBCs की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, हम फिर से sectioned (५० μm करने के लिए) एक कील टुकड़ा है कि 4% पीएफए में पनडुब्बी द्वारा तय किया गया था और क्रेसिल वायलेट दाग प्रदर्शन के लिए सोमता लेबल । वेज स्लाइस(चित्रा 2, बाएंगोलार्द्ध) के मोटे पक्ष में, सीएन लगभग अपने पूर्ण रोस्ट्रो-कौडल सीमा में मौजूद था। इसके अतिरिक्त, सीएन के पृष्ठीय और वेंट्रल उपविभाजन बरकरार थे(चित्रा 2;एस 19 में तीर और तीर) । टी-स्टेलेट न्यूरॉन्स और जीबीसी क्लस्टर वेंट्रल कॉकलियर नाभिक में जहां श्रवण तंत्रिका(चित्रा 2)एस 17 में तीर) सीएन61,62, 63,64,65में प्रवेश करती है। वेज स्लाइस में एमएनएनटीबी इप्सिलेटरल से एमओसी न्यूरॉन्स के न्यूरॉन्स भी होते हैं जिनसे रिकॉर्डिंग की जाती है (मूल वेज स्लाइस का पतला गोलार्द्ध, चित्रा 2में दाईं ओर)। यह पुष्टि करता है कि MOC न्यूरॉन्स के लिए निरोधात्मक इनपुट का कम से कम हिस्सा बरकरार है(चित्रा 2,स्लाइस 1-15, S11 में धराशायी अंडाकार द्वारा हाइलाइट किया गया)।

अलग-अलग प्रयोगों में, हमने पुष्टि की कि सीएन न्यूरॉन्स के एक्सोन और प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल बायोसाइटिन के साथ एंटेरोग्रेड लेबलिंग का उपयोग करके वेज स्लाइस में बरकरार थे। सबसे पहले, लाइव वेज स्लाइस तैयार किया गया था और इंटरफेस पेपर पर रखा गया था। वेज स्लाइस तैयार करने के तुरंत बाद, बायोसाइटिन क्रिस्टल को सीएन में रखा गया था जिसने इनक्यूबेशन अवधि के दौरान एक्सॉन के साथ तेज और एंटीरोग्रेड परिवहन की अनुमति दी थी। फिर ऊतक (70 मिमी वर्गों) की फिक्सिंग और री-सेक्शनिंग किया गया। बायोसाइटिन के साथ लेबल किए गए एक्सॉन की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले स्ट्रेप्टाविडिन वाले वर्गों का धुंधला प्रदर्शन किया गया था। इन वर्गों की कॉन्फोकल छवियां सीएन में उज्ज्वल लेबलिंग दिखाती हैं जहां क्रिस्टल रखे गए थे और सेल निकायों में ले जाया गया था(चित्र 3 ए,बाएं गोलार्द्ध, धराशायी क्षेत्र)। वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राॅ्रिया(चित्रा 3 ए,सफेद एरोहेड) के साथ सीएन से बाहर निकलने वाले एक्सॉन को स्पष्ट रूप से लेबल किया गया था और उनके समाप्ति बिंदुओं पर पीछा किया जा सकता था। बायोसाइटिन-पॉजिटिव विराम चिह्न आसपास के कॉन्ट्रालेटरल एमओसी न्यूरॉन्स का सुझाव है कि हमारी तैयारी सीएन(चित्रा 3 बी)से निकलने वाले सिनैप्टिक संपर्कों को बरकरार रखता है। इसी तरह, कॉन्ट्रालेटरल एमएनटीबी में आयोजित लेबल किए गए कैलिसेस से संकेत मिलता है कि जीबीसी से एमएनटीबी न्यूरॉन्स तक पेश होने वाले एक्सॉन को वेज स्लाइस(चित्रा 3 सी)में संरक्षित किया जाता है। ये हिस्टोलॉजिकल परीक्षाएं पुष्टि करती हैं कि हमारे वेज स्लाइस में एमओसी न्यूरॉन्स के लिए अफरेंट इनपुट सर्किटरी के सेल निकाय और अक्षीय अनुमान दोनों होते हैं, जो इसलिए, हमें आरोही सर्किटरी के माध्यम से श्रवण तंत्रिका और गतिविधि के बाद के प्रचार की उत्तेजना से पैदा किए गए पोस्टसिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को मापने की अनुमति देता है।

वेज स्लाइस में सिनैप्टिक फिजियोलॉजी
उत्तेजक और निरोधात्मक सिनैप्टिक इनपुट का एकीकरण गंभीर रूप से न्यूरोनल गतिविधि को आकार देता है। हमने हाल ही में एमएनएनटीबी57के न्यूरॉन्स से एमओसी न्यूरॉन्स को निरोधात्मक आदानों का वर्णन किया है, लेकिन एमओसी न्यूरॉन गतिविधि पर उत्तेजक इनपुट के साथ इन आदानों के एकीकरण का प्रभाव अज्ञात है। एक ChAT-IRES-Cre एक्स tdTomato माउस से एक कील टुकड़ा में, वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग एक MOC न्यूरॉन से किया गया । वर्तमान को प्रीसाइनैप्टिक एक्सॉन से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज पैदा करने के लिए एक उत्तेजना आइसोलेशन यूनिट द्वारा संचालित एक द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू किया गया था। सबसे पहले मिडलाइन पर वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राया (वीएएस) को टीबीसी एक्सॉन उत्तेजना(चित्रा 4 ए)के माध्यम से टी-स्टेलेट एक्सॉन और एमएनएनबी न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित किया गया था, ताकि एक रिकॉर्डिंग विन्यास में पोस्ट-सिनेप्टिक प्रतिक्रियाओं के लिए विलंबता को मापने के लिए विशिष्ट पतली-स्लाइस प्रयोगों(चित्रा 4B),उदाहरण के निशान, ग्रे, होल्डिंग संभावित -60 mV) की नकल की जा सके। अलग-अलग प्रयोगों में, श्रवण तंत्रिका जड़ को मोन्यूरल आरोही सर्किटरी को सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया गया था और ऊपर वर्णित एमओसी न्यूरॉन्स में पोस्ट-सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को मापा गया था। या तो स्थान में विद्युत उत्तेजना एक तेजी से बिजली की विरूपण साक्ष्य पैदा की जिसके बाद बहुभाषी वर्तमान प्रतिक्रियाएं (चित्रा 4Cमें एक उत्तेजना से उदाहरण प्रतिक्रियाएं, काले निशान, संभावित -60 एमवी पकड़े हुए)। हमने पहले पोस्टसिनैप्टिक वर्तमान (पीएससी) के विलंबता उपायों की तुलना श्रवण तंत्रिका उत्तेजना के साथ पैदा किए गए लोगों के साथ वास की सीधी उत्तेजना के साथ पैदा की और एक उत्तेजना की घटनाओं के लिए काफी लंबी विलंबता पाई। यह एक/CN synapse (एक उत्तेजना: ५.२७ ± ०.४३ एमएस, औसत ± औसत निरपेक्ष विचलन (पागल), रेंज 4.26-5.93 एमएस, एन = 8 में किए गए सिनैप्टिक देरी के लिए जिंमेदार ठहराया गया था; VAS उत्तेजना: 1.98 ± 0.28 एमएस, औसत ± पागल, रेंज 0.75-3.46 एमएस, एन = 17; विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक टेस्ट, पी = 0.014, चित्रा 4D)। ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि श्रवण तंत्रिका जड़ की उत्तेजना के परिणामस्वरूप सीएन न्यूरॉन्स और बाद में सर्किट गतिविधि के सिनैप्टिक सक्रियण होते हैं, जो वीवो में अधिक बारीकी से प्रतिनिधित्व करते हैं - जैसे टी-स्टेलाट या जीबीसी/एमआरटीबी एक्सॉन की सीधी उत्तेजना की तुलना में समय।

हमारे सीज़ियम आधारित, उच्च [सीएल-]आंतरिक समाधान वोल्टेज क्लैंप, उत्तेजक (ग्लूटामेटर्जिक) और निरोधात्मक (गाबा और ग्लाइसिनर्जिक) में उपयोग किया जाता है, दोनों झिल्ली क्षमता (-60 एमवी) आराम करने पर आवक करते हैं और इसलिए अविवेच्य। एक उत्तेजक विन्यास में सर्किट गतिविधि पैदा करते समय, हमने होल्डिंग क्षमता को 0 एमवी में स्थानांतरित करके माना अवरोधक इनपुट को विद्युत रूप से अलग किया, एम्पा मध्यस्थता ग्लूटामेर्गिक धाराओं के लिए अनुमानित उलट क्षमता। हमारे उदाहरण में न्यूरॉन, बाहरी वर्तमान प्रतिक्रियाएं क्लोराइड चालन का संकेत 0 एमवी(चित्रा 4Ci,लाल निशान) पर देखी गईं। ये गाबा-या ग्लाइसिनर्जिक सिनैप्टिक प्रतिक्रियाएं होने की संभावना है। ये डेटा बाद में अफ़रीद सर्किटरी की सक्रियता के साथ, श्रवण तंत्रिका जड़ को उत्तेजित करके एमओसी न्यूरॉन्स को उत्तेजक करने के लिए कील स्लाइस की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, पोस्ट-सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं के विविध पैटर्न एक उत्तेजना द्वारा पैदा किए गए थे, यह सुझाव देते हुए कि एक अक्षांस की समान उत्तेजना की शर्तों के तहत भी, पूरे सर्किट की गतिविधि गतिशील और जटिल है। यह प्रयोगात्मक प्रतिमान इस बात के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है कि कैसे जटिल श्रवण उत्तेजनाएं ब्रेनस्टेम के माध्यम से प्रचारित होती हैं और एमओसी न्यूरॉन्स में एकीकृत होती हैं, जो एमओसी एफेरेंट सिस्टम के आउटपुट और कॉकलिया पर अंतिम प्रभाव का निर्धारण करती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: वेज टुकड़ा योजनाबद्ध और उदाहरण छवि। (A)मध्याख्वोला ओलिवोकोकलियर फीडबैक सर्किट का योजनाबद्ध। नीले तीर MOC न्यूरॉन्स और काले तीर के लिए afferent आरोही मार्ग संकेत मिलता है MOC न्यूरॉन्स से बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC) के आधार पर उतरते प्रतिक्रिया मार्ग का संकेत मिलता है । (ख)मोटी तरफ श्रवण तंत्रिका जड़ (एएनआर) और कॉकलियर न्यूक्लियस (धराशायी रूपरेखा) के लेबल के साथ एक वेज स्लाइस की ब्राइटफील्ड छवि। तारांकन ट्रैपेज़ाइड शरीर के वेंट्रल नाभिक के अनुमानित स्थान को इंगित करता है जहां एमओसी न्यूरॉन्स को वेज स्लाइस के पतले पक्ष पर पैच-क्लैंपिंग के लिए लक्षित किया जाता है। धराशायी काली रेखाएं चेहरे की नसों को इंगित करती हैं जिन्हें रोस्ट्रल सतह पर स्लाइस के दोनों गोलार्द्धों में देखा जा सकता है। आईएचसी - इनर हेयर सेल, जीबीसी - गोलाकार जंगली कोशिका, एसपीएन - बेहतर पैरालिवारी न्यूक्लियस, एमएनएनटी - ट्रैपेज़ाइड शरीर का मध्य नाभिक, वीएनटीबी - ट्रैपेज़ाइड शरीर का वेंट्रल न्यूक्लियस, एलएसओ - पार्श्व बेहतर जैतून। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: क्रेसिल वायलेट एक कील टुकड़ा है कि फिर से ५० μm पर अनुभागित किया गया था से वर्गों दाग । हर दूसरे खंड की छवि थी। खंड गिने-चुने हुए रोस्ट्रल --> कौडल हैं । वेज स्लाइस दोनों पृष्ठीय CN (S19 में तीर) और वेंट्रल सीएन (S19 में तीर), श्रवण तंत्रिका जड़ (S17 में खुला तीर) और MNTB के बहुत (S3-S15 में वेंट्रल सतह के पास अंधेरे क्षेत्र, S11 में डैश्ड अंडाकार के साथ प्रकाश डाला सहित कॉकलियर नाभिक (CN) की संपूर्णता को नियंत्रित करने के लिए खड़ा है । स्केल बार पर डी और वी स्लाइस ओरिएंटेशन में पृष्ठीय और वेंट्रल का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कॉन्ट्रालेट्रल कॉकलियर नाभिक से MOC न्यूरॉन्स के लिए आरोही इनपुट के एक्सॉन कील टुकड़ा में बरकरार रहते हैं । (क)एक P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (लाल फ्लोरेसेंस) माउस से लिया एक कील टुकड़ा से रोस्ट्रल-सबसे अनुभाग है कि फिर से sectioned (७० μm) और बायोसाइटिन दृश्य के लिए संसाधित किया गया था । कॉन्फोकल इमेज एक टाइल, अधिकतम तीव्रता वाले प्रक्षेपण जेड-स्टैक है। वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राइरिया में एक्सॉन को सफेद एरोहेड द्वारा हाइलाइट किया जाता है। धराशायी रूपरेखा इस रोस्ट्रल-मोस्ट स्लाइस में शेष कॉकलियर नाभिक के छोटे हिस्से को इंगित करती है। स्केल बार 500 माइक्रोन(बी)आसपास के न्यूरोपिल में बायोसाइटिन पॉजिटिव पंचटा के साथ वीटीबी में एक ChAT-IRES-Cre x tdTomato सकारात्मक न्यूरॉन की कॉन्फोकल छवि। स्केल बार 50 माइक्रोन(सी)बायोसाइटिन लेबल वाले एक्सॉन को मिडलाइन पार करते हुए दिखाया गया है और कॉन्ट्रालेट्रल एमएनटीबी में को हेल्स ऑफ हेलिस ऑफ हेलिस के रूप में समाप्त किया गया है। ऊर्ध्वाधर धराशायी रेखा स्लाइस के मिडलाइन का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: वोल्टेज क्लैंप में अफ़रीद आदानों की विद्युत उत्तेजना एमओसी न्यूरॉन्स में मल्टीपीक पोस्टसिनैप्टिक धाराओं की पैदावार करती है। (ए)एमओसी को एफेरेंट इनपुट्स के वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राॅ्रिया (वीएएस) उत्तेजना (ग्रे उत्तेजक इलेक्ट्रोड) और श्रवण तंत्रिका (एएन) उत्तेजना (ब्लैक उत्तेजक इलेक्ट्रोड) दोनों के लिए रिकॉर्डिंग सेट-अप के साथ कील स्लाइस की योजनाबद्ध । (ख)एक व्यक्तिगत P17 न्यूरॉन से पोस्टसिनैप्टिक धाराओं (पीएससी) के उदाहरण -60 मीटर की दूरी पर मिडलाइन के पास एक ही विद्युत उत्तेजना के साथ पैदा किया । (ग)पीएससी एक पी15 न्यूरॉन में -60 mV पर एक उत्तेजना के दौरान पैदा किया। (Ci)उदाहरण पीएससी सी के रूप में एक ही सेल में 0 एमवी होल्डिंग क्षमता पर पैदा (AMPA हमारे रिकॉर्डिंग सेटअप, लाल में मध्यस्थता धाराओं के लिए अनुमानित उलट क्षमता) । (घ)वीएएस और उत्तेजना के लिए प्रथम पीएससी के लिए विलंबता की मात्रा के लिए जनसंख्या डेटा । बक्से: क्वार्टाइल्स, लाइन इनसेट: मीडियन, स्क्वायर इनसेट: मतलब, मूंछ: औसत पूर्ण विचलन। * पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित टुकड़ा करने की प्रक्रिया को बरकरार प्रेसिनैप्टिक न्यूरोनल सर्किटरी बनाए रखने के लिए शक्तिशाली है, लेकिन न्यूरोनल फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोग की पहुंच के साथ। सर्किट विश्लेषण की तैयारी की उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए कई प्रारंभिक चरणों में बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा का उपयोग करके कील के आयामों की पुष्टि की जानी चाहिए, जो पुष्टि के लिए अभिन्न है कि प्रीसाइनैप्टिक नाभिक और उनके अक्षीय अनुमान दोनों तैयार वेज स्लाइस के भीतर निहित हैं। यदि अनुमान कटे हुए हैं या कुछ अक्षों को लक्षित नाभिक तक पहुंचते हैं तो स्लाइस ज्यामिति को संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। आम तौर पर, कील स्लाइस के लिए वाइब्रेकोम पर फिनिशिंग कट गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। इष्टतम वेज स्लाइस तैयारी के लिए ज्ञात मस्तिष्क स्थलों के आधार पर सेटिंग्स के समायोजन के साथ-साथ मंच आधार पर गाढ़ा सर्कल चिह्नों के उपयोग सहित वाइब्रेकोम कॉन्फ़िगरेशन के लगातार उपयोग के संयोजन की आवश्यकता होगी। स्लाइस ज्यामिति के अनुकूलन के बाद, हमने 18 वेज स्लाइस में से 8 में श्रवण तंत्रिका जड़ को विद्युत रूप से उत्तेजित करके एमओसी न्यूरॉन्स में लगातार पीएससी दर्ज किए। हमारे पिछले काम में हम MOC न्यूरॉन्स57के लगभग 60% में MNTB अक्षों की सीधी उत्तेजना के माध्यम से निरोधात्मक पीएससी पैदा करने में सक्षम थे, सुझाव है कि हमारी सफलता की दर यहां केवल एक मामूली कमी इनपुट और पॉलीसाइनैप्टिक सर्किट सक्रियण के लिए आवश्यकता की लंबी श्रृंखला को देखते हुए है। स्लाइस तैयार करते समय, मोटा टुकड़ा के कारण दृश्यता में कमी के रूप में मोटा पक्ष पर गलती करने की सलाह दी जाती है, जो एक अनुपयोगी अनुभाग पर अनुकूल है जो अधूरा है या सर्किट कनेक्टिविटी का अभाव है। किसी भी स्लाइस विन्यास या आयामों का उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि स्लाइस रिकॉर्डिंग माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत फिट बैठता है, पैच और उत्तेजक इलेक्ट्रोड (या अन्य जांच या उपकरण) द्वारा सुलभ है, और ब्याज की पोस्टसिनैप्टिक सेल पर ऑप्टिकली-आधारित पैच-क्लैंपिंग के लिए पर्याप्त पतली है। पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए सर्किट की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए तेजी से, कोमल विच्छेदन और उचित इनक्यूबेशन और वसूली की स्थिति भी महत्वपूर्ण है। हमारे श्रवण ब्रेनस्टेम तैयारी के लिए विशिष्ट, मस्तिष्क को अक्षुण्ण और कार्यात्मक श्रवण तंत्रिका जड़ों को संरक्षित करने के लिए खोपड़ी से बहुत सावधानी से हटा दिया जाना चाहिए। तंत्रिका को खींचना या फाड़ना फाइबर को उत्तेजित करने और श्रवण न्यूरॉन्स में गतिविधि को प्राप्त करने की क्षमता को प्रभावित करेगा। स्लाइस में ऊतक की बड़ी मात्रा के कारण, पारंपरिक टुकड़ा करने की क्रिया समाधान, तापमान, इनक्यूबेशन विवरण, और पर्फ्यूजन सिस्टम के संशोधन से स्लाइस के स्वास्थ्य में सुधार हो सकता है। यहां हम अपने सामान्य स्लाइस तैयारी में मामूली संशोधन ों को नियोजित करते हैं। इनमें कम रिकवरी इनक्यूबेशन बार (30 मिनट बनाम 60 मिनट) और स्लाइस चैंबर परफ्यूजन सिस्टम में तेज प्रवाह दरें शामिल हैं।

एक बार जब स्लाइस आयाम और इनक्यूबेशन विवरण निर्धारित किए गए हैं, तो स्लाइस के भीतर सर्किटरी के विभिन्न घटकों के कार्य और कनेक्टिविटी का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। हमारी तैयारी में, हम यह सुनिश्चित करते हैं कि टी-स्टेलेट और जीबीसी (एमएनटीबी के माध्यम से) के साथ कॉकलियर नाभिक में उत्पन्न होने के लिए काल्पनिक और निरोधात्मक आदान दोनों ही अपेक्षा के अनुसार मौजूद हों। श्रवण तंत्रिका के लिए सक्शन इलेक्ट्रोड जैसे वैकल्पिक उत्तेजना विधियों, या ऑप्टिकल उत्तेजना विधियों जैसे ऑप्टोजेनेटिक्स या फोकल न्यूरोट्रांसमीटर अनक एजिंग भी सर्किट सक्रियण में वृद्धि कर सकते हैं या सेल-प्रकार विशिष्ट सक्रियण के लिए अनुमति दे सकते हैं जब सेल उपप्रकारों के आनुवंशिक लक्ष्यीकरण के साथ जोड़ा जाता है।

हालांकि यह टुकड़ा करने की क्रिया विधि उम्मीद है कि कई प्रणालियों और सर्किट के लिए उपयोगी होगी, मानक पतले-स्लाइस वर्गों की कुछ सीमाएं भी इस तैयारी के लिए प्रासंगिक हैं। आम तौर पर, कम प्लैनर प्रक्षेपण पैटर्न के साथ सर्किट को संरक्षित करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि एक्सॉन की संभावना कटे होंगे। कपाल नसों पर सर्किट को सक्रिय करना, जैसा कि श्रवण आदानों की नकल करने के लिए यहां किया गया है, कई सर्किट में संभव नहीं हो सकता है। अन्य स्लाइस तैयारी के साथ, किसी भी फार्माकोलॉजी के नेटवर्क प्रभावों पर विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स के स्नान अनुप्रयोग अवरोधक (गाबा-या ग्लाइसिनर्जिक) या संचरण के अन्य साधनों को आइसोलेट करने के लिए पॉलीसाइनैप्टिक सर्किट सक्रियण के साथ उपयोग नहीं किया जा सकता है जब ग्लूटामेट न्यूरॉन्स के ऊपर न्यूरॉन्स की सक्रियता के लिए आवश्यक है। यह हमारे मामले में सच है क्योंकि एएन/सीएन और जीबीबी सिनेप्स दोनों ग्लूटामे एलर्जी हैं, इसलिए, ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स के स्नान अनुप्रयोग के साथ एमओसी न्यूरॉन्स में सभी संचरण को समाप्त कर दिया जाएगा । इसके अतिरिक्त, एमएनटीबी-एमओसी सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को समाप्त करने के लिए गाबा या ग्लाइसिन रिसेप्टर ब्लॉकर्स के आवेदन से सीएन के भीतर आंतरिक निरोधात्मक कनेक्टिविटी को नष्ट करने का अनपेक्षित परिणाम होगा जो एमओसी न्यूरॉन्स को अफररेंट इनपुट के पैटर्न को आकार दे सकता है। रिसेप्टर ब्लॉकर्स के फोकल एप्लिकेशन, दबाव इंजेक्शन या आयनोफोरेसिस के साथ, औषधीय कार्य को प्रतिबंधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अंत में, इस की मुख्य सीमा, और किसी भी, इन विट्रो तकनीक यह है कि हालांकि यह तैयारी मोनारल आरोही श्रवण सर्किटरी की सक्रियता को अधिकतम करती है, बाकी तंत्रिका तंत्र, जिसमें परिधीय रिसेप्टर्स शामिल हैं, जो उत्तेजनाओं को एन्कोड करते हैं, अनुपस्थित हैं। इसमें कॉकलिया ही शामिल है, दूसरे कान66,कॉमिसुरल सीएन कनेक्शन67, 68,69,70,और उतरतेकॉर्टिकल71, 72,73, 74और कोल्युलर75,76 अनुमानों और मॉड्यूलरी इनपुट्स से उत्तेजक जानकारी77,78,79,80 सीएन और एसओसी नाभिक के प्रभाव के लिए जाना जाता है। हालांकि यह संभव है कि उतरते आईसी अनुमानों के एक हिस्से को बनाए रखा जाता है यह टुकड़ा ज्यामिति के कारण दोनों कॉर्टिकल अनुमानों और कॉमिसुरल CN अनुमानों को शामिल करना असंभव होगा। इसलिए, हम वर्तमान प्रयोगों के साथ कॉकलिया से आरोही श्रवण सर्किटरी पर ध्यान केंद्रित करते हैं। पतली तरफ स्लाइस की न्यूनतम मोटाई भी बिनौरल पॉलीसाइनैप्टिक सर्किट विश्लेषण करने की क्षमता को कम करती है, जो सममित मोटी स्लाइस तैयारी10,11का लाभ है। इसके अतिरिक्त, हम सर्किट गतिविधि के प्राकृतिक पैटर्न पैदा करने के लिए ध्वनि के साथ श्रवण तंत्रिका को उत्तेजित करने में असमर्थ हैं। श्रवण तंत्रिका प्रतिक्रियाएं नीनूटोपिक रूप से विविध, नर्वस और प्लास्टिक81,82,83, 84हैं, जिससे हमारी विद्युत उत्तेजना विधि के साथ पूरी तरह से अनुकरण करना मुश्किल होजाताहै। यह श्रवण प्रणाली में इन विट्रो प्रयोग की एक बड़ी खामी है। हमारी उत्तेजना का Tonotopic प्रतिबंध संभव नहीं है क्योंकि पूरे एक जड़ को उत्तेजित करने से टोनोटोपिक ढाल में एक फाइबर में स्पाइकिंग प्रकाश में आएगी। एक विद्युत उत्तेजना पैटर्न के लिए फाइबर प्रतिक्रियाओं (यानी, कम बनाम उच्च सहज दर फाइबर) की विविधता को सटीक रूप से नकल करना भी संभव नहीं है। सीएन में कई फाइबर की गतिशील तीव्रता कोडिंग को ठीक से मैच करना भी मुश्किल है। हालांकि, हम विभिन्न ध्वनिक उत्तेजनाओं के दौरान उपयुक्त श्रवण तंत्रिका उत्पादन की नकल करने के उद्देश्य से विभिन्न प्रकार के उत्तेजना पैटर्न का उत्पादन करने के लिए अपने इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में सक्षम हैं (उदाहरण केलिए छोटी, जोर से आवाज़, शांत, लंबे समय तक ध्वनियां या पृष्ठभूमि शोर में लगता है) विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के बीच उत्तेजना आवृत्ति को अलग करके और लगभग संयुक्त ए इनपुट (रेफरी में मॉडलिंग) के लिए एक व्यक्तिगत प्रोटोकॉल के भीतर भी। इन प्रयोगों के दौरान MOC उत्पादन की निगरानी क्या उत्तेजना पैटर्न निषेध या MOC न्यूरॉन्स में उत्तेजना एहसान हो सकता है के बारे में हमारी परिकल्पना का परीक्षण करेंगे ।

ऊपर वर्णित सीमाओं के बावजूद, एक कील टुकड़ा तैयारी विधि वीवो और विशिष्ट इन विट्रो स्लाइस फिजियोलॉजी विधियों की तुलना में लाभ है और कोशिकाओं के लिए टुकड़ा में जितना संभव हो उतना बारीकी से वीवो सर्किट सक्रियण में दृष्टिकोण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं । वीवो में श्रवण ब्रेनस्टेम में पूरे सेल रिकॉर्डिंग इस क्षेत्र तक पहुंचने में कठिनाइयों के कारण दुर्लभ हो गए हैं शल्य चिकित्सा८६। इसके बजाय टुकड़ा श्रवण तंत्रिका है, जो सीधे पूरे मोनारल आरोही सर्किट को सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया जाता है के साथ शुरू MOC न्यूरॉन्स के लिए आरोही आदानों को शामिल करने के लिए तैयार किया गया था । हम उत्तेजक और निरोधात्मक सिनैप्टिक दोनों आदानों की सक्रियता प्रदर्शित करते हैं, और इन आदानों के जवाब सिनैप्टिक इनपुट के समय के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं क्योंकि वे एमओसी न्यूरॉन्स तक पहुंचते हैं। यह उच्च थ्रूपुट प्रयोग के लिए एक मंच प्रदान करता है जहां हम इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी टूल जैसे कैल्शियम या वोल्टेज इमेजिंग, न्यूरोट्रांसमीटर अनकिंग, और दोनों इंट्रासेलुलर (पैच पिपेट के माध्यम से) और एक्सट्रासेलुलर (स्नान आवेदन या आयनटोपोरेसिस के माध्यम से) फार्माकोलॉजी के एक बड़े प्रदर्शनों की सूची को नियोजित कर सकते हैं। तैयारी को डीआईसी ऑप्टिक्स का उपयोग करके लक्षित न्यूरॉन्स की बेहतर दृश्यता के कारण मोटी स्लाइस तैयारी पर थ्रूपुट में वृद्धि की भी पेशकश करनी चाहिए, जो विशेष रूप से वेंट्रल ब्रेनस्टेम में बढ़ी हुई ऊतक मोटाई के साथ धुंधला होता है। कुल मिलाकर, यह तकनीक वीवो विधियों में लक्ष्यीकरण और थ्रूपुट में सुधार प्रदान करती है, और पारंपरिक स्लाइस फिजियोलॉजी विधियों की तुलना में सर्किट विश्लेषण के लिए बेहतर अवसर प्रदान करती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईएच, एनआईडीसीडी, जेड01 DC000091 (CJCW) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 162 मध्यीय ओलिवोकोकलियर न्यूरॉन्स इन विट्रो स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सिनैप्टिक एकीकरण श्रवण तंत्रिका श्रवण ब्रेनस्टेम कॉकलियर न्यूक्लियस निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमिशन
विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter